JP3093194B2 - 新規のペリヌス属菌株から分離した免疫増強活性多糖類物質及びその使用 - Google Patents
新規のペリヌス属菌株から分離した免疫増強活性多糖類物質及びその使用Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規の免疫増強活
性多糖類物質を生産するペリヌス属菌株と、この菌株が
生産する多糖類物質及びこの物質の使用に関する。より
具体的には、本発明の多糖類物質は、新規の免疫増強活
性を示す多糖類物質を生産するペリヌス属(Phellinus)
菌株を同定し、同定した菌株とペリヌス属菌株の菌糸体
又は子実体から新規の免疫増強活性多糖類物質を分離精
製することによって得ることができる。分離された多糖
類物質は、癌、ＡＩＤＳ等の免疫関連疾患の予防・治
療、ならびに、それら疾患の機序の基礎研究のための薬
物として使用し得る。
性多糖類物質を生産するペリヌス属菌株と、この菌株が
生産する多糖類物質及びこの物質の使用に関する。より
具体的には、本発明の多糖類物質は、新規の免疫増強活
性を示す多糖類物質を生産するペリヌス属(Phellinus)
菌株を同定し、同定した菌株とペリヌス属菌株の菌糸体
又は子実体から新規の免疫増強活性多糖類物質を分離精
製することによって得ることができる。分離された多糖
類物質は、癌、ＡＩＤＳ等の免疫関連疾患の予防・治
療、ならびに、それら疾患の機序の基礎研究のための薬
物として使用し得る。
【０００２】
【従来の技術】真菌類の高等菌類に属する茸は、顕微鏡
的構造の菌糸により外部から栄養の供給を受けて従属栄
養生活をし(Whittaker,1969)、生態界内では複雑な有機
物質を分解して自然に還元させる分解者の役割を担当す
る。典型的な茸の種類は、大部分の菌類中でも担子病を
形成して四つの担子胞子を外生する担子菌類(Basidiomy
cetes)に属し、担子菌類中でも子実層を露出して胞子を
能動的に放出する菌蕈類(Hymenomycetes)に属する。菌
蕈類の代表例は、平はら茸目(Aphyllophorales)とはら
茸目(Agaricales)であり、平はら茸目には箒茸、すずめ
の茸、はり茸、かわら茸、あな茸、さるのこしかけ等の
種類があり、はら茸目には平茸、椎茸、末広茸、松茸、
べんてん茸、はさくれしとよ茸等の種類が代表的である
(李 等、１９８５)。担子菌の一種で平はら茸目(Aphyl
lophorales)に属する茸類の多くの種類が各種の疾病、
特に腫瘍に対する治療効果があるとの事実が以前から知
られており、主に漢方薬又は民間薬として伝承されて来
た。その中でもさるのこしかけ科(polyporaceae)のすっ
ぽん茸属(Phellinus)に属するペリヌス・リンテウス(Ph
ellinus linteus)は、漢方では桑黄と呼ばれる貴重な薬
材として用いられて来た。しかし、桑黄は自然界では非
常に稀貴種であって、子実体(fruiting body)の入手が
極めて難しいのみならず、菌糸体(mycelium)を分離して
人工培養するのも極めて難しいという欠点がある。従っ
て、桑黄が腫瘍治療剤として非常に効果があるとの事実
が認知されていたにも拘わらず積極的に活用することが
できなかった。
的構造の菌糸により外部から栄養の供給を受けて従属栄
養生活をし(Whittaker,1969)、生態界内では複雑な有機
物質を分解して自然に還元させる分解者の役割を担当す
る。典型的な茸の種類は、大部分の菌類中でも担子病を
形成して四つの担子胞子を外生する担子菌類(Basidiomy
cetes)に属し、担子菌類中でも子実層を露出して胞子を
能動的に放出する菌蕈類(Hymenomycetes)に属する。菌
蕈類の代表例は、平はら茸目(Aphyllophorales)とはら
茸目(Agaricales)であり、平はら茸目には箒茸、すずめ
の茸、はり茸、かわら茸、あな茸、さるのこしかけ等の
種類があり、はら茸目には平茸、椎茸、末広茸、松茸、
べんてん茸、はさくれしとよ茸等の種類が代表的である
(李 等、１９８５)。担子菌の一種で平はら茸目(Aphyl
lophorales)に属する茸類の多くの種類が各種の疾病、
特に腫瘍に対する治療効果があるとの事実が以前から知
られており、主に漢方薬又は民間薬として伝承されて来
た。その中でもさるのこしかけ科(polyporaceae)のすっ
ぽん茸属(Phellinus)に属するペリヌス・リンテウス(Ph
ellinus linteus)は、漢方では桑黄と呼ばれる貴重な薬
材として用いられて来た。しかし、桑黄は自然界では非
常に稀貴種であって、子実体(fruiting body)の入手が
極めて難しいのみならず、菌糸体(mycelium)を分離して
人工培養するのも極めて難しいという欠点がある。従っ
て、桑黄が腫瘍治療剤として非常に効果があるとの事実
が認知されていたにも拘わらず積極的に活用することが
できなかった。
【０００３】癌を治療するための方法としては、化学療
法(chemotherapy)、放射線療法(radiotherapy)、手術療
法(surgery)等が用いられているが、これら治療法は、
効果的に固形癌等を除去することができるが、癌を完全
に治療することができなく、特に癌の転移に対しては治
療効果が低い。更に、アドリアマイシン等のような抗癌
剤を用いる化学療法及び放射線療法は、甚だしい副作用
を誘発する。副作用を減少させるために抗癌剤の量を減
らして癌を治療することもあるが、この場合、治療効果
が低まる欠点がある。より大きい問題点としては、前述
の通り、抗癌治療後に癌転移を抑制し得ないということ
である。従って、既存の化学療法による抗癌治療は癌細
胞の成長を抑制する効果があるが、癌を完治することは
できなかった。
法(chemotherapy)、放射線療法(radiotherapy)、手術療
法(surgery)等が用いられているが、これら治療法は、
効果的に固形癌等を除去することができるが、癌を完全
に治療することができなく、特に癌の転移に対しては治
療効果が低い。更に、アドリアマイシン等のような抗癌
剤を用いる化学療法及び放射線療法は、甚だしい副作用
を誘発する。副作用を減少させるために抗癌剤の量を減
らして癌を治療することもあるが、この場合、治療効果
が低まる欠点がある。より大きい問題点としては、前述
の通り、抗癌治療後に癌転移を抑制し得ないということ
である。従って、既存の化学療法による抗癌治療は癌細
胞の成長を抑制する効果があるが、癌を完治することは
できなかった。
【０００４】最近、免疫療法(immunotherapy)を化学療
法と共に用いて抗癌効果を高め、副作用を減少させる方
法が用いられている。即ち、免疫増強剤とアドリアマイ
シン等の抗癌剤を併用(immunochemotherapy)して副作用
を減らし抗癌効果を高めている。免疫療法に用いられる
物質としてはインターロイキン−２のようなサイトカイ
ンがある。インターロイキン−２は免疫治療剤として治
療効果が優れ、特に癌移転に優れた治療効果を見せてい
る。しかし、人体に応用して癌治療をする場合には高い
濃度で用いなければならないが、この際、甚だしい副作
用を誘発する欠点がある。最近、サイトカインでない免
疫増強物質としてレンチナン、OK−４３２等が開発され
ており、これら物質は副作用無しに抗癌作用を示してい
る。
法と共に用いて抗癌効果を高め、副作用を減少させる方
法が用いられている。即ち、免疫増強剤とアドリアマイ
シン等の抗癌剤を併用(immunochemotherapy)して副作用
を減らし抗癌効果を高めている。免疫療法に用いられる
物質としてはインターロイキン−２のようなサイトカイ
ンがある。インターロイキン−２は免疫治療剤として治
療効果が優れ、特に癌移転に優れた治療効果を見せてい
る。しかし、人体に応用して癌治療をする場合には高い
濃度で用いなければならないが、この際、甚だしい副作
用を誘発する欠点がある。最近、サイトカインでない免
疫増強物質としてレンチナン、OK−４３２等が開発され
ており、これら物質は副作用無しに抗癌作用を示してい
る。
【０００５】一方、ペリヌス菌株の微生物学的又は遺伝
学的特性を糾明して報告した研究も皆無の実情である。
微生物の場合、同一の種(species)であっても各菌株が
生産する活性物質の種類や生産量等に著しい差異がある
のみならず、培養条件、菌株の安定性、遺伝的変異の頻
度等にも大きな差異をみせている。従って、強力な免疫
抗癌活性物質を多量に生産すると共に、人工液体培養が
可能であり、遺伝的変異が少ない安定した微生物の選抜
が最も重要な要因になる。すっぽん茸類は形態的にも顕
微鏡下での変かが甚だしく多様であるため、それらの分
類は顕微鏡下での形態学的差異に依存しているのが実情
である。
学的特性を糾明して報告した研究も皆無の実情である。
微生物の場合、同一の種(species)であっても各菌株が
生産する活性物質の種類や生産量等に著しい差異がある
のみならず、培養条件、菌株の安定性、遺伝的変異の頻
度等にも大きな差異をみせている。従って、強力な免疫
抗癌活性物質を多量に生産すると共に、人工液体培養が
可能であり、遺伝的変異が少ない安定した微生物の選抜
が最も重要な要因になる。すっぽん茸類は形態的にも顕
微鏡下での変かが甚だしく多様であるため、それらの分
類は顕微鏡下での形態学的差異に依存しているのが実情
である。
【０００６】最近、集団遺伝学と系統遺伝学において
は、ＤＮＡ分析法が多く利用される。そのうち、ＲＦＬ
Ｐ(restriction fragment Length polymorphism)は、塩
基配列の変異の推定を可能にする方法であって(Dowling
et al., 1990)、このＤＮＡ分析法は表現型による分析
方法とは異なり遺伝子型を進化速度や遺伝傾向に基づき
分析することができる長所を有している（Dowling et a
l., Nucleic acid II: Restriction site analysis. I
n: Molecular systematics ed. by D.M. Hills and C.
Moritz, pp.250-317, Sinauer Associates Press）。と
ころで、ＤＮＡ分析の場合、核のＤＮＡはあまり大きく
分析が容易でないという欠点があるため、主にオルガネ
ラゲノム(organellar genome)を多く用いる(White and
Densmore,1992)。そのうちでもミトコンドリアＤＮＡを
多く利用するが、一般的にミトコンドリアＤＮＡは核の
ＤＮＡより大きさが小さく、進化的変化速度が相対的に
早く、母系半数体遺伝をするため、集団の遺伝子構造と
歴史の研究によく使用される。特に、ミトコンドリアＤ
ＮＡのＲＦＬＰは諸種間の種間変異研究に用いられてい
る(Foster et al., 1987,1988)。
は、ＤＮＡ分析法が多く利用される。そのうち、ＲＦＬ
Ｐ(restriction fragment Length polymorphism)は、塩
基配列の変異の推定を可能にする方法であって(Dowling
et al., 1990)、このＤＮＡ分析法は表現型による分析
方法とは異なり遺伝子型を進化速度や遺伝傾向に基づき
分析することができる長所を有している（Dowling et a
l., Nucleic acid II: Restriction site analysis. I
n: Molecular systematics ed. by D.M. Hills and C.
