CN104497162A - 具有保肝作用的海胆黄多糖及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有保肝作用的海胆黄多糖及其制备方法和应用。本发明通过对海胆黄多糖的提取分离工艺进行改进，在现有的制备方法上，采用性能更好的DEAE Sepharose Fast Flow填料，在DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱层析前进行超滤除杂，同时在Sephacryl-400凝胶柱层析后采用超滤替代现有的透析。本发明着重于海胆黄多糖在制备预防和/或治疗爆发性肝炎药物中的应用。经过药理实验研究表明，本发明提供的海胆黄多糖，能显著提高爆发性肝炎小鼠的存活率，显著降低爆发性肝炎小鼠血清AST、ALT及肝组织MDA含量，增强肝脏SOD、GSH-Px、CAT活力及GSH活性，显著降低促炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和NO水平，提高抗炎症因子IL-10水平，对肝脏损伤具有显著的保护作用，可望开发成新的保肝作用的药物或保健品。

Description

具有保肝作用的海胆黄多糖及其应用

技术领域

本发明涉及一种多糖，具体涉及一种从光棘球海胆(Strongylocentrotus nudus)中提取分离得到的具有保肝作用的海胆黄多糖及其制备预防或治疗爆发性肝炎药物或保健品中的应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

爆发性肝炎又叫急性坏死型肝炎，临床上亦称急性重型肝炎或急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)，是在慢性肝炎或肝硬化的基础上，机体对化学、物理、生物等因素的免疫应答而导致肝细胞的损害、坏死，其发病率占肝炎发病率的0.2-0.4％，临床死亡率高，尚缺乏特异性的治疗措施。急性肝炎是爆发性肝炎的主要原因是机体免疫应答异常，人体免疫系统功能的变化与爆发性肝炎的发生、发展有着密切的关系。因此寻找肝炎的免疫治疗方法已成为当前研究的热点。目前国内外学者多应用D-半乳糖糖胺(D-galactosamine，D-GalN)造成原发性肝损伤，结合腹腔内注射脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)模拟肠源性内毒素血症建立肝衰竭模型，其与HBV所致肝功能衰竭有较高的临床相关性，是目前比较公认的急性肝衰竭动物模型之一。因此，LPS/D-GalN诱导的急性肝衰竭模型被广泛用于研究临床急性肝衰竭的潜在机制，开发应对内毒素有效的治疗药物。

LPS/D-GalN诱导的急性肝衰竭模型的相关机制如下，D-GalN是肝细胞的磷酸尿嘧啶核苷(UTP)的干扰剂，进入体内后与磷酸尿苷结合形成磷酸尿苷-半乳糖胺，致使磷酸尿苷耗竭，从而限制核酸、糖蛋白、脂糖等物质的生物合成，限制了细胞器及酶的生成和补充，细胞器受损、膜损害、钙离子内流入细胞，造成肝细胞的弥漫性坏死和炎症。脂多糖是G-细菌重要的致病物质，属病原性相关分子模式(pathogen associated molecular pattem，PAMP)。LPS通过激活单核-巨噬细胞系统(mononuclear phagacytic system，MPS)，引起IL-1β，IL-6，TNF-α等大量炎症因子的释放，造成肝细胞凋亡及炎性细胞的侵润，最终导致全身过度炎症反应及脑、心、肾、肝等重要器官的衰竭。啮齿类动物多对LPS具有自然抗性，而D-GalN能使LPS的炎症效应放大约104以上，大大减弱这种自然抗性，现多用D-GalN联合小剂量LPS建立急性肝衰竭动物模型。

目前临床上常用的抗肝炎保肝药物分为三类，即抗病毒药物、保护肝细胞的药物和调节免疫功能的药物。这些药物中有些价格昂贵，有些具有较大的副作用，有的效果不显著，有重 复性差。因此，研发安全有效的预防或治疗急性肝衰竭药物成为当前药物研究的热点。

海胆是属于棘皮动物门海胆纲的一种低等海洋无脊椎动物，主要有紫海胆、棘冠海胆等品种。海胆黄是雌性海胆的生殖腺，在中医里被称为“云丹”。传统医学认为海胆黄具有治疗瘰疬痰核、积痰不化、胸胁胀痛等证。海胆黄中含有丰富的蛋白质、多糖、脂肪酸及各种微量元素，具有增强人体免疫力，防治心血管疾病的作用，具有极高的研究价值。

