CN1171630C - 从香菇菌丝体的提取物来源的lak活性增强剂和含有此提取物的lak活性增强配方 - Google Patents

Abstract

本发明的一个目的是提供低成本和有良性副作用的免疫增强剂和免疫治疗配方。按照本发明，提供了含有香菇菌丝体提取物的LAK活性增强剂和含有所述增强剂的LAK活性增强配方。

Description

从香菇菌丝体的提取物来源的LAK活性增强剂和 含有此提取物的LAK活性增强配方

发明领域

本发明涉及免疫学领域。特别地，它涉及含有香菇(Lentinus edodes)菌丝体提取物的免疫活性增强剂和治疗配方。并且更特别地，它涉及含有此提取物的用于增强LAK活性和LAK活性增强配方物质。

现有技术

免疫系统活性可以分类为两种作用方式：细胞介导免疫和体液免疫。体液免疫是指涉及抗体的免疫反应，而细胞介导免疫是指由直接作用于靶的细胞引起的免疫反应。

淋巴细胞在这种细胞介导免疫反应中起主要的作用，通常靶细胞表面物质作为抗原。细胞介导免疫被认为也参与对抗肿瘤、细胞内寄生虫和病毒、移植、一些药物的过敏和一些自身免疫疾病的免疫反应。一般地，反应通常是特异性的，但是也可是非特异性的。

例如，在肿瘤免疫学中已知肿瘤细胞具有肿瘤抗原。也就是说，已知有两种抗原类型，一种类型是肿瘤特异性抗原(TSA)和另一种肿瘤相关抗原(TAA)，TAA也以非常低的水平存在于正常细胞，随恶性转化而上调。

这些肿瘤抗原通过遗传序列改变或者自体细胞突变来表达。一种用于针对有非正常抗原表达的肿瘤细胞的常用治疗是免疫治疗，包括用肿瘤抗原免疫或者施用一种增强免疫功能的药物。众所周知自然杀伤(NK)细胞表现比正常细胞更高的肿瘤细胞毁坏活性，并且免疫治疗也可增强NK细胞的活性。NK细胞是细胞毒性淋巴细胞，也存在于正常个体中，已知对于肿瘤细胞、病毒感染细胞等表现MHC(主要组织相容性复合物)抗原-非限制性细胞毒性。但是，最近显示存在甚至对NK细胞有抵抗力肿瘤细胞。

美国国家癌症研究所(NCI)的S.Rosenberg博士发现外周血淋巴细胞与白介素2(IL-2)温育可以诱导杀伤细胞对宽范围的靶癌细胞表现细胞毒性，包括自体固有的癌细胞，而且这些杀伤细胞可以杀死甚至对NK细胞有抵抗力的癌细胞(见日本专利公开文本116518/87)。这些杀伤细胞被命名为淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)。LAK细胞不是由细胞学上同质的群体组成的，已知包括NK细胞和杀伤性T细胞。

最近，尝试了过继免疫，其中在细胞培养系统中来源于患者的外周淋巴细胞被IL-2激活，然后具有抗肿瘤活性的LAK细胞被回输入该患者体内(LAK治疗)。有报道，通过包括反复施用这样的LAK细胞的过继免疫治疗的使用，可以实现晚期癌症的缓解或者肿瘤生长抑制。但是，IL-2-介导的LAK治疗包括很多问题，例如与大量白细胞的分离相关联的物理应激、施行分离的白细胞大量培养的高成本、或者昂贵的IL-2的使用等，而且此外，IL-2的施用通常引起严重的副作用。

特别地，已知使用IL-2的LAK过继免疫治疗引起副作用，如全身疲惫、寒战、发热、低清蛋白血症、贫血、嗜酸性粒细胞增多和那些比单独施用IL-2引起的副作用更严重的副作用。更显著地，一些重要的副作用与LAK细胞对正常细胞的细胞毒性强烈地关联。也有报道LAK细胞对造血干细胞的这种细胞毒性引起贫血和血小板减少症，以及在体外引起对淋巴细胞、巨噬细胞和血管内皮细胞的损伤。此外，通过口服途径施用IL-2吸收差，所以因此目前必须主要通过注射和直接施用。

所以，需要开发能够克服这些不利之处的治疗剂，特别是不使用IL-2或者含有这类药剂的药物而能增强淋巴细胞LAK活性的药剂。

抗癌剂通常靶向于癌细胞的非正常生长，可以分类为靶向核酸生物合成抑制剂如烷基化剂，核酸生物合成底物类似物、抗生素、类固醇激素类等，和有丝分裂抑制剂如植物生物碱类。

但是，这样的抗癌剂对正常增殖细胞如骨髓、胃肠道上皮和毛囊也引起显著的副作用。也就是说，通常引起恶心、呕吐、口腔和小肠溃疡、腹泻、脱毛、骨髓抑制导致主要血液成分的产生不足等等，与施用的途径无关。