Moritz, pp.250-317, Sinauer Associates Press）。と
ころで、ＤＮＡ分析の場合、核のＤＮＡはあまり大きく
分析が容易でないという欠点があるため、主にオルガネ
ラゲノム(organellar genome)を多く用いる(White and
Densmore,1992)。そのうちでもミトコンドリアＤＮＡを
多く利用するが、一般的にミトコンドリアＤＮＡは核の
ＤＮＡより大きさが小さく、進化的変化速度が相対的に
早く、母系半数体遺伝をするため、集団の遺伝子構造と
歴史の研究によく使用される。特に、ミトコンドリアＤ
ＮＡのＲＦＬＰは諸種間の種間変異研究に用いられてい
る(Foster et al., 1987,1988)。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、前記
の如き事実を鑑み免疫増強活性を示す新規の多糖類物質
を生産するペリヌス属菌株、この多糖類物質、及び免疫
疾患治療剤としての前記多糖類物質を提供することにあ
る。本発明の別の目的は、免疫増強活性を示す新規の多
糖類物質を生産する前記ペリヌス属菌株のミトコンドリ
アＤＮＡを制限酵素で処理し、ＲＦＬＰパターンを調べ
て同定した後、この菌株の菌糸体及び子実体から免疫増
強活性多糖類物質を分離精製すること、ならびに、分離
精製した多糖類物質を癌、ＡＩＤＳなどの免疫関連疾患
の予防・治療及び基礎的機序研究のための薬物として使
用することにある。
の如き事実を鑑み免疫増強活性を示す新規の多糖類物質
を生産するペリヌス属菌株、この多糖類物質、及び免疫
疾患治療剤としての前記多糖類物質を提供することにあ
る。本発明の別の目的は、免疫増強活性を示す新規の多
糖類物質を生産する前記ペリヌス属菌株のミトコンドリ
アＤＮＡを制限酵素で処理し、ＲＦＬＰパターンを調べ
て同定した後、この菌株の菌糸体及び子実体から免疫増
強活性多糖類物質を分離精製すること、ならびに、分離
精製した多糖類物質を癌、ＡＩＤＳなどの免疫関連疾患
の予防・治療及び基礎的機序研究のための薬物として使
用することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明の前記目的を達成
するために、先ず、多様なペリヌス属菌株を培養してSD
S-Phenol法でＤＮＡを分離した後、このうちミトコンド
リアＤＮＡだけを分離して制限酵素BamHI、ClaI、EcoRI
及びPvuIIでそれぞれ処理し、処理された試料をアガロ
ースゲル(Agarose gel)上で電気泳動した。ペリヌス属
菌株間のＤＮＡ近縁関係をNeiとLiの方法(1979)により
分析及び調査して近縁関係があると判断された新規の菌
株ペリヌス・リンテウス・ユーKCTC 0399BP菌株の子実
体に対する微生物学的特性を調べた。菌株の子実体及び
菌糸体から多糖類物質を抽出及び精製し、免疫増強活性
を測定して免疫増強活性物質であることを確かめ、この
免疫増強活性物質を精製した後、構成単糖類及び構造的
特徴を調べ、免疫増強活性多糖類物質の構造分析を行っ
た。次いで、ペリヌス属に属する各種の菌株を前記ペリ
ヌス・リンテウス・ユー菌株KCTC 0399BPと同一の方法
で培養し、菌糸体又は子実体から多糖類物質を抽出・精
製した後、前記免疫増強活性測定法と同一の方法で免疫
増強活性を調べて、ペリヌス属菌株に属する他の菌株か
らも免疫増強活性多糖類物質が分離されることを確認し
た。
するために、先ず、多様なペリヌス属菌株を培養してSD
S-Phenol法でＤＮＡを分離した後、このうちミトコンド
リアＤＮＡだけを分離して制限酵素BamHI、ClaI、EcoRI
及びPvuIIでそれぞれ処理し、処理された試料をアガロ
ースゲル(Agarose gel)上で電気泳動した。ペリヌス属
菌株間のＤＮＡ近縁関係をNeiとLiの方法(1979)により
分析及び調査して近縁関係があると判断された新規の菌
株ペリヌス・リンテウス・ユーKCTC 0399BP菌株の子実
体に対する微生物学的特性を調べた。菌株の子実体及び
菌糸体から多糖類物質を抽出及び精製し、免疫増強活性
を測定して免疫増強活性物質であることを確かめ、この
免疫増強活性物質を精製した後、構成単糖類及び構造的
特徴を調べ、免疫増強活性多糖類物質の構造分析を行っ
た。次いで、ペリヌス属に属する各種の菌株を前記ペリ
ヌス・リンテウス・ユー菌株KCTC 0399BPと同一の方法
で培養し、菌糸体又は子実体から多糖類物質を抽出・精
製した後、前記免疫増強活性測定法と同一の方法で免疫
増強活性を調べて、ペリヌス属菌株に属する他の菌株か
らも免疫増強活性多糖類物質が分離されることを確認し
た。
【０００９】また、動物試験において、前記免疫増強活
性多糖類物質をマウスの皮膚癌細胞が移植されたマウス
に投与して抗癌活性を調べ、同一の方法で前記多糖類物
質と化学薬剤を併用して、抗癌活性を調べた後、人体癌
細胞に対する抗癌効果を調べた。次いで、皮膚癌細胞を
尾静脈に移植した後、化学薬剤と前記免疫増強活性多糖
類物質で処理して癌転移に及ぼすこれらの影響を調べ、
これにより化学薬剤と前記多糖類物質が示す抗癌作用の
機序の違いが判明した。
性多糖類物質をマウスの皮膚癌細胞が移植されたマウス
に投与して抗癌活性を調べ、同一の方法で前記多糖類物
質と化学薬剤を併用して、抗癌活性を調べた後、人体癌
細胞に対する抗癌効果を調べた。次いで、皮膚癌細胞を
尾静脈に移植した後、化学薬剤と前記免疫増強活性多糖
類物質で処理して癌転移に及ぼすこれらの影響を調べ、
これにより化学薬剤と前記多糖類物質が示す抗癌作用の
機序の違いが判明した。
【００１０】従って、本発明は以下のように要約され
る。 （１）免疫増強活性多糖類物質を生産し、ミトコンドリ
アＤＮＡの大きさが６１ｋｂであることを特徴とするペ
リヌス・リンテウス・ユー(Phellinus linteusYoo) KCT
C 0399BP菌株。 （２）ペリヌス属菌株の培養菌糸体又は子実体から抽出
・精製して得られた免疫増強活性多糖類物質。
る。 （１）免疫増強活性多糖類物質を生産し、ミトコンドリ
アＤＮＡの大きさが６１ｋｂであることを特徴とするペ
リヌス・リンテウス・ユー(Phellinus linteusYoo) KCT
C 0399BP菌株。 （２）ペリヌス属菌株の培養菌糸体又は子実体から抽出
・精製して得られた免疫増強活性多糖類物質。
【００１１】（３）前記天然物質がマンノース、ガラク
トース及びグルコースで構成されることを特徴とする上
記（２）記載の多糖類物質。 （４）ペリヌス菌株をグルコース、酵母抽出物およびペ
プトンを含む培地で培養して菌糸体又は子実体を得る工
程、該菌糸体または子実体を熱水で抽出する工程、エタ
ノールで沈澱して沈殿物を得る工程、該沈殿物を水に懸
濁し、透析膜で透析して免疫増強活性分画を得る工程、
ＤＥＡＥセルロースクロマトグラフィー等のアニオン交
換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーを
順次に行って免疫活性多糖類物質を分離精製する工程を
含む、免疫活性多糖類物質の製造方法。
トース及びグルコースで構成されることを特徴とする上
記（２）記載の多糖類物質。 （４）ペリヌス菌株をグルコース、酵母抽出物およびペ
プトンを含む培地で培養して菌糸体又は子実体を得る工
程、該菌糸体または子実体を熱水で抽出する工程、エタ
ノールで沈澱して沈殿物を得る工程、該沈殿物を水に懸
濁し、透析膜で透析して免疫増強活性分画を得る工程、
ＤＥＡＥセルロースクロマトグラフィー等のアニオン交
換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーを
順次に行って免疫活性多糖類物質を分離精製する工程を
含む、免疫活性多糖類物質の製造方法。
【００１２】（５）ペリヌス属菌糸体又は子実体から得
られた多糖類物質又はその誘導体を有効成分として含む
抗癌免疫増強活性医薬組成物。 （６）上記（２）または（３）記載の多糖類物質の、抗
癌免疫治療剤としての使用。 （７）上記（２）または（３）記載の多糖類物質の、
癌、ＡＩＤＳ等の免疫関連疾患治療剤としての使用。
られた多糖類物質又はその誘導体を有効成分として含む
抗癌免疫増強活性医薬組成物。 （６）上記（２）または（３）記載の多糖類物質の、抗
癌免疫治療剤としての使用。 （７）上記（２）または（３）記載の多糖類物質の、
癌、ＡＩＤＳ等の免疫関連疾患治療剤としての使用。
【００１３】
【発明の実施の形態】本発明の新規の菌株、多糖類物質
とその製法，医薬組成物についてさらに詳細に説明す
る。新規菌株ペリヌス・リンテウス・ユー菌株KCTC 039
9BPを含むペリヌス属(Phellinus)菌株の１３種をポテト
デキストロースアガー(Potato dextrose agar:PDA)培地
でそれぞれ培養する。培養されたそれぞれの菌糸体から
全ＤＮＡをSDS-フェノール法で分離する。ミトコンドリ
アＤＮＡは株間の近縁性を分析するのに有用である。前
記分離された全体ＤＮＡからミトコンドリアＤＮＡを分
離する段階；前記分離されたミトコンドリアＤＮＡを制
限酵素で消化し、この制限酵素消化されたＤＮＡをアガ
ロースゲル(Agarose gel)電気泳動にかけて各断片に分
離する。前記電気泳動結果に従って距離移動を調べて制
限酵素断片類似度(Ｆ値)を求めた後、この値を利用して
塩基位置当り塩基置換度(Ｐ値)を求めて実験に用いた菌
株の近縁関係を分析及び調査する。前記調査により本発
明の新規の菌株ペリヌス・リンテウス・ユー菌株KCTC 0
399BPが見出されたが、その子実体に対する微生物学的
特性を調査して、この菌株の増殖に役立てる。本発明の
新規の菌株を培養して，治療に有効であると考えられる
多糖類物質を抽出(特に，熱水抽出)・精製する。精製物
が多糖類であることは、フェノール‐硫酸法、Folin‐
フェノール法によって分析される。免疫増強活性多糖類
物質の構成単糖類成分を分析し、また免疫増強活性多糖
類物質の構造的特徴をＮＭＲ法で調査する。
とその製法，医薬組成物についてさらに詳細に説明す
る。新規菌株ペリヌス・リンテウス・ユー菌株KCTC 039
9BPを含むペリヌス属(Phellinus)菌株の１３種をポテト
デキストロースアガー(Potato dextrose agar:PDA)培地
でそれぞれ培養する。培養されたそれぞれの菌糸体から
全ＤＮＡをSDS-フェノール法で分離する。ミトコンドリ
アＤＮＡは株間の近縁性を分析するのに有用である。前
記分離された全体ＤＮＡからミトコンドリアＤＮＡを分
離する段階；前記分離されたミトコンドリアＤＮＡを制
限酵素で消化し、この制限酵素消化されたＤＮＡをアガ
ロースゲル(Agarose gel)電気泳動にかけて各断片に分
離する。前記電気泳動結果に従って距離移動を調べて制
限酵素断片類似度(Ｆ値)を求めた後、この値を利用して
塩基位置当り塩基置換度(Ｐ値)を求めて実験に用いた菌
株の近縁関係を分析及び調査する。前記調査により本発
明の新規の菌株ペリヌス・リンテウス・ユー菌株KCTC 0
399BPが見出されたが、その子実体に対する微生物学的
