JP2000159685A - シイタケ菌糸体抽出物由来のｌａｋ活性増強物質 - Google Patents
シイタケ菌糸体抽出物由来のｌａｋ活性増強物質Info
- Publication number
- JP2000159685A JP2000159685A JP10353927A JP35392798A JP2000159685A JP 2000159685 A JP2000159685 A JP 2000159685A JP 10353927 A JP10353927 A JP 10353927A JP 35392798 A JP35392798 A JP 35392798A JP 2000159685 A JP2000159685 A JP 2000159685A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- extract
- lak
- cells
- mycelia
- lentinus edodes
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Landscapes
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 副作用が無くて安価に入手可能な抗腫瘍剤も
しくは抗癌剤、特にＬＡＫ療法に使用可能な免疫療法剤
を提供する。 【解決手段】 シイタケ菌糸体抽出物をＩＬ−２に代え
て用いる。
しくは抗癌剤、特にＬＡＫ療法に使用可能な免疫療法剤
を提供する。 【解決手段】 シイタケ菌糸体抽出物をＩＬ−２に代え
て用いる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、腫瘍免疫学の分野
に関する。特定すれば、本発明は、抗腫瘍活性および／
または抗癌活性を有する免疫療法剤に関する。さらに特
定すれば、本発明は、ＬＡＫ細胞（Lymphokine Activat
ed Killer Cell：リンホカイン活性化キラー細胞）の誘
導に有用な免疫療法剤に関する。
に関する。特定すれば、本発明は、抗腫瘍活性および／
または抗癌活性を有する免疫療法剤に関する。さらに特
定すれば、本発明は、ＬＡＫ細胞（Lymphokine Activat
ed Killer Cell：リンホカイン活性化キラー細胞）の誘
導に有用な免疫療法剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】腫瘍免疫学における基本的概念は、腫瘍
細胞が腫瘍抗原を有するということである。即ち、腫瘍
細胞に特異な抗原（TSA：Tumor Specific Antigen）、
または正常細胞にもごく微量存在するが細胞の癌化に伴
いその発現が増強される腫瘍関連抗原（TAA：Tumor Ass
ociated Antigen）の存在がわかっている。このような
腫瘍抗原は自己の細胞の変異に伴って生じる遺伝子自体
またはその発現の変化により発現される。抗原性が異常
な腫瘍細胞の治療法としては、免疫療法がもっとも一般
的であり、腫瘍抗原で免疫したり、免疫機能を増強する
薬剤が用いられる。一般に、腫瘍細胞を破壊する活性は
正常細胞よりもＮＫ（ナチュラルキラー）細胞の方が高
く、またＮＫ細胞の活性も免疫療法により増強されるこ
とが知られている。ＮＫ細胞は正常個体中にも存在する
細胞障害性リンパ系細胞であり、腫瘍細胞、ウイルス感
染細胞等に対してＭＨＣ抗原に拘束されずに障害活性を
示すことが知られているが、ＮＫ細胞でも殺傷し得ない
腫瘍細胞の存在も明らかとなった。
細胞が腫瘍抗原を有するということである。即ち、腫瘍
細胞に特異な抗原（TSA：Tumor Specific Antigen）、
または正常細胞にもごく微量存在するが細胞の癌化に伴
いその発現が増強される腫瘍関連抗原（TAA：Tumor Ass
ociated Antigen）の存在がわかっている。このような
腫瘍抗原は自己の細胞の変異に伴って生じる遺伝子自体
またはその発現の変化により発現される。抗原性が異常
な腫瘍細胞の治療法としては、免疫療法がもっとも一般
的であり、腫瘍抗原で免疫したり、免疫機能を増強する
薬剤が用いられる。一般に、腫瘍細胞を破壊する活性は
正常細胞よりもＮＫ（ナチュラルキラー）細胞の方が高
く、またＮＫ細胞の活性も免疫療法により増強されるこ
とが知られている。ＮＫ細胞は正常個体中にも存在する
細胞障害性リンパ系細胞であり、腫瘍細胞、ウイルス感
染細胞等に対してＭＨＣ抗原に拘束されずに障害活性を
示すことが知られているが、ＮＫ細胞でも殺傷し得ない
腫瘍細胞の存在も明らかとなった。
【０００３】米国ＮＣＩのＳ．Rosenbergは、リンパ球
をインターロイキン２（ＩＬ−２）と共に培養すると、
広い範囲の腫瘍細胞に細胞障害性を示す、ＮＫ細胞でも
殺傷不可能な腫瘍細胞を殺傷するキラー細胞が誘導され
ることを発見した（特開昭62-116518号参照）。このキ
ラー細胞はＬＡＫ細胞（Lymphokine Activated KillerC
ell：リンホカイン活性化キラー細胞）と命名された。
ＬＡＫ細胞は、細胞学上は均一な集団ではなく、ＮＫ細
胞系やキラーＴ細胞系の細胞集団であることが知られて
いる。近年は、ＬＡＫ細胞を用いた養子免疫が試みられ
ており（ＬＡＫ療法）、ＬＡＫ細胞の繰り返し投与によ
り末期癌の縮小あるいは増殖抑制例が報告されている。
しかしながら、ＬＡＫ療法には多量の白血球分離に対す
る肉体的負担や高濃度のＩＬ−２投与による重篤な副作
用があり、大量培養に関する経済的負担も大きい。具体
的には、ＩＬ−２を用いたＬＡＫ養子免疫療法はＩＬ−
２を単独で用いた場合よりも副作用が強く、全身倦怠、
悪寒、発熱、低アルブミン、貧血、好酸球増加などの症
状は必発である。さらに注目すべきは、重大ないくつか
の副作用の発現にＬＡＫ細胞の正常細胞に対する傷害活
性が関与している可能性が高いことで、造血幹細胞傷害
による貧血や血小板現象のほか、リンパ球、マクロファ
ージや血管内皮細胞に対するインビトロ傷害も報告され
ている。
をインターロイキン２（ＩＬ−２）と共に培養すると、
広い範囲の腫瘍細胞に細胞障害性を示す、ＮＫ細胞でも
殺傷不可能な腫瘍細胞を殺傷するキラー細胞が誘導され
ることを発見した（特開昭62-116518号参照）。このキ
