CN103382229A - 一种具有免疫调节作用的新型海胆黄多糖的制备方法及结构鉴定 - Google Patents

Abstract

本发明具体一种具有α-1，4糖苷键主链和α-1，3糖苷键侧链的海胆黄多糖及其制备方法和用途；属于天然高分子领域。本发明提供一种从烟台光棘球海胆(Strongylocentrotus nudus)生殖腺中提取多糖的方法、该多糖的化学结构及其用途。利用化学分析及波谱技术对其结构进行分析，发现本发明中的海胆黄多糖的重复结构单元中含有1→3和1→4两种糖苷键，其中主链由1→4糖苷键组成，侧链由1→6糖苷键组成，糖残基为α构型，其相对分子量为6.78×10⁵Da，比旋度此多糖为首次从光棘球海胆的尘殖腺(海胆黄)中分离得到的一种结构新颖的葡聚糖。同时，本发明中的海胆黄多糖可以刺激小鼠脾淋巴细胞及巨噬细胞的增殖，并提高巨噬细胞吞噬中性红的能力，表明本发明中的海胆黄多糖具有免疫增强作用。

Description

一种具有免疫调节作用的新型海胆黄多糖的制备方法及结构鉴定

技术领域

本发明具体涉及一种具有α-1，4糖苷键主链和α-1，3糖苷键侧链的海胆黄多糖及其制备方法和用途；属于天然高分子领域。

背景技术

雌性海胆的生殖腺即海胆黄为名贵的海产珍品，被称为“云丹”，国际市场上价格昂贵，有“黄色钻石”之称。海胆黄含有丰富的蛋白质，多糖，脂肪酸，维生素及各种微量元素等多种对人体有益的营养成分。因此海胆黄不仅具有较高的食用价值，同时还具有极好的药用价值，尤其在增强人体免疫力，防治心血管疾病方面有较好的效果。应用海胆治疗各种肿毒的方法在传统医学中早有记载。随着科技的进步，海胆的抗肿瘤作用已经得到了当今医学的肯定。

国外对海胆的研究始于上世纪60年代，早期的研究主要集中在对海胆棘色素及海胆内生或共生菌代谢产物方面的研究。1981年，George首次从有毒的绿海胆(S.droebachiensis)中分离得到两种具有抗肿瘤活性的糖蛋白。自此开始，越来越多的学者从不同种类的海胆的外壳，内脏，卵等来源中发现了多种具有抗肿瘤，免疫调节等不同生物活性的多糖，糖蛋白，糖脂等化合物。

我国是海胆资源比较丰富的国家，而多糖是海胆黄中重要的营养成分。通过人们对药用多糖作用机制的研究发现，从天然产物中分离得到的多糖发挥抗肿瘤等生理活性，往往是通过多糖分子作为免疫调节剂而发挥作用的。多糖不仅仅能够激活多种免疫细胞，同时对正常的机体细胞没有毒副作用，因而作为一种加强生物免疫反应或抗体生成及激活的免疫调节剂应用于癌症和免疫缺损疾病的临床治疗方面具有巨大的研究潜力。相应地，多糖的研究范围也不断扩大，不仅仅包括了多糖的分离纯化、结构分析的研究，也逐渐发展到了多糖的构效关系，作用机制，临床应用等方面。随着研究的不断深入，多糖化合物吸引了越来越多学者的注意，其生物活性的研究得到了飞速发展。

发明内容

本发明的目的是从烟台光棘球海胆的生殖腺中提取出一种多糖，鉴定其化学结构并确定其具体的活性用途。

本发明涉及海胆黄多糖结构的鉴定，即从光棘球海胆黄中分离得到的海胆黄多糖，经单糖组成分析结果表明，海胆黄多糖为一种葡聚糖，通过化学分析和光谱分析推断出本发明中海胆黄多糖的重复单元结构如图1所示，主链由1→4糖苷键组成，侧链由1→3糖苷键组成，糖苷键残基为α构型。表明本发明所涉及的海胆黄多糖是从烟台光棘球海胆中首次分离得到的一种结构新颖的葡聚糖。

上述海胆黄多糖在200-800μg/mL时对脾淋巴细胞有明显的增殖作用，并且呈一定的剂量依赖性。另外海胆黄多糖可显著促进小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的能力，在100-400μg/mL浓度范围内，与对照组相比有显著性差异(P＜0.05)，并且可以显著地刺激小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7增殖。