已知一些细菌、食物和其它天然存在的物质有抗癌性质。由于通常良性的性质和低副作用，细菌和食物类物质通常用于抗癌剂是非常优选的。很多尝试使用细菌治疗癌症，例如在涉及由粘质沙雷氏菌(Serratiamarcesens)和酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)培养物过滤液构成的Coley氏毒素(1964)；用卡介苗(BCG)治疗白血病(Mathe，G.，癌症研究进展，(Ady.Cancer Res.)，14，1971)；豚鼠肿瘤消退(Zbar B.等人，国家癌症研究所杂志，(J.Natl.Cancer Inst.)，48，831，1971)；和酵母细胞壁多糖的施用对移植肿瘤细胞如肉瘤180的有效性报道显示的。

特别地，大量研究归纳为从酵母来源的(如酵母葡聚糖和酵母甘露聚糖)、从其它细菌来源、从地衣和从担子菌纲来源的多糖的抗癌效果。其中，作为抗癌免疫增强剂商业产品目前在市场上存在，包括从培养的kawaratake菌丝体来源的Krestin(多色革盖菌(Coriolus versicolor)，担子菌(Basidiomycetes)：多孔菌科(Polyporaceae))(宿主免疫功能促进剂，Kureha Chemical Industry and Sankyo Co.Ltd.)，来源于香菇的被称为蘑菇多糖(香菇)的多糖和来源于suehirotake(SchizophyllumCommune)的多糖。

香菇(Shiitake)是一种常见的可食用的蘑菇，在日本和中国都可以找到，在日本已经栽培了约300年。最近阐明了它的药理学作用和有效成分以及报道有多种作用，如对在小鼠和大鼠大肠和肝中移植肿瘤细胞生长抑制的作用(Sugano N.等人，癌症通讯，(Cancer Letter)27：1，1985；Suzuki Y.等人，日本结肠直肠学学会杂志，(Journal of theJapan Society of Coloproctology)43：178，1990)；促有丝分裂作用(TabataT.等人，免疫药理学，(Immonopharmacology)24：57，1992；Hibino等人，免疫药理学，28：77，1994)等。

发明公开

本发明人研究了香菇的免疫增强活性、抗肿瘤活性和/或者抗癌活性，以提供一种有较少副作用的廉价的免疫治疗剂。

本发明是在发现菌丝体提取物有比子实体高很多的免疫增强活性、抗肿瘤活性和/或者抗癌活性、而且上述提取物也有LAK活性增强活性的基础上完成的，菌丝体是香菇可食用子实体的前体。

按照本发明的第一个方面，因此，提供了一种含有香菇菌丝体提取物的LAK活性增强剂。

“LAK活性”是指细胞毒性T淋巴细胞的细胞毒性活性，细胞毒性T淋巴细胞攻击不能被有NK活性之淋巴细胞识别的肿瘤，但对自体正常细胞有少许影响。“LAK活性增强”是指增强这种LAK活性的作用，也就是直接地或间接地从淋巴细胞诱导LAK细胞产生，或者进一步增强已有LAK细胞活性。

LAK活性增强增加LAK细胞的抗肿瘤活性，导致细胞介导免疫系统功能的改善。所以，本发明可不仅用于改善抗肿瘤活性治疗，也用于改善免疫功能的治疗。

从外周血来源的淋巴细胞可以用本发明的LAK活性增强剂处理以增强LAK活性。优选地在每10⁶个淋巴细胞香菇菌丝体提取物浓度为1μg或者更多的浓度，或者每1ml外周血1μg或者更多的浓度下所述提取物可直接作用于从外周血来源的淋巴细胞。本发明的LAK活性增强剂可替代IL-2用于免疫治疗。

本发明的LAK活性增强剂可由香菇菌丝体提取物本身组成或者可进一步含有香菇菌丝体提取物以外的物质。这种物质的范围不受限制，只要香菇菌丝体提取物的LAK活性-增强活性不受它们的使用的影响。