ラー細胞はＬＡＫ細胞（Lymphokine Activated KillerC
ell：リンホカイン活性化キラー細胞）と命名された。
ＬＡＫ細胞は、細胞学上は均一な集団ではなく、ＮＫ細
胞系やキラーＴ細胞系の細胞集団であることが知られて
いる。近年は、ＬＡＫ細胞を用いた養子免疫が試みられ
ており（ＬＡＫ療法）、ＬＡＫ細胞の繰り返し投与によ
り末期癌の縮小あるいは増殖抑制例が報告されている。
しかしながら、ＬＡＫ療法には多量の白血球分離に対す
る肉体的負担や高濃度のＩＬ−２投与による重篤な副作
用があり、大量培養に関する経済的負担も大きい。具体
的には、ＩＬ−２を用いたＬＡＫ養子免疫療法はＩＬ−
２を単独で用いた場合よりも副作用が強く、全身倦怠、
悪寒、発熱、低アルブミン、貧血、好酸球増加などの症
状は必発である。さらに注目すべきは、重大ないくつか
の副作用の発現にＬＡＫ細胞の正常細胞に対する傷害活
性が関与している可能性が高いことで、造血幹細胞傷害
による貧血や血小板現象のほか、リンパ球、マクロファ
ージや血管内皮細胞に対するインビトロ傷害も報告され
ている。
【０００４】そこで、このような欠点を補う制癌剤の開
発が望まれている。抗癌剤は一般に癌細胞の異常な増殖
性を標的としており、阻害対象により分類すれば、核酸
合成阻害剤として、例えばアルキル化剤、核酸合成基質
アナログ、抗生物質、ステロイドホルモン等があり、有
糸分裂阻害剤として植物アルカロイド等がある。しかし
ながら、これらの抗癌剤は、同時に増殖性の正常細胞で
ある骨髄、胃腸管上皮、毛嚢に対して著しい副作用を示
す。即ち、一般的な症状として、悪心、嘔吐、口腔およ
び小腸の潰瘍、下痢、脱毛、血液の有効成分産生の低下
をきたす骨髄抑制等を引き起こす。そこで、これらの抗
癌剤に代わる物質として、古くから抗癌作用を有するこ
とがわかっている安全な細菌類あるいは食品等に含まれ
る抗癌作用物質が模索されている。例えば、細菌により
癌を制圧しようとする試みは既に1900年代から始められ
ており、セラチア菌と溶連菌の培養濾液を用いたColey'
sトキシン（1964）、ＢＣＧによる白血病治療（Mathe,
G., Adv.Cancer Res., 14, 1, 1971）およびモルモット
における癌腫瘤の退縮（Zbar, B.,et al., J. Natl. Ca
ncer Inst., 48, 831, 1971）、および酵母壁多糖体の
投与によるサルコーマ180等の移植癌に対する有効性等
が報告されている。
発が望まれている。抗癌剤は一般に癌細胞の異常な増殖
性を標的としており、阻害対象により分類すれば、核酸
合成阻害剤として、例えばアルキル化剤、核酸合成基質
アナログ、抗生物質、ステロイドホルモン等があり、有
糸分裂阻害剤として植物アルカロイド等がある。しかし
ながら、これらの抗癌剤は、同時に増殖性の正常細胞で
ある骨髄、胃腸管上皮、毛嚢に対して著しい副作用を示
す。即ち、一般的な症状として、悪心、嘔吐、口腔およ
び小腸の潰瘍、下痢、脱毛、血液の有効成分産生の低下
をきたす骨髄抑制等を引き起こす。そこで、これらの抗
癌剤に代わる物質として、古くから抗癌作用を有するこ
とがわかっている安全な細菌類あるいは食品等に含まれ
る抗癌作用物質が模索されている。例えば、細菌により
癌を制圧しようとする試みは既に1900年代から始められ
ており、セラチア菌と溶連菌の培養濾液を用いたColey'
sトキシン（1964）、ＢＣＧによる白血病治療（Mathe,
G., Adv.Cancer Res., 14, 1, 1971）およびモルモット
における癌腫瘤の退縮（Zbar, B.,et al., J. Natl. Ca
ncer Inst., 48, 831, 1971）、および酵母壁多糖体の
投与によるサルコーマ180等の移植癌に対する有効性等
が報告されている。
【０００５】特に、多糖体に関しては、酵母グルカン、
酵母マンナン、その他の菌体の多糖体、地衣類および担
子菌類の多糖体における抗癌効果の追求に多大な労力が
注がれてきた。しかしながら、これらのうちで制癌免疫
増強薬として現在市販されているのは、担子菌類のサル
ノコシカケ科のカワラタケ培養菌糸体由来のクレスチン
（呉羽化学、三共製薬：宿主の免疫機能賦活剤）および
シイタケ多糖体のレンチナン並びにスエヒロタケ多糖体
などがあるにすぎない。
酵母マンナン、その他の菌体の多糖体、地衣類および担
子菌類の多糖体における抗癌効果の追求に多大な労力が
注がれてきた。しかしながら、これらのうちで制癌免疫
増強薬として現在市販されているのは、担子菌類のサル
ノコシカケ科のカワラタケ培養菌糸体由来のクレスチン
（呉羽化学、三共製薬：宿主の免疫機能賦活剤）および
シイタケ多糖体のレンチナン並びにスエヒロタケ多糖体
などがあるにすぎない。
【０００６】とりわけ、シイタケ（Lentinus edodes）
は日本並びに中国を代表する食用キノコであって日本で
は約300年も前から人工栽培が行われてきたが、その薬
理効果並びに薬効成分が解明され始めたのはごく最近の
ことである。例えば、ラット・マウスにおける大腸およ
び肝臓等の移植腫瘍細胞の増殖抑制効果（Sugano, N,et
al., Cancer Letter, 27: 1, 1985；鈴木康将ら、日本
大腸肛門病会誌、43:178、 1990）およびマイトジェン効
果（Tabata, T. et al., Immunopharmacology, 24: 57,
1992；Hibino, et al., Immunopharmacology, 28: 77,
1994）などが報告されている。
は日本並びに中国を代表する食用キノコであって日本で
は約300年も前から人工栽培が行われてきたが、その薬
理効果並びに薬効成分が解明され始めたのはごく最近の
ことである。例えば、ラット・マウスにおける大腸およ
び肝臓等の移植腫瘍細胞の増殖抑制効果（Sugano, N,et
al., Cancer Letter, 27: 1, 1985；鈴木康将ら、日本
大腸肛門病会誌、43:178、 1990）およびマイトジェン効
果（Tabata, T. et al., Immunopharmacology, 24: 57,
1992；Hibino, et al., Immunopharmacology, 28: 77,
