JPWO2003070264A1 - マツタケ由来陰イオン交換樹脂吸着画分、免疫増強剤、及びストレス負荷回復促進剤 - Google Patents

Abstract

マツタケＦＥＢＭ ＢＰ−７３０４株の菌糸体の熱水抽出液と、前記菌糸体熱水抽出液を得る際に残留する菌糸体残渣のアルカリ溶液抽出液とを混合して得られる混合液の陰イオン交換樹脂吸着画分を開示する。また、前記の新規陰イオン交換樹脂吸着画分を有効成分としてとして含有する、免疫増強剤及びストレス負荷回復促進剤を開示する。

Description

技術分野
本発明は、新規のマツタケ由来陰イオン交換樹脂吸着画分、並びにそれを含有する免疫増強剤及びストレス負荷回復促進剤に関する。本発明の免疫増強剤又はストレス負荷回復促進剤は、医薬品として投与することができるだけでなく、種々の形態、例えば、健康食品（好ましくは機能性食品）又は飼料として飲食物の形で与えることも可能である。なお、前記食品には飲料が含まれる。更には、オーラル衛生用組成物、例えば、口中に一時的に含むものの、そのほとんどを口中より吐き出す形態、例えば、歯磨剤、洗口剤、チューインガム、又はうがい剤の形で与えることも、あるいは、鼻から吸引させる吸入剤の形で与えることも可能である。
背景技術
本発明者は、或る生物製剤（ＢＲＭ）を原発腫瘍内に投与すると、原発腫瘍のみならず、遠隔転移腫瘍まで治癒させることを、本発明者の一部及びその共同研究者が考案したマウス「二重移植腫瘍系］で明らかにしてきた（Ｅｂｉｎａ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ，１４，３７９−３９４，２０００；海老名ら，癌と化学療法，１８，１８１２−１８１６，１９９１；Ｅｂｉｎａら，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ，１２，４９５−５００，１９９８）。すなわち、腫瘍がまだ原発巣しかない場合には、手術して摘出すれば問題ないが、既に遠隔転移巣がある場合（特には、肉眼で観察することができない微小転移巣がある場合）には、手術によって原発巣を摘出すると、転移巣が増殖を開始し、癌治療には結びつかない。すなわち、転移巣の治療が、癌治療の大きな課題と言える。
従来、薬剤を癌局所に投与することは、癌細胞を散らばすことになり、好ましくないと言われてきたが、生物製剤を癌局所に投与すると、癌原発巣のみならず、転移巣まで退縮させることを見出した（Ｅｂｉｎａら，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，７７，１０３４−１０４２，１９８６）。その研究を通して、カワラタケ菌糸体から抽出したタンパク質結合多糖体ＰＳＫは、原発腫瘍のみならず、遠隔転移巣も治癒させるのに対して、シイタケ子実体から精製したβ−グルカンであるレンチナン（ｌｅｎｔｉｎａｎ）では抗腫瘍効果がみられなかった。また、タマサキツヅラフジ抽出物であるセファランチン（ｃｅｐｈａｒａｎｔｈｉｎ）は、左右腫瘍に抗腫瘍効果が認められた（海老名ら，癌と化学療法，２８，２１１−２１５，２００１）が、精製したアルカロイド単品では、抗腫瘍効果が弱かった。
以上の結果から、生物製剤の中でも、西洋医学による精製物ではかえって抗腫瘍効果がなく、有効成分を含む抽出物の方が効果があることがわかり（海老名，癌と化学療法，２８，１５１５−１５１８，２００１）、漢方医学の漢方薬のように、数種類の生薬の混合物とも異なる第三の医学・統合医学の発想に結びついた（海老名，医学のあゆみ，１９４，６９０−６９２，２０００）。
一方、マツタケ［Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ ｍａｔｓｕｔａｋｅ（Ｓ．Ｉｔｏ ＆ Ｉｍａｉ）Ｓｉｎｇ．］には種々の生理活性物質が含まれていることが知られており、例えば、特公昭５７−１２３０号公報及び特許第２７６７５２１号明細書には、マツタケに含有される各種の抗腫瘍性物質が開示されている。前記特公昭５７−１２３０号公報には、マツタケ菌糸体の液体培養物を熱水又は希アルカリ溶液で抽出して得られる抽出液から分離精製されたエミタニン−５−Ａ、エミタニン−５−Ｂ、エミタニン−５−Ｃ、及びエミタニン−５−Ｄに、サルコーマ１８０細胞の増殖阻止作用があることが開示されている。また、前記特許第２７６７５２１号明細書には、マツタケ子実体の水抽出物から分離精製された分子量２０〜２１万のタンパク質（サブユニットの分子量＝１０〜１１万）が抗腫瘍活性を有することが開示されている。
更に、本発明者は、マツタケ熱水抽出液、マツタケのアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分が、免疫増強活性を有することを既に見出している（ＷＯ０１／４９３０８号公報）。
本発明者は、免疫増強作用を有する物質を更に鋭意探索したところ、特定のマツタケ株を特定の培養方法により培養して得られた菌糸体由来の部分精製画分に、このような免疫増強作用があることを新たに見出した。また、この画分が、理化学的性質の点で、公知の画分（例えば、ＷＯ０１／４９３０８号公報に記載の陰イオン交換樹脂吸着画分）と異なる画分であることも見出した。更に、本発明者は、この画分が、ストレス負荷回復促進作用を示すことも新たに見出した。本発明はこのような知見に基づくものである。
発明の開示
従って、本発明の課題は、マツタケ由来の新規の陰イオン交換樹脂吸着画分、並びに新規の免疫増強剤及びストレス負荷回復促進剤を提供することにある。
本発明の前記課題は、マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株の菌糸体の熱水抽出液と、前記菌糸体熱水抽出液を得る際に残留する菌糸体残渣のアルカリ溶液抽出液とを混合して得られる混合液の陰イオン交換樹脂吸着画分であって、
（ａ）フェノール硫酸法によるグルコース換算値としての糖質含量が６０〜７２％であり、
（ｂ）銅フォリン法によるアルブミン換算値としてのタンパク質含量が２８〜４０％である
前記陰イオン交換樹脂吸着画分により解決することができる。
また、本発明は、前記陰イオン交換樹脂吸着画分を有効成分として含有する、免疫増強剤に関する。
また、本発明は、前記陰イオン交換樹脂吸着画分と、薬剤学的に許容することのできる担体とを含有する、免疫増強組成物に関する。
また、本発明は、前記陰イオン交換樹脂吸着画分を、それ単独で、あるいは、所望により１又はそれ以上の食品成分と共に含有する、免疫増強健康食品に関する。
本発明の免疫増強健康食品の好ましい態様によれば、前記健康食品が機能性食品である。
また、本発明は、前記陰イオン交換樹脂吸着画分を、免疫増強が必要な対象に、有効量で投与することを含む、免疫を増強する方法に関する。
また、本発明は、前記陰イオン交換樹脂吸着画分の、免疫増強組成物又は免疫増強健康食品を製造するための使用に関する。
また、本発明は、前記陰イオン交換樹脂吸着画分を有効成分として含有する、転移巣治療又は予防剤に関する。
また、本発明は、前記陰イオン交換樹脂吸着画分と、薬剤学的に許容することのできる担体とを含有する、転移巣治療又は予防組成物に関する。
また、本発明は、前記陰イオン交換樹脂吸着画分を、それ単独で、あるいは、所望により１又はそれ以上の食品成分と共に含有する、転移巣治療又は予防健康食品に関する。
本発明の転移巣治療又は予防健康食品の好ましい態様によれば、前記健康食品が機能性食品である。
また、本発明は、前記陰イオン交換樹脂吸着画分を、転移巣治療又は予防が必要な対象に、有効量で投与することを含む、転移巣を治療する方法に関する。
また、本発明は、前記陰イオン交換樹脂吸着画分の、転移巣治療若しくは予防組成物又は転移巣治療若しくは予防健康食品を製造するための使用に関する。
また、本発明は、前記陰イオン交換樹脂吸着画分を有効成分として含有する、血清ＩＡＰ値上昇剤に関する。
また、本発明は、前記陰イオン交換樹脂吸着画分と、薬剤学的に許容することのできる担体とを含有する、血清ＩＡＰ値上昇組成物に関する。
また、本発明は、前記陰イオン交換樹脂吸着画分を、それ単独で、あるいは、所望により１又はそれ以上の食品成分と共に含有する、血清ＩＡＰ値上昇健康食品に関する。
本発明の血清ＩＡＰ値上昇健康食品の好ましい態様によれば、前記健康食品が機能性食品である。
また、本発明は、前記陰イオン交換樹脂吸着画分を、血清ＩＡＰ値上昇が必要な対象に、有効量で投与することを含む、血清ＩＡＰ値を上昇させる方法に関する。
また、本発明は、前記陰イオン交換樹脂吸着画分の、血清ＩＡＰ値上昇組成物又は血清ＩＡＰ値上昇健康食品を製造するための使用に関する。
また、本発明は、前記陰イオン交換樹脂吸着画分を有効成分として含有する、ストレス負荷回復促進剤に関する。
また、本発明は、前記陰イオン交換樹脂吸着画分と、薬剤学的に許容することのできる担体とを含有する、ストレス負荷回復促進組成物に関する。
また、本発明は、前記陰イオン交換樹脂吸着画分を、それ単独で、あるいは、所望により１又はそれ以上の食品成分と共に含有する、ストレス負荷回復促進健康食品に関する。
本発明のストレス負荷回復促進健康食品の好ましい態様によれば、前記健康食品が機能性食品である。
また、本発明は、前記陰イオン交換樹脂吸着画分を、ストレス負荷回復促進が必要な対象に、有効量で投与することを含む、ストレス負荷回復を促進する方法に関する。
また、本発明は、前記陰イオン交換樹脂吸着画分の、ストレス負荷回復促進組成物又はストレス負荷回復促進健康食品を製造するための使用に関する。
また、本発明は、前配陰イオン交換樹脂吸着画分を有効成分として含有する、免疫増強剤（但し、転移巣治療又は予防剤及び血清ＩＡＰ値上昇剤を除く）に関する。
また、本発明は、前記陰イオン交換樹脂吸着画分と、薬剤学的に許容することのできる担体とを含有する、免疫増強組成物（但し、転移巣治療又は予防組成物及び血清ＩＡＰ値上昇組成物を除く）に関する。
また、本発明は、前記陰イオン交換樹脂吸着画分を、それ単独で、あるいは、所望により１又はそれ以上の食品成分と共に含有する、免疫増強健康食品（但し、転移巣治療又は予防健康食品及び血清ＩＡＰ値上昇健康食品を除く）に関する。
本発明の免疫増強健康食品の好ましい態様によれば、前記健康食品が機能性食品である。
また、本発明は、前記陰イオン交換樹脂吸着画分を、免疫増強が必要な対象に、有効量で投与することを含む、免疫を増強する方法（但し、転移巣を治療又は予防する方法及び血清ＩＡＰ値を上昇させる方法を除く）に関する。
また、本発明は、前記陰イオン交換樹脂吸着画分の、免疫増強組成物（但し、転移巣治療又は予防組成物及び血清ＩＡＰ値上昇組成物を除く）又は免疫増強健康食品（但し、転移巣治療又は予防健康食品及び血清ＩＡＰ値上昇健康食品を除く）を製造するための使用に関する。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の免疫増強剤又はストレス負荷回復促進剤は、有効成分として、マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株［Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ ｍａｔｓｕｔａｋｅ（Ｓ．Ｉｔｏ ＆ Ｉｍａｉ）Ｓｉｎｇ．ＣＭ６２７１］の菌糸体の熱水抽出液（以下、単に「菌糸体熱水抽出液」と称することがある）と、前記菌糸体熱水抽出液を得る際に残留する菌糸体残渣のアルカリ溶液抽出液（以下、単に「菌糸体残渣アルカリ溶液抽出液」と称することがある）とを混合して得られる混合液（以下、単に「混合抽出液」と称することがある）の陰イオン交換樹脂吸着画分であって、
（ａ）フェノール硫酸法によるグルコース換算値としての糖質含量が６０〜７２％（好ましくは６２〜７０％）であり、
（ｂ）銅フォリン法によるアルブミン換算値としてのタンパク質含量が２８〜４０％（好ましくは３０〜３８％）である
前記混合抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分を含有する。
本発明の免疫増強剤又はストレス負荷回復促進剤における有効成分である、混合抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分は、これに限定されるものではないが、例えば、
マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株をタンク培養により培養し、菌糸体を得る工程（以下、培養工程と称する）；
得られたマツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株の菌糸体を熱水で抽出して、菌糸体熱水抽出液を得る工程（以下、熱水抽出工程と称する）；
熱水で抽出した後の前記菌糸体の残渣を、アルカリ溶液で抽出して、菌糸体残渣アルカリ溶液抽出液を得る工程（以下、アルカリ溶液抽出工程と称する）；
前記菌糸体熱水抽出液と前記菌糸体残渣アルカリ溶液抽出液とを混合して得られる混合抽出液を、陰イオン交換樹脂に吸着させる工程（以下、陰イオン交換樹脂吸着工程と称する）；及び
適当な溶離液により吸着画分を溶出する工程（以下、溶出工程と称する）
を含む製造方法により、調製することができる。
培養工程に用いる前記マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株（国際出願第ＰＣＴ／ＪＰ０１／０８８７６号）は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター［（旧）工業技術院生命工学工業技術研究所（あて名：〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）］に平成１２年９月１４日より寄託しているものである。このマツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株は、京都府亀岡市で採取したマツタケＣＭ６２７１株から子実体組織を切り出し、試験管内で培養することにより、菌糸体継代株を得たものであり、呉羽化学工業株式会社生物医学研究所で維持している。
マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株の子実体の形態は、今関六也・本郷次雄編の「原色日本菌類図鑑」、保育社（大阪）、昭和３２年発行、プレート（Ｐｌａｔｅ）９及び２６頁記載のマツタケ子実体に合致するものであった。マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株の継代は、エビオス寒天斜面培地で実施することができる。前記菌株の菌糸体を大量培養する場合には、液体培地に摂取し、例えば、静置培養、振とう培養、又はタンク培養により実施することができる。
マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株の菌糸体をエビオス寒天平板培地に接種すると、白色の菌糸が放射状に密に生育し、大きなコロニーを形成する。走査型電子顕微鏡で観察すると、太さ１〜２μｍの枝状の菌糸体が無数に存在し、菌糸体側部に数μｍ程の突起物が時々みられる。なお、マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株は、もっぱら菌糸体の形状で継代維持又は培養することが可能であるが、子実体の形状となることもある。
以下、マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株の菌学的性質について説明する。
（１）麦芽エキス寒天培地における培養的・形態的性質
マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株は、麦芽エキス寒天培地においては、白色の菌糸が放射状に密に生育してコロニーを形成する。接種３０日目のコロニー径は約４ｃｍである。
（２）ツアペック寒天培地、オートミール寒天培地、合成ムコール寒天培地、及びフェノールオキシダーゼ反応検定用培地における培養的・形態的性質
マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株は、ツアペック寒天培地、オートミール寒天培地、合成ムコール寒天培地、又はフェノールオキシダーゼ反応検定用培地のいずれの培地においても、接種１ヶ月経過しても菌糸の発育はほとんど見られない。
（３）ＹｐＳｓ寒天培地における培養的・形態的性質
マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株は、ＹｐＳｓ寒天培地においては、白色の光沢を有し、マット状に生育する。接種３０日目の生育距離は約５ｍｍである。
（４）グルコース・ドライイースト寒天培地における培養的・形態的性質
マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株は、グルコース・ドライイースト寒天培地においては、白色の光沢を有し、マット状に生育する。接種３０日目の生育距離は約２ｍｍである。
（５）最適生育温度及び生育の範囲
滅菌処理した液体培地（３％グルコース，０．３％酵母エキス；ｐＨ７．０）１０ｍＬの入った１００ｍＬ容三角フラスコに、マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株の種菌約２ｍｇを接種し、５〜３５℃の種々の温度でそれぞれ培養し、２８日目にフラスコから菌体を取り出し、蒸留水でよく洗浄した後に乾燥させ、重量を測定した。その結果、菌体重量は５〜１５℃の範囲で直線的に増加し、１５〜２５℃の範囲で緩やかに増加した。２７．５℃以上ではほとんど増殖しなかった。最適生育温度は１５〜２５℃である。
（６）最適生育ｐＨ及び生育の範囲
液体培地（３％グルコース，０．３％酵母エキス）のｐＨを１ｍｏｌ／Ｌ塩酸又は１ｍｏｌ／Ｌ水酸化カリウムで調製して、ｐＨが３．０〜８．０の範囲の種々の培地を調製して生育ｐＨ値を調べた。各培地をフィルター滅菌し、培地１０ｍＬを滅菌済１００ｍＬ容三角フラスコに分注した。マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株の種菌約２ｍｇを接種後、２２℃で培養し、２８日目にフラスコから菌体を取り出し、蒸留水でよく洗浄した後に乾燥させ、重量を測定した。その結果、菌体の生育限界はｐＨ３．０〜７．０の範囲にあり、最適生育ｐＨは４．０〜６．０であった。
（７）対峙培養による帯線形成の有無
エビオス寒天平板培地に、マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株のブロック（約３ｍｍ×３ｍｍ×３ｍｍ）と、公知の１３種類のマツタケ株［例えば、ＩＦＯ ６９１５株；（財）発酵研究所］の各ブロック（約３ｍｍ×３ｍｍ×３ｍｍ）とを、約２ｃｍ間隔に対峙して植菌し、２２℃で３週間培養した後、両コロニー境界部に帯線が生じるか否かを判定した。
その結果、マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株は、公知の１３種類のマツタケ株のいずれの株に対しても、明確な帯線を形成しなかった。なお、マツタケでは、異株間対峙培養で帯線は生じないとされており、公知の１３種類のマツタケ株間についても、明確な帯線を形成した組み合わせはなかった。
（８）栄養要求性
滅菌処理した菌根菌用合成培地（Ｏｈｔａら，Ｔｒａｎｓ．Ｍｙｃｏｌ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，３１，３２３，１９９０）１０ｍＬの入った１００ｍＬ容三角フラスコに、マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株の種菌約２ｍｇを接種し、２２℃で培養し、４２日目にフラスコから菌体を取り出し、蒸留水でよく洗浄した後に乾燥させ、重量を測定したところ、菌体４４１ｍｇが得られた。
前記菌根菌用合成培地中の炭素（Ｃ）源であるグルコースの代わりに、２８種類の糖質関連物質のいずれか１つを加えた各培地に、マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株を接種して培養し、培養終了後、菌体重量を測定した。
その結果、菌体重量が多かった糖質関連物質から菌体重量が少なかった糖質関連物質を順に示せば、以下のとおりである：
小麦デンプン＞トウモロコシデンプン＞デキストリン＞メチルβグルコシド＞セロビオース＞マンノース＞フラクトース＞アラビノース＞ソルビトール＞グルコース＞ラクトース＞グリコーゲン＞マンニトール＞リボース＞マルトース＞トレハロース＞ガラクトース＞ラフィノース＞メリビオース＞Ｎ−アセチルグルコサミン。
なお、セルロース、ダルチトール、シュークロース、キシロース、メチルαグルコシド、イヌリン、イノシトール、又はソルボースでは菌の発育はほとんどみられなかった。
次に、前記菌根菌用合成培地中の窒素（Ｎ）源である酒石酸アンモニウムの代わりに、１５種類の窒素関連物質のいずれか１つを加えた各培地に、マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株を接種して培養し、培養終了後、菌体重量を測定した。
その結果、菌体重量が多かった窒素関連物質から菌体重量が少なかった窒素関連物質を順に示せば、以下のとおりである：
コーンステイープリカー＞大豆ペプトン＞ミルクペプトン＞硝酸アンモニウム＞硫酸アンモニウム＞酒石酸アンモニウム＞炭酸アンモニウム＞アスパラギン＞リン酸アンモニウム＞塩化アンモニウム＞硝酸ナトリウム＞肉エキス＞酵母エキス＞カザミノ酸＞クロレラ＞トリプトーン＞硝酸カリウム。
更に、前記合成培地中のミネラル及びビタミン類の内、特定一成分を除去した培地に、マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株を接種して培養し、培養終了後、菌体重量を測定した。
その結果、塩化カルシウム・二水和物、硫酸マンガン（ＩＩ）・五水和物、硫酸亜鉛・七水和物、硫酸コバルト・七水和物、硫酸銅・五水和物、硫酸ニッケル・六水和物、塩酸チアミン、ニコチン酸、葉酸、ビオチン、塩酸ピリドキシン、塩化カーニチン、アデニン硫酸・二水和物、又は塩酸コリンのいずれか１つの欠損によっては、菌体重量にはほとんど影響なかった。一方、硫酸マグネシウム・七水和物、塩化鉄（ＩＩ）、又はリン酸二水素カリウムのいずれか１つを培地から除くと、菌体重量は顕著に減少した。すなわち、マグネシウム、鉄、リン、及びカリウムは、マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株の増殖に必須と考えられる。
（９）ＤＮＡの塩基組成（ＧＣ含量）
マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株のＧＣ含量は、４９．９％である。