据马益华(Yihua Ma，Yingying Xing，et al.Extraction，preliminary characterization and immunostimulatory activity in vitro of a polysaccharide isolated from Strongylocentrotus nudus eggs[J].Carbohydrate Polymers，2014，111，576-583)等人报道，海胆黄多糖是从产于黄渤海的光棘球海胆(Strongylocentrotus nudus)中提取出来的一种多糖，对其理化性质进行了分析，利用化学分析和波谱技术对其结构进行鉴定，表明海胆黄多糖具有α-1，4-糖苷键主链和α-1，3-糖苷键侧链，是从海胆黄中分离到的一种结构新颖的葡聚糖。各国科学家早在七十年代初九对各类多糖进行研究，发现多糖对肿瘤、心血管疾病等都具有一定的疗效。1969年日本学者Chihara等首次从香菇子实体的热水浸提物中分离到一种具有明显的抗肿瘤活性的多糖β-葡聚糖，并在Nature上报到了他们的研究成果。1978年香菇多糖进入临床应用，作为免疫调节剂和肿瘤放化疗治疗的辅助药物，效果显著。目前，很多生物活性多糖，如云芝、茯苓、灵芝等多种真菌中提取的多糖及许多动植物多糖均具有广泛的免疫活性和抗肿瘤活性。大量研究表明，多糖还具有抗氧化、抗炎、抗病毒、保肝等活性。

本发明涉及的海胆黄多糖系从光棘球海胆中分离纯化得到均一多糖组分，高效液相结果表明海胆黄多糖纯度达99％。药效学研究结果表明，海胆黄多糖能显著提高爆发性肝炎小鼠的存活率，显著降低AST和ALT。本发明所述的海胆黄多糖基于抗炎和抗氧化的保肝药理学作用尚未记载和报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从海胆黄(Strongylocentrotus nudus)中提取分离的多糖。

本发明另一个目的在于提供海胆黄多糖的制备方法及该多糖在调节机体免疫功能药物和保肝药物中的应用，尤其是作为预防或治疗爆发性肝炎药物的应用。

目前文献公开的制备方法主要包括：光棘球海胆黄脱脂、热水浸提、木瓜蛋白酶-Sevage除蛋白、醇沉、Cellulose DE-52离子交换柱层析、Sephacryl-400凝胶柱层析、真空干燥，本发明在此技术上进行如下改进，采用性能更好的DEAE Sepharose Fast Flow填料替换现有的在Cellulose DE-52填料，在DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱层析前进行超滤除杂，同 时在Sephacryl-400凝胶柱层析后采用超滤替代现有的透析，在整个分离纯化过程中使用AKTA纯化设备。本发明的方法分离得到海胆黄多糖产率高，纯度高，制备成本低，适合规模化生产。

技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：

具有保肝作用的海胆黄多糖，是主链由α-1，4-糖苷键组成，侧链由α-1，3-糖苷键组成的重复单元结构，所述的重复结构单元结构如下：

本发明提供的具有保肝作用的海胆黄多糖的提取分离纯化方法，包括以下步骤：

(1)丙酮脱脂：取新鲜的海胆黄加等体积的无水丙酮脱脂，搅拌，静置，弃上层丙酮，减压干燥，制成海胆黄丙酮粉；

(2)热水浸提：将步骤(1)中的海胆黄丙酮粉置于10倍体积水中，经90℃热水浸提5h，浸提三次，收集提取液并浓缩至原提取液体积的1/5左右；

(3)木蛋白酶-Sevage法除蛋白：加入0.6％(w/v)的木瓜蛋白酶，60℃保温20h，90℃加热15min使酶失活，离心收集上清液；加入五分之倍体积的Sevage试剂(氯仿∶正丁醇＝5∶1)，剧烈搅拌15min，5000rpm离心10min或者静置3-5h，除至溶液中间层无蛋白层为止，将除蛋白后的溶液55℃减压浓缩至1/2体积。

(4)乙醇沉淀：将浓缩的多糖提取液预冷，向其中缓慢加入五倍体积的预冷无水乙醇，搅拌4℃过夜，离心收集沉淀，将沉淀用乙醇和丙酮洗涤数次，真空干燥得到海胆黄粗多糖；

(5)超滤除杂：将干燥的粗糖溶于水，将其制成50mg/ml的水溶液，离心取上清；选择截留分子量为100k的超滤膜，超滤粗多糖溶液，除去色素等杂质；

(6)DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱层析：将步骤(5)中的超滤液，经过平衡好的DEAE Sepharose Fast Flow纤维素离子交换柱，双蒸水进行洗脱，分部收集，苯酚硫酸法逐管测定糖含量，绘制洗脱曲线，合并相同组分，冷冻干燥；