1994）などが報告されている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、副作用
がなくて安価に入手可能な抗腫瘍剤もしくは抗癌剤、特
にＬＡＫ療法用の免疫療法剤を提供すべく、シイタケの
持つ抗腫瘍活性および／または抗癌活性に着目した。
がなくて安価に入手可能な抗腫瘍剤もしくは抗癌剤、特
にＬＡＫ療法用の免疫療法剤を提供すべく、シイタケの
持つ抗腫瘍活性および／または抗癌活性に着目した。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、シイタケ
の食用形態である子実体の前の形態である菌糸から抽出
された成分中に、子実体をはるかに凌ぐ免疫賦活活性並
びに抗腫瘍活性および／または抗癌活性があることを見
いだして、本発明を完成するに至った。
の食用形態である子実体の前の形態である菌糸から抽出
された成分中に、子実体をはるかに凌ぐ免疫賦活活性並
びに抗腫瘍活性および／または抗癌活性があることを見
いだして、本発明を完成するに至った。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明による、ＬＡＫ療法用の免
疫療法剤用のシイタケ菌体抽出物とは、シイタケ菌を固
体培地上で培養して得られる菌糸体、好ましくは菌糸体
を含む固体培地を水および酵素の存在下で粉砕、分解し
て得られる抽出物を言う。
疫療法剤用のシイタケ菌体抽出物とは、シイタケ菌を固
体培地上で培養して得られる菌糸体、好ましくは菌糸体
を含む固体培地を水および酵素の存在下で粉砕、分解し
て得られる抽出物を言う。
【００１０】シイタケ菌糸体抽出物は、好ましくは以下
の方法により得られたものを使用するが、これに限定さ
れない。即ち、バカス（サトウキビ濃度がしぼりかす）
と脱脂米糠を基材とする固体培地上にシイタケ菌を接種
し、次に菌糸体を増殖させて得られる菌糸体を含む固体
培地を１２メッシュ通過分が３０重量％以下となるよう
に解束し、この解束された固体培地に水およびセルラー
ゼ、プロテアーゼまたはグルコシダーゼから選択される
酵素１種またはそれ以上を３０−３５℃の温度に保ちな
がら、前記固体培地に添加すると共に、前記固体培地を
前記酵素の存在下で粉砕、擂潰してバカス繊維少なくと
も７０重量％以上が１２メッシュ通過分であるようにし
て、次に９５℃までの温度に加熱することにより酵素を
失活させると共に滅菌し、得られた懸濁状液体を濾過す
ることによりシイタケ菌糸体抽出物を得る。シイタケ菌
糸体抽出物はそのまま本発明の免疫療法剤に用いてよい
が、これを濃縮、凍結乾燥して粉末として保存して、使
用時に種々の形態で使用するのが便利である。凍結乾燥
して得られる粉末は褐色粉末であり、吸湿性があり、特
異な味と匂いを有する。
の方法により得られたものを使用するが、これに限定さ
れない。即ち、バカス（サトウキビ濃度がしぼりかす）
と脱脂米糠を基材とする固体培地上にシイタケ菌を接種
し、次に菌糸体を増殖させて得られる菌糸体を含む固体
培地を１２メッシュ通過分が３０重量％以下となるよう
に解束し、この解束された固体培地に水およびセルラー
ゼ、プロテアーゼまたはグルコシダーゼから選択される
酵素１種またはそれ以上を３０−３５℃の温度に保ちな
がら、前記固体培地に添加すると共に、前記固体培地を
前記酵素の存在下で粉砕、擂潰してバカス繊維少なくと
も７０重量％以上が１２メッシュ通過分であるようにし
て、次に９５℃までの温度に加熱することにより酵素を
失活させると共に滅菌し、得られた懸濁状液体を濾過す
ることによりシイタケ菌糸体抽出物を得る。シイタケ菌
糸体抽出物はそのまま本発明の免疫療法剤に用いてよい
が、これを濃縮、凍結乾燥して粉末として保存して、使
用時に種々の形態で使用するのが便利である。凍結乾燥
して得られる粉末は褐色粉末であり、吸湿性があり、特
異な味と匂いを有する。
【００１１】このようにして得られるシイタケ菌糸体抽
出物はフェノール−硫酸法による糖質分析により糖質を
２５．３％（重量／重量）、ローリー法によるタンパク
質分析によりタンパク質を１９．７％（重量／重量）、
没食子酸を規準とするFolon-Denis法によりポリフェノ
ールを２．６％（重量／重量）含んでいた。シイタケ菌
糸体抽出物には、その他に粗脂肪８％、粗灰分２２％、
糖質以外の可溶性無窒素物を約２０％含んでいた。
出物はフェノール−硫酸法による糖質分析により糖質を
２５．３％（重量／重量）、ローリー法によるタンパク
質分析によりタンパク質を１９．７％（重量／重量）、
没食子酸を規準とするFolon-Denis法によりポリフェノ
ールを２．６％（重量／重量）含んでいた。シイタケ菌
糸体抽出物には、その他に粗脂肪８％、粗灰分２２％、
糖質以外の可溶性無窒素物を約２０％含んでいた。
【００１２】また、シイタケ菌糸体抽出物の構成糖組成
（５）は以下のとおりであった。 Ｘｙｌ：１５．２；Ａｒａ：８．２；Ｍａｎ：８．４；
Ｇｕｌ：３９．４；Ｇａｌ：５．４；ＧｌｃＮ：１２．
０ＧＬｕＵＡ：１１．３。
（５）は以下のとおりであった。 Ｘｙｌ：１５．２；Ａｒａ：８．２；Ｍａｎ：８．４；
Ｇｕｌ：３９．４；Ｇａｌ：５．４；ＧｌｃＮ：１２．
０ＧＬｕＵＡ：１１．３。
【００１３】本発明のシイタケ菌糸体抽出物は、ヒト患
者の腫瘍免疫活性増強のために、ＬＡＫ療法においてＩ
Ｌ−２の代わりに使用することができる。
者の腫瘍免疫活性増強のために、ＬＡＫ療法においてＩ
Ｌ−２の代わりに使用することができる。
【００１４】ＬＡＫ療法は、一般には、癌患者から得た
リンパ球をＩＬ−２と共に組織培養してＬＡＫ細胞を誘
導し、そして患者の体内に戻す工程からなるが、患者に
戻す工程においてＩＬ−２を併用投与する場合もある。
リンパ球をＩＬ−２と共に組織培養してＬＡＫ細胞を誘
導し、そして患者の体内に戻す工程からなるが、患者に
戻す工程においてＩＬ−２を併用投与する場合もある。
【００１５】本発明のシイタケ菌糸体抽出物は、末梢血
に対して直接添加することができるが、添加の前にアセ
トンによる無菌処理を行うことが好ましい。本発明のシ
イタケ菌糸体抽出物を直接添加する際の濃度は、好まし
くは１μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌであり、さらに好まし