特性を調査して、この菌株の増殖に役立てる。本発明の
新規の菌株を培養して，治療に有効であると考えられる
多糖類物質を抽出(特に，熱水抽出)・精製する。精製物
が多糖類であることは、フェノール‐硫酸法、Folin‐
フェノール法によって分析される。免疫増強活性多糖類
物質の構成単糖類成分を分析し、また免疫増強活性多糖
類物質の構造的特徴をＮＭＲ法で調査する。
【００１４】前記抽出・精製した多糖類物質を動物に投
与後，リンパ球数をカウントしおよびリンパ球の増殖を
測定することによって免疫増強活性を測定する。前記ペ
リヌス・リンテウス・ユー菌株KCTC 0399BPと同様に他
のペリヌス属菌株を培養、菌糸体抽出、物質単離した
後、免疫増強活性、抗癌免疫活性を測定する。ペリヌス
属菌株子実体から多糖類物質を得て、免疫増強活性、抗
癌免疫活性を測定する。
与後，リンパ球数をカウントしおよびリンパ球の増殖を
測定することによって免疫増強活性を測定する。前記ペ
リヌス・リンテウス・ユー菌株KCTC 0399BPと同様に他
のペリヌス属菌株を培養、菌糸体抽出、物質単離した
後、免疫増強活性、抗癌免疫活性を測定する。ペリヌス
属菌株子実体から多糖類物質を得て、免疫増強活性、抗
癌免疫活性を測定する。
【００１５】多糖類物質の抗癌活性をアッセイするため
には、マウス由来皮膚癌細胞をマウスに移植し、次いで
免疫増強活性多糖類物質を投与した後、マウスの生存率
を調べる。また、アドリアマイシン等の抗癌剤を多糖類
物質と共に投与した後、生存率を調べてそれぞれの抗癌
活性を調べる。ヒト由来癌細胞をヌードマウスに移植
し、多糖類物質及びアドリアマイシンを単独かまたは組
合せて投与して抗癌効果を調べる。マウス由来皮膚癌細
胞をマウスの尾静脈に移植し、次いで免疫増強活性多糖
類物質およびアドリアマイシンを投与して癌転移抑制効
果を調べる。マウス皮膚癌細胞とヒト肺癌細胞を多糖類
物質とアドリアマイシンで単独かまたは組合せて処理し
た後、スルフォローダミンB(Sulforhodamin B)法で生存
するマウス皮膚癌細胞を測定して癌細胞に対する細胞毒
性を測定する。
には、マウス由来皮膚癌細胞をマウスに移植し、次いで
免疫増強活性多糖類物質を投与した後、マウスの生存率
を調べる。また、アドリアマイシン等の抗癌剤を多糖類
物質と共に投与した後、生存率を調べてそれぞれの抗癌
活性を調べる。ヒト由来癌細胞をヌードマウスに移植
し、多糖類物質及びアドリアマイシンを単独かまたは組
合せて投与して抗癌効果を調べる。マウス由来皮膚癌細
胞をマウスの尾静脈に移植し、次いで免疫増強活性多糖
類物質およびアドリアマイシンを投与して癌転移抑制効
果を調べる。マウス皮膚癌細胞とヒト肺癌細胞を多糖類
物質とアドリアマイシンで単独かまたは組合せて処理し
た後、スルフォローダミンB(Sulforhodamin B)法で生存
するマウス皮膚癌細胞を測定して癌細胞に対する細胞毒
性を測定する。
【００１６】本発明に用いたペリヌス・リンテウス・ユ
ー菌株は、本発明者らにより微生物国際寄託機関である
韓国科学技術研究院生命工学研究所遺伝資源センターに
１９９７年１１月１７日付で寄託番号KCTC 0399BPとし
て寄託された菌株である。この菌株及び他のペリヌス属
菌株の免疫増強活性測定は、Ｂリンパ球の場合、生命工
学研究所遺伝資源センター実験動物研究室から分譲受け
たB6C3Fマウスから摘出した脾臓の細胞(splenocyte)を
各試料と陽性対照のＬＰＳ(lipopolysaccharide)で処理
して２日間免疫化した後、形成された抗体を分光光度法
により測定して活性の指標とした。Ｔリンパ球の増殖に
対する多糖類物質の作用は混合リンパ球応答法で測定し
た。リンパ球の増殖効果は、細胞内の核ＤＮＡ合成程度
を同位元素（トリチウム）で置換したチミジン(3H‐ Th
ymidine)を用いて測定して活性の指標とした。
ー菌株は、本発明者らにより微生物国際寄託機関である
韓国科学技術研究院生命工学研究所遺伝資源センターに
１９９７年１１月１７日付で寄託番号KCTC 0399BPとし
て寄託された菌株である。この菌株及び他のペリヌス属
菌株の免疫増強活性測定は、Ｂリンパ球の場合、生命工
学研究所遺伝資源センター実験動物研究室から分譲受け
たB6C3Fマウスから摘出した脾臓の細胞(splenocyte)を
各試料と陽性対照のＬＰＳ(lipopolysaccharide)で処理
して２日間免疫化した後、形成された抗体を分光光度法
により測定して活性の指標とした。Ｔリンパ球の増殖に
対する多糖類物質の作用は混合リンパ球応答法で測定し
た。リンパ球の増殖効果は、細胞内の核ＤＮＡ合成程度
を同位元素（トリチウム）で置換したチミジン(3H‐ Th
ymidine)を用いて測定して活性の指標とした。
【００１７】以下、本発明の具体的な構成と作用を実施
例を挙げて説明するが、本発明の権利範囲は下記実施例
にのみ制限されるのではない。
例を挙げて説明するが、本発明の権利範囲は下記実施例
にのみ制限されるのではない。
【００１８】
【実施例】実施例１：ペリヌス菌株培養 供試菌株は、表１に示した多様なペリヌス属菌株であっ
て、これらをそれぞれポテトデキストロースアガー(pot
ato dextrose agar:PDA)培地で２８℃に維持しながら５
〜１２日間培養した後、４５０ｍｌのＰＤブロス(brot
h)に接種して、２８℃、１２０rpmの条件で１２日間振
盪培養した。
て、これらをそれぞれポテトデキストロースアガー(pot
ato dextrose agar:PDA)培地で２８℃に維持しながら５
〜１２日間培養した後、４５０ｍｌのＰＤブロス(brot
h)に接種して、２８℃、１２０rpmの条件で１２日間振
盪培養した。
【００１９】
【表１】
【００２０】実施例２：全ＤＮＡの分離 菌糸体からの全ＤＮＡの分離はSDS-フェノール法を利用
した。前記実施例１において培養が終った菌糸体それぞ
れを、20mM EDTAで洗浄した後、フィルターペーパー(fi
lter paper;Waterman no.1)を用いた真空濾過法により
得て、−７０℃で氷らせて凍結乾燥した。凍結乾燥され
た菌糸体はすり鉢で細粉砕して粉末にした後、２ｇを計
って２０ｍｌの抽出緩衝溶液(extraction buffer;0.2M
Tris・HC1, PH 8.5, 0.25M NaCl, 25mM EDTA, 0.5%(w/
v) SDS)に入れてフェノール１４mlとクロロホルム６ml
を加えて緩やかに振る。遠心分離して上澄液だけを取っ
た後、RNアーゼ A(10mg/ml)１５μｌを添加して３７℃
で３０分間反応させ、プロテイナーゼＫ(Proteinase K)
(10mg/ml)１５μｌを添加して、６０℃で１５分間反応
させた。反応後、同一容量のフェノール：クロロホル
ム：イソアミールアルコール(25:24:1)を加えて良く混
ぜて、４℃、12000ｘgで３０分間遠心分離して上澄液を
取った、分離した上澄液に同量のクロロホルム:イソア
ミールアルコール(24:1)を入れて良く混ぜた後、同一条
件で遠心分離して上澄液を得た。この溶液に0.54容のイ
ソプロパノール(isopropanol)を添加し、同一条件で遠
心分離してＤＮＡペレット(pellet)を得た。ＤＮＡペレ
ットは７０％エタノールで洗浄して空気中で乾燥し、8m
lのTE緩衝溶液(10mM Tris・HCl, 1mM EDTA, pH 8.0)に
溶かして−２０℃で保管し使用した。実施例３：ミトコンドリアＤＮＡの分離 前記実施例２で分離された菌株それぞれの全ＤＮＡから
ミトコンドリアＤＮＡを得るために超遠心分離をした。
即ち、8mlのＤＮＡ溶液に8.8gの塩化セシウム(Cesium c
hloride;Sigma, U. S. A)と6μlのビスベンズイミド溶
液(bisbenzimidesolution)(10mg/ml)を混合し、２０
℃、40000ｘgの条件で４０時間超遠心分離した。超遠心
分離後、紫外線灯下で現われる二つのＤＮＡバンドのう
ち上バンドだけを２１ゲージ(gauge)注射針で回収し
た。回収したミトコンドリアＤＮＡ分画はビスベンズイ
ミド(bisbenzimide)を除去するために飽和塩化セシウム
イソプロパノール(CsCl-saturated isopropanol)を同一
容量で添加した後、弱くボルテキシング(Vortexing)
し、４℃で1200ｘgに遠心分離して６〜７回洗浄した。
塩化セシウムを除去するためにミトコンドリアＤＮＡ分
画に３倍容の７０％エタノールを添加して４℃で100×g
で10分間遠心分離してミトコンドリアＤＮＡを沈澱させ
た。ミトコンドリアＤＮＡは７０％エタノールで更に洗
浄した後、常温で乾燥してTE buffer(PH 8.0)に溶か
し、分光光度計(DU-64 Spectrometer Beckman, U.S. A)
で260nmの波長で定量して−２０℃で保管し使用した。実施例４：ミトコンドリアＤＮＡの制限酵素消化 本実施例の実験に用いた制限酵素及び緩衝溶液は、Boeh
ringer Mannheim(独国)から購入し、制限酵素とそれら
の認識部位は表２に示した。前記実施例３で得た菌株そ
れぞれのミトコンドリアＤＮＡ試料は、制限酵素反応溶
液10μlに1μgになるように用い、３７℃で３時間反応
させた。
した。前記実施例１において培養が終った菌糸体それぞ
れを、20mM EDTAで洗浄した後、フィルターペーパー(fi
lter paper;Waterman no.1)を用いた真空濾過法により
得て、−７０℃で氷らせて凍結乾燥した。凍結乾燥され
た菌糸体はすり鉢で細粉砕して粉末にした後、２ｇを計
って２０ｍｌの抽出緩衝溶液(extraction buffer;0.2M
Tris・HC1, PH 8.5, 0.25M NaCl, 25mM EDTA, 0.5%(w/
v) SDS)に入れてフェノール１４mlとクロロホルム６ml
を加えて緩やかに振る。遠心分離して上澄液だけを取っ
た後、RNアーゼ A(10mg/ml)１５μｌを添加して３７℃
で３０分間反応させ、プロテイナーゼＫ(Proteinase K)
(10mg/ml)１５μｌを添加して、６０℃で１５分間反応
させた。反応後、同一容量のフェノール：クロロホル
ム：イソアミールアルコール(25:24:1)を加えて良く混
ぜて、４℃、12000ｘgで３０分間遠心分離して上澄液を
取った、分離した上澄液に同量のクロロホルム:イソア
ミールアルコール(24:1)を入れて良く混ぜた後、同一条
件で遠心分離して上澄液を得た。この溶液に0.54容のイ
ソプロパノール(isopropanol)を添加し、同一条件で遠
心分離してＤＮＡペレット(pellet)を得た。ＤＮＡペレ
ットは７０％エタノールで洗浄して空気中で乾燥し、8m
lのTE緩衝溶液(10mM Tris・HCl, 1mM EDTA, pH 8.0)に
溶かして−２０℃で保管し使用した。実施例３：ミトコンドリアＤＮＡの分離 前記実施例２で分離された菌株それぞれの全ＤＮＡから
ミトコンドリアＤＮＡを得るために超遠心分離をした。
即ち、8mlのＤＮＡ溶液に8.8gの塩化セシウム(Cesium c