本发明的LAK活性增强剂也可与其他有免疫增强活性和抗肿瘤活性和/或者抗癌活性的物质联合。

按照本发明的第二个方面，提供了一种含有香菇菌丝体提取物的LAK活性增强剂之LAK活性增强配方。

本发明的LAK活性增强配方可以是香菇菌丝体提取物本身，或者是药理学或者兽医学配方，其中包括含有香菇菌丝体提取物的LAK活性增强剂和药学可以接受的载体。

本发明的LAK活性增强配方可以适于口服施用或者注射或者透皮施用。

本发明的LAK活性增强配方可以是食品、饮料或者饲料的形式。

本发明的LAK活性增强配方可以用于治疗肿瘤和/或者癌症。本发明的LAK活性增强配方不是特异地攻击特定肿瘤细胞，因为它们诱导LAK细胞。所以，本发明的LAK活性增强配方可以用于治疗多种肿瘤，上皮的或者非上皮的。

本发明的LAK活性增强配方也可以用于治疗肿瘤或者癌症以外的其它疾病，例如免疫功能的改善。特别地，本发明的LAK活性增强配方也可用于改善受免疫损害治疗或者事故(如辐射)、自身免疫疾病、感染性疾病等损害的免疫功能。

本发明的LAK活性增强配方也可用作多种疾病的预防剂。例如，它们可以为预防肿瘤和/或癌症或者预防细菌或者病毒感染而施用。

本发明的LAK活性增强配方可以与其它药物(如抗肿瘤和/或者抗癌剂)如免疫增强剂、抗生素、镇痛药、抗炎剂等联合使用。

按照本发明的第三个方面，提供了一种包括施用上述LAK活性增强配方的用于治疗肿瘤和/或者癌症的方法。

本发明的治疗肿瘤和/或者癌症的方法可与其它治疗如化疗、手术治疗、放射、热疗等联合使用。

按照本发明的第四个方面，提供了用于获得治疗肿瘤和/或者癌症的药物的LAK活性增强剂的用途。

为了获得用于治疗肿瘤和/或者癌症的药物，本发明的LAK活性增强剂可与其它有免疫增强活性和抗肿瘤活性和/或者抗癌活性的物质联合使用。

附图简述

图1是条形图，显示与IL-2比较香菇菌丝体提取物直接加入到外周血中的LAK活性增强作用。

图2是条形图，显示香菇菌丝体提取物直接加入到外周血中的浓度的LAK活性变化。

图3是条形图，显示直接将Krestin加入到外周血中得到的LAK活性。

图4是条形图，显示香菇菌丝体提取物口服施用前和后外周血中的LAK活性。

本发明最优选的实施方案

在本发明的LAK活性增强剂中含有的香菇菌丝体提取物是指通过压榨和分解培养在固体培养基上生长的香菇菌丝体得到的提取物，或者在水和酶存在下通过压榨和分解含有香菇菌丝体的固体培养基本身得到。

在这里使用的香菇菌丝体提取物优选地通过但不是特别地限于下面的方法得到。

香菇菌丝接种于基于蔗渣(甘蔗残余物)和脱脂稻糠的固体培养基以生长菌丝体，然后含有生长菌丝体的固体培养基被去木质化以使约30％(重量)或更少通过12目筛。

将水和从纤维素酶、蛋白酶或者葡萄糖苷酶中选择的一种或者多种酶加入到去木质的固体培养基，维持上述的固体培养基在温度约30-55℃，上述的固体培养基在上述的酶存在下被压榨和研磨，结果是至少蔗渣纤维的70％(重量)能够通过12目筛。然后，温度升高到80-100℃以灭活酶和灭菌，得到的悬液被过滤以得到香菇菌丝体提取物。

上面制备的香菇菌丝体提取物可以直接用作本发明的LAK活性增强剂或者LAK活性增强配方，但是方便地将之浓缩和冻干成粉末以用多种形态贮存和使用。冻干的产物是有吸湿性质褐色的粉末和有独特的味道和气味。

含有制备的香菇菌丝体提取物(或者香菇菌丝体提取物自身)的LAK活性增强剂可替代IL-2用于LAK治疗以增强针对受试者对肿瘤的免疫活性。

LAK治疗通常包括与IL-2体外培养从受试者来源的淋巴细胞的步骤，以从淋巴细胞诱导LAK细胞，然后将LAK细胞重新输入受试者体内。在将LAK细胞重新输入试验材料体内的步骤，IL-2可以(直接)同时施用。

本发明的含有香菇菌丝体提取物的LAK活性增强剂可以在体外与受试者(人、动物等)来源的淋巴细胞培养，以诱导LAK细胞，或者在将培养的淋巴细胞重新输入受试者内的步骤时可以(直接)同时施用于受试者。它们可以与其他抗肿瘤和/或者抗癌剂联合使用。