くは１０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌであり、特に好
ましくは１０μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌである。
に対して直接添加することができるが、添加の前にアセ
トンによる無菌処理を行うことが好ましい。本発明のシ
イタケ菌糸体抽出物を直接添加する際の濃度は、好まし
くは１μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌであり、さらに好まし
くは１０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌであり、特に好
ましくは１０μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌである。
【００１６】本発明のシイタケ菌糸体抽出物のＬＡＫ活
性増強は、高木らの方法に従い（臨床免疫、１９：２４
５−２４９，１９８７）、次のとおりに実施することが
できるが、これに限定されない。
性増強は、高木らの方法に従い（臨床免疫、１９：２４
５−２４９，１９８７）、次のとおりに実施することが
できるが、これに限定されない。
【００１７】被験者から採血した末梢血にヘパリンを加
え、Ficoll-Conary液（s.g.＝1.077）を用いた比重遠心
分離法により界面の単核球を分離する。分離された単核
球をＰＢＳ（ｐＨ７．４、ＣａおよびＭｇを含まず）に
より２〜３回洗浄したのち、１×１０6／ｍｌになるよ
うに１０％ＦＢＳ（非働化血清）を加えたＲＰＭＩ 164
0培地（Gibco）に懸濁する。自己血清（血漿）を３７℃
１５分処理してコートしたペトリ皿に移し、３７℃１時
間培養する。非付着性細胞を回収して、リンパ球分画と
する。
え、Ficoll-Conary液（s.g.＝1.077）を用いた比重遠心
分離法により界面の単核球を分離する。分離された単核
球をＰＢＳ（ｐＨ７．４、ＣａおよびＭｇを含まず）に
より２〜３回洗浄したのち、１×１０6／ｍｌになるよ
うに１０％ＦＢＳ（非働化血清）を加えたＲＰＭＩ 164
0培地（Gibco）に懸濁する。自己血清（血漿）を３７℃
１５分処理してコートしたペトリ皿に移し、３７℃１時
間培養する。非付着性細胞を回収して、リンパ球分画と
する。
【００１８】エフェクター細胞を１ウエルあたりの最終
個数が１００μｌになるように濃度を調節して培養液に
浮遊させる。最終培養細胞濃度が１×１０6／ｍｌを越
えないようにする。該浮遊液に、シイタケ菌糸体抽出物
を最終濃度１〜１００μｇ／ｍｌになるように加える。
９６穴Ｕ底マイクロテストプレートにエフェクター細胞
と抽出物含有培養液１００μｌずつを入れ、炭酸ガス培
養器で培養するこの際、自然解離用と最大解離用のウエ
ルを用意して全体がプレートの中央にまとまるようにす
る。自然解離用のウエルには培養液のみを２００μｌ入
れる。培養は、３日間室温において静置する。対照は何
も加えない。培養細胞を再び新鮮な１０％ＦＢＳ添加Ｒ
ＰＭＩ 1640培地に懸濁する（１×１０6／ｍｌ）。
個数が１００μｌになるように濃度を調節して培養液に
浮遊させる。最終培養細胞濃度が１×１０6／ｍｌを越
えないようにする。該浮遊液に、シイタケ菌糸体抽出物
を最終濃度１〜１００μｇ／ｍｌになるように加える。
９６穴Ｕ底マイクロテストプレートにエフェクター細胞
と抽出物含有培養液１００μｌずつを入れ、炭酸ガス培
養器で培養するこの際、自然解離用と最大解離用のウエ
ルを用意して全体がプレートの中央にまとまるようにす
る。自然解離用のウエルには培養液のみを２００μｌ入
れる。培養は、３日間室温において静置する。対照は何
も加えない。培養細胞を再び新鮮な１０％ＦＢＳ添加Ｒ
ＰＭＩ 1640培地に懸濁する（１×１０6／ｍｌ）。
【００１９】標的細胞である継代培養細胞、好ましくは
DaudiあるいはRajiを遠心分離により集菌し、100〜150
μCiの51Ｃｒ−クロム酸ナトリウムを添加する。５％Ｃ
Ｏ2培養器にて３７℃において１時間培養する。培養細
胞をＰＢＳにより３回洗浄後、１×１０6／ｍｌになる
ように１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ 1640培地に懸濁す
る。
DaudiあるいはRajiを遠心分離により集菌し、100〜150
μCiの51Ｃｒ−クロム酸ナトリウムを添加する。５％Ｃ
Ｏ2培養器にて３７℃において１時間培養する。培養細
胞をＰＢＳにより３回洗浄後、１×１０6／ｍｌになる
ように１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ 1640培地に懸濁す
る。
【００２０】上記マイクロテストプレートの各ウエルに
ついて、最大解離群には１Ｎ−ＨＣｌを分注し、自然解
離群（対照）には１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ 1640培地
を分注し、そして実験解離群にはエフェクター細胞（５
０μｌ（１×１０4／ウエル）ずつ）を分注する。プレ
ート遠心分離機により800rpmにおいて５分間遠心分離し
て、５％ＣＯ2培養器にて３７℃において３．５時間培
養する。
ついて、最大解離群には１Ｎ−ＨＣｌを分注し、自然解
離群（対照）には１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ 1640培地
を分注し、そして実験解離群にはエフェクター細胞（５
０μｌ（１×１０4／ウエル）ずつ）を分注する。プレ
ート遠心分離機により800rpmにおいて５分間遠心分離し
て、５％ＣＯ2培養器にて３７℃において３．５時間培
養する。
【００２１】培養したプレートからSOKEN-PET Σ-96に
て各ウエルの培養上清を採取し、γ−シンチレーション
カウンターにより放射活性を測定する。
て各ウエルの培養上清を採取し、γ−シンチレーション
カウンターにより放射活性を測定する。
【００２２】ＬＡＫ療法の効果は、以下の表に従って算
出したＬＡＫ活性値を比較することにより評価した。
出したＬＡＫ活性値を比較することにより評価した。
【００２３】
【００２４】本発明を以下の実施例によりさらに詳細に