（１０）ＲＡＰＤ法により生成するＤＮＡパターン
６種類の異なるＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）用プライマー（１０ｍｅｒ）をそれぞれ単独で用いるＲＡＰＤ（ｒａｎｄｏｍ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ）法により生成するＤＮＡパターンについて、マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株と、公知の４４種類のマツタケ株［例えば、ＩＦＯ ６９１５株；（財）発酵研究所］とを比較したところ、マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株は、４４種類のマツタケ株のいずれとも異なるＤＮＡパターンを示した。
培養工程で用いる培地としては、例えば、グルコース・酵母エキス培地を用いることができる。
前記培地におけるグルコース濃度は、０．０１〜１５％であることが好ましく、１〜１０％であることがより好ましく、３％であることが特に好ましい。前記培地における酵母エキスの濃度は、０．０１〜３％であることが好ましく、０．１〜０．６％であることがより好ましく、０．３％であることが特に好ましい。前記培地のｐＨは、２．５〜８であることが好ましく、４〜７であることが好ましく、６であることが特に好ましい。
培養工程における培養温度は、１０〜２６℃であることが好ましく、１５〜２５℃であることがより好ましく、２５℃であることが特に好ましい。
培養期間は、１〜２０週間であることが好ましく、２〜１０週間であることがより好ましく、１０週間であることが特に好ましい。
培養により得られた培養物から菌糸体を分離する方法としては、例えば、濾過（例えば、濾布濾過）又は遠心分離を用いることができる。得られた菌糸体は、例えば、蒸留水により充分に洗浄してから、次の熱水抽出工程を実施することが好ましい。また、抽出効率が向上するように、破砕物又は粉体の状態に加工することが好ましい。
熱水抽出工程に用いる熱水の温度は、６０〜１００℃であることが好ましく、８０〜９８℃であることがより好ましい。また、抽出の際には、抽出効率が向上するように、撹拌又は振盪しながら実施することが好ましい。抽出時間は、例えば、菌糸体の状態（例えば、破砕物又は粉体の状態に加工した場合にはその加工状態）、熱水の温度、又は撹拌若しくは振盪の有無若しくは条件に応じて、適宜決定することができるが、通常、１〜６時間であり、２〜３時間であることが好ましい。
熱水抽出の後、適当な分離操作、例えば、遠心分離又は濾過により、菌糸体熱水抽出液と菌糸体残渣とを得ることができる。
アルカリ溶液抽出工程に用いるアルカリ溶液としては、特に限定されるものではないが、例えば、アルカリ金属（例えば、ナトリウム又はカリウム）の水酸化物、特には水酸化ナトリウムの水溶液を用いることができる。前記アルカリ溶液のｐＨは、８〜１３であることが好ましく、９〜１２であることがより好ましい。アルカリ溶液抽出は、０〜３０℃で実施することが好ましく、０〜２５℃で実施することがより好ましい。抽出時間は、例えば、菌糸体残渣の状態（例えば、破砕物又は粉体の状態に加工した場合にはその加工状態）、アルカリ溶液のｐＨ若しくは温度、又は撹拌若しくは振盪の有無若しくは条件に応じて、適宜決定することができるが、通常、３０分間〜５時間であり、１〜３時間であることが好ましい。
アルカリ溶液抽出の後、適当な分離操作、例えば、遠心分離又は濾過により、菌糸体残渣アルカリ溶液抽出液と菌糸体残渣とを得ることができる。
得られた菌糸体残渣アルカリ溶液抽出液は、中和処理を実施してから、次の陰イオン交換樹脂吸着工程に用いることが好ましい。
熱水抽出工程で得られた菌糸体熱水抽出液と、アルカリ溶液抽出工程で得られた菌糸体残渣アルカリ溶液抽出液とを混合して得られる混合抽出液は、不溶物が混在する状態で、そのまま、次の陰イオン交換樹脂吸着工程に用いることもできるが、不溶物を除去してから、あるいは、不溶物を除去し、更に、抽出液中の低分子画分を除去してから、次の陰イオン交換樹脂吸着工程に用いることが好ましい。例えば、不溶物が混在する混合抽出液を遠心分離することにより不溶物を除去し、得られる上清のみを、次の陰イオン交換樹脂吸着工程に用いることができる。あるいは、不溶物が混在する混合抽出液を遠心分離して得られる前記上清を透析し、低分子画分（好ましくは分子量３５００以下の画分）を除去してから、次の陰イオン交換樹脂吸着工程に用いることができる。
陰イオン交換樹脂吸着工程に用いることのできる陰イオン交換樹脂としては、公知の陰イオン交換樹脂を用いることができ、例えば、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セルロース又はトリエチルアンモニオエチル（ＴＥＡＥ）セルロースを挙げることができる。
溶出工程に用いる溶離液は、陰イオン交換樹脂吸着工程に用いる陰イオン交換樹脂の種類に応じて適宜決定することができ、例えば、塩化ナトリウム水溶液などを挙げることができる。
溶出工程により溶出される画分は、そのまま、本発明の免疫増強剤の有効成分として用いることができるが、通常、溶離液に由来する塩を含有するので、それを除去するために、更に透析を実施することが好ましい。
本発明の免疫増強剤又はストレス負荷回復促進剤における有効成分である、混合抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分は、以下に示す理化学的性質を有する。
（１）糖質含量：フェノール硫酸法によるグルコース換算値として６０〜７２％（好ましくは６２〜７０％）である。
（２）タンパク質含量：銅フォリン法によるアルブミン換算値として２８〜４０％（好ましくは３０〜３８％）である。
（３）糖組成：グルコース６１μｇ／ｍｇ、マンノース３．３μｇ／ｍｇ、及びガラクトース２．０μｇ／ｍｇである。
（４）アミノ酸組成：アスパラギン酸及びアスパラギン１０．３５ｍｏｌ％、トレオニン５．８３ｍｏｌ％、セリン６．２７ｍｏｌ％、グルタミン酸及びグルタミン１０．４９ｍｏｌ％、グリシン８．５５ｍｏｌ％、アラニン９．１９ｍｏｌ％、バリン６．８８ｍｏｌ％、１／２−シスチン０．６０ｍｏｌ％、メチオニン１．４９ｍｏｌ％、イソロイシン５．３６ｍｏｌ％、ロイシン９．２５ｍｏｌ％、チロシン２．５５ｍｏｌ％、フェニルアラニン４．０５ｍｏｌ％、リシン５．１７ｍｏｌ％、ヒスチジン２．１８ｍｏｌ％、アルギニン４．４４ｍｏｌ％、トリプトファン１．８２ｍｏｌ％、及びプロリン５．５４ｍｏｌ％である。
（５）等電点：等電点電気泳動法によれば、メインバンドの等電点は５．８５付近である。
（６）核磁気共鳴分析（ＮＭＲ）
（ｉ）^１Ｈ一次元ＮＭＲ分析：図７に示すスペクトル［測定条件は、後述の実施例９（６）（ｉ）を参照のこと］を示す。
（ｉｉ）^１３Ｃ一次元ＮＭＲ分析：図８及び図９に示すスヘクトル［測定条件は、後述の実施例９（６）（ｉｉ）を参照のこと］を示す。
（７）円偏光二色性分析：図１０に示すスペクトル［測定条件は、後述の実施例９（７）を参照のこと］を示す。
（８）旋光度：２５℃において４２である。
（９）赤外分光分析：図１１に示すスペクトル［測定条件は、後述の実施例９（９）を参照のこと］を示す。
（１０）紫外分光分析（ＵＶ）：図１２に示すスペクトル［測定条件は、後述の実施例９（１０）を参照のこと］を示す。
（１１）電子スピン共鳴（ＥＳＲ）：図１３及び図１４に示すスペクトル［測定条件は、後述の実施例９（１１）を参照のこと］を示す。
（１２）粘度：３０℃における還元粘度は１０８である。
（１３）分子量：主成分の分子量は２０００ｋＤａである。
（１４）元素分析：炭素（Ｃ）、水素（Ｈ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）、リン（Ｐ）、及び塩素（Ｃｌ）の各含量は、それぞれ、４１．３％、６．０％、５．１％、１．０％、０．０５２％、及び０．１６％である。
（１５）α−グルカン推定含有率：全糖質に対して７１％である。
（１６）エンドトキシン含量：２．５ｎｇ／ｍｇである。
本発明の免疫増強剤又はストレス負荷回復促進剤は、有効成分としての混合抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分を、薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤と共に、動物、好ましくは哺乳動物（特にはヒト）に投与することができる。すなわち、本発明の免疫増強組成物（好ましくは免疫増強医薬組成物）又はストレス負荷回復促進組成物（好ましくはストレス負荷回復促進医薬組成物）は、有効成分としての混合抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分と、薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる担体又は希釈剤とを含有する。
本発明の免疫増強剤における有効成分である、混合抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分は、免疫増強活性を有する。前記免疫増強活性には、抗腫瘍活性［例えば、担癌個体における生存期間の延長活性、抗原発腫瘍活性（特には、原発腫瘍の増殖抑制活性）、又は抗転移活性（特には、転移巣の増殖抑制活性）］、キラー活性誘導促進活性（特には、腸管リンパ球のキラー活性誘導促進活性）、腫瘍細胞認識増強活性、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）遺伝子発現増強活性、又は血清ＩＡＰ値上昇活性などが含まれる。本発明の免疫増強剤は、抗腫瘍活性、例えば、抗原発腫瘍活性（特には原発腫瘍の増殖抑制活性）又は抗転移活性（特には転移巣の増殖抑制活性）を有するので、癌（例えば、原発腫瘍又は転移巣）に対する予防又は治療作用を有する。
従って、本発明における有効成分である、混合抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分は、それ単独で、あるいは、好ましくは薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤と共に、免疫増強が必要な対象に、有効量で投与することができる。
また、本発明における有効成分である、混合抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分は、免疫増強組成物（好ましくは免疫増強医薬組成物）、免疫増強健康食品（好ましくは免疫増強機能性食品）、あるいは、免疫増強用のオーラル衛生用組成物を製造するために使用することができる。
本発明のストレス負荷回復促進剤における有効成分である、混合抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分は、ストレス負荷に対する回復促進活性を有する。
従って、本発明における有効成分である、混合抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分は、それ単独で、あるいは、好ましくは薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤と共に、ストレス負荷に対する回復促進が必要な対象に、有効量で投与することができる。
また、本発明における有効成分である、混合抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分は、ストレス負荷に対する回復促進組成物（好ましくは、ストレス負荷に対する回復促進医薬組成物）、ストレス負荷に対する回復促進健康食品（好ましくは、ストレス負荷に対する回復促進機能性食品）、あるいは、ストレス負荷に対する回復促進用のオーラル衛生用組成物を製造するために使用することができる。
一般に、動物に対して、単発的に、あるいは、或る期間に亘ってストレスを与えると、通常、その動物における免疫能は低下するが、前記ストレス負荷から解放されると、自発的な免疫力の回復が起こる。本明細書における「ストレス負荷に対する回復促進活性（ストレス負荷回復促進活性）」とは、ストレス負荷から開放した後、免疫力回復期における免疫力の回復を、自発的な回復よりも促進する活性を意味する。
本発明のストレス負荷回復促進剤の投与時期は、ストレス負荷により一時的に低下した免疫力を、その投与により回復促進可能である限り、特に限定されるものではなく、例えば、ストレス負荷の前、ストレス負荷中、及び／又はストレス負荷から開放した後の免疫力回復期に投与することができる。
なお、本発明における前記「ストレス負荷回復促進活性」は、本発明者が見出した前記の単なる「免疫増強活性」とは異なる。すなわち、「免疫増強活性」とは、そのような活性を有する有効成分を投与した場合に、投与前の状態（ストレスの負荷がなく、免疫力が通常の状態であることもできるし、あるいは、ストレス負荷により、免疫力が低下している状態であることもできる）と比較して、免疫力の向上がみられる活性を一般に意味し、従って、免疫力それ自体を向上させる活性である。一方、本発明における「ストレス負荷回復促進活性」とは、前述のように、免疫力回復期における免疫力の回復を促進する活性であって、従って、免疫力の回復速度を向上させる活性である。本発明のストレス負荷回復促進剤を投与すると、本発明のストレス負荷回復促進剤を投与しない場合と比較して、免疫力の回復速度が上昇する。
更には、「免疫増強活性」においては、そのような活性を有する有効成分を投与すると、直接的に、免疫力の向上がみられるのに対して、本発明のストレス負荷回復促進剤における有効成分である、混合抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分を、予め、ストレスを負荷する前に対象動物に投与しておくと、ストレス負荷中及び免疫力回復期中に、混合抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分を投与しなくても、免疫力回復期において免疫力の回復が促進される。この点においても、本発明における「免疫増強活性」と本発明における「ストレス負荷回復促進活性」とは、異なる活性である。
本発明の免疫増強剤又はストレス負荷回復促進剤の投与剤型としては、特に限定がなく、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、若しくは丸剤等の経口剤、又は注射剤、外用液剤、軟膏剤、坐剤、局所投与のクリーム、若しくは点眼薬などの非経口剤を挙げることができる。
これらの経口剤は、例えば、アルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸、又は合成ケイ酸アルミニウムなどの賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、矯味剤、安定化剤、保湿剤、防腐剤、又は酸化防止剤等を用いて、常法に従って製造することができる。
非経口投与方法としては、注射（皮下、静脈内等）、又は直腸投与等が例示される。これらのなかで、注射剤が最も好適に用いられる。
例えば、注射剤の調製においては、有効成分の他に、例えば、生理食塩水若しくはリンゲル液等の水溶性溶剤、植物油若しくは脂肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖若しくは塩化ナトリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、又は乳化剤などを任意に用いることができる。
また、本発明の免疫増強剤又はストレス負荷回復促進剤は、徐放性ポリマーなどを用いた徐放性製剤の手法を用いて投与してもよい。例えば、本発明の免疫増強剤をエチレンビニル酢酸ポリマーのペレットに取り込ませて、このペレットを治療又は予防すべき組織中に外科的に移植することができる。
本発明の免疫増強剤又はストレス負荷回復促進剤は、これに限定されるものではないが、混合抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分を、０．０１〜９９重量％、好ましくは０．１〜８０重量％の量で含有することができる。
本発明の免疫増強剤又はストレス負荷回復促進剤を用いる場合の投与量は、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法などに応じて適宜決定することができ、経口的に又は非経口的に投与することが可能である。
また、投与形態も医薬品に限定されるものではなく、種々の形態、例えば、健康食品（好ましくは機能性食品）又は飼料として飲食物の形で与えることも可能である。なお、前記食品には飲料が含まれる。
食品には、（１）栄養素としての働き（第一次機能）、（２）人間の五感に訴える働き（第２次機能）の他に、（３）人間の健康、身体能力、又は心理状態に好ましい影響を与える働き（第３次機能）、例えば、消化器系、循環器系、内分泌系、免疫系、又は神経系などの生理系統を調節して、健康の維持や健康の回復に好ましい効果を及ぼす働きがあることが知られている。本明細書において「健康食品」とは、健康に何らかの効果を与えるか、あるいは、効果を期待することができる食品を意味し、「機能性食品」とは、前記「健康食品」の中でも、前記の種々の生体調節機能（すなわち、消化器系、循環器系、内分泌系、免疫系、又は神経系などの生理系統の調節機能）を充分に発現することができるように設計及び加工された食品を意味する。
更には、オーラル衛生用組成物、例えば、口中に一時的に含むものの、そのほとんどを口中より吐き出す形態、例えば、歯磨剤、洗口剤、チューインガム、又はうがい剤の形で与えることも、あるいは、鼻から吸引させる吸入剤の形で与えることも可能である。例えば、混合抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分を、添加剤（例えば、食品添加剤）として、所望の食品（飲料を含む）、飼料、歯磨剤、洗口剤、チューインガム、又はうがい剤等に添加することができる。
実施例
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１：マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株菌糸体の混合抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分の調製
マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株菌糸体を、滅菌処理した培地（３％グルコース，０．３％酵母エキス，ｐＨ６．０）３．５ｔの入った７ｔ容培養タンクに接種し、２５℃で撹拌しながら４週間培養を行なった。得られた培養物を濾布濾過し、菌糸体を分離した後、蒸留水で充分に洗浄した。
得られた菌糸体の一部（約１ｋｇ）に精製水３０Ｌを加えて、９８℃の湯浴中で３時間撹拌抽出した。冷却後、遠心分離（８０００ｒｐｍ，３０分間）を行ない、上清Ａ_１を得た。残渣に精製水３０Ｌを加えて、同一条件下で、再度、抽出及び遠心操作を行ない、上清Ａ_２を得た。
続いて、上清Ａ_２を得た後の残渣に、０．５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液２０Ｌを加え、２５℃で１時間撹拌抽出した。遠心分離を行ない、上清Ｂ_１を得た。残渣に１．０ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を加え、同一条件で、再度、抽出及び遠心操作を行ない、上清Ｂ_２を得た。得られた上清Ｂ_１及び上清Ｂ_２を合わせた後、１．０ｍｏｌ／Ｌ塩酸にて、ｐＨを７．０に調整した（以下、上清Ｂと称する）。
上清Ａ_１、上清Ａ_２、及び上清Ｂを合わせて得られた混合液（以下、抽出混合液Ｍと称する）を透析チューブ（分画分子量＝３５００）に入れ、流水中で４８時間透析した。透析内溶液を回収し、凍結乾燥機で乾燥し、白色の粉末（約７０ｇ）を得た。
得られた粉末の一部（１０ｇ）を５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）５００ｍＬに溶解し、予め同じ緩衝液で平衡化させておいたジエチルアミノエチルセファセル（ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｃｅｌ；ファルマシア社）を充填したカラムを通過させ、素通り画分（非吸着画分）Ｍ１を得た。カラムを前記トリス塩酸緩衝液で充分に洗浄した後、０．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム含有５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）をアプライし、溶出画分（吸着画分）Ｍ２を得た。
得られたＭ１画分及びＭ２画分を、それぞれ、４℃にて注射用蒸留水で４８時間透析した後、透析内液を凍結乾燥して粉末を得た。菌糸体（乾燥重量）に対するＭ１画分及びＭ２画分の各収量は、それぞれ、７％及び１３％であった。
実施例２：二重移植腫瘍系による吸着画分Ｍ２の評価
本実施例では、人工転移モデルである二重移植腫瘍系を用いて、実施例１で得られたＭ２画分の免疫増強作用について評価した。
具体的には、７週齢ＢＡＬＢ／ｃ雄マウス（１群７匹；日本エスエルシー社）と、ＢＡＬＢ／ｃマウスと同系のＭｅｔｈ−Ａ線維芽肉腫細胞とを用いて、マウスの右側腹皮内に２×１０^６個のＭｅｔｈ−Ａ細胞を、左側腹皮内に４×１０^５個のＭｅｔｈ−Ａ細胞を同時に移植した。移植後３日目［右側の大きな腫瘍（原発巣と想定）が指で触れるようになる］に、実施例１で得られたＭ１画分又はＭ２画分５ｍｇを、右側腫瘍内に３日間連続投与し、左側腫瘍（転移巣と想定）及び右側腫瘍の増殖の度合を２１日間観察した。なお、対照として、Ｍ１画分又はＭ２画分の代わりに、生理食塩水を投与した。
結果を図１及び図２並びに表１に示す。
図１は、右側腫瘍における腫瘍直径（平均値±標準偏差）の経時的変化を示すグラフであり、図２は、左側腫瘍における腫瘍直径（平均値±標準偏差）の経時的変化を示すグラフである。図１及び図２において、白丸は、対照の結果を示し、黒四角は、Ｍ１画分の結果を示し、白三角は、Ｍ２画分の結果を示す。
また、表１には、移植後２１日経過後の右側腫瘍及び左側腫瘍の各腫瘍直径（平均値±標準偏差、単位＝ｍｍ）及び各腫瘍重量（平均値±標準偏差，単位＝ｇ）を示す。
Ｍ２画分を投与することにより、対照に比べ、左右の腫瘍増殖を有意に抑制した。その効果は、Ｍ２画分を直接注入した右側腫瘍で顕著であったが、非注入の左側腫瘍の増殖をも抑制したことから、免疫（サイトカイン）を介したメカニズムが考えられる。