(7)Sephacryl-400凝胶柱层析：将步骤(6)中的多糖冻干粉溶于0.05M NaCl溶液配成20mg/ml，过0.22um滤膜，过Sephacryl-400凝胶柱，用0.05M NaCl溶液进行洗脱，分部收集，苯酚-硫酸法逐管测定糖含量，合并相同的组分；

(8)超滤脱盐浓缩：选择截留分子量为100k的超滤膜对步骤(7)中收集的组分进一步超滤脱盐和浓缩；

(9)冷冻干燥：将步骤(8)中的超滤液冷冻干燥，得到海胆黄多糖，将其保存在-20℃。

本发明提供的具有保肝作用的海胆黄多糖在制备保肝药物或保健品中的应用。

本发明通过建立LPS/D-GalN诱导的急性肝衰竭动物模型，观察海胆黄多糖对急性肝衰竭的预防性治疗作用并探讨其作用机理。研究结果表明，海胆黄多糖对LPS/D-GalN诱导的急性肝衰具有预防性治疗作用。

本发明以ICR小鼠为动物实验模型，通过预防性给药，首先考察海胆黄多糖对LPS/D-GalN诱导的急性肝衰竭的预防性治疗作用。预防性治疗方案是在腹腔注射LPS/和D-GalN造模前，通过尾静脉注射给予小鼠海胆黄多糖，每天一次，总共给药一周，给药剂量分为低、中、高三个，即5mg/kg、10mg/kg和20mg/kg。阳性组药物为silibinin，此药极不溶于水，用0.5％的羧甲基纤维素钠配成悬浮液，通过灌胃给予小鼠silibinin，每天一次，共一周，给药剂量为100mg/kg。末次给药一个小时后，腹腔注射40ug/kg的LPS和800mg/kg的D-GalN，使小鼠产生急性免疫损伤，最终导致全身过度炎症反应及肝等重要器官的衰竭而死亡。造模后6小时处理小鼠，实验结果分析表明，较模型组，海胆黄多糖预防给药均能显著降低小鼠爆发性肝炎引起的ALT和AST的升高作用；与阳性组相比，海胆黄多糖预防给药均能显著降低ALT和AST。同时海胆黄多糖还可以显著提高爆发性肝炎小鼠的存活率，海胆黄多糖高剂量预防给药组小鼠存活率甚至达100％，而模型组的死亡率达100％，阳性组存活率只有10％左右，显示出海胆黄多糖对LPS/D-GalN诱导的急性肝衰竭肝功能具有明显的保护作用。此外，与模型组相比，海胆黄多糖预防给药组的MDA均有极显著降低，而抗氧化酶SOD、GSH-Px和CAT及抗氧化物GSH均显著提高，该研究结果表明海胆黄多糖具有降低脂质过氧化产物MDA水平，起到抗氧化损伤的作用。同时，ELISA和NO试剂盒检测造模后2小时小鼠血清中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、NO和抗炎因子IL-10的含量，海胆黄多糖预防给药组比模型组和阳性组有显著降低。髓过氧化物酶(MPO)检测试剂盒检测肝脏中MPO，与模型组和阳性组相比，海胆黄多糖预防给药组显著降低小鼠肝脏中髓过氧化物酶(MPO)活性，减轻中性白细胞对肝脏的侵润。这些结果说明海胆黄多糖对LPS/D-GalN诱导的急性肝衰竭引起的促炎症因子的升高有显著的抑制作用，对抗炎因子的有促进作用，发挥了抗炎作用。肝脏病理学研究结果表明：造模6小时后模型组各例肝脏肝细胞均见严重的肝细胞灶性坏死，肝细胞结构破坏，细胞核固缩或溶解，纹理模糊，残存肝细胞见脂肪变性，嗜酸性变等改变，肝窦扩张淤血，出血。而海胆黄多糖预防给药组均可以明显的减轻上述肝细胞病变，各例均无重度肝细胞灶性坏死，只有轻度的肝细胞坏死，且坏死面积及程度均明显较模型组轻。这些实验结果充分地说明了还单行多糖能有效地预防性治疗LPS/D-GalN诱导的急性肝衰竭。