説明するが、これらはあくまで例示であって、本発明の
範囲を限定するためのものではない。本発明の精神から
逸脱することなく、本発明に対する様々な変更あるいは
修飾がなされてよいことは、当業者には理解される。
説明するが、これらはあくまで例示であって、本発明の
範囲を限定するためのものではない。本発明の精神から
逸脱することなく、本発明に対する様々な変更あるいは
修飾がなされてよいことは、当業者には理解される。
【００２５】
【実施例】実施例１：シイタケ菌糸体抽出物の調製 バカス９０重量部、米糠１０重量部からなる固体培地に
純水を適度に含ませた後に、シイタケ種菌を接種し、温
度および湿度を調節した培養室内に放置し、菌糸体を増
殖させた。菌糸体が固体培地に密集した後、バカス基材
の繊維素を解束し、１２メッシュ通過分が２４重量％以
下となるようにした。この解束された培地１．０ｋｇ
に、純水３．５ｌおよび精製シルラーゼ２．０ｇを、固
体培地を４０℃にた持ちながら加えて培地含有混合物と
した。
純水を適度に含ませた後に、シイタケ種菌を接種し、温
度および湿度を調節した培養室内に放置し、菌糸体を増
殖させた。菌糸体が固体培地に密集した後、バカス基材
の繊維素を解束し、１２メッシュ通過分が２４重量％以
下となるようにした。この解束された培地１．０ｋｇ
に、純水３．５ｌおよび精製シルラーゼ２．０ｇを、固
体培地を４０℃にた持ちながら加えて培地含有混合物と
した。
【００２６】次いで、培地含有混合物を変速付ギヤーポ
ンプにより循環させながら、固体培地にギヤー部分にお
いて粉砕および擂潰作用を２００分間程度加えて、バカ
ス繊維の約８０重量％が１２メッシュ通過分となるよう
にした。培地含有混合物の粉砕および擂潰は、該混合物
の温度を徐々に上昇させながら実施した。その後、培地
含有混合物をさらに９０℃まで加熱して酵素を失活せし
めると同時に滅菌して、９０℃に３０分間放置した。得
られた培地含有混合液を６０メッシュ濾布を用いて濾過
してシイタケ菌糸体抽出物とし、濃縮した後、凍結乾燥
粉末を得た。 実施例２：シイタケ菌糸体抽出物対ＩＬ−２のＬＡＫ活
性の比較 被験者Ａから採血した末梢血にヘパリンを加え、Ficoll
-Conary液（s.g.＝1.077）を用いた比重遠心分離法によ
り界面の単核球を分離した。分離された単核球をＰＢＳ
（ｐＨ７．４、ＣａおよびＭｇを含まず）により２回洗
浄したのち、１×１０6／ｍｌになるように１０％ＦＢ
Ｓ（非働化血清）を加えたＲＰＭＩ 1640培地（Gibco）
に懸濁した。自己血清（血漿）を３７℃５分処理してコ
ートしたペトリ皿に移し、３７℃１時間培養した。非付
着性細胞を回収して、リンパ球分画とした。
ンプにより循環させながら、固体培地にギヤー部分にお
いて粉砕および擂潰作用を２００分間程度加えて、バカ
ス繊維の約８０重量％が１２メッシュ通過分となるよう
にした。培地含有混合物の粉砕および擂潰は、該混合物
の温度を徐々に上昇させながら実施した。その後、培地
含有混合物をさらに９０℃まで加熱して酵素を失活せし
めると同時に滅菌して、９０℃に３０分間放置した。得
られた培地含有混合液を６０メッシュ濾布を用いて濾過
してシイタケ菌糸体抽出物とし、濃縮した後、凍結乾燥
粉末を得た。 実施例２：シイタケ菌糸体抽出物対ＩＬ−２のＬＡＫ活
性の比較 被験者Ａから採血した末梢血にヘパリンを加え、Ficoll
-Conary液（s.g.＝1.077）を用いた比重遠心分離法によ
り界面の単核球を分離した。分離された単核球をＰＢＳ
（ｐＨ７．４、ＣａおよびＭｇを含まず）により２回洗
浄したのち、１×１０6／ｍｌになるように１０％ＦＢ
Ｓ（非働化血清）を加えたＲＰＭＩ 1640培地（Gibco）
に懸濁した。自己血清（血漿）を３７℃５分処理してコ
ートしたペトリ皿に移し、３７℃１時間培養した。非付
着性細胞を回収して、リンパ球分画とした。
【００２７】エフェクター細胞を１ウエルあたりの最終
個数が１００μｌになるように濃度を調節して培養液に
浮遊させた。該浮遊液に、ＩＬ−２を最終濃度２５Ｕ／
ｍｌ、シイタケ菌糸体抽出物を最終濃度１、１０、１０
０および１０００μｇ／ｍｌになるように加えた。９６
穴Ｕ底マイクロテストプレートにエフェクター細胞と抽
出物含有培養液１００μｌずつを入れ、炭酸ガス培養器
で培養した。この際、自然解離用と最大解離用のウエル
を用意した。自然解離用のウエルには培養液のみを２０
０μｌ入れた。培養は、３日間室温において静置した。
尚、対照は何も加えなかった。培養細胞を再び新鮮な１
０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ 1640培地に懸濁した（１×１
０6／ｍｌ）。
個数が１００μｌになるように濃度を調節して培養液に
浮遊させた。該浮遊液に、ＩＬ−２を最終濃度２５Ｕ／
ｍｌ、シイタケ菌糸体抽出物を最終濃度１、１０、１０
０および１０００μｇ／ｍｌになるように加えた。９６
穴Ｕ底マイクロテストプレートにエフェクター細胞と抽
出物含有培養液１００μｌずつを入れ、炭酸ガス培養器
で培養した。この際、自然解離用と最大解離用のウエル
を用意した。自然解離用のウエルには培養液のみを２０
０μｌ入れた。培養は、３日間室温において静置した。
尚、対照は何も加えなかった。培養細胞を再び新鮮な１
０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ 1640培地に懸濁した（１×１
０6／ｍｌ）。
【００２８】標的細胞である継代培養細胞（Daudi）を
遠心分離により集菌し、100〜150μCiの51Ｃｒ−クロム
酸ナトリウム（New England Nuclear）を添加した。５
％ＣＯ2培養器にて３７℃において１時間培養した。培
養細胞をＰＢＳにより３回洗浄後、１×１０6／ｍｌに
なるように１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ 1640培地に懸濁
した。
遠心分離により集菌し、100〜150μCiの51Ｃｒ−クロム
酸ナトリウム（New England Nuclear）を添加した。５
％ＣＯ2培養器にて３７℃において１時間培養した。培
養細胞をＰＢＳにより３回洗浄後、１×１０6／ｍｌに
