KR100278928B1 - 펠리누스린테우스로부터분리한다당류물질의신규한용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 펠리누스속의 균주, 특히 펠리누스 린테우스 유(Phellinus linteusYoo KCTC 0399BP)로부터 분리한 다당류 물질의 면역 항암치료제로서의 용도에 관한 것으로, 본 발명은 펠리누스 린테우스 유 균주로부터 분리한 다당류 물질이 생체내 면역기능을 매개로 하여 암전이를 억제하므로 면역관련 질환의 예방, 치료 및 기초기전연구를 위한 약물로 사용할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

Description

펠리누스 린테우스로부터 분리한 다당류물질의 신규한 용도 {A novel use of polysaccharide substance isolated from phellinus linteus}
본 발명은 펠리누스 린테우스로 부터 분리한 다당류물질의 면역 항암치료제로서의 신규한 용도에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 펠리누스 린테우스로부터 다당류 물질을 분리하고 암을 비롯한 면역관련 질환의 예방, 치료 및 기초 기전연구를 위한 약물로서 이 다당류 물질을 제공하는 것에 관한 것이다.
암을 치료하기 위한 방법으로는 화학요법(chemotherapy), 방사선요법 (radiotherapy), 수술요법(surgery) 등이 사용되고 있으나 이들 치료법들은 효과적으로 고형암 등을 제거할 수 있지만 암을 완전히 치료할 수 없으며, 특히 암의 전이에 대해서는 치료효과가 낮다. 또한 아드리아마이신 등과 같은 항암제의 처리에 의한 화학요법 및 방사선요법은 심한 부작용을 유발한다. 부작용을 감소시키기 위하여 항암제의 양을 감소시켜서 암을 치료하기도 하나 이럴 경우 치료 효과가 낮아지는 단점이 있다. 더 큰 문제점으로는 전술한 바와 같이 항암치료후 암전이를 억제하지 못한다는 것이다. 따라서 기존의 화학요법에 의한 항암치료는 암세포의 성장을 억제하는 효과가 있으나 암을 완치시키지는 못했다. 최근 면역요법(immunotherapy)을 화학요법과 함께 사용하여 항암효과를 높이고 부작용을 감소시키는 방법이 사용되고 있다. 즉 면역증강제와 아드리아마이신 등의 항암제를 병용(immunochemotherapy)하여 부작용은 줄이고 항암효과는 높이고 있다. 면역요법에 사용되는 물질로는 인터루킨-2와 같은 사이토카인이 있다. 인터루킨-2는 면역요법제로서 치료효과가 우수하며 특히 암전이에 뛰어난 치료효과를 보이고 있다. 그러나 인체에 응용하여 암치료를 할 경우에는 높은 농도로 사용해야 하고 이때 심한 부작용을 유발하는 단점이 있다. 최근 사이토카인이 아닌 면역증강물질로서 레티난, 오케이-432 등이 개발되고 있으며 이들 물질은 부작용 없이 항암작용을 나타내고 있다.
담자균류의 일종인 펠리누스 린테우스는 한방에서는 상황으로 불리우며, 각종 질환, 특히 종양에 대한 치료효과가 커서 민간에서는 매우 귀중한 약재로 이용되고 있다. 본 발명자들은 펠리누스 린테우스로부터 분리한 다당류의 면역활성을 연구하던 중 펠리누스 린테우스가 항암활성이 있음을 알아냈다.
따라서, 본 발명의 목적은 펠리누스 린테우스로부터 항암활성이 있는 다당류물질을 분리하여 제공함에 있다.
본 발명의 다른 목적은 펠리누스 린테우스로부터 분리한 다당류 물질을 암을 비롯한 면역관련질환의 예방, 치료 및 기초기전연구를 위한 약물로서의 새로운 용도로 제공함에 있다.