以本发明提供的具有保肝作用的海胆黄多糖，将海胆黄多糖和常规药物赋形剂或辅剂制备 成注射剂、粉针剂等剂型。

本发明提供的海胆黄多糖制成粉针剂、注射剂时加入赋形剂或辅剂按药学常规方法制备得到。

本发明提供的海胆黄多糖或含有它的药物组合物的给药途径可为注射给药。注射包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射等。

本发明提供的具有保肝作用的海胆黄多糖和现有的技术相比具有以下优点：

药理实验研究表明，本发明提供的海胆黄多糖，可显著提高LPS/D-GalN诱导的爆发性肝炎小鼠存活率，显著降低小鼠血清中AST、ALT活性及肝组织MDA含量，增强肝脏SOD、CAT、GSH-Px和GSH活性，显著性降低小鼠血清中促炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和NO水平，同时显著提高小鼠血清中抗炎因子IL-10，此外降低小鼠肝脏中髓过氧化物酶(MPO)活性，具有很好的保肝功效。

附图说明

图1是海胆黄多糖的重复单元。

图2是海胆黄多糖的DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱层析洗脱曲线。

图3是海胆黄多糖的Sephacryl-400凝胶柱层析洗脱曲线。

图4是海胆黄多糖分离提取流程图。

图5是海胆黄多糖高效液相(HPLC)色谱图。

图6是海胆黄多糖对LPS/D-GalN诱导的急性肝炎模型小鼠存活率的影响。

图7是LPS/D-GalN诱导的爆发性肝炎小鼠肝组织病理形态和肝细胞超微结构的变化

A：造模后6小时对照组小鼠肝组织HE染色图(×200)；

B：造模后6小时模型组小鼠肝组织HE染色图(×200)；

C：造模后6小时海胆黄多糖预防低剂量(5mg/kg)组小鼠肝组织HE染色图(×200)；

D：造模后6小时海胆黄多糖预防中剂量(10mg/kg)组小鼠肝组织HE染色图(×200)；

E：造模后6小时海胆黄多糖预防高剂量(20mg/kg)组小鼠肝组织HE染色图(×200)；

F：造模后6小时silibinin预防组小鼠肝组织HE染色图(×200)；

具体实施方式

本发明的目的在于研究一种从海胆黄中提取并分离到的均一多糖，其保肝活性尚未报道。 下面结合具体实施例，进一步详尽阐述海胆黄多糖的制备及保肝功效，这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求书所限定的范围。

一、制备方法及其分子量的测定

实施例1：海胆黄多糖的制备方法

将新鲜的海胆黄切开，小心剥离海胆黄，过滤除去海胆黄中的水分。向收集到的海胆黄中加入的等体积的丙酮，搅拌使之与丙酮充分接触，静置1h，弃去上层丙酮，反复数次至丙酮层基本无色为止，最后将丙酮减压挥发，得到海胆黄丙酮粉。取2.5kg海胆黄丙酮粉置于50L玻璃反应釜中，加25L蒸馏水，90℃热水浸提小时，反复提取3次，合并提取液共计75L，50℃减压浓缩至15L。

向浓缩液中加入木瓜蛋白酶90g，60℃水浴20小时，90℃加热15min使酶变形失活，离心收集上清液。酶解后的提取液反复用Sevage试剂除蛋白，加入3L Sevage试剂(氯仿∶水饱和正丁醇＝5∶1)，剧烈搅拌15min，4000rpm离心15min，取上清，重复上述操作数次直至氯仿和水之间的界面无沉淀为止。55℃减压除去氯仿和正丁醇，同时将溶液浓缩至7L。

将浓缩液和无水乙醇预冷至4℃，向浓缩液中缓慢加入35L无水乙醇，边加边搅拌，并在4℃下搅拌过夜沉淀多糖，5000rpm，10min离心收集沉淀，用无水乙醇和丙酮分别洗涤沉淀3-5次，将粗多糖真空干燥，得到海胆黄多糖325g。

取粗多糖25g配成50mg/ml的水溶液，5000rpm离心10min，取上清液。选择截留分子量为100k的超滤膜，超滤粗上清液，除去小分子杂质。使用AKTA purifier 100UPC快速纯化液相色谱系统，过DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱(3.6cm×30cm)，上样体积为50ml，蒸馏水洗脱，流速为1.0ml/min，每管5ml分部收集，苯酚-硫酸法逐管检测糖含量，绘制洗脱曲线(附图2)，收集10-19管，合并后冷冻干燥得到多糖DP1.525g，得率为61％。