なるように１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ 1640培地に懸濁
した。
【００２９】上記マイクロテストプレートの各ウエルに
ついて、最大解離群には１Ｎ−ＨＣｌを分注し、自然解
離群（対照）には１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ 1640培地
を分注し、そして実験解離群にはエフェクター細胞（５
０μｌ（１×１０4／ウエル）ずつ）を分注した。プレ
ート遠心分離機により800rpmにおいて５分間遠心分離し
て、５％ＣＯ2培養器にて３７℃において３．５時間培
養した。
ついて、最大解離群には１Ｎ−ＨＣｌを分注し、自然解
離群（対照）には１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ 1640培地
を分注し、そして実験解離群にはエフェクター細胞（５
０μｌ（１×１０4／ウエル）ずつ）を分注した。プレ
ート遠心分離機により800rpmにおいて５分間遠心分離し
て、５％ＣＯ2培養器にて３７℃において３．５時間培
養した。
【００３０】培養したプレートからSOKEN-PET Σ-96に
て各ウエルの培養上清を採取し、γ−シンチレーション
カウンターにより放射活性を測定した。
て各ウエルの培養上清を採取し、γ−シンチレーション
カウンターにより放射活性を測定した。
【００３１】ＬＡＫ活性は以下の表に従って算出した。
【００３２】結果を表１並びに図１に示す。
【００３３】
【表１】実験番号 誘導物質 ＬＡＫ活性 １ なし １１％ ２ ＩＬ−２（最終濃度：２５Ｕ／ｍｌ） ５５％ ３ 本発明抽出物（最終濃度：１μｇ／ｍｌ） １４％ ４ 本発明抽出物（最終濃度：１０μｇ／ｍｌ） ２０％ ５ 本発明抽出物（最終濃度：１００μｇ／ｍｌ） １４％
【００３４】実施例３：シイタケ菌糸体抽出物のＬＡＫ
活性至適濃度 被験者ＢおよびＣから採血した末梢血を用いて、抽出物
の最終濃度を１、５、１０および１００μｇ／ｍｌとし
た以外は、実施例２の方法に従い、ＬＡＫ活性を算出し
た。
活性至適濃度 被験者ＢおよびＣから採血した末梢血を用いて、抽出物
の最終濃度を１、５、１０および１００μｇ／ｍｌとし
た以外は、実施例２の方法に従い、ＬＡＫ活性を算出し
た。
【００３５】結果を表２並びに図２に示す。
【００３６】
【表２】 実験番号 誘導物質 ＬＡＫ活性 被験者Ｂ 被験者Ｃ １ なし １３％ ２７％ ２ 本発明抽出物（最終濃度：１μｇ／ｍｌ） １８％ ２８％ ３ 本発明抽出物（最終濃度：５μｇ／ｍｌ） １９％ ２９％ ４ 本発明抽出物（最終濃度：１０μｇ／ｍｌ） ２１％ ３４％ ５ 本発明抽出物（最終濃度：５０μｇ／ｍｌ） １９％ ３６％ ６ 本発明抽出物（最終濃度：１００μｇ／ｍｌ）１５％ ３０％
【００３７】比較例１：クレスチンのＬＡＫ活性 被験者Ｄから採血した末梢血を用いてＬＡＫ細胞誘導に
際してクレスチンを最終濃度１ｍｇ／ｍｌにて用いた以
外は、実施例１の方法に従い、ＬＡＫ活性を算出した。
この濃度は、クレスチンを用いた場合に、最も効果的で
あると言われて居る濃度である。
際してクレスチンを最終濃度１ｍｇ／ｍｌにて用いた以
外は、実施例１の方法に従い、ＬＡＫ活性を算出した。
この濃度は、クレスチンを用いた場合に、最も効果的で
あると言われて居る濃度である。
【００３８】結果を表３並びに図３に示す。
【００３９】
【表３】実験番号 誘導物質 ＬＡＫ活性 １ なし １４％ ２ クレスチン（最終濃度：１ｍｇ／ｍｌ） １３％
【００４０】
【発明の効果】本発明のシイタケ菌糸体抽出物は、１ｍ
ｇ／ｍｌの用量においてもリンパ球がほぼ１００％生存
していた（顕微鏡観察；結果は示さず）。よって、リン
パ球に対する直接の毒性はないと言える。
ｇ／ｍｌの用量においてもリンパ球がほぼ１００％生存
していた（顕微鏡観察；結果は示さず）。よって、リン
パ球に対する直接の毒性はないと言える。
【００４１】本発明のシイタケ菌糸体抽出物は、最終濃
度１０μｇ／ｍｌあるいは５０μｇ／ｍｌにおいてもっ
とも高いＬＡＫ活性を示すことがわかった。これに対し
て、同様な抗腫瘍免疫活性を有するクレスチンは１ｍｇ
／ｍｌの濃度であっても対照より活性が低かった。
度１０μｇ／ｍｌあるいは５０μｇ／ｍｌにおいてもっ
とも高いＬＡＫ活性を示すことがわかった。これに対し
て、同様な抗腫瘍免疫活性を有するクレスチンは１ｍｇ
／ｍｌの濃度であっても対照より活性が低かった。
【００４２】本発明のシイタケ菌糸体抽出物は、副作用
が強いＩＬ−２に代えてＬＡＫ療法に使用することがで
きる。
が強いＩＬ−２に代えてＬＡＫ療法に使用することがで
きる。
【００４３】
【図１】図１は、本発明のシイタケ菌糸体抽出物対ＩＬ
−２のＬＡＫ活性％を示す表１のデータを棒グラフによ
り表す。
−２のＬＡＫ活性％を示す表１のデータを棒グラフによ
り表す。
【図２】図２は、本発明のシイタケ菌糸体抽出物の濃度
変化によるＬＡＫ活性の変化を示す表２のデータを棒グ
ラフにより表す。
変化によるＬＡＫ活性の変化を示す表２のデータを棒グ
ラフにより表す。
【図３】図３は、比較例であるクレスチンのＬＡＫ活性
を示す表３のデータを棒グラフにより表す。
を示す表３のデータを棒グラフにより表す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 松田 由紀子 大阪府大阪市淀川区三津屋南３−13−35 小林製薬株式会社内 (72)発明者 田島 裕 佐賀県佐賀市八戸溝３丁目10番511号 Ｆターム(参考） 4C088 AA08 AC17 BA04 BA11 BA12 BA16 NA14 ZB09 ZB26
Claims (3)
- 【請求項１】 シイタケ菌糸体抽出物を含有するＬＡＫ
活性増強物質。 - 【請求項２】 末梢血由来のリンパ球に直接作用させる
ことによりＬＡＫ活性を増強させる、請求項１記載のＬ
ＡＫ活性増強物質。 - 【請求項３】 シイタケ菌糸体抽出物の濃度が１μｇ／
ｍｌ以上である、請求項２記載のＬＡＫ活性増強物質。
Priority Applications (11)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10353927A JP2000159685A (ja) | 1998-11-27 | 1998-11-27 | シイタケ菌糸体抽出物由来のｌａｋ活性増強物質 |