hloride;Sigma, U. S. A)と6μlのビスベンズイミド溶
液(bisbenzimidesolution)(10mg/ml)を混合し、２０
℃、40000ｘgの条件で４０時間超遠心分離した。超遠心
分離後、紫外線灯下で現われる二つのＤＮＡバンドのう
ち上バンドだけを２１ゲージ(gauge)注射針で回収し
た。回収したミトコンドリアＤＮＡ分画はビスベンズイ
ミド(bisbenzimide)を除去するために飽和塩化セシウム
イソプロパノール(CsCl-saturated isopropanol)を同一
容量で添加した後、弱くボルテキシング(Vortexing)
し、４℃で1200ｘgに遠心分離して６〜７回洗浄した。
塩化セシウムを除去するためにミトコンドリアＤＮＡ分
画に３倍容の７０％エタノールを添加して４℃で100×g
で10分間遠心分離してミトコンドリアＤＮＡを沈澱させ
た。ミトコンドリアＤＮＡは７０％エタノールで更に洗
浄した後、常温で乾燥してTE buffer(PH 8.0)に溶か
し、分光光度計(DU-64 Spectrometer Beckman, U.S. A)
で260nmの波長で定量して−２０℃で保管し使用した。実施例４：ミトコンドリアＤＮＡの制限酵素消化 本実施例の実験に用いた制限酵素及び緩衝溶液は、Boeh
ringer Mannheim(独国)から購入し、制限酵素とそれら
の認識部位は表２に示した。前記実施例３で得た菌株そ
れぞれのミトコンドリアＤＮＡ試料は、制限酵素反応溶
液10μlに1μgになるように用い、３７℃で３時間反応
させた。
【００２１】
【表２】
【００２２】実施例５：アガロースゲル(Agarose gel)
電気泳動 前記実施例４で制限酵素反応が終った試料は、ゲルロー
ディング緩衝溶液(gelloading buffer;0.25% ブロモフ
ェノールブルー（bromophenol blue）, 0.25%キシレン
シアノールFF, 30%グリセロール水溶液)と混合して電気
泳動した。電気泳動は水平電気泳動装置(BRL, U. S. A)
を用いて1%アガロースゲル(agarose MP,Boehringer Man
nheim co.，独国)でTAE緩衝溶液(40mM Tris-acetate, 1
mM EDTA, pH 8.0)を使用して５０Ｖで４時間実施した。
展開後のゲルは臭化エチジウム(ethidium bromide;0.5
μg/ml水溶液)で染色した。表３に各菌株のミトコンド
リアＤＮＡの大きさをまとめて示した。
電気泳動 前記実施例４で制限酵素反応が終った試料は、ゲルロー
ディング緩衝溶液(gelloading buffer;0.25% ブロモフ
ェノールブルー（bromophenol blue）, 0.25%キシレン
シアノールFF, 30%グリセロール水溶液)と混合して電気
泳動した。電気泳動は水平電気泳動装置(BRL, U. S. A)
を用いて1%アガロースゲル(agarose MP,Boehringer Man
nheim co.，独国)でTAE緩衝溶液(40mM Tris-acetate, 1
mM EDTA, pH 8.0)を使用して５０Ｖで４時間実施した。
展開後のゲルは臭化エチジウム(ethidium bromide;0.5
μg/ml水溶液)で染色した。表３に各菌株のミトコンド
リアＤＮＡの大きさをまとめて示した。
【００２３】
【表３】
【００２４】実施例６：ＲＦＬＰ(restriction fragmen
t length polymorphism)分析 ペリヌス属菌株間のＤＮＡ近縁関係の分析及び調査は、
NeiとLiの方法(1979)により行った。即ち、制限酵素で
消化した各菌株のミトコンドリアＤＮＡ断片を前記実施
例５で説明した通り、アガロースゲルに電気泳動し、等
距離で移動するＤＮＡ断片を同一のものと仮定して制限
酵素断片類似度（Ｆ値）と塩基位置当り塩基置換度（Ｐ
値）を求め、Ｐ値からペリヌス・リンテウス・ユー菌株
KCTC 0399BPと他のペリヌス属菌株との近縁関係をUPGMA
(Unweighted Pari-Group Method,arithmetic average)C
lustring方法により分析した。Ｐ値とＦ値は下記式に基
づき計算した。 制限酵素断片類似度 F=2nxy/(nx+ny) (nx、nyは各菌株x、yのDNA断片の総数、nxyは二つのペ
リヌス菌株間の共通DNA断片数) 塩基位置当り塩基置換度 P=-(1nF)/r (rは制限酵素認識部位の塩基対数)表４に、制限酵素Bam
HIで処理した各菌株のＦ値とこれに相応するＰ値を、
又、表５には制限酵素CIaIで処理した各菌株のＦ値とこ
れに相応するＰ値を、表６には制限酵素EcoRIで処理し
た各菌株のＦ値とこれに相応するＰ値を、表７には制限
酵素PvuIIで処理した各菌株のＦ値とこれに相応するＰ
値を示し、そして表８には共通切片の比率と表４〜７の
斜線上Ｐ値に相応する算術平均的な距離を示した。又、
この結果により図１のような進化系統図を作成し、これ
に従って本発明の新規の菌株ペリヌスリンテウスユー菌
株KCTC 0399BPは、ペリヌス属菌株と有縁関係がある新
たに分化された菌株であることを示した。
t length polymorphism)分析 ペリヌス属菌株間のＤＮＡ近縁関係の分析及び調査は、
NeiとLiの方法(1979)により行った。即ち、制限酵素で
消化した各菌株のミトコンドリアＤＮＡ断片を前記実施
例５で説明した通り、アガロースゲルに電気泳動し、等
距離で移動するＤＮＡ断片を同一のものと仮定して制限
酵素断片類似度（Ｆ値）と塩基位置当り塩基置換度（Ｐ
値）を求め、Ｐ値からペリヌス・リンテウス・ユー菌株
KCTC 0399BPと他のペリヌス属菌株との近縁関係をUPGMA
(Unweighted Pari-Group Method,arithmetic average)C
lustring方法により分析した。Ｐ値とＦ値は下記式に基
づき計算した。 制限酵素断片類似度 F=2nxy/(nx+ny) (nx、nyは各菌株x、yのDNA断片の総数、nxyは二つのペ
リヌス菌株間の共通DNA断片数) 塩基位置当り塩基置換度 P=-(1nF)/r (rは制限酵素認識部位の塩基対数)表４に、制限酵素Bam
HIで処理した各菌株のＦ値とこれに相応するＰ値を、
又、表５には制限酵素CIaIで処理した各菌株のＦ値とこ
れに相応するＰ値を、表６には制限酵素EcoRIで処理し
た各菌株のＦ値とこれに相応するＰ値を、表７には制限
酵素PvuIIで処理した各菌株のＦ値とこれに相応するＰ
値を示し、そして表８には共通切片の比率と表４〜７の
斜線上Ｐ値に相応する算術平均的な距離を示した。又、
この結果により図１のような進化系統図を作成し、これ
に従って本発明の新規の菌株ペリヌスリンテウスユー菌
株KCTC 0399BPは、ペリヌス属菌株と有縁関係がある新
たに分化された菌株であることを示した。
【００２５】
【表４】
【００２６】
【表５】
【００２７】
【表６】
【００２８】
【表７】
【００２９】
【表８】
【００３０】実施例７：本発明ペリヌス・リンテウス・
ユー(Phellinus linteus Yoo)菌株KCTC0399BPの微生物
学的特性調査 前記実施例１〜６までの結果から、ペリヌス属菌株と近
縁関係がある、新たに分化された新規の菌株であるのが
証明された本発明の新規の菌株の微生物学的特性を調べ
た。この菌株の子実体は、無柄であり多年生で木質部分
が形成されており、笠は半円形で幅10cm、厚さ約4cmで
あった。採取した桑黄茸の表面は、初めには暗褐色を呈
していたが、後には黒褐色に変化し、多くの巨裂を呈し
荒かった。下面は初めには鮮黄色を帯びた後、黄褐色に
変った。下面の管孔は多層であり、孔の入口は微細であ
り、胞子は類球形、淡黄褐色で3〜4μm、剛毛体は多数
であり、厚膜は15〜30×8〜10μmであった。
ユー(Phellinus linteus Yoo)菌株KCTC0399BPの微生物
学的特性調査 前記実施例１〜６までの結果から、ペリヌス属菌株と近
縁関係がある、新たに分化された新規の菌株であるのが
証明された本発明の新規の菌株の微生物学的特性を調べ
た。この菌株の子実体は、無柄であり多年生で木質部分
が形成されており、笠は半円形で幅10cm、厚さ約4cmで
あった。採取した桑黄茸の表面は、初めには暗褐色を呈
していたが、後には黒褐色に変化し、多くの巨裂を呈し
荒かった。下面は初めには鮮黄色を帯びた後、黄褐色に
変った。下面の管孔は多層であり、孔の入口は微細であ
り、胞子は類球形、淡黄褐色で3〜4μm、剛毛体は多数
であり、厚膜は15〜30×8〜10μmであった。
【００３１】実験の結果、この菌株は日本で発行された
「原色日本新菌類図鑑(II)、Hoikusha発行、イマゼキロ
クヤ及びホンゴーツコウ編著p189」に記録された桑黄茸
(Phellinus linteus)と殆ど一致するが桑黄茸の新菌株
と認め、本発明者らはこの菌株の菌株名をペリヌス・リ
ンテウス・ユー(Phellinus linteus Yoo)と命名した。
前述した通り、この菌株は韓国科学技術研究院生命工学
研究所に１９９７年１１月１２日付寄託番号KCTC 0399B
Pで寄託された。実施例８：ペリヌスリンテウスユー菌株(Phellinus lin
teus Yoo;KCTC 0399BP)の培養 本発明の新規のペリヌス・リンテウス・ユー菌株を液体
培養するために培地１リットル当り葡萄糖50g、ペプト
ン10g、酵母抽出物10g及びKH2PO4 0.8g、MgSO4・7H2O
0.5g、CaCl2 0.3gを混合した無機塩類溶液1mLが入って
いる液体培地をpH6.0に調整した後、滅菌して用いた。
この際、菌糸体を培養するために5リットル発酵槽を用
いて3.5リットルの液体培地を作り、温度２８℃、通気
量2vvm、回転数160rpm条件で１１日間培養し、この際の
菌糸体収率は５日後に最も高く、リットル当り30gであ
った(図２)。５日間培養した菌糸体の熱水抽出で得られ
る多糖類物質の収率は、表９から見られる通り、菌糸体
乾燥重量当り0.873％であった。
「原色日本新菌類図鑑(II)、Hoikusha発行、イマゼキロ
クヤ及びホンゴーツコウ編著p189」に記録された桑黄茸
(Phellinus linteus)と殆ど一致するが桑黄茸の新菌株
と認め、本発明者らはこの菌株の菌株名をペリヌス・リ
ンテウス・ユー(Phellinus linteus Yoo)と命名した。
前述した通り、この菌株は韓国科学技術研究院生命工学
研究所に１９９７年１１月１２日付寄託番号KCTC 0399B
Pで寄託された。実施例８：ペリヌスリンテウスユー菌株(Phellinus lin
teus Yoo;KCTC 0399BP)の培養 本発明の新規のペリヌス・リンテウス・ユー菌株を液体
培養するために培地１リットル当り葡萄糖50g、ペプト
ン10g、酵母抽出物10g及びKH2PO4 0.8g、MgSO4・7H2O
0.5g、CaCl2 0.3gを混合した無機塩類溶液1mLが入って
いる液体培地をpH6.0に調整した後、滅菌して用いた。