取多糖DP100mg，溶于2ml(0.05mol/L)NaCI溶液中，经过0.22um滤膜过滤后，经Sephacryl-400凝胶柱层析(1.6cm×80cm)分离，AKTA纯化仪流速设置为0.5ml/min，用0.05mol/L的NaCI溶液洗脱，每管3ml分部收集，苯酚-硫酸法逐管检测糖含量，绘制洗脱曲线(附图3)，收集合并11-17管，选择截留分子量为100k的超滤膜对收集液进行超滤脱盐和进一步除去小分子杂质，冷冻干燥，得到海胆黄多糖42mg，得率为42％。海胆黄制备过程流程图如图4所示。

实施例2：海胆黄多糖分子量的测定

Waters 600高效液相色谱系统，采用Shodex KS-805串联KS-802色谱柱，2414示差折光 检测器，流动相为0.1M NaNO3，样品浓度为5.0mg/ml，进样量20ul，流速为1.0ml/min，柱温30℃，记录样品色谱曲线。

结果显示(附图5)，海胆黄多糖的出峰时间为13.125min，纯度达到99％以上，并按照标准曲线推算出平均相对分子量为6.78×105Da。

二、药理学实验研究

1.药物和试剂 

AST，ALT，MDA，SOD，CAT，GSH-Px，GSH，NO和MPO试剂盒购于南京建成生物工程研究所；BCA蛋白浓度测定试剂盒购于碧云天生物技术公司；TNF-α，IL-1β，IL-6和IL-10 ELISA试剂盒购于深圳市达科为生物工程有限公司；脂多糖(LPS，Sigma公司)，使用前用生理盐水溶解稀释成10ug/kg；氨基半乳糖苷(D-GalN，Sigma公司)，临用前用生理盐水溶解配成100mg/ml；silibinin购于Sigma公司。

2.实验动物

清洁级雄性ICR小鼠，体重18-20g，由扬州大学动物医学比较中心提供，合格证号SCXK(浙)2014-0001。

3.实验仪器

酶联免疫仪(美国Bio-Rad公司)；BT125型电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；KQ-250E型超声波清洗器(昆明禾创超声仪器有限公司)；AnkeGL-16GII型离心机(上海安亭科学仪器厂)。

4.受试药物及处理方法

取实施例1制备得到的海胆黄多糖，加生理盐水配制成4mg/ml；阳性药物为silibinin，给药前0.5％羧甲基纤维素钠溶液配制成10mg/ml。

实施例3：海胆黄多糖预防性治疗对LPS/D-GalN诱导的爆发性肝炎肝功能的保护作用

方法：雄性ICR小鼠，体重18-20g，适应性喂养一周后，按体重随机分为12组，造模后6小时处理的一批：溶剂对照组(Control，9只/组)；LPS/D-GalN模型组(Model，9只/组)；海胆黄多糖低、中、高预防给药组(5，10，20mg/kg，9只/组)；阳性对照组(silibinin，100mg/kg，10只/组)。造模后24小时处理的一批：溶剂对照组(Control，9只/组)；LPS/D-GalN模型组(Model，9只/组)；海胆黄多糖预防组给药组(5，10，20mg/kg，9只/组)；阳性对照组(silibinin，100mg/kg，10只/组)。预防给药组尾静脉注射海胆黄多糖，每天一次，共一周；阳性对照组采用连续灌胃给药一周，其余各组给予同体积的注射用生理盐水一周。末次给药后一个小时后，除对照组腹腔注射生理盐水外，其余各组小鼠均腹腔注射40ug/kg的LPS和800mg/kg的D-GalN。造模6小时后，眼眶后静脉丛采血，室温静置30分钟后，在4℃下4000rpm离 心20min，取血清，用南京建成试剂盒分析血清中ALT和AST的含量。

结果：实验结果如表1所示，小鼠经腹腔注射建模6小时后，模型组小鼠血清AST、ALT均明显升高(P＜0.001)，分别是正常对照组的13倍和11倍，而海胆黄多糖预防给药组(5，10，20mg/kg)，能显著降低LPS/D-GalN诱导的爆发性肝炎肝损伤引起的AST和ALT的升高，5mg/kg组血清中AST和ALT分别是模型组的0.3倍和0.69倍；10mg/kg组的分别是模型组的0.23倍和0.326倍；20mg/kg组的分别是模型组的0.21倍和0.27倍；silibinin组的分别是模型组的0.78倍和0.84倍。由此可见，海胆黄多糖具有明显的抗急性免疫性肝炎肝损伤和保护肝功能的作用。此外，海胆黄多糖的保肝作用明显强于silibinin。

表1 海胆黄多糖预防治疗对LPS/D-GalN诱导的爆发性肝炎肝损伤小鼠血清AST、ALT的影响

(Values are expressed as mean±SD for 9 mice.**P＜0.01，***P＜0.001，compared to Model group.) 