| CNB998151874A CN1171630C (zh) | 1998-11-27 | 1999-11-26 | 从香菇菌丝体的提取物来源的lak活性增强剂和含有此提取物的lak活性增强配方 |
| TW088120732A TWI224006B (en) | 1998-11-27 | 1999-11-26 | LAK activity potentiator orginating in shiitake mushroom hyphae extract and LAK activity potentiating preparations containing the same |
| US09/856,718 US6919081B1 (en) | 1998-11-27 | 1999-11-26 | Lak activity potentiator orginating in shitake mushroom hyphae extract and lak activity potentiating preparations containing the same |
| TW093121040A TW200422049A (en) | 1998-11-27 | 1999-11-26 | LAK activity potentiator orginating in shiitake mushroom hyphae extract and LAK activity potentiating preparations containing the same |
| KR1020017006501A KR20010101065A (ko) | 1998-11-27 | 1999-11-26 | 표고버섯 균사체 추출물 유래의 ｌａｋ 활성증강물질 및이를 함유하는 ｌａｋ 활성증강용 제제 |
| CA002352512A CA2352512A1 (en) | 1998-11-27 | 1999-11-26 | Lak activity enhancers derived from extract of lentinus endodes mycelium and lak activity-enhancers formulations containing the extract |
| PCT/JP1999/006616 WO2000032212A1 (fr) | 1998-11-27 | 1999-11-26 | Potentialisateur de l'activite lak obtenu a partir d'un extrait d'hypes du champignon shiitake, et preparations de potentialisation de l'activite lak contenant ledit potentialisateur |
| GB0113000A GB2359561B (en) | 1998-11-27 | 1999-11-26 | LAK activity enhancers derived from extract of Lentinus edodes mycelium and LAKactivity-enhancing formulations containing the extract |
| HK02101524.1A HK1041435A1 (zh) | 1998-11-27 | 2002-02-27 | 來自香菇菌絲提取物的lak活性增強劑及含有上述提取物的lak活性增加製劑 |
| HK02104331.8A HK1042651B (zh) | 1998-11-27 | 2002-06-08 | 從香菇菌絲體的提取物來源的lak活性增強劑和含有此提取物的lak活性增強配方 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10353927A JP2000159685A (ja) | 1998-11-27 | 1998-11-27 | シイタケ菌糸体抽出物由来のｌａｋ活性増強物質 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000159685A true JP2000159685A (ja) | 2000-06-13 |
Family
ID=18434169
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10353927A Withdrawn JP2000159685A (ja) | 1998-11-27 | 1998-11-27 | シイタケ菌糸体抽出物由来のｌａｋ活性増強物質 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000159685A (ja) |
| CA (1) | CA2352512A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109481477B (zh) * | 2018-12-17 | 2021-08-06 | 上海市农业科学院 | 一种香菇菌丝的转色菌丝菌皮醇提取物的制备方法及用途 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH037236A (ja) * | 1989-02-10 | 1991-01-14 | Nippon Chem Res Kk | ヘルペスウイルスの吸着阻害剤 |
| JPH07173070A (ja) * | 1993-12-17 | 1995-07-11 | Hitoshi Nagaoka | Ｈｉｖ型ウイルス活性阻害剤 |
-
1998
- 1998-11-27 JP JP10353927A patent/JP2000159685A/ja not_active Withdrawn
-
1999
- 1999-11-26 CA CA002352512A patent/CA2352512A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH037236A (ja) * | 1989-02-10 | 1991-01-14 | Nippon Chem Res Kk | ヘルペスウイルスの吸着阻害剤 |