本发明的含有的香菇菌丝体提取物的LAK活性增强剂可以直接加入到从受试者采集的外周血中，但是优选地在加入前用丙酮灭菌。

本发明的含有香菇菌丝体提取物的LAK活性增强剂可以优选地在用香菇菌丝体提取物表示的浓度1μg-1mg/10⁶淋巴细胞下，直接加入到从试验材料采集的外周血中，更优选地10μg-100μg/10⁶淋巴细胞，最优选地10μg-50μg/10⁶淋巴细胞。每ml外周血的剂量(部分取决于外周血淋巴细胞的水平)约代表1μg-2.5mg，优选地10μg-250μg，更优选地10μg-125μg。

包括本发明的含有香菇菌丝体提取物的LAK活性增强剂之LAK活性增强配方可以直接施用于受试者以增强受试者的抗肿瘤免疫活性，因此提供与使用IL-2的LAK治疗产生的作用相当的作用。

通过直接施用本发明的LAK活性增强剂诱导受试者(如人或者动物)的LAK细胞，可以减少与大量白细胞分离相关联的物理应激和由于制备大量培养物的高成本。另外，本发明的LAK活性增强剂的使用也可减少在从受试者分离血液和重新输入时的污染的危险性。

考虑到加于受试者的最小应激等，本发明的LAK活性增强配方最优选地(但不限于)是口服途径施用。它们也可以通过静脉注射、皮内注射、皮下注射或者肌肉内注射、或者经皮、鼻、肠或者其它途径施用。

本发明LAK活性增强配方的合适剂型包括，但不限于，片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、溶液剂、糖浆剂、注射剂、乳油剂、软膏剂、贴剂、喷雾剂、栓剂等。

可与本发明的LAK活性增强配方任选地混合的药学上可接受的载体包括，但不限于，赋形剂如乳糖、葡萄糖、淀粉、结晶纤维素；粘合剂如淀粉、明胶、甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮；崩解剂如淀粉、羧基甲基纤维素钙、羧基甲基淀粉；润滑剂如滑石、硬酯酸盐；包衣剂如蔗糖、滑石、明胶；以及多种增白剂、调味剂、着色剂、矫味剂、助溶剂、稳定剂、延缓剂、助吸收剂或者本领域公知的类似物，这取决于目的。为用于注射，通常在本领域中使用的多种稀释剂如水或者乙醇可以使用。

本发明的LAK活性增强配方施用途径、剂量、频率等取决于受试者的年龄、体重、状况和其它因素来决定。

因为已经作为食物的成分长期摄入，在本发明的LAK活性增强配方中含有的香菇菌丝体提取物是非常安全的。所以，剂量不是严格限制的。例如，香菇菌丝体提取物正常地优选以剂量100mg-10000mg每天2-3次，更优选地500mg-5000mg每天3次，最优选地1000mg-1500mg每天3次施用。可以与其他药物如抗肿瘤和/或者抗癌剂如免疫增强剂、抗生素、镇痛药、抗炎药等联合施用。

本发明的LAK活性增强配方也可以食物形式提供。优选的食物形式包括粉末、颗粒、糊剂、胶冻等。颗粒期望地加入糖如乳糖以增加甜味。本发明的LAK活性增强配方也可以饮料形式提供。这些食品和饮料可在香菇菌丝体提取物之外加入维生素、矿物质如钙、醇类、除臭剂如多酚。这些食物或者饮料可以包括特殊健康食物、医学食物等的种类。

本发明的LAK活性增强配方也可以饲料或者饲料添加剂形式提供。本发明的LAK活性增强配方可用作家畜饲料或者饲料添加剂以治疗和/或者预防家畜发生的肿瘤，或者治疗和/或预防家畜的细菌或者病毒感染。

结果，由于目前治疗剂(如抗生素)的使用量可以减少，从而减少饲养成本。另一个优势是由于施用抗生素动物运输的时间可以缩短。

本发明的LAK活性增强剂的LAK活性增强可以通过，但不限于，按照Takagi等人(临床免疫学，(Clinical Immunology)，19：245-249，1987)如下的方法加以证实。

LAK活性检测

LAK活性可通过⁵¹Cr释放试验、[³H]尿苷试验或者类似试验测定。考虑到便利和客观性，优选地使用⁵¹Cr释放试验。

⁵¹Cr释放试验是体外测定用LAK活性增强剂处理的淋巴细胞诱导的LAK细胞针对靶细胞的细胞毒性的一种方法，包括以下步骤：

(i)将⁵¹Cr标记的铬酸钠加入到靶细胞中以标记靶细胞，

(ii)将标记的靶细胞与诱导的LAK细胞反应，和

(iii)测量从被LAK细胞提升的(bursted)靶细胞释放到细胞培养物上清中⁵¹Cr的量。

在⁵¹Cr释放试验中用作靶细胞的次代培养细胞优选地是Daudi细胞或者Raii细胞。在培养瓶或者类似物中培养的靶细胞通过离心收集，通过加入100-150μCi⁵¹Cr标记的铬酸钠后在5％ CO₂培养箱37℃温育1-2小时用⁵¹Cr标记。靶细胞的培养基是那些适合于所用细胞生长的液体培养基，包括，例如，合适地加入血清、抗生素等的RPMI1640或者F-12。