본 발명의 상기 목적은 펠리누스 린테우스(Phellinus linteus) 균주를 배양하여 이 균주로부터 다당류를 포함하는 물질을 추출 분리하여 정제한 후, 다당류 물질의 구성 단당류와 구조적 특징을 조사하였다. 피부암세포가 이식된 마우스를 상기 다당류 물질로 처리하여 항암활성을 조사하고 같은 방법으로 상기 다당류 물질과 화학약제를 병용하여 항암활성을 조사한 후 인체에 대한 항암효과를 조사하였다. 이어서 피부암세포를 꼬리정맥에 이식한 후 화학약제와 상기 다당류 물질로 처리하여 암전이에 미치는 이들의 영향을 조사하고 화학약제와 상기 다당류 물질이 나타내는 항암효과의 서로 다른 기전을 조사하였다.
도 1은 펠리누스 린테우스(Phellinus linteus) 균주 배양 특성의 경시적 변화를 나타낸 그래프이다.
도 2은 펠리누스 린테우스 균주의 배양, 추출 및 정제의 과정을 나타낸 플로우 챠트이다.
도 3는 펠리누스 린테우스로부터 추출, 분리 및 정제한 다당류의 구성 단당류를 가스크로마토그라피로 분석한 결과를 나타낸다.
도 4은 펠리누스 린테우스로부터 추출, 분리 및 정제한 다당류를 HW65F 겔크로마토그라피 결과를 나타낸 용출도이다.
도 5는 펠리누스 린테우스로부터 추출, 분리 및 정제한 다당류를 탄소 핵자기 공명 스펙트럼으로 분석한 결과를 나타낸다.
도 6는 마우스 유래의 암세포에 대한 다당류의 항암활성을 다당류의 투여방법에 따라 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 7a는 다당류와 0.1mg/kg의 아드리아마이신 처리에 의한 마우스 유래의 암세포의 항암활성을 나타낸 그래프이다.
도 7b는 다당류와 0.3mg/kg의 아드리아마이신 처리에 의한 마우스 유래의 암세포의 항암활성을 나타낸 그래프이다.
도 8a는 다당류와 아드리아마이신 처리에 의한 인체 유래의 암세포의 크기 변화를 나타낸 그래프이다.
도 8b는 다당류와 아드리아마이신 처리에 의한 인체 유래의 암세포의 최종무게를 나타낸 그래프이다.
도 9a는 아드리아마이신 처리에 의한 암전이 억제효과를 나타낸 그래프이다.
도 9b는 아드리아마이신과 다당류의 병용처리에 의한 암전이 억제효과를 나타낸 그래프이다.
도 10는 아드리아마이신과 다당류로 암세포를 처리한 후 세포독성을 측정하여 나타낸 그래프이다.
본 발명은 펠리누스 린테우스 균주 유(Phellinus linteus YooKCTC 0399BP)를 배양하는 단계; 배양 균사체를 열수추출 및 에탄올추출하고 투석하여 다당류 물질을 얻은 단계; DEAE-셀루로스와 겔 여과 크로마토크래피를 순차적으로 행하여 활성분획을 얻는 단계; 다당류 물질을 가스크로마토그라피하여 구성하는 단당류 물질을 분석하는 단계; 겔 칼럼크로마토그라피 및 탄소 핵자기 공명 스펙트럼으로 다당류 물질의 구조를 분석하는 단계; 마우스 유래 피부암세포를 마우스에 이식하고 다당류 물질을 투여한 후 마우스의 생존율을 조사하고 또 아드리아마이신 등의 항암제를 다당류 물질과 함께 투여한 후 생존율을 조사하여 각각의 항암활성을 알아보는 단계; 마우스에서 유래한 피부암세포를 마우스에 이식하고 아드리아마이신 등의 항암제와 다당류 물질을 함께 투여하여 항암활성을 규명하는 단계; 인체 유래 암세포를 누드마우스에 이식하고 다당류 물질 및 아드리아마이신을 투여하여 항암효과를 조사하는 단계; 마우스 유래 피부암 세포를 마우스의 꼬리 정맥에 이식하고 다당류 물질을 투여하여 암전이 억제 효과를 조사하는 단계 및; 마우스 피부암 세포 및 인체 폐암세포를 다당류 물질과 아드리아마이신으로 처리한 후 설포로다민 비(Sulforhodamin B) 측정법으로 살아있는 세포를 측정하여 암세포에 대한 세포독성을 측정하는 단계들로 구성된다.