附图说明

图1是海胆黄多糖的重复单元

图2是海胆黄多糖分离提取流程图

图3是海胆黄多糖高效液相(HPLC)色谱图

图4是海胆黄多糖水解产物薄层层析图

图5是海胆黄多糖的糖醇乙酸酯的气相(GC)色谱图

图6是NaIO₄溶液的浓度-吸光值标准曲线

图7是海胆黄多糖的Smith降解产物的气相色谱图

图8是海胆黄多糖完全甲基化后的红外谱图

图9是完全甲基化的海胆黄多糖的糖醇乙酸酯GC-MS联机分析中的气相(GC)色谱图

图10是海胆黄多糖部分酸水解后的糖醇乙酸酯的气相(GC)色谱图

图11是海胆黄多糖紫外分光图谱

图12是海胆黄多糖红外分光图谱

图13是海胆黄多糖的¹HNMR图谱

图14是海胆黄多糖的¹³CNMR图谱

图15是海胆黄多糖对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用图

图16是海胆黄多糖对小鼠巨噬细胞RAW264.7增殖作用图

图17是海胆黄多糖对小鼠巨噬细胞RAW264.7吞噬中性红的影响图

具体实施方式

实施例1

一、提取流程

将新鲜的海胆切开，小心剥离海胆黄，纱布过滤除去海胆黄中的水分。向收集到的500g海胆黄中加入等体积的丙酮，搅拌使之与丙酮充分接触，静置30min，弃上层丙酮，反复数次至丙酮层基本无色为止，最后将丙酮减压挥干，得海胆黄多糖丙酮粉200g。海胆黄丙酮粉置于2L蒸馏水中，90℃提取5小时，反复3次，得水提液共6L，50℃减压浓缩至1.2L。

向浓缩液中加入木瓜蛋白酶8g，60℃水浴20小时。利用Sevage法除蛋白，10-15次。加入0.3L Sevag试剂(氯仿：水饱和正丁醇＝5∶1)，剧烈振荡15min，4000rpm离心15min，取上清，重复上述操作10次。55℃减压浓缩除去有机试剂并将溶液体积浓缩至500mL。

向除去蛋白的浓缩液中缓慢加入2.5L预冷至4℃的无水乙醇，并在4℃下静置过夜沉淀多糖，5000rpm，10min离心收集沉淀，用无水乙醇洗涤沉淀得到的粗多糖3次。将粗多糖溶解于50mL蒸馏水中，冻干后得到粗多糖17.5g。

取粗多糖500mg配成50mg/mL的水溶液，过0.45μm滤膜滤后经过DEAE-52纤维素离子交换柱(3.5cm×25cm)分离。蒸馏水洗脱，流速0.5mL/min，每管5mL分部收集，苯酚-硫酸法逐管测定糖含量，绘制洗脱曲线，收集第8～17管，合并后冷冻干燥得到315mg多糖CP。取多糖CP30mg，溶于1mL(0.05mol/L)NaCl溶液中，经0.22μm滤膜过滤后，经Sephacryl S-400柱层析(1.6cm×80cm)分离，0.05mol/L的NaCl溶液洗脱，流速0.5mL/min，每管3mL分部收集，硫酸-苯酚法逐管检测糖含量，绘制洗脱曲线，收集第10～20管，用截留分子量10kD的透析袋透析除盐后，冷冻干燥，得海胆黄多糖14mg。提取过程流程图如图2所示。

二、性质测定

经高效液相(HPLC)分析表明，海胆黄多糖的纯度为为98.501％，如图3所示。

经高效凝胶柱层析(HPGPC)分析表明海胆黄多糖的分子量为6.78×10⁵Da。

WZZ-2B自动旋光仪测定海胆黄多糖的比旋度为

元素分析结果表明，海胆黄多糖不含N，C和H的质量百分含量分别为39.12％和6.68％，属中性糖的碳氢组成范围。

海胆黄多糖与苯酚-硫酸、蒽酮-硫酸及斐林试剂反应呈阳性，表明其为还原性多糖；与碘-碘化钾反应呈阴性，表明其空间结构不同于淀粉；与咔唑-硫酸反应呈阴性，表明结构中不含糖醛酸。