実施例３：血清ＩＡＰ値の測定
本実施例では、Ｍ２画分の投与による血清ＩＡＰ（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）値の変化を測定した。血清ＩＡＰは、活性化マクロファージにより産生することが知られており、血清ＩＡＰ値はマクロファージ活性化の指標となる。
具体的には、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、実施例１で調製したＭ１画分又はＭ２画分５ｍｇを皮内注射し、経時的に血液を採取し、ＳＲＩＤ（ｓｉｎｇｌｅ ｒａｄｉａｌ ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）法（Ｊ．Ｃｌａｕｓｅｎ著，佐々木賽及び村地孝訳，「免疫化学的同定法」，東京化学同人，１８−２１，１９７３）により血清ＩＡＰ値を測定した。
結果を図３に示す。図３において、白丸は、Ｍ１画分の結果を示し、黒丸は、Ｍ２画分の結果を示す。
図３に示すように、Ｍ２画分投与により、４３０μｇ／ｍＬのＩＡＰの産生が認められた。
実施例４：吸着画分Ｍ２のサルコーマ１８０腫瘍増殖抑制活性の評価
動物としては、日本クレア（株）から購入した雌性ＩＣＲマウスを用い、腫瘍としては、呉羽化学工業株式会社生物医学研究所で雌性ＩＣＲマウスの腹腔内で継代維持しているサルコーマ１８０細胞を用いた。すなわち、５週齢の雌性ＩＣＲマウスの腋窩部皮下に、サルコーマ１８０細胞を１０^６個移植した（１群＝１０匹）。移植後翌日から、実施例１で得られた吸着画分Ｍ２の所定量（１．０ｍ９／ｋｇ，１０ｍｇ／ｋｇ，又は５０ｍｇ／ｋｇ）を隔日に１０回、腹腔内投与し、移植後２５日目にマウスを屠殺して腫瘍結節を摘出し、重量を測定した。対照としては生理食塩水投与群を設けた。
増殖抑制率（単位＝％）は、式：
［増殖抑制率（％）］＝｛（Ｗｃ−Ｗ）／Ｗｃ｝×１００
［式中、Ｗはサンプル処置群の平均結節重量（単位＝ｇ）であり、Ｗｃは生理食塩水処置群の平均結節重量（単位＝ｇ）である］
により算出した。
結果を表２に示す。表２から明らかなように、Ｍ２画分投与により有意の増殖抑制がみられた。