이하, 본 발명의 구체적인 방법은 실시예를 들어 상세히 설명하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정하는 것은 아니다.
실시예 1: 펠리누스 린테우스 균주의 배양
한국과학기술연구원 생명공학연구소 유전자원센터 미생물 국제기탁기관에 기탁된 펠리누스 린테우스 유(Phellinus linteus Yoo, KCTC 0399BP) 균주를 배지 1ℓ당 포도당 50g, 펩톤 10g, 효모추출액 10g 및 KH2PO40.8g, MgSO4·7H2O 0.5g, CaCl20.3g을 혼합한 무기염류용액 1㎖를 함유하고 pH가 6.0인 멸균한 액체배지에서 배양하였다. 이때 액체배지는 5ℓ 발효조를 사용하여 3.5ℓ로 만들어 사용하였고 배양은 온도 28℃, 통기량 2vvm, 회전수 160rpm 조건에서 11일 동안 실시하였다. 실험결과, 도1에 나타낸바와 같이 균사체 수율은 5일 후 가장 높은 ℓ당 30g이였다.
실시예 2: 다당류 추출
실시예 1에서 얻어진 배양 균사체 280g을 열수추출한 후 농축하여 3g의 열수추출액을 얻었다. 이 추출액에 에탄올 농도가 80%가 되도록 에탄올을 가하고 4℃에서 24시간 동안 방치한 후 원심분리하여 상등액과 침전물을 얻었다. 침전물은 물에 녹인 후 투석막(cellulose tubing, 일본 삼광순약제품)을 사용하여 10℃ 저온에서 72시간 동안 12시간 간격으로 투석액을 교환하면서 투석하였다. 투석막속의 내액을 동결건조하여 2.45g의 조추출물을 얻었다.
실시예 3: 순수한 활성분획으로 정제
실시예 2에서 얻은 조추출물을 5mM 소듐 포스페이트 완충액(pH 7.2)에 용해한 후 DEAE-셀루로스 칼럼에 적정하고 동일 완충액으로 세척한 다음 동일 완충액에 0 내지 1몰 농도의 소듐 크로라이드를 조제하여 gradient로 분당 5ml의 유속으로 용출시켜 각 시험관에 15ml씩 분취하였다. 페놀-황산정량법에 의해 당 함량을 결정하고, 브래드포드 방법에 의해 단백질 함량을 결정하였다. 이때 얻어진 당 함량 조추출물 분획은 Toyopearl HW 65F 겔 여과 크로마토그라피를 행하여 분자량이 균일하고 성질이 동일한 순수한 활성분획을 얻었다. 이때 용출은 물로 실시하였다. 상기 실시예 1, 실시예 2 및 실시예 3의 과정은 도2에 나타냈다.