この際、菌糸体を培養するために5リットル発酵槽を用
いて3.5リットルの液体培地を作り、温度２８℃、通気
量2vvm、回転数160rpm条件で１１日間培養し、この際の
菌糸体収率は５日後に最も高く、リットル当り30gであ
った(図２)。５日間培養した菌糸体の熱水抽出で得られ
る多糖類物質の収率は、表９から見られる通り、菌糸体
乾燥重量当り0.873％であった。
【００３２】
【表９】
【００３３】実施例９：ペリヌス・リンテウス・ユー菌
株の培養菌糸体抽出 本発明の新規のペリヌス・リンテウス・ユー菌株の培養
菌糸体を次のような方法により抽出・精製して免疫増強
活性粗抽出物を得た。前記実施例８で得られた培養菌糸
体280gを熱水抽出した後、濃縮して3gの熱水抽出液を得
た。この抽出液にエタノール濃度が80%になるようにエ
タノールを加えた後、４℃で２４時間放置した後に遠心
分離して、上澄液と沈澱物を得た。沈澱物は水に溶かし
た後、透析膜(cellulose tubing,日本三光純薬製品)を
用いて１０℃低温で７２時間の間に１２時間間隔で透析
液を交換しながら透析した。透析膜内の内液を凍結乾燥
して2.45gの粗抽出物を得た。実施例１０：純粋な免疫活性物質の分離 前記実施例９で得られた粗抽出物をDEAE-セルロースと
ゲル濾過クロマトグラフィーを順次に行って純粋な活性
分画を得た。先ず、粗抽出物を5mMソジウムホスフェー
ト緩衝液(pH 7.2)に溶解した後、DEAE-セルロースカラ
ムにアプライし、同一緩衝溶液で洗浄した後、同一緩衝
溶液に0から1M濃度のNaClを調製してgradientで１分当
り5mLの流速で溶出させて各試験管に15mLずつ分取し
た。フェノール−硫酸定量法より糖含量を、ブラッドフ
ォード法により蛋白質含量を決定した。この際、得られ
た糖含量粗抽出物分画はToyopearl HW 65Fゲル濾過クロ
マトグラフィーにかけて分子量が均一で性質が同一な純
粋活性分画を得た。溶出は水で行った。糖と蛋白質含量
は前記の同一な方法で決定した。このようにして得られ
た純粋な免疫活性物質をピーエル(PL)とし、抽出及び精
製過程は図３に示した。 実施例１１：抽出分画多糖類物質の免疫増強活性の調査 担子菌由来の多糖類物質は、生体内の免疫機構であるリ
ンパ球の増殖又は活性に影響を与えることにより外部因
子に対する免疫性を増強させ、この結果、癌細胞の破壊
をもたらすと知られている。このような作用は直接的な
細胞毒性に起因するのではなく、免疫活性により媒介さ
れるもので、生体内の副作用が少ない長所がある。即
ち、T-細胞とB-細胞リンパ球のそれぞれに対する細胞毒
性作用と免疫作用体である抗体形成を誘導して免疫活性
が増加し、その結果として免疫抗癌活性を示す。従っ
て、抗体形成リンパ球をカウントし、リンパ球とT-細胞
の増殖程度を測定することにより、免疫抗癌活性を間接
的に説明することができる。
株の培養菌糸体抽出 本発明の新規のペリヌス・リンテウス・ユー菌株の培養
菌糸体を次のような方法により抽出・精製して免疫増強
活性粗抽出物を得た。前記実施例８で得られた培養菌糸
体280gを熱水抽出した後、濃縮して3gの熱水抽出液を得
た。この抽出液にエタノール濃度が80%になるようにエ
タノールを加えた後、４℃で２４時間放置した後に遠心
分離して、上澄液と沈澱物を得た。沈澱物は水に溶かし
た後、透析膜(cellulose tubing,日本三光純薬製品)を
用いて１０℃低温で７２時間の間に１２時間間隔で透析
液を交換しながら透析した。透析膜内の内液を凍結乾燥
して2.45gの粗抽出物を得た。実施例１０：純粋な免疫活性物質の分離 前記実施例９で得られた粗抽出物をDEAE-セルロースと
ゲル濾過クロマトグラフィーを順次に行って純粋な活性
分画を得た。先ず、粗抽出物を5mMソジウムホスフェー
ト緩衝液(pH 7.2)に溶解した後、DEAE-セルロースカラ
ムにアプライし、同一緩衝溶液で洗浄した後、同一緩衝
溶液に0から1M濃度のNaClを調製してgradientで１分当
り5mLの流速で溶出させて各試験管に15mLずつ分取し
た。フェノール−硫酸定量法より糖含量を、ブラッドフ
ォード法により蛋白質含量を決定した。この際、得られ
た糖含量粗抽出物分画はToyopearl HW 65Fゲル濾過クロ
マトグラフィーにかけて分子量が均一で性質が同一な純
粋活性分画を得た。溶出は水で行った。糖と蛋白質含量
は前記の同一な方法で決定した。このようにして得られ
た純粋な免疫活性物質をピーエル(PL)とし、抽出及び精
製過程は図３に示した。 実施例１１：抽出分画多糖類物質の免疫増強活性の調査 担子菌由来の多糖類物質は、生体内の免疫機構であるリ
ンパ球の増殖又は活性に影響を与えることにより外部因
子に対する免疫性を増強させ、この結果、癌細胞の破壊
をもたらすと知られている。このような作用は直接的な
細胞毒性に起因するのではなく、免疫活性により媒介さ
れるもので、生体内の副作用が少ない長所がある。即
ち、T-細胞とB-細胞リンパ球のそれぞれに対する細胞毒
性作用と免疫作用体である抗体形成を誘導して免疫活性
が増加し、その結果として免疫抗癌活性を示す。従っ
て、抗体形成リンパ球をカウントし、リンパ球とT-細胞
の増殖程度を測定することにより、免疫抗癌活性を間接
的に説明することができる。
【００３４】本発明においては抗体形成リンパ球をカウ
ントする抗体形成細胞計算法(antibody forming cell m
ethod)、T-細胞の増殖程度を測定する混合リンパ球応答
(Mixed lymphocytes response)とリンパ球の増殖効果が
判る細胞内の核ＤＮＡ合成量を同位元素で置換されたチ
ミジン(3H ‐Thymidine)を用いて測定することにより、
活性の指標とした。実験結果は表１０に示した。
ントする抗体形成細胞計算法(antibody forming cell m
ethod)、T-細胞の増殖程度を測定する混合リンパ球応答
(Mixed lymphocytes response)とリンパ球の増殖効果が
判る細胞内の核ＤＮＡ合成量を同位元素で置換されたチ
ミジン(3H ‐Thymidine)を用いて測定することにより、
活性の指標とした。実験結果は表１０に示した。
【００３５】
【表１０】
【００３６】本発明の新規のペリヌス・リンテウス菌糸
体から得た多糖類物質は、対照区に比べて約５倍高いリ
ンパ球増殖及びT-細胞活性効果を示し、B細胞の抗体形
成能の場合、免疫諸剤のうち効果が最も優れているが、
生体内の副作用に因り用いることができない陽性対照区
リポポリサカライドの活性程度とは殆ど類似の水準を示
した。実施例１２：免疫増強活性多糖類物質の構成糖単位及び
糖組成の調査 実施例１０で得た多糖類物質の構成単糖類成分を分析す
るためにガスクロマトグラフィーを実施した(図４)。更
に、構成成分は炭水化物の場合、フェノール‐硫酸法に
より測定し、蛋白質の場合、Folin−フェノール法によ
り測定した。分析機種として、ヒューレットパッカード
(HP 5890 GC)を用い、カラムはヒューズドシリカキャピ
ラリカラムＳＰ−2330(fused silica capillary column
sp-2330, 0.32mm x 30cm)を用いた。下記条件でガスク
ロマトグラフィーを行った。カラム温度を初期に２００
℃で２分間維持した後、１分間隔で４℃ずつ温度を高め
て最終温度が２５０℃で２分間維持されるようにして測
定し、ディテクター(detector)の温度は２６０℃、注入
部(injector)の温度は２５０℃に維持した。実施例１１
で得た各抽出分画多糖類物質2mgずつをTFAで加水分解
し、ソジウムボロハイドライド(NaBH4)で還元した後、
無水酢酸でアセチル化してアジトールアセテート(adito
l acetate)とし、前記の条件でガスクロマトグラフィー
を実施した。その結果を下記表１１に示した・
体から得た多糖類物質は、対照区に比べて約５倍高いリ
ンパ球増殖及びT-細胞活性効果を示し、B細胞の抗体形
成能の場合、免疫諸剤のうち効果が最も優れているが、
生体内の副作用に因り用いることができない陽性対照区
リポポリサカライドの活性程度とは殆ど類似の水準を示
した。実施例１２：免疫増強活性多糖類物質の構成糖単位及び
糖組成の調査 実施例１０で得た多糖類物質の構成単糖類成分を分析す
るためにガスクロマトグラフィーを実施した(図４)。更
に、構成成分は炭水化物の場合、フェノール‐硫酸法に
より測定し、蛋白質の場合、Folin−フェノール法によ
り測定した。分析機種として、ヒューレットパッカード
(HP 5890 GC)を用い、カラムはヒューズドシリカキャピ
ラリカラムＳＰ−2330(fused silica capillary column
sp-2330, 0.32mm x 30cm)を用いた。下記条件でガスク
ロマトグラフィーを行った。カラム温度を初期に２００
℃で２分間維持した後、１分間隔で４℃ずつ温度を高め
て最終温度が２５０℃で２分間維持されるようにして測
定し、ディテクター(detector)の温度は２６０℃、注入
部(injector)の温度は２５０℃に維持した。実施例１１
で得た各抽出分画多糖類物質2mgずつをTFAで加水分解
し、ソジウムボロハイドライド(NaBH4)で還元した後、
無水酢酸でアセチル化してアジトールアセテート(adito
l acetate)とし、前記の条件でガスクロマトグラフィー
を実施した。その結果を下記表１１に示した・
【００３７】
【表１１】
【００３８】実施例１３：免疫増強活性多糖類物質の構
造分析 免疫増強活性多糖類物質の構造分析を実施した。先ず、
純度をHW 65Fゲルカラムクロマトグラフィーによって確
めた。このクロマトグラフィーで単一対称ピークを示し
たのでPLが純粋であることが確認された(図５)。炭素核
磁気共鳴スペクトル分析の結果(図６)、グルコース単位
がα(１→４)及びβ(１→６)結合によって結合された長
鎖を形成し、この長鎖にマンノースとガラクトースが分
枝として結合されたガラクトマンノグルカン(Galactoma
nnoglucan)と同定された。
造分析 免疫増強活性多糖類物質の構造分析を実施した。先ず、
純度をHW 65Fゲルカラムクロマトグラフィーによって確
めた。このクロマトグラフィーで単一対称ピークを示し
たのでPLが純粋であることが確認された(図５)。炭素核
磁気共鳴スペクトル分析の結果(図６)、グルコース単位
がα(１→４)及びβ(１→６)結合によって結合された長
鎖を形成し、この長鎖にマンノースとガラクトースが分
枝として結合されたガラクトマンノグルカン(Galactoma
nnoglucan)と同定された。
【００３９】以上の結果、構成単糖類成分結果とよく一
致し、抽出分画単糖類がβ-グルカンとは構造が相違す
る新規の多糖類物質であることが判明した。実施例１４：ペリヌス属菌株培養菌糸体の抽出、精製及
び免疫増強活性調査 前記実施例８〜１１まで実施した方法と同様にペリヌス
属に属するペリヌス・イグニアリウス(Phellinus ignia
rius)、ペリヌス・バウミ(P. baumi)、ペリヌス・ピニ