実施例５：吸着画分Ｍ２の腸管リンパ球キラー活性誘導に及ぼす影響の評価
実施例１で得られたＭ１画分、Ｍ２画分、又は分画前の抽出物（すなわち、抽出混合液Ｍの凍結乾燥粉末）を、マウスに経口投与し、腸管リンパ球のキラー活性誘導に及ぼす影響を検討した。腸間膜リンパ節細胞の活性は、原田らの方法（Ｈａｒａｄａ Ｍ．ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５５，６１４６−６１５１，１９９５）により評価した。
すなわち、腫瘍細胞を盲腸壁に移植したマウスから、腸間膜リンパ節細胞を取り出し、試験管内で前記腫瘍細胞で再刺激した時のキラー活性を測定することにより、生物活性を検定した。用いた腫瘍細胞は、マウス白血病細胞Ｐ８１５及びＢ７／Ｐ８１５細胞であり、これらは九州大学生体防御医学研究所原田守博士（現在、久留米大学医学部）から供与された細胞株を、１０％牛胎児血清（５６℃で３０分間の熱処理済み）添加ＲＰＭＩ１６４０培地中で、呉羽化学工業株式会社生物医学研究所で継代維持している。動物は日本ＳＬＣから購入した雌性ＤＢＡ／２マウスであり、予備飼育した後、８週齢で実験に用いた。
予め、ネンブタール５０ｍｇ／ｋｇの腹腔内注射による麻酔下、マウスを固定し、その腹部をはさみとピンセットとで開き、盲腸部を取り出し、１／８Ｇの歯科用注射針（旗印本木注射針）を装着した１ｍＬ容注射筒を用いて、Ｂ７／Ｐ８１５細胞（１×１０^６個／５０μＬ）を盲腸壁下に移植し、解剖用ホッチキスを用いて腹部を閉じた。麻酔からさめたマウスを飼育ケージに入れ、通常の飼育環境下で飼育した。そして、腫瘍細胞移植翌日から、経口投与用ゾンデを用いて、各サンプルを連日１０日間経口投与した（１群当たり１０匹）。
最終投与の翌日にマウスを屠殺し、腸間膜リンパ節を無菌的に取り出し、ハンクス平衡塩類溶液（Ｈａｎｋｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を入れた無菌シャーレに移した。はさみとピンセットとでリンパ節をほぐした後、メッシュを通してリンパ球の単細胞液を調製した。１０％牛胎児血清（５６℃で３０分間の熱処理済み）添加ＲＰＭＩ１６４０培地で細胞を３回洗浄した後、１０％牛胎児血清（５６℃で３０分間の熱処理済み）、５×１０^−５ｍｏｌ／Ｌの２−メルカプトエタノール、２０ｍｍｏｌ／Ｌの４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸、及び３０μｇ／ｍＬゲンタマイシンをそれぞれ添加したＲＰＭＩ１６４０培地で、細胞濃度を５×１０^６個／ｍＬに調整し、エフェクター細胞として用いた。
一方、刺激細胞は、以下の手順で調製した。すなわち、Ｐ８１５細胞又はＢ７／Ｐ８１５細胞をＲＰＭＩ１６４０培地中に５×１０^６個／ｍＬになるように懸濁し、マイトマイシンＣ（シグマ）を５０μｇ／ｍＬになるように加え、５％炭酸ガス培養器中で３０分間反応させた後、１０％牛胎児血清（５６℃で３０分間の熱処理済み）添加ＲＰＭＩ１６４０培地で細胞を３回洗浄し、細胞濃度を１×１０^５個／ｍＬに調整した。
混合リンパ球・腫瘍細胞反応（Ｍｉｘｅｄ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＭＬＲ）は、以下の条件で検討した。
すなわち、９６ウエルの細胞培養用平底マイクロプレート（Ｆａｌｃｏｎ ３０７２；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ，米国）に、前記エフェクター細胞及び／又は刺激細胞を０．１ｍＬずつ加え、３７℃の５％炭酸ガス培養器中で３日間培養し、細胞をフィルター上に回収した。なお、エフェクター細胞及び刺激細胞の両方を加える場合には、両者の細胞数比を１２．５（エフェクター細胞数／刺激細胞数）とした。本測定系においては、前記エフェクター細胞が、混合リンパ球・腫瘍細胞反応における「リンパ球」として機能し、前記刺激細胞が「腫瘍細胞」として機能する。培養終了の８時間前に、プレートの各ウエルに^３Ｈ−チミジン（アマーシャムジャパン）３７ｋＢｑを加えた。回収した細胞を５％トリクロロ酢酸で充分に洗浄した後、乾燥し、液体用バイアルに入れ、液体シンチレーターを加え、液体シンチレーションカウンターで、放射能活性を測定した。
スティミュレーション・インデックス（Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ Ｉｎｄｅｘ；Ｓ．Ｉ．）は、式：
［Ｓ．Ｉ．］＝（Ｂｍｉｘ−Ｂｓ）／（Ｂｅ−Ｂｓ）
［式中、Ｂｍｉｘは、エフェクター細胞及び刺激細胞混合培養群の放射能活性（単位＝Ｂｑ）であり、Ｂｓは、刺激細胞単独培養群の放射能活性（単位＝Ｂｑ）であり、Ｂｅは、エフェクター細胞単独培養群の放射能活性（単位＝Ｂｑ）である］
により算出した。
一方、リンパ球・腫瘍細胞の混合培養による細胞傷害活性誘導反応（ＭＬＲ−ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ；ＭＬＲ−ＣＭＣ）は、以下の条件で検討した。
すなわち、２４ウエルの細胞培養用マイクロプレート（Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｌａｓｔａｒ）（Ｃｏｓｔａｒ ３５２４；Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．，米国）に、前記エフェクター細胞及び刺激細胞（エフェクター細胞数／刺激細胞数＝１２．５）を１．０ｍＬずつ加え、３７℃の５％炭酸ガス培養器中で３日間培養した。培養終了後、細胞を回収し、１０％牛胎児血清（５６℃で３０分間の熱処理済み）添加ＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄した。顕微鏡を用いて、細胞懸濁液中のエフェクター細胞数のみを計数し、エフェクター細胞数を２．５×１０^６個／ｍＬに調整した。
一方、別に用意したＰ８１５細胞をクロム酸ナトリウム（アマーシャムジャパン）と３７℃で２０分間反応させた。未結合の放射性物質を１０％牛胎児血清（５６℃で３０分間の熱処理済み）添加ＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄することにより除去し、放射性クロム標識腫瘍細胞を５×１０^４／ｍＬに調整した。
前記エフェクター細胞又はその２倍希釈系列と放射性クロム標識腫瘍細胞とを試験管に０．１ｍＬずつ加え、３７℃の５％炭酸ガス培養器中で４時間反応させた。反応終了後、１０％牛胎児血清（５６℃で３０分間の熱処理済み）添加ＲＰＭＩ１６４０培地をそれぞれの試験管に１．５ｍＬずつ加え、ミキサーでよく混合した後、遠心分離（１２００ｒｐｍ，５分間，４℃）して上清を分離し、放射能活性をガンマカウンターを用いて測定した。
特異的傷害率［Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｌｙｓｉｓ；Ｓ．Ｌ．（単位＝％）］は
式：
［Ｓ．Ｌ．（％）］＝｛（Ｂ−Ｂｆ）／（Ｂｍａｘ−Ｂｆ）｝×１００
［式中、Ｂは実験群上清の放射能活性（単位＝Ｂｑ）であり、Ｂｆは自然遊離群上清の放射能活性（単位＝Ｂｑ）であり、Ｂｍａｘは最大遊離群の放射能活性（単位＝Ｂｑ）である］
により算出した。なお、自然遊離群とは、放射性クロム標識腫瘍細胞単独培養群を意味し、最大遊離群とは、５％トリトンＸ１００（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００）処置放射性クロム標識腫瘍細胞群を意味する。
実施例１で調製した各サンプルのＭＬＲ−ＣＭＣに及ぼす影響を測定した結果（エフェクター細胞数／腫瘍細胞数が１２．５の時の値）を表３に示す。表３において、＊は対照群に対してｐ＜０．０１で有意差のあることを示す。なお、対照群には純水０．２ｍＬを経口投与した。表３から明らかなように、ＭＬＲ−ＣＭＣ増強活性は、Ｍ２画分にあり、その作用は用量依存的であった。