실시예 4: 다당류 물질의 구성당 및 구성비율 조사
실시예 3에서 얻어진 각 추출 분획 다당류 2mg씩을 2N TFA로 가수분해하고 소듐 브라이드(NaBH4)로 환원시킨 다음 무수초산으로 아세칠화시켜 애디톨 아세테이트(aditol acetate)로 만들어 가스크로마토그라피(gas chromatography)를 실시하였다. 이때 조건은 칼럼 온도를 초기에 200℃로 2분간 유지한 후 1분 간격으로 4℃씩 온도를 증가시켜 최종온도가 250℃로 2분간 유지되게 하여 측정하였으며 디텍터(ditector)의 온도는 260℃, 주입부(injector)의 온도는 250℃로 유지하였다. 사용된 기기는 휴렛팩커드(HP 5890 GC)를 사용하였으며 칼럼은 휴즈드 실리카 캐피러리 칼럼 에스피 2330(fused silica capillary column sp-2330, 0.32mm X 30m)를 사용하였다. 탄수화물은 페놀-설퓨릭 에시드 방법으로 측정하였고 단백질의 경우는 폴린-페놀 방법으로 측정하였다. 실험결과는 도3에 표시된 바와 같이 만노스, 갈락토오스, 글루코스가 차례로 확인되었고 이 내용을 표1에 정리하였다.
다당류 물질의 구성당 및 구성비율
추출분획다당류 탄수화물(%) 단백질(%) 구 성 당(몰비 %)
글루코스 만노스 갈락토오스
PL-2 82.7 17.3 78.6 18.0 3.4
실시예 5: 다당류의 구조 조사
상기 실시예 4의 추출분획 다당류인 PL-2의 순수도를 HW65F 겔 칼럼크로마토그라피로 확인하였다. 실험결과, 도4에 나타낸 바와 같이 단일 대칭 피크를 나타내므로 PL-2가 순수함을 알 수 있다. 탄소 핵자기 공명 스펙트럼 분석결과, 도5에 나타낸 바와 같이 알파(1→4) 및 베타(1→6) 타입의 글루코오스 단당류의 긴 사슬 결합양식에 만노스와 갈락토오스가 가지형태로 부착되어진 갈락토만노글루칸 (Galactomannoglucan)임이 확인되었다.
실시예 6: 투여방법에 따른 다당류 물질의 암세포에 대한 항암활성 조사
다당류의 항암활성은 마우스에서 유래한 암세포인 B16F10 피부암 세포를 이용하여 측정했다. B16F10 피부암세포는 10%의 혈청을 함유한 RPMI1640 배지에서 배양했으며 1주에 2번 정도 계대배양하였다. B16F10 피부암세포는 BDF1 마우스 당 100,000 세포를 복강으로 이식했으며 30일 동안 마우스의 생존율을 조사하였다. 이어서 다당류를 암세포 이식 일주일 전부터 암세포를 이식한 후 12일 후까지 지속적으로 복강 투여하는 전처리법을 행한 후 생존율을 조사하고 두 번째로 암세포를 이식한 후 12일 동안 다당류를 복강 투여하는 후처리를 행한 후 생존율을 조사하였다. 실험결과, 도6에 나타낸 바와 같이 미처리군의 생존율이 가장 적었고 다음이 다당류 후처리군, 그 다음이 다당류 전처리군임을 알 수 있었다. 이를 표2에 정리하였다. B16F10 피부암세포를 이식한 마우스의 경우 평균 생존율이 20.8일이였고 다당류를 전처리한 경우는 평균생존율이 29일이였으며 다당류를 후처리한 경우는 25.8일이였다. 이때 몸무게의 변화는 없었다.