(P. pini)、ペリヌス・ギルブス(P. gilvus)及びペリヌ
ス・ニグリカンス(P. nigricans)を培養し、菌糸体を
得、多糖類物質を抽出・精製した後、これらを使用して
T-細胞とB-細胞リンパ球のそれぞれの細胞毒性作用と免
疫作用体である抗体形成の増強を誘導した。抗体形成リ
ンパ球をカウントし、またT-細胞の増殖程度を測定して
抗癌免疫活性を間接的に証明した。結果は、前記実施例
１１と殆ど同じであることが分かった。実施例１５：ペリヌス属菌株子実体の抽出、精製及び免
疫増強活性調査 前記実施例８〜１１まで実施した方法と同様にペリヌス
属に属するペリヌス・イグニアリウス(Phellinus ignia
rius)、ペリヌス・バウミ(P. baumi)、ペリヌス・ピニ
(P. pini)、ペリヌス・ギルブス(P. gilvus)及びペリヌ
ス・ニグリカンス(P. nigricans)菌株を培養し、子実体
を収得して多糖類物質を抽出・精製した後、これらを使
用してT-細胞とB-細胞リンパ球のそれぞれの細胞毒性作
用と免疫作用体である抗体形成の増強を誘導した。抗体
形成リンパ球をカウントし、T-細胞の増殖程度を測定し
て抗癌免疫活性を間接的に証明した。結果は、前記実施
例１１と殆ど同じであることが分かった。実施例１６：投与時間による多糖類物質の癌細胞に対す
る抗癌活性調査 多糖類物質の抗癌活性は、マウス由来癌細胞であるB16F
10皮膚癌細胞を利用して測定した。B16F10皮膚癌細胞は
10%の血清を含有したRPMI1640培地で培養し、１週に２
回程継代培養した。B16F10皮膚癌細胞は、BDF1マウス当
り100,000細胞を移植して、３０日間マウスの生存率を
調べた。多糖類物質を癌細胞移植１週間前から癌細胞移
植後１２日まで持続的に腹腔投与する前処置を行い生存
率を調べ、一方癌細胞を移植した後１２日間多糖類物質
を腹腔投与する後処置を行い生存率をそれぞれ調べた。
実験の結果、図７に示す通り、未処置群の生存率が最も
少なく、次が多糖類物質後処置群、その次の多糖類物質
前処置群であることが分かった。これを表１２にまとめ
た。B16F10皮膚癌細胞を移植したマウスの場合、平均生
存が２０.８日であり、多糖類物質を前処置した場合に
は平均生存が２９日であり、多糖類物質を後処置した場
合には２５.８日であった。この際、試験マウスに体重
の変化はなかった。
致し、抽出分画単糖類がβ-グルカンとは構造が相違す
る新規の多糖類物質であることが判明した。実施例１４：ペリヌス属菌株培養菌糸体の抽出、精製及
び免疫増強活性調査 前記実施例８〜１１まで実施した方法と同様にペリヌス
属に属するペリヌス・イグニアリウス(Phellinus ignia
rius)、ペリヌス・バウミ(P. baumi)、ペリヌス・ピニ
(P. pini)、ペリヌス・ギルブス(P. gilvus)及びペリヌ
ス・ニグリカンス(P. nigricans)を培養し、菌糸体を
得、多糖類物質を抽出・精製した後、これらを使用して
T-細胞とB-細胞リンパ球のそれぞれの細胞毒性作用と免
疫作用体である抗体形成の増強を誘導した。抗体形成リ
ンパ球をカウントし、またT-細胞の増殖程度を測定して
抗癌免疫活性を間接的に証明した。結果は、前記実施例
１１と殆ど同じであることが分かった。実施例１５：ペリヌス属菌株子実体の抽出、精製及び免
疫増強活性調査 前記実施例８〜１１まで実施した方法と同様にペリヌス
属に属するペリヌス・イグニアリウス(Phellinus ignia
rius)、ペリヌス・バウミ(P. baumi)、ペリヌス・ピニ
(P. pini)、ペリヌス・ギルブス(P. gilvus)及びペリヌ
ス・ニグリカンス(P. nigricans)菌株を培養し、子実体
を収得して多糖類物質を抽出・精製した後、これらを使
用してT-細胞とB-細胞リンパ球のそれぞれの細胞毒性作
用と免疫作用体である抗体形成の増強を誘導した。抗体
形成リンパ球をカウントし、T-細胞の増殖程度を測定し
て抗癌免疫活性を間接的に証明した。結果は、前記実施
例１１と殆ど同じであることが分かった。実施例１６：投与時間による多糖類物質の癌細胞に対す
る抗癌活性調査 多糖類物質の抗癌活性は、マウス由来癌細胞であるB16F
10皮膚癌細胞を利用して測定した。B16F10皮膚癌細胞は
10%の血清を含有したRPMI1640培地で培養し、１週に２
回程継代培養した。B16F10皮膚癌細胞は、BDF1マウス当
り100,000細胞を移植して、３０日間マウスの生存率を
調べた。多糖類物質を癌細胞移植１週間前から癌細胞移
植後１２日まで持続的に腹腔投与する前処置を行い生存
率を調べ、一方癌細胞を移植した後１２日間多糖類物質
を腹腔投与する後処置を行い生存率をそれぞれ調べた。
実験の結果、図７に示す通り、未処置群の生存率が最も
少なく、次が多糖類物質後処置群、その次の多糖類物質
前処置群であることが分かった。これを表１２にまとめ
た。B16F10皮膚癌細胞を移植したマウスの場合、平均生
存が２０.８日であり、多糖類物質を前処置した場合に
は平均生存が２９日であり、多糖類物質を後処置した場
合には２５.８日であった。この際、試験マウスに体重
の変化はなかった。
【００４０】
【表１２】
【００４１】実施例１７：免疫化学療法併用による多糖
類物質の癌細胞に対する抗癌活性調査 実験例１：アドリアマイシン(adriamycin)と多糖類物質
併用投与による抗癌活性調査 多糖類物質とアドリアマイシンの併用処置による抗癌活
性を測定するためにB16F10皮膚癌細胞の同種移植試験系
を用いた。皮膚癌細胞は腹腔に移植した。アドリアマイ
シンは癌細胞を移植した後１２日間腹腔に投与し、多糖
類物質は癌細胞移植７日前から癌細胞移植後１２日目で
腹腔に投与した。動物の生存を６０日間にわたり毎日測
定した。ここで用いられたアドリアマイシンは毒性がな
い低濃度を用いた。実験の結果、図８ａ及び図８ｂに示
す通り、未処置群は生存率が急激に減少し、多糖類物質
単独処置時には未処置群より生存率がかなり増加した。
図８ａにアドリアマイシン0.1mg/kgの濃度で処置した場
合と図８ｂの0.3mg/kgの濃度で処置した場合には0.3mg/
kgで処理した場合が生存率が高いことが分かるし、併用
処置した場合にあってもアドリアマイシン0.1mg/kgを共
に用いることよりは、0.3mg/kgを共に用いる方がマウス
の生存率をもっと高めることができることが分かった。
この結果を表１３にまとめた。B16F10皮膚癌を移植した
マウスの平均生存が１８.１日であり、多糖類物質の単
独処置によるマウスの平均生存が３１日に増延長され
た。アドリアマイシン0.1mg/kgの濃度で処置するとマウ
スの平均生存が３５.４日であり、多糖類物質を併用処
置すると４６.９日以上に増加した。アドリアマイシン
0.3mg/kgの濃度で処置するとマウスの平均生存が４０.
１日以上であり、多糖類物質の併用処置により５７.８
日以上に延長された。この際、マウスの体重は減少しな
かった。
類物質の癌細胞に対する抗癌活性調査 実験例１：アドリアマイシン(adriamycin)と多糖類物質
併用投与による抗癌活性調査 多糖類物質とアドリアマイシンの併用処置による抗癌活
性を測定するためにB16F10皮膚癌細胞の同種移植試験系
を用いた。皮膚癌細胞は腹腔に移植した。アドリアマイ
シンは癌細胞を移植した後１２日間腹腔に投与し、多糖
類物質は癌細胞移植７日前から癌細胞移植後１２日目で
腹腔に投与した。動物の生存を６０日間にわたり毎日測
定した。ここで用いられたアドリアマイシンは毒性がな
い低濃度を用いた。実験の結果、図８ａ及び図８ｂに示
す通り、未処置群は生存率が急激に減少し、多糖類物質
単独処置時には未処置群より生存率がかなり増加した。
図８ａにアドリアマイシン0.1mg/kgの濃度で処置した場
合と図８ｂの0.3mg/kgの濃度で処置した場合には0.3mg/
kgで処理した場合が生存率が高いことが分かるし、併用
処置した場合にあってもアドリアマイシン0.1mg/kgを共
に用いることよりは、0.3mg/kgを共に用いる方がマウス
の生存率をもっと高めることができることが分かった。
この結果を表１３にまとめた。B16F10皮膚癌を移植した
マウスの平均生存が１８.１日であり、多糖類物質の単
独処置によるマウスの平均生存が３１日に増延長され
た。アドリアマイシン0.1mg/kgの濃度で処置するとマウ
スの平均生存が３５.４日であり、多糖類物質を併用処
置すると４６.９日以上に増加した。アドリアマイシン
0.3mg/kgの濃度で処置するとマウスの平均生存が４０.
１日以上であり、多糖類物質の併用処置により５７.８
日以上に延長された。この際、マウスの体重は減少しな
かった。
【００４２】
【表１３】
【００４３】実験例２：マイトマイシンＣ(mitomycin
C)と多糖類物質併用投与による抗癌活性調査 多糖類物質とマイトマイシンCの併用処理による抗癌活
性を測定するために、前記実験１の通り、B16F10皮膚癌
細胞の同種移植試験系を用い、皮膚癌細胞を腹腔に移植
した。マイトマイシンCは、癌細胞を移植した後１２日
間腹腔に投与し、多糖類物質は癌細胞を移植前７日から
癌細胞移植後１２日めで腹腔に投与した。動物の生存率
は６０日間にわたり測定した。ここで用いられたマイト
マイシンCは毒性がない低濃度で用いた。実験結果、実
験１と類似に未処置群は生存率が急激に減少し、多糖類
物質単独処置時には未処置群より生存率がかなり増加し
た。この結果を表１４にまとめた。B16F10皮膚癌を移植
したマウスの平均生存が１８.１日であり、多糖類物質
の単独処置によるマウスの平均生存が３１日に増加し
た。マイトマイシンC 0.2mg/kgの濃度で処置するとマ
ウスの平均生存が３２.５日であり、多糖類物質を併用
処置すると４３.５日以上に増加した。マイトマイシンC
0.6mg/kgの濃度で処置するとマウスの平均生存が３８.
０日以上であり、多糖類物質の併用処置により５１.５
日以上に増加した。この際、マウスの体重は減らなかっ
た。
C)と多糖類物質併用投与による抗癌活性調査 多糖類物質とマイトマイシンCの併用処理による抗癌活
性を測定するために、前記実験１の通り、B16F10皮膚癌
細胞の同種移植試験系を用い、皮膚癌細胞を腹腔に移植
した。マイトマイシンCは、癌細胞を移植した後１２日
間腹腔に投与し、多糖類物質は癌細胞を移植前７日から
癌細胞移植後１２日めで腹腔に投与した。動物の生存率
は６０日間にわたり測定した。ここで用いられたマイト
マイシンCは毒性がない低濃度で用いた。実験結果、実
験１と類似に未処置群は生存率が急激に減少し、多糖類
物質単独処置時には未処置群より生存率がかなり増加し
た。この結果を表１４にまとめた。B16F10皮膚癌を移植
したマウスの平均生存が１８.１日であり、多糖類物質
の単独処置によるマウスの平均生存が３１日に増加し
た。マイトマイシンC 0.2mg/kgの濃度で処置するとマ
ウスの平均生存が３２.５日であり、多糖類物質を併用
処置すると４３.５日以上に増加した。マイトマイシンC
0.6mg/kgの濃度で処置するとマウスの平均生存が３８.