| JPH07173070A (ja) * | 1993-12-17 | 1995-07-11 | Hitoshi Nagaoka | Ｈｉｖ型ウイルス活性阻害剤 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2352512A1 (en) | 2000-06-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Chen et al. | Antitumor activity of polysaccharides: an overview | |
| Reshetnikov et al. | Medicinal value of the genus Tremella Pers.(Heterobasidiomycetes) | |
| JP3621404B1 (ja) | 免疫力強化活性剤 | |
| JPH01228480A (ja) | 食用担子菌菌糸体培養抽出物の製造方法 | |
| Kodama et al. | Potential antitumor activity of a low-molecular-weight protein fraction from Grifola frondosa through enhancement of cytokine production | |
| JP2000159686A (ja) | シイタケ菌糸体抽出物由来のｌａｋ活性増強用製剤 | |
| JP4308350B2 (ja) | シイタケ菌糸体抽出物を含有するｌａｋ活性スクリーニング物質およびそれを用いたｌａｋ活性スクリーニング法 | |
| JP2003306442A (ja) | 抗酸化能と免疫賦活能とを有する製剤と製造方法 | |
| CN109527583A (zh) | 羊肚菌子实体多肽的新用途 | |
| JP2000159685A (ja) | シイタケ菌糸体抽出物由来のｌａｋ活性増強物質 | |
| JP4203965B2 (ja) | バシディオマイセテス及びバシディオマイセテス抽出組成物並びに健康食品及び免疫賦活剤 | |
| JPH11228425A (ja) | Ｉｌ−１２産生誘導組成物 | |
| US6919081B1 (en) | Lak activity potentiator orginating in shitake mushroom hyphae extract and lak activity potentiating preparations containing the same | |
| WO1999053937A1 (fr) | Agents immunostimulants et antitumoraux | |
| JPH02134325A (ja) | エイズ治療剤およびその製造方法 | |
| JP2009143854A (ja) | 創傷治癒促進剤 | |
| WO2019209706A2 (en) | Bioactive fungal compounds produced by solid-state fermentation | |
| JP2006335746A (ja) | 食用微生物の休眠状態のヒト生理活性物質の利用 | |
| JP2006141346A (ja) | 樹状細胞活性化剤 | |
| CA2352459A1 (en) | .gamma..delta.t cell immunoactivity enhancers containing extract of lentinus edodes mycelium | |
| JP2001112436A (ja) | 担子菌を含有する健康食品、飼料ならびにペットフード | |
| JP4165690B2 (ja) | インターロイキン１２産生促進組成物の製造方法 | |
| JP2006104068A (ja) | 樹状細胞活性化剤 | |
| WO2006043783A1 (en) | Pharmaceutical compositions, comprising red ginseng acid polysaccharide and lentinus edodes, of preventing and treating cancer | |
| JP2003238438A (ja) | 外因子から生体を防御する組成物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20041124 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20050520 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20051128 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090804 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20091001 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20091022 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20091002 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20091221 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20091221 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20101022 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20101026 |
|
| A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20101027 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20101026 |