三、化学结构测定：

一)单糖组成分析

1、微晶纤维素薄层分析：取本发明中的海胆黄多糖10mg置于安瓿管中，加入2mL2.0mol/L三氟乙酸(TFA)，充N₂封管，于110℃水解2h。完全水解后40℃减压浓缩除去TFA，加入甲醇2.0mL蒸干，重复3次以完全除去TFA。将样品溶于0.5mL蒸馏水中，以葡萄糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖为对照品，在微晶纤维素板作薄层分析以检测样品所含的单糖种类，所使用的展开剂为：乙酸乙酯∶吡啶∶水∶乙酸＝5∶5∶3∶1，显色剂为苯胺-邻苯二甲酸，110℃显色10min，以确定其单糖组成。结果从图4可以看出水解产物仅有一个棕色斑点，且其R_f值与葡萄糖标准品一致，表明本发明中的海胆黄多糖可能为一种由葡萄糖组成的多糖。

2、气相色谱分析：本发明中的海胆黄多糖水解成单糖后，在硼氢化钠的作用下还原成相应的糖醇，经乙酰化，得到相应的糖醇乙酸酯衍生物。通过气相色谱分析，海胆黄多糖的水解产物仅含有一个主峰，其保留时间为19.743min如图5所示，表明海胆黄多糖由一种单糖组成。葡萄糖标准品进行平行操作，葡萄糖标准品出峰时间为19.800min，与糖醇乙酸酯的GC图谱中主峰的保留时间一致，说明海胆黄多糖完全由葡萄糖组成。结合上述薄层层析法结果，证明本发明中的海胆黄多糖为葡聚糖。

二)NaIO₄氧化分析

1、NaIO₄溶液标准曲线的绘制：用重蒸水精确配制10mM、8mM、6mM、4mM、2mM的NaIO₄溶液，均稀释250倍后以重蒸水为对照，测定其在223nm处的吸光值，绘制吸光值A₂₂₃-浓度C标准曲线，见图6。

2、称取本发明中的海胆黄多糖10mg，置于棕色反应瓶中，加入30mL10mM的NaIO₄，振荡令其溶解，加塞置于4℃冰箱黑暗处氧化，并间歇振荡，分别于24h、48h、72h、96h、120h间隔取反应液200μL，稀释250倍测定其在223nm处的吸光值(双蒸水调零)，根据标准曲线计算NaIO₄的消耗量。待吸光值达到稳定时，向体系中加入2mL乙二醇并搅拌30min以还原未反应的NaIO₄。取2.0mL反应结束后的溶液，以酚酞作指示剂，用0.05mM的NaOH溶液进行滴定，计算甲酸的释放量。根据NaIO₄的消耗量和甲酸的释放量计算不同糖苷键的摩尔比。

海胆黄多糖经10mM的NaIO₄氧化96h达到平衡，反应中IO₄ ^-的消耗量为2.127mmol，甲酸释放量约为0.215mmol。根据原理可推知，1→4或(和)1→2糖苷键与1→6糖苷键或(和)非还原末端的比例为9.4∶1。

三)Smith降解

1、取10mg海胆黄多糖，置于棕色反应瓶中，加入30mL10mM的NaIO₄，振荡令其溶解，加塞置于4℃冰箱黑暗处完全氧化后，加入2mL乙二醇并搅拌30min使反应终止。反应液对流水透析2天，再蒸馏水透析1天。将袋内液体40℃减压浓缩至10mL，加入30mgNaBH₄，室温下暗处搅拌反应24h，再用0.1M醋酸调PH至5，依次用流水、蒸馏水透析至彻底脱盐，冷冻干燥得多糖醇。

2、将上述多糖醇置于安瓿瓶中，加入2mL2.0mol/L三氟乙酸(TFA)，充N₂封管，于110℃水解2h。完全水解后40℃减压浓缩除去TFA，加入甲醇2.0mL蒸干，重复3次以完全除去TFA。水解后的样品溶于3mL蒸馏水中，加入25mg NaBH₄，于室温下还原2h。反应完成后，用冰醋酸破坏过量的NaBH₄，调节溶液的pH值至5，减压蒸干，加入3mL甲醇及一滴冰醋酸，再减压蒸干，重复3次后冷冻干燥。

3、将冻干后的样品加入2mL无水吡啶中，超声15min使其完全溶解后，加入1mL醋酸酐，充N₂后密塞，100℃反应2h。反应结束后冷却至室温，加入5mL双蒸水，用HCl调节pH至中性。反应液用氯仿反复萃取，直至氯仿层无色，合并收集的氯仿相，用等体积蒸馏水洗涤3次，氯仿层用无水硫酸钠静置干燥10min，再过滤除去硫酸钠固体，将氯仿浓缩至0.1mL后进行气相色谱(GC)分析，如图7所示。