培养的靶细胞用PBS洗3次，以1×10⁶细胞/毫升重悬于细胞培养基中用于试验。

为诱导LAK细胞，淋巴细胞被从受试者外周血中分离。在受试者外周血中加入肝素，通过在Ficoll-Conray溶液(s.g.＝1.077)密度梯度离心分离在分界面上的单核细胞。分离的单核细胞用PBS(pH7.4，无钙和镁)洗2-3次，然后以1×10⁶细胞/毫升重悬于培养基中(优选地，RPMI 1640培养基(Gibco)含有FBS(灭活胎牛血清)和/或者抗生素，如果需要)。这一悬液转移到用自体血清(血浆)37℃ 15分钟预包被的陪替氏培养皿中37℃温育1小时。未粘附的细胞回收作为淋巴细胞成分。

如上面制备的淋巴细胞以预定浓度，优选地1×10⁵-10⁶细胞/毫升重悬于培养基中。

香菇菌丝体提取物被终浓度约1-100μg/ml加入到用于制备淋巴细胞悬液溶液的培养基中。

预定量的淋巴细胞悬液溶液和香菇菌丝体提取物被加入到培养板的孔中。平行地，预定量的淋巴细胞悬液溶液和不含香菇菌丝体提取物的培养基被加入到孔中作为无提取物对照。然后，培养板稳定地在CO₂培养箱室温下温育3天。

当使用96孔U型底微孔检测板时，例如，淋巴细胞悬浮液100μl优选地以1×10⁴到1×10⁵细胞/孔的浓度加入到每孔中。每孔中的细胞数可由本领域技术人员按照孔容积、LAK细胞活性、靶细胞对LAK细胞的敏感性等适当地决定。

这样，从受试者来源的淋巴细胞在本发明香菇菌丝体提取物的多种浓度(包括0)存在下培养以诱导效应细胞。如这里使用的，术语效应细胞是指经历上述的培养处理3天的细胞，而且包括与LAK活性增强剂共培养的淋巴细胞(用LAK活性增强剂处理的淋巴细胞)和无LAK活性增强剂的单独培养基中培养的淋巴细胞(在无提取物的条件下处理的淋巴细胞)。

培养的淋巴细胞(效应细胞)从孔中回收且重悬于新鲜的含有10％FBS的RPMI 1640培养基中(1×10⁶细胞/毫升)。

在测定细胞毒性的试验中，含有上述靶细胞的每孔中以1×10⁵-1×10⁶细胞/毫升浓度进一步加入预定量的含有上述多种效应细胞的悬浮液(用LAK活性增强剂处理的淋巴细胞或者在无提取物的条件下处理的那些)用于实验解离，加入与效应物悬浮液等量的1N HCl用于最大解离，或者加入与效应物悬浮液等量的单独培养基用于自然解离。然后，用板离心机或者类似物将细胞收集在培养板孔底，然后在5％ CO₂培养箱37℃下温育预定的时间(例如，2-5小时)。

温育结束后，每孔中释放到培养物上清液中的⁵¹Cr放射活性使用闪烁计数仪或者类似物测量。

术语“最大解离”是指当所有靶细胞被破坏时释放的⁵¹Cr的总量。最大解离可通过，例如，在含1N HCl的培养基无效应细胞在预定条件下温育裂解靶细胞，且测量培养物上清液中释放的⁵¹Cr的量。

术语“实验解离”是指当效应细胞加入到靶细胞中效应细胞对靶细胞的细胞毒性和靶细胞自然死亡而释放的⁵¹Cr的量。实验解离可通过，例如，在与最大解离相同的条件下温育靶细胞和测量培养物上清液中释放的⁵¹Cr的量，除了用效应细胞而不是1N HCl加入到培养基中。

术语“自然解离”是指靶细胞自然死亡释放的⁵¹Cr的量。自然解离可通过，例如，除了既不含效应细胞也不含1N HCl外，在与最大解离相同的条件下温育靶细胞和测量培养物上清中释放的⁵¹Cr的量。

LAK细胞的激活水平通过下面方程式(1)计算出的LAK活性为基础来评价。

方程式(1)