다당류 물질의 면역항암치료효과(immunotherapy)
실험군 평균생존율 비율 30일째 생존동물수(마리)
미처리군 20.8일 100% 0/10
다당류 전처리군(100mg/kg) 29.0일 이상 139% 이상 8/10
다당류 후처리군(100mg/kg) 25.8일 이상 124% 이상 2/10
실시예 7: 면역화학요법 병용에 따른 다당류 물질의 암세포에 대한 항암활성 조사
실험예 1: 아드리아마이신(adriamycin)과 다당류 물질 병용투여에 따른 항암활성조사
다당류 물질과 아드리아마이신의 병용처리에 의한 항암활성을 측정하기 위하여 B16F10 피부암세포의 동종이식 시험계를 사용했다. 피부암세포는 복강으로 이식했다. 아드리아마이신은 암세포를 이식한 후 12일 동안 복강으로 처리했으며 다당류 물질은 암세포를 이식하기 7일전부터 암세포를 이식한 후 12일 동안 복강으로 처리했다. 동물의 생존율을 60일 동안 매일 측정했다. 여기서 사용된 아드리아마이신은 독성이 없는 저농도를 사용했다. 실험결과, 도7a 및 도7b에 나타낸 바와 같이 미처리군은 생존율이 급격히 감소하였고 다당류 물질 단독 처리시에는 미처리군보다 생존율이 상당히 증가하였다. 도7a에 아드리아마이신 0.1mg/kg의 농도로 처리한 경우와 도7b의 0.3mg/kg의 농도로 처리한 경우는 0.3mg/kg으로 처리한 경우가 생존율이 월등히 높음을 알 수 있고 병용처리한 경우에 있어서도 아드리아마이신 0.1mg/kg을 함께 사용하는 것보다는 0.3mg/kg을 함께 사용하는 것이 마우스의 생존율을 더 높힐 수 있음을 알 수 있었다. 이 결과를 표3에 정리하였다. B16F10 피부암을 이식한 마우스의 평균 생존율이 18.1일이였으며 다당류 물질의 단독처리에 의한 마우스의 평균생존율이 31일로 증가했다. 아드리아마이신을 0.1mg/kg의 농도로 처리하면 마우스의 평균생존율이 35.4일이였으며 다당류 물질을 병용처리하면 46.9일 이상으로 증가했다. 아드리아마이신을 0.3mg/kg의 농도로 처리하면 마우스의 평균생존율이 40.1일 이상이였으며 다당류 물질의 병용처리에 의하여 57.8일 이상으로 증가했다. 이때 마우스의 몸무게는 감소하지 않았다.
아드리아마이신과 다당류 물질의 병용처리에 의한 면역화학항암효과
실험군 평균생존율 비율(%) 60일째생존 동물수(마리)
미처리군 18.1 100.0 0/10
다당류(100mg/kg) 31.0 171.3 0/10
아드리아마이신(0.1mg/kg) 35.4 195.6 0/10
아드리아마이신(0.1mg/kg)+다당류(100mg/kg) 46.9 이상 259.1 이상 4/10
아드리아마이신(0.3mg/kg) 40.1 이상 240.9 이상 2/10
아드리아마이신(0.3mg/kg)+다당류(100mg/kg) 57.8 이상 319.3 이상 9/10
실험예 2: 마이토마이신 씨(mitomycin C)과 다당류 물질 병용투여에 따른 항암활성조사
다당류 물질과 마이토마이신 씨의 병용처리에 의한 항암활성을 측정하기 위하여 상기 실험예 1과 같이 B16F10 피부암세포의 동종이식 시험계를 사용하였고 피부암세포는 복강으로 이식했다. 마이토마이신 씨는 암세포를 이식한 후 12일 동안 복강으로 처리했으며 다당류 물질은 암세포를 이식하기 7일전부터 암세포를 이식한 후 12일 동안 복강으로 처리했다. 동물의 생존율을 60일 동안 매일 측정했다. 여기서 사용된 마이토마이신 씨는 독성이 없는 저농도를 사용했다. 실험결과, 실험예 1과 유사하게 미처리군은 생존율이 급격히 감소하였고 다당류물질 단독 처리시에는 미처리군보다 생존율이 상당히 증가하였다. 이 결과를 표4에 정리하였다. B16F10 피부암을 이식한 마우스의 평균 생존율이 18.1일이였으며 다당류물질의 단독처리에 의한 마우스의 평균생존율이 31일로 증가했다. 마이토마이신 씨를 0.2mg/kg의 농도로 처리하면 마우스의 평균생존율이 32.5일이였으며 다당류물질을 병용처리하면 43.5일 이상으로 증가했다. 마이토아마이신 씨를 0.6mg/kg의 농도로 처리하면 마우스의 평균생존율이 38.0일 이상이였으며 다당류물질의 병용처리에 의하여 51.5일 이상으로 증가했다. 이때 마우스의 몸무게는 감소하지 않았다.