气相色谱结果表明海胆黄多糖的Smith降解产物中有甘油(保留时间为4.106min)、赤藓醇(保留时间为8.034min)和葡萄糖(保留时间为23.590min)，峰面积归一化后得出三者的比例为1∶8.8∶5.3。综合分析Smith降解和NaIO₄氧化的结果得到：海胆黄多糖精品中的1→3糖苷键，1→4糖苷键以及1→6糖苷键和非还原末端的摩尔比为5.5∶9∶1。

四)甲基化分析

1、称取本发明中的海胆黄多糖10mg置于反应瓶中，真空干燥6h。干燥后的样品加入4mL用4A分子筛处理过的DMSO，室温磁力搅拌直至多糖样品完全溶解后在N₂保护下加入研磨过的干燥的NaOH粉术20mg，室温搅拌3h，然后冰浴5min，待反应瓶中的溶液完全冰冻后，逐滴加入0.5mL碘甲烷，继续磁力搅拌反应3h，室温减压蒸馏，除尽过量的碘甲烷。

2、向反应液中加入10mL双蒸水后用氯仿反复萃取，直至氯仿层无色，合并收集的氯仿相，用等体积蒸馏水洗涤3次，氯仿层用无水硫酸钠静置干燥10min后过滤除去硫酸钠固体，得到的氯仿相减压蒸发至干，将得到的甲基化产物溶于1mL蒸馏水中冷冻干燥，然后真空干燥5h。重复上述操作3次后，取少量样品进行红外检测。当IR谱上原样品的3300cm^-1处强而宽的羟基峰消失，而2900cm^-1处的甲基峰相对增强时，如图8所示，说明样品已被完全甲基化。

3、向完全甲基化后的样品中加入4mL2mol/L的TFA，密封后110℃下水解4h，反应瓶中的溶液减压蒸干，再加入3mL甲醇，蒸干，重复3次以除尽过量的TFA。将水解后的样品溶于3mL蒸馏水中，加入25mg NaBH₄，于室温下还原2h，再用冰醋酸调节溶液的pH值至5，减压蒸干，加入3mL甲醇及一滴冰醋酸，再减压蒸干，重复3次，然后真空干燥4h。

4、干燥后的样品加入2mL无水吡啶，超声5min完全溶解后加入1mL醋酸酐，充N₂后密塞，100℃反应2h。反应结束后冷却至室温，加入3mL双蒸水，用HCl调节pH至中性。反应液用氯仿反复萃取，直至氯仿层无色，合并收集的氯仿相，用等体积蒸馏水洗涤3次，氯仿层用无水硫酸钠静置干燥10min后过滤除去硫酸钠固体，将氯仿浓缩至0.1mL后进行气质联用分析。

海胆黄多糖甲基化产物在GC中出现了四个甲基化衍生物离子峰，如图9所示，其保留时间分别为12.269min、13.725min、14.456min、和14.756min。联机检索各质谱图，初步确定各质谱的归属，根据部分甲基化糖醇乙酸酯衍生物的裂解规律归属质谱图中的初级碎片和次级碎片，通过解析，GC谱图中四个组成依次为：1，5-二-氧-乙酰基-2，3，4，6-四-氧-甲基-葡萄糖(2，3，4，6-Me4-Glc)、1，4，5-三-氧-乙酰基-2，3，6-三-氧-甲基-葡萄糖(2，3，6-Me3-Glc)、1，3，5-三-氧-乙酰基-2，4，6-三-氧-甲基-葡萄糖(2，4，6-Me3-Glc)和1，3，4，6-四-氧-乙酰基-2，3-二-氧-甲基-葡萄糖(2，3-Me2-Glc)四个组分摩尔比约为1∶9∶5∶1。综合Smith降解和NaIO₄的结果可知，海胆黄多糖为一种含有非还原末端1→、1→4和1→3糖苷键的组成的葡聚糖，三者的比例约为1∶9∶5。

五)部分酸水解

取本发明中的海胆黄多糖10mg，置于安瓿管中，加入0.3mol/L的TFA5mL，充N₂封管，100℃水解18h，用NaOH中和多余的TFA，透析，冷冻干燥得水解产物，再经NaIO₄氧化和NaBH₄还原后得相应的糖醇，糖醇经水解和乙酰化后进行气相色谱分析，仅检出赤藓醇，如图10所示，表明海胆黄多糖的主链由1→4糖苷键组成。