本申请以日本专利353927/98和353928/98公开为基础要求优先权，在这里引用全部作为参考。

下面的实施例进一步阐述本发明但不能被认为是对本发明范围的限制。本领域的技术人员知晓可以不背离本发明精神的多种改变和修饰。

实施例

实施例1：香菇菌丝体提取物的制备

由90份(重量)蔗渣和10份(重量)稻糠组成的固体培养基用适当量的纯水湿透，然后用香菇菌种接种，使其在培养箱中在控制的温度和湿度下生长菌丝体。在菌丝体扩展至整个固体培养基后，蔗渣基质被去木质化以使24％(重量)或者更少能通过12目筛。1.0kg去木质化培养基中加入3.5L纯水和2.0g纯化的纤维素酶，保持固体培养基在40℃以制备含培养基的混合物。

然后，通过可调速齿轮泵使含培养基的混合物循环，在此过程中固体培养基在齿轮上被压榨和研磨约200分钟，这样约80％(重量)的蔗渣纤维能够通过12目筛。含培养基的混合物被压榨和研磨，同时上述混合物的温度逐渐增加。然后含培养基的混合物进一步加热到90℃以保证酶灭活和灭菌，使在90℃保持30分钟。得到的含培养基的混合物用60目滤布滤过以得到香菇菌丝体溶液提取物，将其浓缩和转变为冻干粉末。

如上述制备的香菇菌丝体提取物含有用酚-硫酸方法测定的25.3％(w/w)碳水化合物、用Lowry方法测定的19.7％的蛋白质(w/w)和用Folin-Denis方法用没食子酸作为标准测定的2.6％的多酚(w/w)。香菇菌丝体提取物进一步含有8％粗脂肪、22％粗灰和约20％可溶的无氮非碳水化合物。

香菇菌丝体提取物含糖组成(％)如下：木糖(Xyl)15.2、阿拉伯糖(Ara)8.2、甘露糖(Man)8.4、古洛糖(Gul)39.4、半乳糖(Gal)5.4、N-乙酰葡萄糖胺(GlcN)12.0、葡糖醛酸(GluUA)11.3。

实施例2：香菇菌丝体提取物与IL-2的LAK活性比较

在实施例1中得到的香菇菌丝体提取物直接施用于从受试者采集的外周血以与IL-2比较LAK活性增强作用。

受试者A外周血中加入肝素，通过在Ficoll-Conray溶液(s.g.＝1.077)密度梯度离心分离在分界面上的单核细胞。分离的单核细胞用PBS(pH7.4，无钙和镁)洗2次，然后以1×10⁶细胞/毫升浓度重悬于含有10％FBS(灭活胎牛血清)RPMI 1640培养基(Gibco)中。细胞悬液转移到用自体血清(血浆)37℃5分钟预包被的陪替氏培养皿中37℃温育1小时，然后未粘附的细胞回收作为淋巴细胞成分。

如上述制备的淋巴细胞以1×10⁶细胞/毫升重悬于含有10％FBS(灭活血清)RPMI 1640培养基(Gibco)中。

含有LAK增强剂的溶液通过在含有10％ FBS(灭活血清)RPMI1640培养基(Gibco)中加入终浓度为25U/ml的IL-2来制备，或者加入实施例1中得到的终浓度为1、10、100或者1000μg/ml香菇菌丝体提取物。

在96孔U型微量测定板每孔中加入100μl淋巴细胞悬液和多种浓度的100μl IL-2，或者含有香菇菌丝体提取物的LAK增强剂的溶液(总体积为200μl)。作为无提取物的对照，加入100μl淋巴细胞悬液和100μl无提取物的培养基(含有10％ FBS(灭活血清)RPMI 1640培养基(Gibco))。然后，培养板稳定地在CO₂培养箱中室温温育3天

培养的淋巴细胞(效应细胞)从孔中回收和以1×10⁶细胞/毫升浓度重悬于新鲜的含有10％ FBS的RPMI 1640培养基中。

在含有10％ FBS的RPMI 1640培养基中次代培养的靶细胞(来自Dainippon Pharmaceutical的Daudi细胞)通过离心回收，与⁵¹Cr标记的铬酸钠(New England Nuclear)100-150μCi/10⁶细胞在5％ CO₂培养箱37℃温育1小时。用⁵¹Cr标记的培养细胞用PBS洗3次，然后以1×10⁶细胞/毫升浓度重悬于含有10％ FBS的RPMI 1640培养基中。