実施例６：吸着画分Ｍ２のＩＬ−１２遺伝子発現増強活性の評価
腸間膜リンパ節細胞のインターロイキン１２（ＩＬ−１２）遺伝子発現は、原田らの方法（Ｈａｒａｄａ Ｍ．ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５８，３０７３−３０７７，１９９８）に従って、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により測定した。
具体的には、Ｍ２画分２５０ｍｇ／ｋｇ／日又は蒸留水を投与した盲腸壁腫瘍移植マウス（移植後１１日目）、健常マウス、又はシャム（ｓｈａｍ）マウスを屠殺後、腸間膜リンパ節を分離し、直ちに液体窒素中で凍結し、分析まで−８０℃で保存した。なお、盲腸壁腫瘍移植マウスは、実施例５と同様にして、マウス盲腸壁へ腫瘍を移植することにより調製した。また、シャムマウスは、腫瘍細胞の代わりに、盲腸壁に生理食塩水を注射することにより調製した。
以下に示す操作は、特に断らない限り、市販の各キット又は各試薬に添付のプロトコールに従って実施した。ＲＮＡ調製試薬（ＴＲＩｚｏｌ試薬；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いて、各試料から全ＲＮＡを調製した後、逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ランダムヘキサマー、及びデオキシヌクレオシド三リン酸を用いて、全ＲＮＡを逆転写し、続いて、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏ．，ＵＳＡ）、デオキシヌクレオシド三リン酸、及びプライマー対の存在下、ＰＣＲサーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＰＣＲ Ｔｈｅｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＴＰ−２０００；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏ．）を用いて、ｃＤＮＡを増幅した。
なお、ＰＣＲのサイクル数は、ＩＬ−１２ ｐ４０及びβ−アクチンの場合、それぞれ、３０回及び３６回とした。また、前記プライマー対としては、ＩＬ−１２ ｐ４０のセンスプライマー及びアンチセンスプライマーとして、それぞれ、配列番号１及び２で表される各塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用し、β−アクチンのセンスプライマー及びアンチセンスプライマーとして、それぞれ、配列番号３及び４で表される各塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用した。
ＰＣＲ増幅物は、臭化エチジウム存在下でアガロースゲル電気泳動の後、マルチ分析システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｍｕｌｔｉ−Ａｎａｌｙｓｔ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて数値化した。
結果を図４に示す。図４において、グラフ（Ａ）は、健常マウスの結果であり、グラフ（Ｂ）は、シャムマウスの結果であり、グラフ（Ｃ）は、腫瘍移植マウスの結果である。また、図４において、ＩＬ−１２ ｐ４０遺伝子の発現率は、健常・蒸留水投与群に対する百分率で示す。
健常・蒸留水投与群と比べて、腫瘍移植・蒸留水投与群では、ＩＬ−１２遺伝子発現が増強されていた。Ｍ２画分は、健常個体のＩＬ−１２遺伝子発現に殆ど影響なかったが、腫瘍移植個体の発現を有意に促進した。なお、シャム群でも、Ｍ２画分は発現を軽度促進した。
実施例７：吸着画分Ｍ２を経口投与した腫瘍免疫マウスにおける生存期間延長と抗ＩＬ−１２抗体処置の影響の評価
本実施例では、Ｍ２画分の抗腫瘍効果に及ぼす影響を調べた。Ｂ７／Ｐ８１５細胞を盲腸部移植した場合、腫瘍は一旦増殖するが、移植１４日目以降に退縮し、全マウスが生存した。一方、マウス盲腸壁にＰ８１５細胞を移植した場合、腫瘍細胞は増殖・転移し、全マウスが腫瘍死した。そこで、ＤＢＡ／２マウスの盲腸部にＢ７／Ｐ８１５腫瘍細胞５×１０^５個／回を２週間隔で計３回免疫し、最終注射から２週間後にＰ８１５細胞１×１０^５個を盲腸部に移植し、その後の生存期間を観察した。なお、Ｐ８１５腫瘍細胞の盲腸部における増殖は、Ｂ７／Ｐ８１５盲腸部免疫群の方が皮下免疫群よりも優っていた。
結果を表４及び図５に示す。表４及び図５において、第Ｉ群は、非免疫処置・蒸留水投与群であり、第ＩＩ群は、免疫処置・蒸留水投与群であり、第ＩＩＩ群は、免疫処置期間中にＭ２画分を連日経口投与（２５０ｍｇ／ｋｇ）した免疫処置・Ｍ２投与群であり、第ＩＶ群は、免疫処置期間中にＭ２画分を連日経口投与（２５０ｍｇ／ｋｇ）し、更に、Ｐ８１５細胞移植の１２日前、７日前、及び２日前に、それぞれ、抗ＩＬ−１２抗体を２００μｇ／回静脈内注射した免疫処置・Ｍ２投与・抗ＩＬ−１２抗体処置群である。また、表４において、「ＳＤ」は標準偏差を意味し、「Ｔ／Ｃ」における記号「Ｔ」は、テスト群（すなわち、第ＩＩ群〜第ＩＶ群）の生存日数を意味し、記号「Ｃ」は、対照（コントロール）群（すなわち、第Ｉ群）の生存日数を意味し、記号「＊」は、第ＩＩ群に対してｐ＜０．０１で有意差のあることを示す。