造模后24小时内，观察并记录各组小鼠的状态，绘制存活曲线。

结果：实验结果如附图6所示，模型组小鼠在12h内死亡率达到100％，存活率为0％，而5mg/kg组、10mg/kg组和20mg/kg组在24小时内的存活率分别为77.8％、88.9％和100％，silibinin组的存活率为11.1％。由此可见，海胆黄多糖能显著提高LPS/D-GalN诱导的急性肝炎模型小鼠的存活率，海胆黄多糖的药效远强于silibinin。

实施例4.：海胆黄多糖预防性治疗对LPS/D-GalN诱导的爆发性肝炎炎症损伤的保护作用

方法：雄性ICR小鼠，体重18-20g，适应性喂养一周后，按体重随机分为6组，分别为对照组(control，10只/组)；模型组(model，10只/组)；海胆黄多糖低、中、高预防给药组(5，10，和20mg/kg，10只/组)；阳性对照组(silibinin，100mg/kg，10只/组)。预防给药组尾静脉注射海胆黄多糖，每天一次，共一周；阳性对照组采用连续灌胃给药一周，其余各组给予同体积的注射用生理盐水一周。末次给药后一个小时后，除对照组腹腔注射生理盐水 外，其余各组小鼠均腹腔注射40ug/kg的LPS和800mg/kg的D-GalN。造模2小时后，眼眶后静脉丛采血，室温静置30分钟后，在4℃下4000rpm离心20min，取血清，用ELISA试剂盒分析测定血清中的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和NO的含量。取血后处死小鼠，随即取部分肝脏，用生理盐水制备成10％的肝匀浆，按照试剂盒说明书测定肝脏中髓过氧化物酶(MPO)活力。

结果：实验结果如表2和表3所示，小鼠经腹腔注射造模后2小时，模型组小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和NO均明显升高，分别是正常对照组的22.5倍、19倍、54.2倍和2.2倍；模型组小鼠血清中IL-10明显降低，降至85.5pg/ml；模型组肝脏组织中髓过氧化物酶(MPO)活力显著提高，表明有大量中性白细胞侵润肝组织。本发明的海胆黄多糖、silibinin组与模型组比较，均不同程度地降低爆发性肝炎引起的TNF-α、IL-1β、IL-6、NO和MPO水平，分别是模型组的0.13倍、0.49倍、0.19倍、0.33倍和0.447倍，显著提高抗炎细胞因子IL-10水平，是模型组的2.3倍和对照组的1.43倍。由此可见，海胆黄多糖具有明显的降低爆发性肝炎引起的促炎症因子的升高，提高抗炎症因子IL-10的水平，减少中性白细胞对肝脏浸润，说明海胆黄多糖具有一定的抗炎作用。

表2 海胆黄多糖预防性治疗对LPS/D-GalN诱导的爆发性肝炎小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的影响

(Values are expressed as mean±SD for 10mice.*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，compared to Model group.) 

表3 海胆黄多糖预防性治疗对LPS/D-GalN诱导的爆发性肝炎小鼠血清中IL-10、NO和肝脏中MPO的影响

(Values are expressed as mean±SD for 10mice.*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，compared to Model group.) 

实施例5：海胆黄多糖预防性治疗对LPS/D-GalN诱导的爆发性肝炎氧化损伤的保护作用

方法：雄性ICR小鼠，体重18-20g，适应性喂养一周后，按体重随机分为6组，分别为对照组(control，10只/组)；模型组(model，10只/组)；海胆黄多糖低、中、高预防给药组(5，10和20mg/kg，10只/组)；阳性对照组(silibinin，100mg/kg，10只/组)。预防给药组尾静脉注射海胆黄多糖，每天一次，共一周；阳性对照组采用连续灌胃给药一周，其余各组给予同体积的注射用生理盐水一周。末次给药后一个小时后，除对照组腹腔注射生理盐水外，其余各组小鼠均腹腔注射40ug/kg的LPS和800mg/kg的D-GalN。造模6小时后，处理小鼠，所有的小鼠均相同部位的肝组织，于冰浴上加生理盐水制成10％的肝匀浆液，4℃8000rpm离心15min后取上清，按照南京建成试剂盒说明，测定肝组织中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)和脂质过氧化合物MDA水平。