六)紫外光谱分析

将本发明中的海胆黄多糖1mg配成1.0mg/mL水溶液，用紫外分光光度计在200～600nm的范围内进行扫描，见图11，其在260nm和280nm处均无特征吸收峰，表明海胆黄多糖多糖无蛋白质和核酸。

七)红外光谱分析

本发明中的海胆黄多糖经真空干燥12h后，取1.0mg以KBr压片，在4000～400cm^-1的范围内进行红外光谱扫描，结果如图12所示，可以看出：在3417.7cm^-1处出现一个较强的宽峰，为-OH的伸缩振动；在2947.6cm^-1和2842.5cm^-1的2个吸收峰为C-H的伸缩振动，1378.7cm^-1处的峰是C-H的变角振动，这三组峰为多糖的特征吸收峰。1020.6cm^-1处的强吸收说明SEP的主要组成单糖为葡萄糖，在969.7cm^-1处的吸收峰以及1020.6、1032.2及1156.0cm^-1处的吸收峰表明海胆黄多糖由α-D-吡喃葡萄糖组成。

八)核磁共振(NMR)分析

取本发明中的海胆黄多糖30mg，在室温下油泵真空干燥3h后溶于0.5mL的D₂O中，在AVANCE500核磁共振仪上测定其¹H NMR谱，；另取冷冻干燥的海胆黄多糖200mg在BRUKER公司AVANCE III400MHz宽腔固体核磁共振谱仪上测定¹³C NMR谱。如图13所示，在¹H NMR中δ＞4.5ppm的低场区有两个异头质子信号，其化学位移分别为δ5.35ppm和δ5.39ppm，提示该多糖含有两种α糖苷键，且这信号比例不同，说明两种糖苷键分布不均衡。如图14所示图，在¹³C NMR中δ90～110ppm的低场区出现两个信号峰，为异头碳的信号峰，其化学位移分别是δ102.72和98.26ppm，与¹H NMR谱中两个异头氢信号峰相对应。

其结果说明组成海胆黄多糖的基本重复单元中含有1→4和1→3两种糖苷键的连接方式，且糖残基构型为α型。与甲基化分析、高碘酸氧化、Smith降解以及部分酸水解等化学方法分析得到的结果一致。

四、综合上述所述分析可得如下结果：

1、单糖组成分析结果表明：本发明中的海胆黄多糖为葡聚糖。

2、高碘酸氧化，Smith降解及甲基化结果表明本发明中的海胆黄多糖为一种含有非还原末端1→，由1→3及1→4糖苷键的组成的葡聚糖，其的比例约为1∶5∶9。

3、部分酸水解的结果表明构成海胆黄多糖主链的葡萄糖连接方式为α-1，4糖苷键。

4、NMR分析结果表明组成海胆黄多糖的基本重复单元中含有1→3和1→4两种糖苷键，且糖残基构型为α型。

因此，本发明中的海胆黄多糖的基本重复单元的结构如下，它是从海胆黄中发现的一种新型结构多糖。

实施例2

材料与试剂：海胆黄多糖(自制，经HPLC检测为均一多糖)，LPS(Sigma)，CCK-8(Sigma)，MTT(Sigma)，RPMI Medium1640(Gibco)，脾淋巴细胞分离液(四季青生物材料有限公司)

仪器 超净工作台(苏州净化设备厂)，CO₂培养箱(美国ThermoForma公司)，Mode1680型酶联免疫检测仪(美国Bio-Rad公司)

一、海胆黄多糖对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响

取6-8周龄ICR小鼠，颈椎脱臼处死，无菌制备脾淋巴细胞悬液，用加入小牛血清的RPMI1640无酚红培养基调整小鼠脾淋巴细胞浓度至2×10⁶/mL，于96孔板每孔加入100/μL细胞悬液，再加入不同浓度的海胆黄多糖的培养液，终浓度分别为6.25，12.5，25，50，100，200，400μg/mL，每孔最终体积为200μL，同时设定空白对照孔和阳性对照组(LPS50μg/mL)。每组均设4个复孔，置37℃、5％CO₂培养箱中培养36h后，每孔加入CCK-820μL，继续培养1h，酶标仪570nm处检测OD值。结果如图15所示，表明海胆黄多糖对脾淋巴细胞有较明显的增殖作用，并且在200-800μg/mL时呈剂量依赖性。