図５に示すように、免疫処置・蒸留水投与群（第ＩＩ群）では、非免疫処置・蒸留水投与群（第ＩＩ群）に比べ、生存期間が約１２０％延長された。免疫処置・Ｍ２投与群（第ＩＩＩ群）では、生存期間は、免疫処置・蒸留水投与群（第ＩＩ群）に比べ、１２８％まで有意に延長された。免疫処置・Ｍ２投与・抗ＩＬ−１２抗体処置群（第ＩＶ群）では、生存期間は、免疫処置・蒸留水投与群（第ＩＩ群）の１０９％まで減弱した。
同様の条件で、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、マイトマイシンＣ処理したｃｏｌｏｎ２６腫瘍細胞を盲腸壁に２週間隔で計３回免疫後、ｃｏｌｏｎ２６生細胞を移植した場合の結果を、表５及び図６に示す。なお、表５及び図６に示す第Ｉ群から第ＩＶ群は、表４及び図５と同じ意味である。

非免疫処置・蒸留水投与群（第Ｉ群）では、大部分のマウスは、悪疫質、腫瘍増殖に伴う腸管閉塞、又は腹膜炎により死亡したが、Ｍ２画分の経口投与は、マウスの生存期間を有意に延長した。更に、その効果は、抗ＩＬ−１２抗体処理により減弱した。なお、非免疫マウスにＭ２画分を投与しても、生存期間に大きな影響はなかった。
実施例８：吸着画分Ｍ２のストレス負荷に対する回復促進活性の評価
本実施例では、実施例１で得られたＭ２画分を評価用サンプルとし、この評価用サンプルをマウスに１０日間経口投与した後、拘束ストレスを１８時間負荷し、ストレス解放後のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性を測定することにより、前記サンプルの影響を検討した。
具体的には、日本チャールズリバーから購入した８週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（各群＝５〜１０匹）に、評価用サンプルの水溶液を１０日間に亘って、通常の飼育用ケージ中で経口投与（３００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）した。続いて、マウスを前記飼育ケージから取り出し、空気抜けの穴を開けた５０ｍＬ容のキャップ付きポリプロピレン製遠心用チューブ（カタログ番号２３４１−０５０；テクノグラス社）にマウスを１匹ずつ閉じ込めた。このチューブ中に閉じ込められたマウスは、身動きができない状態となった。次に、それらのチューブを飼育用ケージに戻し、１８時間その状態で放置することにより、拘束ストレスを与えた。１８時間のストレス負荷の後、チューブからマウスを取り出し、飼育用ケージに戻し、普通の環境下で飼育した。
前記拘束ストレスを開放してから７日経過後にマウスを屠殺し、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇらの方法により（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ Ａ．Ｈ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐｓｙｃｈｏｌ．，１２，２５−３１，１９８６）、以下の手順に従って、試験管内でＮＫ感受性の腫瘍細胞株ＹＡＣ−１に対するリンパ節細胞の細胞傷害活性を測定することにより、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性を評価した。
すなわち、マウスから脾臓及び腸間膜リンパ節を無菌的に取り出し、ハンクス平衡塩類溶液（Ｈａｎｋｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を入れた無菌シャーレに移した。はさみとピンセットとでリンパ節をほぐした後、メッシュを通してリンパ球の単細胞液を調製した。１０％牛胎児血清（５６℃で３０分間の熱処理を実施）添加ＲＰＭＩ１６４０培地で細胞を３回洗浄した後、１０％牛胎児血清（５６℃で３０分間の熱処理を実施）、２０ｍｍｏｌ／Ｌの４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸、及び３０μｇ／ｍＬゲンタマイシンをそれぞれ添加したＲＰＭＩ１６４０培地で、細胞濃度を５×１０^６個／ｍＬに調整して得た細胞懸濁液をエフェクター細胞として用いた。
一方、標的細胞として用いたＹＡＣ−１細胞は、１０％牛胎児血清（５６℃で３０分間の熱処理を実施）添加ＲＰＭＩ１６４０培地中で、呉羽化学工業株式会社生物医学研究所で継代維持したものである。前記ＹＡＣ−１細胞に放射性クロム酸ナトリウム（アマーシャムジャパン）を加え、３７℃で２０分間反応させた。未結合の放射性クロム酸ナトリウムを、１０％牛胎児血清（５６℃で３０分間の熱処理を実施）添加ＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄することにより除去し、放射性クロム標識腫瘍細胞を５×１０^４個／ｍＬに調整した。
先に調整した前記エフェクター細胞懸濁液又はその２倍希釈系列と、前記放射性クロム標識腫瘍細胞懸濁液とを、それぞれ０．１ｍＬずつ試験管に加え、３７℃の５％炭酸ガス培養器中で４時間反応させた。なお、この際、後述する特異的傷害率を算出するために、放射性クロム標識腫瘍細胞と培地とを試験管に加えた懸濁液、そして、放射性クロム標識腫瘍細胞と界面活性剤（トリトン；最終濃度＝０．０５％）とを試験管に加えた懸濁液についても、３７℃の５％炭酸ガス培養器中で４時間反応させた。反応終了後、１０％牛胎児血清（５６℃で３０分間の熱処理を実施）添加ＲＰＭＩ１６４０培地１．５ｍＬを試験管に更に加え、ミキサーで充分に混合した後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ，５分間，４℃）することにより、上清を得た。得られた上清の放射能活性をガンマカウンターを用いて測定した。
特異的傷害率（Ｓ．Ｌ．：Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｌｙｓｉｓ）を、式：
［Ｓ．Ｌ．（％）］＝｛（Ｂ−Ｂｆ）／（Ｂｍａｘ−Ｂｆ）｝×１００
［式中、Ｓ．Ｌ．は、特異的傷害率（単位＝％）であり、Ｂは、実験群における上清の放射能活性（単位＝Ｂｑ）であり、Ｂ_ｆは、自然遊離群（すなわち、放射性クロム標識腫瘍細胞単独培養群）における上清の放射能活性（単位＝Ｂｑ）であり、Ｂ_ｍａｘは、最大遊離群（すなわち、トリトン処置した放射性クロム標識腫瘍細胞群）における上清の放射能活性（単位＝Ｂｑ）である］
から算出し、エフェクター細胞１０^７個当たり３０％の腫瘍細胞を傷害する細胞数、すなわち、「３０％傷害単位（Ｌｙｔｉｃ Ｕｎｉｔｓ ３０％；ＬＵ３０）」でＮＫ細胞活性を表示した。
結果を表６に示す。なお、対照（健常群）試験として、評価用サンプル水溶液の代わりに、蒸留水を１０日間に亘って経口投与したこと、そして、１８時間の拘束ストレスを与えなかったこと以外は、前記操作をそのまま繰り返した。また、比較試験として、評価用サンプル水溶液の代わりに、生理食塩水を１０日間に亘って経口投与したこと以外は、前記操作をそのまま繰り返した。また、表６の拘束欄において、記号「（−）」は、拘束ストレスを与えなかったことを意味し、記号「（＋）」は、拘束ストレスを与えたことを意味する。
なお、有意差検定の結果は、比較群において、対照群に対してｐ＜０．０１であり、Ｍ２画分投与群において、比較群に対してｐ＜０．０５であった。