结果：如表4和表5所示，造模后6小时，模型组小鼠的脂质过氧化物MDA均显著升高，是对照组的1.99倍；模型组小鼠肝脏中抗氧化酶SOD、GSH-Px和CAT及抗氧化物GSH均明显降低，分别是对照组的0.77倍、0.64倍、0.56倍和0.31倍。本发明的海胆黄多糖、silibinin组与模型组比较，均不同程度地降低小鼠肝脏脂质过氧化物MDA的水平，增强抗氧化酶SOD、GSH-Px和CAT的活性及抗氧化物GSH的活力。研究结果表明海胆黄多糖具有抗氧化损伤的作用，起到保护肝的作用。

表4.海胆黄多糖预防性治疗对LPS/D-GalN诱导的爆发性肝炎小鼠肝脏MDA和GSH的影响

(Values are expressed as mean±SD for 10mice.*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，compared to Model group.) 

表5.海胆黄多糖预防性治疗对LPS/D-GalN诱导的爆发性肝炎小鼠肝脏SOD、GSH-Px和CAT的影响

(Values are expressed as mean±SD for 10mice.*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，compared to Model group.) 

实施例6：海胆黄多糖预防性治疗对LPS/D-GalN诱导的爆发性肝炎病理学改变的保护作用

方法：雄性ICR小鼠，体重18-20g，适应性喂养一周后，按体重随机分为6组，分别为对照组(control，5只/组)；模型组(model，5只/组)；海胆黄多糖低、中、高预防给药组(5，10和20mg/kg，5只/组)；阳性对照组(silibinin，100mg/kg，5只/组)。预防给药组尾静脉注射海胆黄多糖，每天一次，共一周；阳性对照组采用连续灌胃给药一周，其余各组给予同体积的注射用生理盐水一周。末次给药后一个小时后，除对照组腹腔注射生理盐水外，其余各组小鼠均腹腔注射40ug/kg的LPS和800mg/kg的D-GalN。造模6小时后，处理小鼠，所有的小鼠均相同部位的肝组织，以10％的中性福尔马林液固定，常规取材，脱水，石蜡包埋。切片经HE染色，光学显微镜镜检查。所有形态改变根据轻重分别评为1-4分。评分标准为：1分：个别肝细胞散在坏死，肝窦淤血，枯否氏细胞略增生；2分：少量肝细胞散在坏死，肝窦淤血，枯否氏细胞增生；3分：肝细胞索不完整，肝细胞中度坏死，出血；4分：肝脏组织结构紊乱，肝细胞重度坏死，出血。

结果：病理评分如表6所示，肝脏病理学研究结果表明：造模后6小时，模型组小鼠肝脏肝脏组织结构紊乱，肝细胞重度坏死，残存肝细胞见脂肪变性，嗜酸性变等改变，肝窦扩张淤血，出血。而海胆黄多糖预防给药高、中、低剂量组，较模型组和silibinin组肝脏病变程度明显减轻，肝细胞坏死程度明显减轻，肝窦淤血，枯否氏细胞增生。这些实验结果充分说明了海胆黄多糖能有效地预防性治疗LPS/D-GalN诱导的爆发性肝炎。HE染色图见图7所示。

表6.海胆黄多糖预防性治疗对LPS/D-GalN诱导的爆发性肝炎小鼠肝脏病理学改变的影响

(Values are expressed as mean±SD for 5mice.**P＜0.01，***P＜0.001，compared to Model group.) 

实施例7：海胆黄多糖预防性治疗对LPS/D-GalN诱导的爆发性肝炎小鼠脏器指数的改善作用

方法：雄性ICR小鼠，体重18-20g，适应性喂养一周后，按体重随机分为6组，分别为对照组(control，10只/组)；模型组(model，10只/组)；海胆黄多糖低、中、高预防给药组(5，10和20mg/kg，10只/组)；阳性对照组(silibinin，100mg/kg，10只/组)。预防给药组尾静脉注射海胆黄多糖，每天一次，共一周；阳性对照组采用连续灌胃给药一周，其余各组给予同体积的注射用生理盐水一周。末次给药后一个小时后，除对照组腹腔注射生理盐水外，其余各组小鼠均腹腔注射40ug/kg的LPS和800mg/kg的D-GalN。造模6小时后，处理小鼠，处死前称小鼠体重并记录，处死后取肝脏、脾脏和胸腺称重并记录，计算肝指数、脾指数和胸腺指数。公式如下：