마이토마이신 씨와 다당류물질의 병용처리에 의한 면역화학항암효과
실험군 평균생존율 비율(%) 60일째생존 동물수(마리)
미처리군 18.1 100.0 0/10
다당류(100mg/kg) 31.0 171.3 0/10
마이토마이신 씨(0.2mg/kg) 32.5 179.6 0/10
마이토마이신 씨(0.2mg/kg)+다당류(100mg/kg) 43.5 이상 240.3 이상 3/10
마이토마이신(0.6mg/kg) 38.0 이상 209.9 이상 1/10
마이토마이신(0.6mg/kg)+다당류(100mg/kg) 51.5 이상 284.5 이상 7/10
실험예 3: 씨스프라틴(cisplatin)과 다당류물질 병용투여에 따른 항암활성조사
다당류물질과 씨스프라틴의 병용처리에 의한 항암활성을 측정하기 위하여 상기 실험예와 같은 방법으로 B16F10 피부암세포의 동종이식 시험계를 사용하였고 피부암세포는 복강으로 이식했다. 씨스프라틴은 암세포를 이식한 후 12일 동안 복강으로 처리했으며 다당류물질은 암세포를 이식하기 7일전부터 암세포를 이식한 후 12일 동안 복강으로 처리했다. 동물의 생존율을 60일 동안 매일 측정했다. 여기서 사용된 씨스프라틴은 독성이 없는 저농도를 사용했다. 실험결과는 상기 실험예들과 유사하게 미처리군은 생존율이 급격히 감소하였고 다당류물질을 단독 처리시에는 미처리군보다 생존율이 상당히 증가하였다. 이 결과를 표5에 정리하였다. 씨스프라틴을 0.5mg/kg의 농도로 처리하면 마우스의 평균생존율이 33.0일이였으며 다당류 물질을 병용처리하면 44.0일 이상으로 증가했다. 씨스프라틴을 1.5mg/kg의 농도로 처리하면 마우스의 평균생존율이 40.5일 이상이였으며 다당류의 병용처리에 의하여 52.6일 이상으로 증가했다. 이때 마우스의 몸무게는 감소하지 않았다.
씨스프라틴과 다당류물질의 병용처리에 의한 면역화학항암효과
실험군 평균생존율 비율(%) 60일째생존 동물수(마리)
미처리군 18.1 100.0 0/10
다당류(100mg/kg) 31.0 171.3 0/10
씨스프라틴(0.5mg/kg) 33.0 182.3 0/10
씨스프라틴(0.5mg/kg)+다당류(100mg/kg) 44.0 이상 243.0 이상 3/10
씨스프라틴(1.5mg/kg) 40.5 이상 223.8 이상 2/10
씨스프라틴(1.5mg/kg)+다당류(100mg/kg) 52.6 이상 290.6 이상 7/10
실험예 4: 5-후로로우라실(5-Fleuoro uracil) 다당류물질 병용투여에 따른 항암활성조사
다당류물질과 5-후로로우라실의 병용처리에 의한 항암활성을 측정하기 위하여 상기 실험예와 같은 방법으로 B16F10 피부암세포의 동종이식 시험계를 사용하였고 피부암세포는 복강으로 이식했다. 5-후로로우라실은 암세포를 이식한 후 12일 동안 복강으로 처리했으며 다당류물질은 암세포를 이식하기 7일전부터 암세포를 이식한 후 12일 동안 복강으로 처리했다. 동물의 생존율을 60일 동안 매일 측정했다. 여기서 사용된 5-후로로우라실은 독성이 없는 저농도를 사용했다. 실험결과는 상기 실험예들과 유사하게 미처리군은 생존율이 급격히 감소하였고 다당류물질 단독 처리시에는 미처리군보다 생존율이 상당히 증가하였다. 이 결과를 표6에 정리하였다. 5-후로로우라실을 1mg/kg의 농도로 처리하면 마우스의 평균생존율이 34.2일이였으며 다당류물질을 병용처리하면 45.5일 이상으로 증가했다. 5-후로로우라실을 3mg/kg의 농도로 처리하면 마우스의 평균생존율이 40.2일 이상이였으며 다당류물질의 병용처리에 의하여 54.8일 이상으로 증가했다. 이때 마우스의 몸무게는 감소하지 않았다.