０日以上であり、多糖類物質の併用処置により５１.５
日以上に増加した。この際、マウスの体重は減らなかっ
た。
【００４４】
【表１４】
【００４５】実験例３：シスプラチン(cisplatin)と多
糖類物質併用投与による抗癌活性調査 多糖類物質とシスプラチンの併用処置による抗癌活性を
測定するために前記実験例と同じ方法でB16F10皮膚癌細
胞の同種移植試験系を用い、皮膚癌細胞を腹腔に移植し
た。シスプラチンは癌細胞を移植した後１２日間腹腔に
投与し、多糖類物質は癌細胞移植前７日から癌細胞移植
後１２日まで腹腔に投与した。動物の生存率を６０日間
にわたり毎日測定した。ここで用いられたシスプラチン
は毒性のない低濃度で用いた。実験結果は前記実験例と
類似に未処置群は生存率が急激に減少し、多糖類物質を
単独処置時には未処置群より生存率がかなり増加した。
この結果を表１５にまとめた。シスプラチン0.5mg/kgの
濃度で処置するとマウスの平均生存が３３.０日であ
り、多糖類物質を併用処置すると４４.日以上に増加し
た。シスプラチンを1.5mg/kgの濃度で処置するとマウス
の平均生存が４０.５日以上であり、多糖類物質の併用
処置により５２.６日以上に増加した。この際、マウス
の体重は減少しなかった。
糖類物質併用投与による抗癌活性調査 多糖類物質とシスプラチンの併用処置による抗癌活性を
測定するために前記実験例と同じ方法でB16F10皮膚癌細
胞の同種移植試験系を用い、皮膚癌細胞を腹腔に移植し
た。シスプラチンは癌細胞を移植した後１２日間腹腔に
投与し、多糖類物質は癌細胞移植前７日から癌細胞移植
後１２日まで腹腔に投与した。動物の生存率を６０日間
にわたり毎日測定した。ここで用いられたシスプラチン
は毒性のない低濃度で用いた。実験結果は前記実験例と
類似に未処置群は生存率が急激に減少し、多糖類物質を
単独処置時には未処置群より生存率がかなり増加した。
この結果を表１５にまとめた。シスプラチン0.5mg/kgの
濃度で処置するとマウスの平均生存が３３.０日であ
り、多糖類物質を併用処置すると４４.日以上に増加し
た。シスプラチンを1.5mg/kgの濃度で処置するとマウス
の平均生存が４０.５日以上であり、多糖類物質の併用
処置により５２.６日以上に増加した。この際、マウス
の体重は減少しなかった。
【００４６】
【表１５】
【００４７】実験例４：5-フルオロウラシル(5-Fluoro
uracil)と多糖類物質併用投与による抗癌活性調査 多糖類物質と5-フルオロウラシルの併用処置による抗癌
活性を測定するために、前記実験例と同じ方法でB16F10
皮膚癌細胞の同種移植試験系を用い、皮膚癌細胞を腹腔
に移植した。5-フルオロウラシルは、癌細胞を移植した
後１２日間腹腔に投与し、多糖類物質は癌細胞移植前７
日から癌細胞移植後１２日まで腹腔に投与した。動物の
生存率は６０日間にわたり毎日測定した。ここで用いら
れた5-フルオロウラシルは毒性がない低濃度で用いた。
実験結果は前記実験例らと類似に未処置群は生存率が急
激に減少し、多糖類物質単独処置時には未処置群より生
存率がかなり増加した。この結果を表１６にまとめた。
5-フルオロウラシル1mg/kgの濃度で処置するとマウスの
平均生存が３４.２日であり、多糖類物質を併用して処
置すると４５.５日以上に増加した。5-フルオロウラシ
ル3mg/kgの濃度で処置するとマウスの平均生存が４０.
２日以上であり、多糖類物質の併用処置により５４.８
日以上に増加した。この際、マウスの体重は減らなかっ
た。
uracil)と多糖類物質併用投与による抗癌活性調査 多糖類物質と5-フルオロウラシルの併用処置による抗癌
活性を測定するために、前記実験例と同じ方法でB16F10
皮膚癌細胞の同種移植試験系を用い、皮膚癌細胞を腹腔
に移植した。5-フルオロウラシルは、癌細胞を移植した
後１２日間腹腔に投与し、多糖類物質は癌細胞移植前７
日から癌細胞移植後１２日まで腹腔に投与した。動物の
生存率は６０日間にわたり毎日測定した。ここで用いら
れた5-フルオロウラシルは毒性がない低濃度で用いた。
実験結果は前記実験例らと類似に未処置群は生存率が急
激に減少し、多糖類物質単独処置時には未処置群より生
存率がかなり増加した。この結果を表１６にまとめた。
5-フルオロウラシル1mg/kgの濃度で処置するとマウスの
平均生存が３４.２日であり、多糖類物質を併用して処
置すると４５.５日以上に増加した。5-フルオロウラシ
ル3mg/kgの濃度で処置するとマウスの平均生存が４０.
２日以上であり、多糖類物質の併用処置により５４.８
日以上に増加した。この際、マウスの体重は減らなかっ
た。
【００４８】
【表１６】
【００４９】実施例１８：多糖類物質のヒト由来癌細胞
に対する抗癌効果調査 多糖類物質のヒト由来癌細胞に対する抗癌免疫活性をNC
l-H23肺癌細胞を使用して検証した。NCl-H23肺癌細胞を
ヌードマウスの皮下に移植し、多糖類物質及びアドリア
マイシンを癌細胞移植後１２日間腹腔に投与した。癌細
胞の大きさを測定し、癌細胞移植後１９日目に癌を分離
して重さを測定した。ヌードマウスにはT細胞が欠乏し
ているため、主にナチュラルキラー細胞や大食細胞によ
り抗癌活性が現われる。それ故、多糖類物質による免疫
抗癌活性は、これら二つの種類の免疫細胞により媒介さ
れる。実験の結果、図９ａと図９ｂに示す通り、癌細胞
の大きさは、未処置群の増加度が最も大きく、次が多糖
類物質及びアドリアマイシンであり、重さは未処置群、
多糖類物質、アドリアマイシン順に減少した。この結果
を表１７及び表１８にまとめた。この際、用いられたマ
ウスの体重は変化がなかった。
に対する抗癌効果調査 多糖類物質のヒト由来癌細胞に対する抗癌免疫活性をNC
l-H23肺癌細胞を使用して検証した。NCl-H23肺癌細胞を
ヌードマウスの皮下に移植し、多糖類物質及びアドリア
マイシンを癌細胞移植後１２日間腹腔に投与した。癌細
胞の大きさを測定し、癌細胞移植後１９日目に癌を分離
して重さを測定した。ヌードマウスにはT細胞が欠乏し
ているため、主にナチュラルキラー細胞や大食細胞によ
り抗癌活性が現われる。それ故、多糖類物質による免疫
抗癌活性は、これら二つの種類の免疫細胞により媒介さ
れる。実験の結果、図９ａと図９ｂに示す通り、癌細胞
の大きさは、未処置群の増加度が最も大きく、次が多糖
類物質及びアドリアマイシンであり、重さは未処置群、
多糖類物質、アドリアマイシン順に減少した。この結果
を表１７及び表１８にまとめた。この際、用いられたマ
ウスの体重は変化がなかった。
【００５０】
【表１７】
【００５１】
【表１８】
【００５２】実施例１９：多糖類物質によるマウス由来
癌細胞の転移抑制効果調査 本発明の多糖類物質による癌転移抑制効果に測定するた
めにB16F10皮膚癌細胞をC57BL/6マウスの尾静脈に移植
し、１４日目肺を分離して癌転移程度を検証した。多糖
類物質は、癌移植７日前から投与を始めて癌移植後１２
日間腹腔に投与した。アドリアマイシンは、癌移植後１
２日間腹腔に投与した。実験の結果、B16F10皮膚癌細胞
の尾静脈注射により転移が起こり肺に黒い斑点が形成さ
れた。図１０ａに示す通り、薬物未処置群の場合、約２
７２個の癌斑点が形成され、アドリアマイシン1mg/kgの
処置により斑点の数が１９７個に減少し、アドリアマイ
シン3mg/kgの処置により斑点の数は１７２個に減少し
た。実施例１７の場合において、0.3〜0.1mg/kgの濃度
でアドリアマイシンが癌細胞の成長を抑制したが、癌転
移抑制は、より高い濃度である3mg/kg〜1mg/kgの濃度に
おいて非常に弱かった。図１０ｂに示す通り、多糖類物
質単独処置により斑点の数が８３個に減少し、アドリア
マイシンとの併用処理の実験群では斑点の数が１３６及
び１３４個であった。この結果は癌転移を抑制するため
には多糖類物質の処置が必ず必要であることを示す。こ
のような結果を表１９にまとめた。
癌細胞の転移抑制効果調査 本発明の多糖類物質による癌転移抑制効果に測定するた
めにB16F10皮膚癌細胞をC57BL/6マウスの尾静脈に移植
し、１４日目肺を分離して癌転移程度を検証した。多糖
類物質は、癌移植７日前から投与を始めて癌移植後１２
日間腹腔に投与した。アドリアマイシンは、癌移植後１
２日間腹腔に投与した。実験の結果、B16F10皮膚癌細胞
の尾静脈注射により転移が起こり肺に黒い斑点が形成さ
れた。図１０ａに示す通り、薬物未処置群の場合、約２
７２個の癌斑点が形成され、アドリアマイシン1mg/kgの
処置により斑点の数が１９７個に減少し、アドリアマイ
シン3mg/kgの処置により斑点の数は１７２個に減少し
た。実施例１７の場合において、0.3〜0.1mg/kgの濃度
でアドリアマイシンが癌細胞の成長を抑制したが、癌転
移抑制は、より高い濃度である3mg/kg〜1mg/kgの濃度に
おいて非常に弱かった。図１０ｂに示す通り、多糖類物
質単独処置により斑点の数が８３個に減少し、アドリア
マイシンとの併用処理の実験群では斑点の数が１３６及
び１３４個であった。この結果は癌転移を抑制するため
には多糖類物質の処置が必ず必要であることを示す。こ
のような結果を表１９にまとめた。
【００５３】
【表１９】
【００５４】実施例２０：多糖類物質の癌細胞に対する
直接細胞毒性測定 抗癌効果が免疫増強を介して発現されたか、又は癌細胞
に対する直接細胞毒性によって発現されたかについて実
験を実施した。B16F10マウス皮膚癌細胞及びNCl-H23人
体肺癌細胞に多糖類物質及びアドリアマイシンを直接処
理した。処理濃度は0.3μg/kg〜30μg/kgであり、２日
間処理した後、生きている細胞の量をスルフォローダミ
ンＢ(Sulforhodamin B)測定法で求めた。薬物処理して
いない実験群の生きている細胞の量を１００％で表わ
し、薬物処理群細胞の量を比率で表わした。実験結果、
図１１に示す通り、アドリアマイシンは二種類の癌細胞
に対し強い細胞毒性を示し、多糖類物質の場合には細胞
毒性を示さなかった。これは、アドリアマイシンは細胞
毒性を媒介とする抗癌剤であり、多糖類物質は生体の免
疫機能を増加させて抗癌効果を示す抗癌免疫治療剤であ
ることを示している。このような結果を表２０にまとめ
た。
直接細胞毒性測定 抗癌効果が免疫増強を介して発現されたか、又は癌細胞
に対する直接細胞毒性によって発現されたかについて実
験を実施した。B16F10マウス皮膚癌細胞及びNCl-H23人
体肺癌細胞に多糖類物質及びアドリアマイシンを直接処
理した。処理濃度は0.3μg/kg〜30μg/kgであり、２日
間処理した後、生きている細胞の量をスルフォローダミ
ンＢ(Sulforhodamin B)測定法で求めた。薬物処理して
いない実験群の生きている細胞の量を１００％で表わ
し、薬物処理群細胞の量を比率で表わした。実験結果、
図１１に示す通り、アドリアマイシンは二種類の癌細胞
に対し強い細胞毒性を示し、多糖類物質の場合には細胞
毒性を示さなかった。これは、アドリアマイシンは細胞
毒性を媒介とする抗癌剤であり、多糖類物質は生体の免
疫機能を増加させて抗癌効果を示す抗癌免疫治療剤であ
ることを示している。このような結果を表２０にまとめ
た。
【００５５】
【表２０】
【００５６】実施例２１：ＡＩＤＳ予防又は治療補助剤
としての効果検定 本発明は多糖類物質による後天性免疫不全症(AIDS)予防
又は治療効果を検証した結果、AIDSの予防及び治療補助
剤として有効な事実を確認した。
としての効果検定 本発明は多糖類物質による後天性免疫不全症(AIDS)予防
又は治療効果を検証した結果、AIDSの予防及び治療補助
剤として有効な事実を確認した。
【００５７】
【発明の効果】本発明は、以上の実施例と実験例にて説
明した通り、多様なペリヌス属菌株からミトコンドリア
ＤＮＡを分離して制限酵素で処理した後、ＲＦＬＰ(res
triction fragment length polymorphism)結果を分析
し、微生物学的特徴を調べることにより新規のペリヌス
・リンテウス・ユー(Phellinus linteus Yoo)菌株を同
定し提供するものである。同定した新規のペリヌス・リ
ンテウス・ユー菌株を始めとするペリヌス属菌糸体から
T-細胞とB-細胞リンパ球のそれぞれに対する細胞毒性作
用と免疫作用体である抗体形成を誘導して免疫活性を増
加させることにより抗癌免疫活性を示す多糖類物質を提
供すること、ならびに、この多糖類物質が抗癌免疫治療
剤として生体の免疫機能を増加させて癌移転を抑制する
ことにより、癌、AIDS等の免疫関連疾患の予防及び治療
に効果があるため、生物医薬産業及び免疫学上非常に有
用である。
明した通り、多様なペリヌス属菌株からミトコンドリア
ＤＮＡを分離して制限酵素で処理した後、ＲＦＬＰ(res
triction fragment length polymorphism)結果を分析
し、微生物学的特徴を調べることにより新規のペリヌス
・リンテウス・ユー(Phellinus linteus Yoo)菌株を同
定し提供するものである。同定した新規のペリヌス・リ
ンテウス・ユー菌株を始めとするペリヌス属菌糸体から