実施例９：吸着画分Ｍ２の理化学的性質の検討
実施例１で得られたＭ２画分、及び後述の参考調製例１で得られた市販マツタケの子実体由来のｍ２画分の理化学的性質を検討した。測定方法及びその結果を以下に示す。
（１）糖質の定量
フェノール硫酸法を用いる比色により定量した。Ｍ２画分の糖質含量は、グルコース換算値として６２％であった。
実施例１の操作を別途、２回繰り返して得られた２種のＭ２画分について、同様に、フェノール硫酸法を用いる比色により糖質含量を測定したところ、グルコース換算値として６９％及び７０％であった。
なお、ｍ２画分の糖質含量は、グルコース換算値として３５％であった。
更に、ヨウ素呈色反応を実施したところ、Ｍ２画分及びｍ２画分のいずれも陰性であり、デンプンとは性状の異なる糖質が存在すると考えられた。
（２）タンパク質の定量
銅フォリン法を用いる比色により定量した。Ｍ２画分のタンパク質含量は、アルブミン換算値として３８％であった。
実施例１の操作を別途、２回繰り返して得られた２種のＭ２画分について、同様に、銅フォリン法を用いる比色によりタンパク質含量を測定したところ、アルブミン換算値として３１％及び３０％であった。
なお、ｍ２画分のタンパク質含量は、アルブミン換算値として６５％であった。
（３）糖質の組成分析
封入管にＭ２画分１．０ｍｇと２ｍｏｌ／Ｌトリフルオロ酢酸０．２ｍＬとを入れ、１００℃で６時間加水分解した後、エバポレーターで減圧乾固し、残渣を得た。残渣を純水５００μＬに溶解し、純水で２倍又は１０倍希釈した。この溶液５０μＬに内部標準物質ヘプトース５００ｎｇを添加し、カラムＴＳＫ−ｇｅｌ Ｓｕｇａｒ ＡＸＧＬＣ−９Ａ １５ｃｍ×４．６ｍｍＩＤ（東ソー）と検出器分光光度計ＲＦ−５３５（島津製作所）とを装着した高速液体クロマト装置ＬＣ−９Ａ（島津製作所）にアプライした。カラム温度は７０℃であり、移動相及びその流速は０．５Ｍホウ酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．７）及び０．４ｍＬ／分であった。ポストカラム標識の条件は、反応試薬として１％アルギニン／３％ホウ酸を用い、流速は０．５ｍＬ／分であり、反応温度は１５０℃であり、検出波長はＥＸ３２０ｎｍ及びＥＭ４３０ｎｍである。
Ｍ２画分の糖組成は、多い方から順に、グルコース６１μｇ／ｍｇ、マンノース３．３μｇ／ｍｇ、及びガラクトース２．０μｇ／ｍｇであった。
また、ｍ２画分の糖組成は、多い方から順に、グルコース１２．９μｇ／ｍｇ、ガラクトース１２．６μｇ／ｍｇ、マンノース５．６μｇ／ｍｇ、フコース３．５μｇ／ｍｇ、及びキシロース０．４μｇ／ｍｇであった。
（４）アミノ酸組成分析
酸加水分解は、以下の手順で実施した。すなわち、封入管にＭ２画分０．３３ｍｇと６ｍｏｌ／Ｌ塩酸０．２ｍＬとを入れ、１１０℃で２２時間加水分解した後、エバポレーターで減圧乾固し、残渣を得た。残渣を純水０．５ｍＬに溶解し、その５０μＬをアミノ酸分析に用いた。
また、アルカリ加水分解（トリプトファン分析用）は、以下の手順で実施した。すなわち、Ｍ２画分０．４８ｍｇをプラスチックチューブに入れた後、可溶性デンプン（Ｓｔａｒｃｈ Ｓｏｌｕｂｌｅ）５ｍｇを含む１％ｎ−オクチルアルコール−４．２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液１００μＬを加えた。このプラスチックチューブをガラス試験管に入れ、真空封管下、１１０℃で１６時間加水分解した。空冷後、開封し、プラスチックチューブを氷中で冷却し、１．０ｍｏｌ／Ｌ塩酸を添加し、中和した。更に、精製水８４０μＬを添加して総量１０００μＬとし、その５０μＬをアミノ酸分析に用いた。
装置は日立Ｌ−８５００型アミノ酸分析計（日立製作所）であり、ニンヒドリン発色により定量した。
アミノ酸組成は、アスパラギン酸及びアスパラギン１０．３５ｍｏｌ％、トレオニン５．８３ｍｏｌ％、セリン６．２７ｍｏｌ％、グルタミン酸及びグルタミン１０．４９ｍｏｌ％、グリシン８．５５ｍｏｌ％、アラニン９．１９ｍｏｌ％、バリン６．８８ｍｏｌ％、１／２−シスチン０．６０ｍｏｌ％、メチオニン１．４９ｍｏｌ％、イソロイシン５．３６ｍｏｌ％、ロイシン９．２５ｍｏｌ％、チロシン２．５５ｍｏｌ％、フェニルアラニン４．０５ｍｏｌ％、リシン５．１７ｍｏｌ％、ヒスチジン２．１８ｍｏｌ％、アルギニン４．４４ｍｏｌ％、トリプトファン１．８２ｍｏｌ％、及びプロリン５．５４ｍｏｌ％であった。
（５）等電点分析
Ｍ２画分を１ｍｇ／ｍＬに調製し、（イ）Ｍ２画分溶液１０μＬに純水１０μＬを添加したものに、あるいは、（ロ）Ｍ２画分溶液２０μＬ（タンパク質量として約１．１４μｇ）に、それぞれ、４０％（体積／体積）程度のサッカロースを加え、電気泳動を実施した。電気泳動の条件は以下のとおりである。
ゲル：ＩＥＦ−ＰＡＧＥｍｉｎｉ（４％，ｐＨ３〜１０；テフコ社）
泳動用緩衝液：（陰極）０．０４ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液、（陽極）０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸溶液
泳動条件：１００Ｖで３０分間泳動を行ない、続いて、３００Ｖで２０分間泳動を行ない、更に、５００Ｖで４０分間泳動を行なった。
ＰＩマーカー：各バンドが１．３５ｇ（ファルマシア）
染色：銀染色
メインバンドの等電点は、５．８５付近であった。
（６）核磁気共鳴分析（ＮＭＲ）
測定条件は以下のとおりである。
（ｉ）^１Ｈ一次元ＮＭＲ測定
Ｍ２画分７ｍｇにＤ_２Ｏ８００μＬを加え、超音波で約５分間溶解を試みた後、遠心機にかけ、その上澄み部分を測定に使用した。測定条件は以下のとおりである。
測定装置として、ＵＮＩＴＹ ＩＮＯＶＡ６００型（Ｖａｒｉａｎ社）を使用し、観測周波数は５９９．６ＭＨｚ（^１Ｈ核）である。溶媒としてＤ_２Ｏ溶液を使用し、濃度は飽和溶液である。基準としてＴＳＰ０．００ｐｐｍ（^１Ｈ）を用い、温度は２５℃であり、繰返し時間７．０秒（^１Ｈ核）で積算回数を２５６回とした。
得られたスペクトルを図７に示す。３．０〜５．６ｐｐｍに糖由来のシグナルが強く観測された。０．５〜３．０ｐｐｍに観測されたシグナルがアミノ酸の側鎖由来であると考えると、糖由来のシグナル強度がアミノ酸由来のシグナル強度よりかなり強いことから、Ｍ２画分は構造内に多くの糖を含むことが推定された。また、６．６〜７．６ｐｐｍに芳香族アミノ酸のＮＭＲシグナルが観測された。
また、αグルカンの推定含有率は、７１％であった。
（ｉｉ）^１３Ｃ一次元ＮＭＲ測定
Ｍ２画分を、約２０．５ｍｇ／０．７５ｍＬになるように、Ｄ_２Ｏ／ＣＤ_３ＯＤ（７２５／２５）に溶解し、以下の操作条件で測定した。
すなわち、観測周波数は１２５．８ＭＨｚであり、基準は重メタノール（δ＝４９ｐｐｍ）であり、温度は４５℃であり、観測幅は３１．４ＫＨｚであり、データ点は６４Ｋであり、パルス幅は約４１°であり、パルス繰返し時間は２．５秒であり、積算回数は４０００であり、デカップリングは^１Ｈ完全デカップリングである条件で測定を実施した。
結果を図８及び図９に示す。糖質由来のシグナルとアミノ酸由来のシグナルとを観測したが、糖質のシグナル強度は、アミノ酸由来のものよりも強かった。Ｍ２画分の構成糖の大部分はグルコースであることから、９５ｐｐｍ〜１１０ｐｐｍのシグナルはグルコースの１位の炭素であり、１０５ｐｐｍ付近のシグナルはβ１位の炭素であり、１０２ｐｐｍ付近及び９９ｐｐｍ付近のシグナルはα１位の炭素であると考えられる。この結果から、少なくとも３種類以上の結合様式が推定された。６３ｐｐｍ付近のシグナルは６位の炭素であるが、ここでも３種類のシグナルが存在し、Ｍ２画分が３種類以上の結合様式を有することを支持している。また、７０〜８０ｐｐｍ付近のシグナルから、４位が結合に関与していると考えられ、α１−４結合とβ１−４結合の存在が推定される。
（７）円偏光二色性分析（ＣＤ）
Ｍ２画分約３ｍｇに水を添加し、２ｍｇ／ｍＬとした。沈殿が若干あったので、遠心して上澄み部分を測定に使用した。測定条件は以下のとおりである。
測定装置としてＪＡＳＣＯＪ−５００Ａを使用し、溶媒として水を使用した。タンパク質濃度は約２ｍｇ／ｍＬであり、波長範囲は２００〜２５０ｎｍであり、セル長は１ｍｍであり、温度は室温（約２３℃）であり、積算回数は８回である条件で測定を実施した。
得られたＣＤスペクトルを図１０に示す。ＣＤ値（縦軸）は、楕円核（ｍｄｅｇ）で示した。αヘリックスなどの規則的な二次構造は若干存在するが、不規則構造が主要な構造と推定された。
（８）旋光度
２５℃で測定したところ、４２であった。
（９）赤外分光分析
赤外分光分析は、ＫＢｒ法により実施した。より具体的には、Ｍ２画分０．５ｍｇと、ＫＢｒ粉末１５ｍｇとを均質に混合した後、プレスして円盤状に成型し、測定を実施した。
得られたスペクトルを図１１に示す。このスペクトルから、Ｍ２画分には多糖類が含まれることが示唆された。
（１０）紫外分光分析（ＵＶ）
純水に溶解し、０．５ｍｇ／１０ｍＬ濃度で測定した。装置として、２５００ＰＣ（島津製作所）を使用した。
得られた紫外可視吸収スペクトルを図１２に示す。２６０〜２７０ｎｍにおいて弱い吸収極大が認められた。
（１１）電子スピン共鳴（ＥＳＲ）
測定は、ＥＳＰ３５０Ｅ（Ｂｒｕｃｋｅｒ社）を用い、窒素雰囲気下での試料のＥＳＲを測定した。主な操作条件は表７に示すとおりである。
結果を表８並びに図１３及び図１４に示す。図１３及び図１４において、縦軸の「強度（ａｒｂ．ｕｎｉｔｓ）」は、縦軸に示す「強度」の単位が任意単位であることを意味する。炭素ラジカルに起因すると考えられるシグナルを、ｇ＝２．００４付近に観察した。また、ｇ＝４．２５（Ｆｅ^３＋）付近とｇ＝２．０３〜２．０５付近のシグナルは、遷移金属イオンに起因すると考えられる。

（１２）粘度
試料（Ｍ２画分又はｍ２画分）０．５ｇを精製水１００ｍＬに溶解し、１００００ｒｐｍで遠心分離後、上清をとり、精製水で１．６７ｍｇ／ｍＬに調整した後、オストワルド粘度計を用いて、３０℃で還元粘度を測定した。Ｍ２画分の還元粘度は１０８ηであり、ｍ２画分の還元粘度は９２４ηであった。
（１３）分子量
試料（Ｍ２画分又はｍ２画分）を精製水で２〜３ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、ゲル濾過を実施した。
ゲル濾過は、装置として送液ポンプＬＣ−７Ａ（島津製作所）を使用し、検出器として紫外分光光度計検出器ＳＰＤ−６Ａ（島津製作所）を使用し、カラムとしてＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（７．５ｍｍＩ．Ｄ．×３０ｃｍ；東ソー）を使用して実施した。また、カラム温度が室温であり、移動相が０．１５ｍｏｌ／Ｌ硫酸ナトリウム含有５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）であり、移動相流速が０．８ｍＬ／分であり、検出波長が２１４ｎｍである条件で、ゲル濾過を実施した。分子量既知の標準曲線に溶出時間を外挿し、分子量を算出した。
Ｍ２画分では、主成分の分子量は２０００ｋＤａであり、それ以外に４．０ｋＤａ及び１．２ｋＤａの成分も確認された。また、ｍ２画分では、主成分の分子量は２０００ｋＤａであり、それ以外に７．０ｋＤａ及び１．０ｋＤａの成分も確認された。
（１４）元素分析
炭素（Ｃ）、水素（Ｈ）、及び窒素（Ｎ）は、有機微量元素分析計（ヤナコＣＨＮコーダーＴＭ−５型）を用いて測定した。
また、硫黄（Ｓ）、リン（Ｐ）、及び塩素（Ｃｌ）については、試料をボンベ法で燃焼分解後、吸収液中のＳＯ_４ ^２−、ＰＯ_４ ^３−、及びＣｌ⁻をイオンクロマトグラフィー（ＩＣ）法で測定し、各元素に換算した。具体的には、試料０．１ｇにアセトン１ｍＬを加え、酸素３Ｍｐａ導入後、燃焼して３０分間水冷した。０．１ｍｏｌ／Ｌ−ＮａＯＨの吸収液と洗浄液とを合わせて１００ｍＬに定容後、ダイオネクスＤＸ−３００型ＩＣを用いて測定した。
結果を表９に示す。