5-후로로우라실과 다당류물질의 병용처리에 의한 면역화학항암효과
실험군 평균생존율 비율(%) 60일째생존 동물수(마리)
미처리군 18.1 100.0 0/10
다당류(100mg/kg) 31.0 171.3 0/10
5-후로로우라실(1mg/kg) 33.0 187.8 0/10
5-후로로우라실(1mg/kg)+다당류(100mg/kg) 44.0 이상 251.4 이상 4/10
5-후로로우라실(3mg/kg) 40.5 이상 222 이상 2/10
5-후로로우라실(3mg/kg)+다당류(100mg/kg) 52.6 이상 302.0 이상 8/10
실시예 8: 다당류물질의 인체 유래 암세포에 대한 항암효과 조사
다당류의 인체 유래 암세포에 대한 면역항암활성을 NCl-H23 폐암세포를 이용하여 검증했다. NCl-H23 폐암세포를 누드마우스에 피하로 이식하였으며 다당류물질 및 아드리아마이신을 암세포 이식 후 12일 동안 복강으로 투여했다. 암세포의 크기를 측정하였으며 암세포이식 후 19일째에 암을 분리하여 무게를 측정했다. 누드마우스에는 T세포가 결핍되어 있기 때문에 주로 자연살해세포나 대식세포에 의해 항암활성이 나타난다. 그러므로 다당류물질에 의한 면역항암활성은 이들 두종류의 면역세포에 의해 매개된다. 실험결과, 도8a와 도8b에 나타낸 바와 같이 암세포의 크기는 미처리군의 증가도가 가장 크고 다음이 다당류물질 및 아드리아마이신이였고 무게 역시 미처리군, 다당류물질, 아드리아마이신 순서로 감소했다. 이 결과를 표7 및 표8에 정리하였다. 이때 사용된 마우스의 몸무게는 변화가 없었다.
인체 유래 암세포에 대한 면역항암효과(암크기의 변화, mm3)
실험군 14일째 17일째 18일째 19일째
미처리군다당류(100mg/kg)아드리아마이신(1mg/kg) 432012 1053927 1314034 1584333
인체 유래 암세포에 대한 면역항암효과
실험군 최종 암무게(mg)
미처리군다당류(100mg/kg)아드리아마이신(1mg/kg) 25911395
실시예 9: 다당류물질에 의한 마우스 유래 암세포의 전이억제효과 조사
본 발명의 다당류물질에 의한 암전이 억제효과를 측정하기 위하여 B16F10 피부암세포를 C57BL/6 마우스에 꼬리정맥으로 이식했으며 14일째 폐를 분리하여 암전이 정도를 검증했다. 다당류물질은 암이식 7일전부터 투여를 시작하여 암 이식 후 12일 동안 복강으로 투여했다. 아드리아마이신은 암이식 후 12일 동안 복강으로 투여했다. 실험결과, B16F10 피부암세포의 꼬리정맥 주사에 의해 전이가 일어나 폐에 검은 반점이 형성되었다. 도9a에 나타낸 바와 같이 약물 미처리군의 경우 약 272개의 암반점이 형성되었고 아드리아마이신 1mg/kg의 처리에 의해 반점의 수가 197개로 감소했고 아드리아마이신의 3mg/kg의 처리에 의해 반점의 수는 172개로 감소했다. 실시예 7의 경우에서 0.3 내지 0.1mg/kg의 농도에서 아드리아마이신이 암세포의 성장을 억제했으나 암전이억제는 더 높은 농도인 3mg/kg 내지 1mg/kg의 농도에서 매우 약했다. 도9b에 나타낸 바와 같이 다당류물질 단독처리에 의해서 반점의 수가 83개로 감소했으며 아드리아마이신과의 병용처리 실험군에서는 반점의 수가 136 및 131개였다. 이 결과는 암전이를 억제하기 위해서는 다당류물질의 처리가 반드시 필요함을 나타낸다. 이와 같은 결과를 표9에 정리하였다.