肝指数＝小鼠的肝重(g)/小鼠的体重(100g)

脾指数＝小鼠的脾重(mg)/小鼠的体重(g)

胸腺指数＝小鼠的胸腺中(mg)/小鼠的体重(g)

结果：实验结果如表7所示，造模后6小时，与对照组相比，模型组小鼠的肝脏指数明显升高，脾指数和胸腺指数明显降低，海胆黄多糖预防组与模型组和阳性组相比，对肝脏指 数有明显的改善，脾指数和胸腺指数显著升高。由此可见，免疫调节是海胆黄多糖抗LPS/D-GalN诱导的爆发性肝炎的一种重要作用方式。此外，海胆黄多糖对LPS/D-GalN诱导的爆发性肝炎引起的肝脏重量异常具有较好的改善作用。

表7.海胆黄多糖预防性治疗对LPS/D-GalN诱导的爆发性肝炎小鼠脏器指数的影响

(Values are expressed as mean±SD for 10mice.*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，compared to Model group.)。

Claims (5)

1.本发明提供了一种海胆黄多糖的制备方法和它的保肝作用；它能抗炎和抗氧化，抑制肝细胞凋亡和坏死，能保护肝细胞和肝干细胞，增强肝细胞抵抗损害的能力和保护肝功能等作用。

2.根据权利要求1所述的海胆黄多糖的制备方法，其特征在于按如下步骤实现：

(1)原料预处理：将光棘球海胆切开，小心剥离海胆黄，纱布过滤除去水分，向海胆黄中加入等体积的丙酮进行脱脂处理，得到海胆黄丙酮粉；

(2)热水浸提：海胆黄丙酮粉经过90℃热水浸提5小时，浸提三次，减压浓缩到五分之一的体积；

(3)脱蛋白：向步骤(2)中的浓缩液中加入0.6％的木瓜蛋白酶，60℃酶解20小时，90℃加热15min；用Sevage法除去提取液中的蛋白质，50℃减压蒸馏除去有机试剂并浓缩提取液；

(4)醇沉：向步骤(3)中的去蛋白液中缓慢加入5倍体积预冷至4℃的无水乙醇，并在4℃下静置过夜沉淀多糖，用无水乙醇洗涤沉淀3次，最后再用丙酮洗涤1次，真空常温干燥，得到海胆黄粗多糖；

(5)超滤除杂：将步骤(4)中的粗多糖溶于水，将其制成50mg/ml的水溶液，离心取上清；选择截留分子量为100k的超滤膜，超滤粗多糖溶液，除去色素等杂质；

(6)DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱分级：将步骤(5)中的超滤液，经过平衡好的DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱，蒸馏水洗脱，分部收集，苯酚-硫酸法逐管测定糖的含量，绘制洗脱曲线，合并相同组分，冷冻干燥得到多糖CP；

(7)Sephacryl S-400凝胶柱分级：将步骤(6)中的多糖冻干粉溶于0.05mol/L NaCl溶液配成20mg/ml，过0.22um滤膜，经过Sephacryl S-400柱层析分离，用0.05mol/L的NaCl溶液洗脱，分部收集，硫酸-苯酚逐管检测糖含量，绘制洗脱曲线，合并相同组分；

(8)超滤脱盐浓缩：选择截留分子量为100k的超滤膜对步骤(7)中收集的组分进一步超滤脱盐和浓缩；

(9)冷冻干燥：将步骤(8)中的超滤液冷冻干燥，得到海胆黄多糖。

3.权利要求2所述的海胆黄多糖的制备方法，其特征在于：所述海胆为光棘球海胆(大连紫海胆)，在DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱前采用超滤除杂，Sephacryl S-400凝胶柱后采用超滤脱盐替代现有的透析，该制备得到的海胆黄多糖分子量为6.78×10⁵Da。

4.权利要求1所述的具有保肝作用的海胆黄多糖在制备保肝药物制剂或保健品中的应用，尤其是在预防或治疗爆发性肝炎药物或保健品中的应用。

5.根据权利要求4所述的具有保肝作用的海胆黄多糖，其特征在于，将海胆黄多糖和药学上可接受的载体制备成注射剂和粉针剂。