（１５）α−グルカン推定含有率
試料（Ｍ２画分又はｍ２画分）を０．５ｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．３）に溶解し、アミログルコシダーゼ溶液（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，ＵＳＡ）を加えて、６０℃で３０分間振盪した。次いで、液のｐＨを４．５に調整後、グルコアミラーゼ（和光純薬）を加えて、６０℃で３０分間振盪した。反応終了後、得られた各反応液中のグルコース量をグルコース測定計にて測定後、ブランク溶液のグルコース量から差し引いた値を、「α−グルカン推定量」とした。一方、試料に１．０ｍｏｌ／Ｌ硫酸を加え、１００℃で１８時間加水分解後、中和し、得られた各反応液中のグルコース量をグルコース測定計にて測定し、「総グルカン量」とした。α−グルカン推定含有率は、前記「総グルカン量」に対する前記「α−グルカン推定量」の百分率として算出した。
Ｍ２画分のα−グルカン推定含有率は、全糖質に対して７１％であり、ｍ２分画のα−グルカン推定含有率は、全糖質に対して３２％であった。
（１６）エンドトキシンの定量
市販測定キット（エンドスペーシー；生化学工業）及びエンドトキシンフリーの器具及び試薬（生化学工業）を用い、ＬＡＬ（Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ）反応（Ｏｈｂａｙａｓｈｉ Ｔ．ら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１４９，５５−６５，１９８５）により、エンドトキシン量を定量した。
すなわち、Ｍ２画分を適当な濃度になるように蒸留水に溶解した後、その５０μＬをエンドトキシンフリーの９６ウェルマイクロプレートに分注した。別のウェルには、蒸留水又はエンドトキシン標準液の希釈系列を同量分注した。次いで、マイクロプレートの各ウェルにＬＡＬ溶液（カブトガニ由来試液）５０μＬを分注し、３７℃で３０分間インキュベートし、ジアゾカップリング試液を加え、発色させた後、５４５ｎｍ（対照＝６３０ｎｍ）の吸光度を測定した。標準液の検量線から、Ｍ２画分のエンドトキシン量を算出したところ、２．５ｎｇ／ｍｇであった。
実施例１０：Ｍ２画分の活性構造の推定
本実施例では、Ｍ２画分の活性構造を推定するために、化学処理又は酵素処理したＭ２画分を調製し、これらの調製物を盲腸壁腫瘍移植マウスに経口投与し、腸間膜リンパ節細胞の活性をＭＬＲ及びＭＬＲ−ＣＭＣにより評価した。
具体的には、タンパク質の少ない画分を調製するため、高崎らの方法（Ｔａｋａｓａｋｉ Ｓ．ら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．８３，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２６３−２６８，１９８２）に準じて、Ｍ２画分のペプチド部分を調製した。すなわち、Ｍ２画分（糖質：タンパク質＝６８：３２）を無水ヒドラジンに溶解し、ガラス試験管に入れ、封管中、１００℃で２４時間加熱した。次に、処理物をデシケーターに入れ、減圧放置によりヒドラジンを流去した。乾燥物を精製水に溶解し、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５（ファルマシア）を用いたゲル濾過により高分子画分を回収し、続いて、ジエチルアミノエチルセファセル（Ｓｅｐｈａｃｅｌ）を用いたイオン交換クロマトグラフィーにより素通り画分（糖質：タンパク質＝９９：１）を得た。
一方、α−グルカンの少ない画分を調製するため、Ｍ２画分を０．５ｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．３）に溶解し、アミログルコシダーゼ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．）を加えて、６０℃で３０分間反応した。次いで、反応液のｐＨを４．５に調整後、グルコアミラーゼ（和光純薬）を加えて、６０℃で３０分間反応した。反応溶液を、セファデックスＧ−２５を用いたゲル濾過にアプライし、高分子画分（糖質：タンパク質＝１３：８７）を回収した。ＮＭＲ分析から、α−グルカンの減少を確認した。
更に、β−グルカンの少ない画分を調製するため、Ｍ２画分を０．５ｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．３）に溶解し、β−グルコシダーゼ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．）を加えて、３７℃で２４時間反応した。反応液を、セファデックスＧ−２５を用いたゲル濾過にアプライし、高分子画分（糖質：タンパク質＝５９：４１）を回収した。ＮＭＲ分析から、β−グルカンの減少を確認した。
腸間膜リンパ節細胞の活性評価は、実施例５に記載の手順と同様にして実施した。
結果を表１０に示す。表１０における「対照群］とは、蒸留水投与対照群を意味する。また、有意差検定は、前記対照群に対して行ない、「ＮＳ」は有意差がないこと（Ｎｏｔ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）を意味する。
表１０から明らかなように、Ｍ２画分のペプチド部分をヒドラジンで処理して分解除去すると、活性は明らかに消失した。また、Ｍ２画分の糖質部分をアミログルコシダーゼ及びグルコアミラーゼ処理してα−グルカンを減少させると、活性は減弱したが、β−グルコシダーゼ処理ではほとんど影響がなかった。
これらの結果は、Ｍ２画分の活性構造がα−グルカンとタンパク質であることを示唆している。

参考調製例１：市販マツタケの混合抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分の調製
市販の長野産マツタケ子実体１００ｇを凍結乾燥して水分を除去した後、粉砕して粉末１５ｇを得た。
以下、出発材料として菌糸体の代わりに、前記子実体粉末を用いること以外は、実施例１の抽出及び分画操作を繰り返すことにより、非吸着画分ｍ１及び吸着画分ｍ２を得た。
産業上の利用可能性
本発明の免疫増強剤によれば、免疫増強が必要な対象の免疫能を増強することができ、例えば、癌の治療又は予防、特には原発腫瘍の治療若しくは予防又は転移巣の治療若しくは予防に有効である。また、本発明のストレス負荷回復促進剤によれば、ストレス負荷に対する回復を促進することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
図１は、二重移植腫瘍系における右側腫瘍の腫瘍直径（平均値±標準偏差）の経時的変化を示すグラフである。
図２は、二重移植腫瘍系における左側腫瘍の腫瘍直径（平均値±標準偏差）の経時的変化を示すグラフである。
図３は、Ｍ１画分又はＭ２画分の投与による血清ＩＡＰ量の経時的変化を示すグラフである。
図４は、Ｍ２画分の経口投与によるマウス腸間膜リンパ節細胞におけるＩＬ−１２遺伝子発現誘導の結果を示すグラフである。
図５は、Ｍ２画分を経口投与した腫瘍（Ｐ８１５腫瘍細胞）免疫マウスにおける生存期間延長と抗ＩＬ−１２抗体処置の影響を示すグラフである。
図６は、Ｍ２画分を経口投与した腫瘍（Ｃｏｌｏｎ２６腫瘍細胞）免疫マウスにおける生存期間延長と抗ＩＬ−１２抗体処置の影響を示すグラフである。
図７は、吸着画分Ｍ２の^１Ｈ一次元ＮＭＲ測定により得られたスペクトルである。
図８は、吸着画分Ｍ２の^１３Ｃ一次元ＮＭＲ測定により得られたスペクトルである。
図９は、吸着画分Ｍ２の^１３Ｃ一次元ＮＭＲ測定により得られたスペクトル（広域）である。
図１０は、吸着画分Ｍ２の円偏光二色性分析により得られたＣＤスペクトルである。
図１１は、吸着画分Ｍ２の赤外分光分析により得られたスペクトルである。
図１２は、吸着画分Ｍ２の紫外分光分析により得られたスペクトルである。
図１３は、吸着画分Ｍ２のＥＳＲ分析により得られたスペクトルである。
図１４は、吸着画分Ｍ２のＥＳＲ分析により得られたスペクトル（広域）である。

Claims (25)

1. マツタケＦＥＲＭ ＢＰ−７３０４株の菌糸体の熱水抽出液と、前記菌糸体熱水抽出液を得る際に残留する菌糸体残渣のアルカリ溶液抽出液とを混合して得られる混合液の陰イオン交換樹脂吸着画分であって、
   （ａ）フェノール硫酸法によるグルコース換算値としての糖質含量が６０〜７２％であり、
   （ｂ）銅フォリン法によるアルブミン換算値としてのタンパク質含量が２８〜４０％である
   前記陰イオン交換樹脂吸着画分。
2. 請求項１に記載の陰イオン交換樹脂吸着画分を有効成分として含有する、免疫増強剤。
3. 請求項１に記載の陰イオン交換樹脂吸着画分と、薬剤学的に許容することのできる担体とを含有する、免疫増強組成物。
4. 請求項１に記載の陰イオン交換樹脂吸着画分を、それ単独で、あるいは、所望により１又はそれ以上の食品成分と共に含有する、免疫増強健康食品。
5. 前記健康食品が機能性食品である、請求項４に記載の免疫増強健康食品。
6. 請求項１に記載の陰イオン交換樹脂吸着画分を、免疫増強が必要な対象に、有効量で投与することを含む、免疫を増強する方法。
7. 請求項１に記載の陰イオン交換樹脂吸着画分の、免疫増強組成物又は免疫増強健康食品を製造するための使用。
8. 請求項１に記載の陰イオン交換樹脂吸着画分を有効成分として含有する、転移巣治療又は予防剤。
9. 請求項１に記載の陰イオン交換樹脂吸着画分と、薬剤学的に許容することのできる担体とを含有する、転移巣治療又は予防組成物。
10. 請求項１に記載の陰イオン交換樹脂吸着画分を、それ単独で、あるいは、所望により１又はそれ以上の食品成分と共に含有する、転移巣治療又は予防健康食品。
11. 前記健康食品が機能性食品である、請求項１０に記載の転移巣治療又は予防健康食品。
12. 請求項１に記載の陰イオン交換樹脂吸着画分を、転移巣治療又は予防が必要な対象に、有効量で投与することを含む、転移巣を治療又は予防する方法。
13. 請求項１に記載の陰イオン交換樹脂吸着画分の、転移巣治療若しくは予防組成物又は転移巣治療若しくは予防健康食品を製造するための使用。
14. 請求項１に記載の陰イオン交換樹脂吸着画分を有効成分として含有する、血清ＩＡＰ値上昇剤。
15. 請求項１に記載の陰イオン交換樹脂吸着画分と、薬剤学的に許容することのできる担体とを含有する、血清ＩＡＰ値上昇組成物。
16. 請求項１に記載の陰イオン交換樹脂吸着画分を、それ単独で、あるいは、所望により１又はそれ以上の食品成分と共に含有する、血清ＩＡＰ値上昇健康食品。
17. 前記健康食品が機能性食品である、請求項１６に記載の血清ＩＡＰ値上昇健康食品。
18. 請求項１に記載の陰イオン交換樹脂吸着画分を、血清ＩＡＰ値上昇が必要な対象に、有効量で投与することを含む、血清ＩＡＰ値を上昇させる方法。
19. 請求項１に記載の陰イオン交換樹脂吸着画分の、血清ＩＡＰ値上昇組成物又は血清ＩＡＰ値上昇健康食品を製造するための使用。
20. 請求項１に記載の陰イオン交換樹脂吸着画分を有効成分として含有する、ストレス負荷回復促進剤。
21. 請求項１に記載の陰イオン交換樹脂吸着画分と、薬剤学的に許容することのできる担体とを含有する、ストレス負荷回復促進組成物。
22. 請求項１に記載の陰イオン交換樹脂吸着画分を、それ単独で、あるいは、所望により１又はそれ以上の食品成分と共に含有する、ストレス負荷回復促進健康食品。
23. 前記健康食品が機能性食品である、請求項２２に記載のストレス負荷回復促進健康食品。
24. 請求項１に記載の陰イオン交換樹脂吸着画分を、ストレス負荷回復促進が必要な対象に、有効量で投与することを含む、ストレス負荷回復を促進する方法。
25. 請求項１に記載の陰イオン交換樹脂吸着画分の、ストレス負荷回復促進組成物又はストレス負荷回復促進健康食品を製造するための使用。

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