标记的靶细胞的50μl等份(5×10⁴细胞/孔)加入到微量测定板每孔中，用于最大解离、自然解离和实验解离。另外，每孔加入100μl 1NHCl用于最大解离，加入100l含有10％ FBS的RPMI 1640培养基用于自然解离，加入100μl本发明的浓度为1、10、100和1000μg/ml的香菇菌丝体提取物或者25U/ml的rIL-2或者单独培养基处理的效应细胞用于实验解离。在这里，用于最大解离、自然解离和实验解离的每孔不是位于板的外周。

然后，微量测定板在板离心机上用800转/分离心5分钟以将细胞收集在孔底，然后在5％ CO₂培养箱37℃温育3.5小时。

用SOKEN-PET ∑-96从温育板上收集每孔中的培养物上清液，在γ-闪烁计数仪上测定放射性。

LAK活性用上述的方程式(1)计算。

结果显示于表1和图1。

                       表1

试验编号     诱导物                      LAK活性

1            无                          11％

2            IL-2(终浓度：25U/ml         55％

3            香菇菌丝体提取物            14％

             (终浓度：1μg/ml)

4            香菇菌丝体提取物            20％

             (终浓度：10μg/ml)

5            香菇菌丝体提取物            14％

             (终浓度：100μg/ml)

为检测香菇菌丝体提取物对淋巴细胞的毒性，用在实施例1中制备的香菇菌丝体提取物以终浓度1mg/ml用如上面描述的相同的程序处理淋巴细胞，且在显微镜下观察，显示几乎100％的淋巴细胞存活(数据未显示)。

实施例3：香菇菌丝体提取物用于LAK活性的最佳浓度

检测了直接加入到从受试者采集的外周血中的香菇菌丝体提取物之最佳浓度。LAK活性用与实施例2中描述的相同方式计算，除了将在实施例1中制备的香菇菌丝体提取物在终浓度1、5、10和100μg/ml下加入到从受试者B和C采集的外周血中。

结果显示于表2和图2。

如表2和图2显示的，当以终浓度10μg/ml或者50μg/ml加入时，(即每10⁶淋巴细胞10μg或者50μg)本发明的香菇菌丝体提取物显示最高的LAK活性。外周血的剂量也取决于受试者外周血的淋巴细胞比例，但是约相当于每1ml外周血香菇菌丝体提取物10-25μg或者50-125μg。

                         表2

试验编号     诱导物                            LAK活性

                                               受试者

                                           B           C

1            无                            13％        27％

2            香菇菌丝体提取物              18％        28％

             (终浓度：1μg/ml)

3            香菇菌丝体提取物              19％        29％

             (终浓度：5μg/ml)

4            香菇菌丝体提取物              21％        34％

             (终浓度：10μg/ml)

5            香菇菌丝体提取物              19％        36％

             (终浓度：50μg/ml)

6            香菇菌丝体提取物              15％        30％

             (终浓度：100μg/ml)

比较性实施例1：Krestin的LAK活性

免疫增强剂Krestin的LAK活性增强作用被检测以与本发明香菇菌丝体提取物作用比较。用如实施例2描述的相同方式评价免疫增强剂Krestin的LAK活性增强作用，除了Krestin(来源于Kureha ChemicalIndustry)以1mg/ml终浓度加入到从受试者D采集的外周血中。

当Krestin用于诱导LAK细胞时1mg/ml终浓度被认为是最有效的浓度。

结果显示于表3和图3。

如表3和图3显示的，即使在1mg/ml的最佳浓度下Krestin的LAK增强活性也比不含LAK活性增强剂的对照更低。

                         表3

试验编号         诱导物                         LAK活性

1                无                             14％

2                Krestin(终浓度：1mg/ml)        13％

实施例4：含有香菇菌丝体提取物的配方施用前和施用后LAK活性的 测定

以与实施例1描述的相同的方式制备的含有香菇菌丝体提取物之LAK活性增强配方施用于受试者B、C、E和F以评价LAK活性增强作用。

这种LAK活性增强配方每3g配方中含有0.6g香菇菌丝体提取物和2.4g乳糖，用6g(1.2g香菇菌丝体提取物)每天3次或者每天共3.6g香菇菌丝体提取物的剂量施用1周。施用前和最后施用2小时后从受试者采集外周血，用实施例2描述的相同方式测定LAK活性。

结果显示于表4和图4。

如表4和图4显示的，本发明的香菇菌丝体提取物显著地增加了全部受试者B、C、E和F的LAK活性。

                             表4

                            LAK活性

受试者           B           C           E           F

LEM施用前        13％        27％        14％        18％

LEM施用后        40％        43％        18％        28％

为检测香菇菌丝体提取物施用引起的副作用，对受试者B、C和E进行生化血液检测。结果显示于表5。香菇菌丝体提取物施用的全部时间，试验材料B、C、E和F未显示任何副作用，如全身疲劳、寒战、发热或消化系统症状。