다당류물질의 암전이 억제효과
시험군 반점의 수
미처리군다당류(100mg/kg)아드리아마이신(1mg/kg)아드리아마이신(1mg/kg) + 다당류(100mg/kg)아드리아마이신(3mg/kg)아드리아마이신(3mg/kg) + 다당류(100mg/kg) 27283197136172131
실시예 10: 다당류물질의 암세포에 대한 직접독성 측정
항암효과가 면역증강을 매개했는지 또는 암세포에 대한 직접 독성을 매개했는지에 대하여 실험을 실시하였다. B16F10 마우스 피부암세포 및 NCl-H23 인체 폐암세포에 다당류물질 및 아드리아마이신을 직접 처리하였다. 처리농도는 0.3㎍/kg에서 30㎍/㎏이였으며 2일 동안 처리한 후 살아있는 세포의 양을 설포로다민 비(Sulforhodamin B)측정법으로 구했다. 약물을 처리하지 않은 실험군의 살아있는 세포의 양을 100%로 표현했으며 약물처리군 세포의 양을 비율로 표현했다. 실험결과, 도10에 나타낸 바와 같이 아드리아마이신은 두종류의 암세포에 대해 강한 세포독성을 나타냈고 다당류의 경우는 세포독성을 나타내지 않았다. 이는 아드리아마이신은 세포독성을 매개로 하는 항암제이고 다당류물질은 생체의 면역기능을 증가시켜 항암효과를 나타내는 면역항암제임을 나타낸다. 이와 같은 결과를 표 10에 정리하였다.
다당류물질의 암세포에 대한 직접독성(%)
실험군 아드리아마이신 다당류
B16F10 NCl-H23 B16F10 NCl-H23
미처리군0.3㎍/ml1㎍/ml3㎍/ml10㎍/ml30㎍/ml 10056299-10-10 10010071397-1 1009389807877 1009389807877
이상의 실시예에서 설명한 바와 같이 본 발명은 펠리누스 린테우스 유로부터 신규한 다당류를 분리하는 효과가 있으며 이 다당류가 면역항암치료제로서 생체의 면역기능을 증가시켜 암전이 억제효과가 있음을 알 수 있어, 본 발명 다당류 추추물은 암을 비롯한 면역관련 질환의 예방 및 치료에 효과가 있고 이와 관련된 기초 기전연구에 약물로서 사용할 수 있어 생물의약 및 면역학상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (1)

  1. 펠리누스 린테우스(Phellinus linteusYoo) KCTC 0399BP 균주의 균사체를 열수추출하고, 에탄올 농도가 80%가 되도록 에탄올을 처리한 후 원심분리에 의해 침전물을 얻고, 침전물을 투석한 추출물을 동결건조시켜 수득된 조다당류를 DEAE-셀룰로스 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피로 분리정제한 추출물로, 탄수화물 함량이 82.7%이고 단백질 함량이 17.3%이며, 가스 크로마토그래피로 분석한 구성당 성분이 78.6몰%의 글루코스, 18.0 몰%의 만노스, 3.4몰%의 갈락토오스로 이루어진 것을 특징으로 하는 항암 면역활성을 갖는 다당류 추출물.
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