二、海胆黄多糖对小鼠的腹腔巨噬细胞RAW264.7的影响

1海胆黄多糖对正常RAW264.7细胞增殖活性的影响

于96孔板中每孔加入密度为1.0×10⁵/mL的RAW264.7细胞100μL，于6h贴壁后加入不同浓度的海胆黄多糖的培养液，终浓度分别为0，25，125，250，500，1000μg/mL，每孔最终体积为200μL，同时设定空白对照组、阳性对照组(LPS50μg/mL)。孵育24h后，每孔加浓度5mg/mL的MTT20μL，置37℃，5％CO₂培养箱培养4h后弃上清，每孔加DMSO150μL，充分振摇10min，在酶标仪570nm波长处测定吸光度。结果如图16所示，海胆黄多糖在高浓度时可显著得促进小鼠腹腔巨噬细胞的增殖。

2海胆黄多糖对正常RAW264.7细胞吞噬中性红功能的影响

于96孔板中每孔加入密度为1.0×10⁵/mL的RAW264.7细胞100μL，于12h贴壁后加入不同浓度的海胆黄多糖培养液，终浓度分别为0，25，50，100，200，400μg/mL，每孔最终体积为200μL，同时设定阳性对照(LPS50μg/mL)。每个浓度设4个复孔。置于37℃、5％CO₂培养箱中培养24h后，弃上清，PBS洗涤2次，每孔加100μL的0.1％中性红生理盐水，置37℃，5％CO₂培养箱培养1h后弃上清，每孔加入PBS液200μL洗涤3遍，每孔加细胞裂解液150μL，37℃裂解细胞3h后，在酶标仪550nm波长处测定吸光度。结果如图17所示，说明海胆黄多糖可以显著增强巨噬细胞吞噬中性红能力。

因此，从实施例2可以看出本发明中的海胆黄多糖是一种免疫增强剂，可以显著地增强免疫活性，并且通过不同免疫调节方式进行，为后续抗肿瘤实验打下良好的基础。

Claims (6)

1.一种具有α-1，4-葡聚糖主链的海胆黄多糖，其特征在于所述多糖的重复结构单元中含有1→4和1→3两种糖苷键，其中主链为1→4糖苷键，侧链由1→3糖苷键组成，糖残基为α构型，其相对分子量为6.78×10⁵Da，比旋度其为首次从烟台光棘球海胆中分离得到的一种结构新颖的葡聚糖。 

2.权利要求1所述的海胆黄多糖具有主链由α-1，4-糖苷键组成，侧链由α-1，3-糖苷键组成的重复单元结构，所述的重复结构单元结构如下所示。 

。

3.根据权利要求1所述的海胆黄多糖的制备方法，其特征在于按如下步骤实现： 

(1)将新鲜的海胆切开，小心剥离海胆黄，纱布过滤除去海胆黄中的水分，向海胆黄中加入等体积的丙酮进行脱脂处理，得海胆黄多糖丙酮粉；海胆黄丙酮粉经90℃热水反复提取后，分别使用木瓜蛋白酶和Sevage法除去提取液中的蛋白质，55℃减压蒸馏除去有机试剂并浓缩提取液； 

(2)向上述提取液中缓慢加入4倍体积预冷至4℃的无水乙醇，并在4℃下静置过夜沉淀多糖，5000rpm，10min离心收集沉淀，用无水乙醇洗涤沉淀3次，将沉淀重新溶解于热水后冷冻干燥，得到海胆黄粗多糖； 

(3)将上述粗多糖配成50mg/mL的水溶液，过0.45μm滤膜滤后经过DEAE-52纤维素离子交换柱分离，蒸馏水洗脱，流速0.5mL/min，每管5mL分部收集，苯酚-硫酸法逐管测定糖含量，绘制洗脱曲线，收集第8～17管，合并后冷冻干燥得到多糖CP； 

(4)取上述多糖CP30mg，溶于1mL(0.05mol/L)NaCl溶液中，0.22μm滤膜过滤后，经Sephacryl S-400柱层析分离，0.05mol/L的NaCl溶液洗脱，流速0.5mL/min，每管3mL分部收集，硫酸-苯酚法逐管检测糖含量，绘制洗脱曲线，收集第10～20管，透析除盐后，冷冻干燥，得海胆黄多糖。 

4.权利要求1所述海胆黄多糖的用途。 

5.权利要求4所述的用途，包括在制备免疫调节剂及抗肿瘤辅助药物中的应用。 

6.权利要求5所述，优先保护在制备免疫调节剂中的应用。 

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