如表5显示的，通过本发明香菇菌丝体提取物施用未观察到任何副作用。

                                                    表5

	受试者B		受试者C		受试者E
							施用1周
	前	后	前	后	前	后
							WBC(×103/μl)RBC(×106/μl)Hb(g/dl)Ht(％)MCV(fl)MCH(pg)MCHC(g/dl)PLT(×104/μl)RDW-SD(f1)RDW-CV(％)PDW(fl)MPV(fl)P-LCR(％)StabSegLymMonoEoBaso	5.454.5614.242.292.531.133.619.143.712.814.011.134.10.554.037.54.52.51.0	5.944.6114.242.892.830.833.218.544.613.013.410.932.50.548.540.57.53.00.0	5.854.9914.443.687.428.933.023.943.513.411.610.024.91.056.038.03.01.50.5	5.084.8513.842.186.828.532.819.343.613.612.610.227.60.043.543.59.51.00.5	8.014.8915.544.891.631.734.629.243.713.013.310.630.10.546.528.511.512.00.5	7.474.6514.842.992.331.834.529.744.813.313.210.428.80.038.535.08.515.50.5
TP(g/dl)ALB(g/dl)A/GTTT(SHU)ZTT(Kunk)U-N(mg/dl)U-A(mg/dl)肌酸酐(mg/dl)总BIL(mg/dl)直接BIL(mg/dl)间接BIL(mg/dl)GLU(mg/dl)AST(GOT)(IU/l)ALT(GPT)(IU/l)LD(LDH)(IU/l)CK(CPK)(IU/l)ALP(IU/l)γ-GT(IU/l)LAP(IU/l)CHE(IU/l)AMY(IU/l)T-CHO(mg/dl)HDLCHO(mg/dl)T-G(mg/dl)Na(mEq/l)K(mEq/l)Cl(mEq/l)Ca(mEq/l)I-P(mg/dl)HLI	6.63.91.443.98.610.45.60.670.60.10.512415291421211311245235878208501351413.710 64.43.3000	6.94.11.465.08.410.35.90.710.70.10.610413301391311361440259387232502101423.91074.43.1001	7.74.41.338.012.610.25.40.840.50.00.594182017122715623802779107206442701404.11054.63.0001	7.54.31.348.112.411.25.20.820.60.00.611116201521771482373274993200403031413.81074.42.7011	8.04.81.505.36.311.86.10.670.50.10.41153345380317174225134319159255474511394.01034.93.5111	7.74.71.573.04.911.65.90.720.50.10.41143357343224162240120329954243473591414.21044.73.2001
							RA实验CRP(mg/dl)ANAANA模式CH50(CH50/ml)	(-)0.03＜40(-)33.0	(-)0.06＜40(-)33.0	(-)0.02＜40(-)45.0	(-)0.01＜40(-)42.0	(-)0.07＜40(-)53.0	(-)0.12＜40(-)52.0

工业应用性

当它们直接施用于外周血时，含有本发明的香菇菌丝体提取物的LAK增强剂显示与IL-2相似的作用，对淋巴细胞无直接毒性。它们与IL-2相比有非常低的成本。所以，它们可以替代昂贵的也有引起强烈副作用缺点的IL-2。

含有本发明的香菇菌丝体提取物的配方可以显著地增加LAK活性，即使直接施用也无副作用。所以，含有本发明的香菇菌丝体提取物的配方可用作一种通过直接施用(如口服施用)有良性副作用而不使用LAK治疗即可增强LAK活性的免疫增强剂。

Claims (9)

1.香菇菌丝体提取物用于制备增强淋巴因子激活的杀伤细胞活性的组合物的用途。

2.权利要求1的用途，其中制备所述组合物以作用于外周血来源的淋巴细胞。

3.权利要求2的用途，其中所述组合物含有以每10⁶淋巴细胞1μg或者更多的浓度之香菇菌丝体提取物。

4.权利要求1的用途，其中所述组合物用于药学或者兽医学用途，其含有药学可接受的载体。

5.权利要求1或4的用途，其中所述组合物用于口服施用。

6.权利要求1的用途，其中所述组合物呈食物、饮料或者饲料的形式。

7.权利要求1或4的用途，其中所述组合物用于注射或者经皮施用。

8.权利要求1或4的用途，其中所述组合物用于治疗肿瘤和/或癌症。

9.香菇菌丝体提取物用于制备治疗肿瘤和/或癌症的药物的用途。

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