T-細胞とB-細胞リンパ球のそれぞれに対する細胞毒性作
用と免疫作用体である抗体形成を誘導して免疫活性を増
加させることにより抗癌免疫活性を示す多糖類物質を提
供すること、ならびに、この多糖類物質が抗癌免疫治療
剤として生体の免疫機能を増加させて癌移転を抑制する
ことにより、癌、AIDS等の免疫関連疾患の予防及び治療
に効果があるため、生物医薬産業及び免疫学上非常に有
用である。
【図１】ペリヌス属菌株間の近縁関係を示す進化系統図
である。
である。
【図2】ペリヌス・リンテウス菌糸体及び多糖類物質生
産のための培養特性図である。
産のための培養特性図である。
【図3】ペリヌス・リンテウス菌株から免疫増強活性多
糖類物質を精製する工程図である。
糖類物質を精製する工程図である。
【図4】免疫増強活性多糖類物質の構成糖のガスクロマ
トグラム図である。
トグラム図である。
【図5】免疫増強活性多糖類物質のHW65Fゲルクロマトグ
ラフィー溶出図である。
ラフィー溶出図である。
【図6】免疫増強活性多糖類物質の炭素核磁気共鳴スペ
クトル図である。
クトル図である。
【図7】マウス由来の癌細胞に対する多糖類物質の抗癌
活性を多糖類物質の投与により測定して示すグラフであ
る。
活性を多糖類物質の投与により測定して示すグラフであ
る。
【図８a】多糖類物質と0.1mg/kgのアドリアマイシンの
併用処置によるマウス由来癌細胞に対する抗癌活性を示
すグラフである。
併用処置によるマウス由来癌細胞に対する抗癌活性を示
すグラフである。
【図８b】多糖類物質と0.3mg/kgのアドリアマイシンの
併用処置によるマウス由来癌細胞に対する抗癌活性を示
すグラフである。
併用処置によるマウス由来癌細胞に対する抗癌活性を示
すグラフである。
【図９a】多糖類物質とアドリアマイシン処置によるヒ
ト由来癌細胞の大きさの変化を示すグラフである。
ト由来癌細胞の大きさの変化を示すグラフである。
【図９b】多糖類物質とアドリアマイシン処置によるヒ
ト由来癌細胞の最終重量を示すグラフである。
ト由来癌細胞の最終重量を示すグラフである。
【図１０a】アドリアマイシン処置による癌転移抑制効
果を示すグラフである。
果を示すグラフである。
【図１０b】アドリアマイシンと多糖類物質の併用処置
による癌転移抑制効果を示すグラフである。
による癌転移抑制効果を示すグラフである。
【図１１】アドリアマイシンと多糖類物質の細胞毒性活
性を示すグラフである。
性を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 趙 秀 黙 大韓民国 京畿道 水原市 勧善区 金 谷洞66番地 江南 アパート 108棟 1103号 (72)発明者 朴 柄 ▲ウック▼ 大韓民国 大田広域市 西区 邊洞 セ ハンアパート ３棟 405号 (72)発明者 劉 載 国 大韓民国 大田広域市 西区 葛馬洞 クンマウルアパート 117棟 303号 (72)発明者 洪 南 斗 大韓民国 ソウル特別市 麻浦区 城山 洞200−205番地 (72)発明者 金 桓 黙 大韓民国 大田広域市 儒城区 魚隠洞 ハンビッアパート 133棟 501号 (72)発明者 韓 相 配 大韓民国 忠清北道 清州市 興徳区 社稷洞204−８番地 (72)発明者 李 昌 雨 大韓民国 大田広域市 大徳区 徳岩洞 ８−16番地 ブギル アパート ビー 102号 (56)参考文献 ＫＲ97015743号明細書 Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，Ｖ ｏｌ．17，Ｎｏ．５，Ｐ．337−342 （1997) Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．, Ｖｏｌ．43，Ｎｏ．12，Ｐ．2105−2108 （1995) Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍ ａｃ．，Ｖｏｌ．18，Ｎｏ．５，Ｐ. 295−303（1996) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 1/00 A61K 35/00 C08B 37/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (3)
- 【請求項１】 抗癌免疫活性多糖類物質を生産し、ミト
コンドリアのＤＮＡの大きさが６１Ｋｂであることを特
徴とする、ペリヌスリンテウスユーＫＣＴＣ０３９９Ｂ
Ｐ菌株。 - 【請求項２】 第１項菌株の菌糸体または子実体から分
離精製され、炭水化物含量が８２．７％であり、蛋白質
含量が１７．３％であり、ガスクロマトグラフィーで分
析した構成糖成分が７８．６モル％のグルコース、１
８．０％のマンノース、３．４モル％のガラクトースか
ら成ることを特徴とする、抗癌免疫活性を有する多糖類
抽出物。 - 【請求項３】 第２項の抗癌免疫活性を有する多糖類抽
出物を有効成分として含む、抗癌用薬学的組成物。
Applications Claiming Priority (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR98-15618 | 1998-04-30 | ||
| KR1019980015617A KR19990081593A (ko) | 1998-04-30 | 1998-04-30 | 신규한 면역증강활성 다당류물질 및 그 제조방법 |
| KR98-15619 | 1998-04-30 | ||
| KR1019980015619A KR100260302B1 (ko) | 1998-04-30 | 1998-04-30 | 신규한 면역증강활성 물질을 생산하는 펠리누스속 균주 |
| KR98-15617 | 1998-04-30 | ||
| KR1019980015618A KR100278928B1 (ko) | 1998-04-30 | 1998-04-30 | 펠리누스린테우스로부터분리한다당류물질의신규한용도 |
| EP99120033A EP1096022B1 (en) | 1998-04-30 | 1999-10-18 | Immuno-stimulating polysaccharide substance from Phellinus spp. strain and use thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11318432A JPH11318432A (ja) | 1999-11-24 |
| JP3093194B2 true JP3093194B2 (ja) | 2000-10-03 |
Family
ID=27443829
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11078704A Expired - Lifetime JP3093194B2 (ja) | 1998-04-30 | 1999-03-23 | 新規のペリヌス属菌株から分離した免疫増強活性多糖類物質及びその使用 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1096022B1 (ja) |
| JP (1) | JP3093194B2 (ja) |
| ES (1) | ES2241219T3 (ja) |
| HK (1) | HK1036823A1 (ja) |
| PT (1) | PT1096022E (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3093194B2 (ja) * | 1998-04-30 | 2000-10-03 | 韓国科学技術研究院 | 新規のペリヌス属菌株から分離した免疫増強活性多糖類物質及びその使用 |
| KR20010086626A (ko) * | 2000-02-15 | 2001-09-15 | 복성해 | 펠리누스 린테우스에서 분리한 다당류의 당뇨병 예방 및치료용 조성물 |
| US6838096B2 (en) | 2001-06-20 | 2005-01-04 | Taipei Veterans General Hospital | Black soybean polysaccharides |
| KR20040096000A (ko) * | 2003-05-07 | 2004-11-16 | 김관호 | 초음파에 의한 세포벽 파쇄 및 효소발효법을 이용한상황버섯 베타글루칸 추출방법 |
| JP2007224286A (ja) * | 2006-01-25 | 2007-09-06 | Tottori Univ | 生体組織からの多糖類の取得方法 |
| KR101855421B1 (ko) * | 2014-10-13 | 2018-07-20 | 농업회사법인자연생명대체의학(주) | 약리작용을 가진 농산물과 곡물균사체가 혼합되어 발효된 발효 선식 조성물 및 그의 제조방법 |
| RU2597788C1 (ru) * | 2015-08-18 | 2016-09-20 | федеральное государственное бюджетное учреждение высшего профессионального образования "Воронежский государственный университет" (ФГБУ ВПО ВГУ) | Способ профилактики осложнений, индуцированных изониазидом |
| CN111919662B (zh) * | 2020-08-26 | 2021-12-21 | 杭州市农业科学研究院 | 一种高产多糖的桑黄菌株及其培养方法与应用 |
| CN113817078B (zh) * | 2021-10-20 | 2022-11-18 | 吉林农业大学 | 基于免疫调控具有抗结直肠癌功效的杨黄菌多糖及用途 |
| CN113880963B (zh) * | 2021-11-16 | 2023-04-18 | 上海市农业科学院 | 一种桑黄多糖及其制备方法和应用 |
| CN114989986B (zh) * | 2022-04-24 | 2023-05-23 | 齐鲁工业大学 | 一种富含多种活性成分的野生桑黄菌及其培养方法、应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3093194B2 (ja) * | 1998-04-30 | 2000-10-03 | 韓国科学技術研究院 | 新規のペリヌス属菌株から分離した免疫増強活性多糖類物質及びその使用 |
-
1999
- 1999-03-23 JP JP11078704A patent/JP3093194B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1999-10-18 EP EP99120033A patent/EP1096022B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-10-18 ES ES99120033T patent/ES2241219T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-10-18 PT PT99120033T patent/PT1096022E/pt unknown
-
2001
- 2001-10-26 HK HK01107487A patent/HK1036823A1/xx not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．５，Ｐ．３３７−３４２（１９９７） |
| Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，Ｖｏｌ．４３，Ｎｏ．１２，Ｐ．２１０５−２１０８（１９９５） |
| Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃ．，Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．５，Ｐ．２９５−３０３（１９９６） |
| ＫＲ９７０１５７４３号明細書 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2241219T3 (es) | 2005-10-16 |
| PT1096022E (pt) | 2005-08-31 |
| EP1096022A1 (en) | 2001-05-02 |
| JPH11318432A (ja) | 1999-11-24 |
| HK1036823A1 (en) | 2003-04-23 |
| EP1096022B1 (en) | 2005-06-22 |
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