JPH02134325A

JPH02134325A - エイズ治療剤およびその製造方法

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Publication number: JPH02134325A
Application number: JP63287316A
Authority: JP
Inventors: Chiyokichi Iizuka; 飯塚　千代吉; Hiroshi Iizuka; 博飯塚; Yasuhiro Ohashi; 大橋　康宏
Original assignee: NODA SHIYOKUKIN KOGYO KK
Current assignee: NODA SHIYOKUKIN KOGYO KK
Priority date: 1988-11-14
Filing date: 1988-11-14
Publication date: 1990-05-23
Anticipated expiration: 2014-09-13
Also published as: JP2947560B2; DE68906245D1; EP0370673A2; AU629855B2; EP0370673B1; EP0370673A3; AU4178189A; DE68906245T2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】「産業上の利用分野」本発明は、担子菌の菌糸体培養物から抽出されたエイズ
治療剤およびその製造方法に関する。

「従来の技術」エイズウィルスｉＨｕｍａｎ　ｉ＋ａ＋ｍｕｎｏｄｅｆ
ｉｃｉｅｎｃｙＶｉｒｕｓ、　ＨＩＶＩは、レトロウィ
ルス１４、レンチウィルス亜科に属するヒトのＲＮＡウ
ィルスで、Ｔ４陽性′１゛細胞に親和性を持ち、これを
感染死滅させるため、感染者に免疫不全を起こさせ、カ
ポジ肉ＨＩや１種々の日和見感染症などの後天性免疫不
全症候群を引き起こすことが知られている。米国のＣＤ
　Ｃ（Ｃｅｎｔｅｒｓ　ｆｏｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏ
ｎｔｒｏｌｌの統計では、米国での症例数は１９８５年
７月１２日の時点で１１．８７１例に達し、そのうち５
．９１７例が既に死亡し、未だに患者数は指数関数的に
増加の一途をたどっている。また、我国でもエイズの発
生患者および抗体保有者が発見されており、その早急な
対策が切望されている。

レトロウィルス科のウィルスは、ＲＮＡをゲノムとして
、２分子のゲノムをそのコアに持っているとともに、そ
の周囲にエンベロープを持ち、そこにウィルスの抗原性
を担っている糖蛋白が存在している。そして、このウィ
ルスの特徴は、逆転写を行なう点にある。すなわち、ウ
ィルスは、まず細胞表面に吸着され、そこでエンベロー
プを脱ぎ細胞内へ侵入する。そして、細胞内で逆転写酵
素を触媒としてアンコーティングが起こり、ＲＮＡゲノ
ムより逆転写が始まる。逆転写されて作られた２本ｉｌ
ｌ　Ｄ　Ｎ　Ａの一部は、細胞ＤＮＡに組み込まれる。

このＤＮＡが転写され、ウィルスのゲノムＲＮＡおよび
ｍＲＮＡとしての役割を果たして蛋白合成後集合し、細
胞表面で股をかぶり、出芽して放出され、ウィルスが増
殖する。

一方１本発明者らは、長年に亙り椎茸等の程子閑類に属
する食用茸の菌糸体について神々研究を重ねた結果、椎
茸等の担子菌の菌糸体培養物より抽出した物質が、免疫
賦活化作用を有すること（特公昭５３−２３３９２号）
、抗ウィルス剤として有効であること（特公昭６２−３
６００９号）、Ｉ３型慢性肝炎に有効であること（特願
昭６１−１１５７１０号）などを見出している。

しかしながら、前述したような機構によって増殖し人間
に特異的に感染するエイズウィルスに対して、担子菌の
菌糸体培養物から抽出した物質が有効であるかどうかは
、未だ不明であった。前述した増殖機構な考■１すると
、エイズウィルスの増殖を抑制するためには、逆転転写
酵素の活性を阻害することが効果的であると考えられる
が、そのような作用については、これまでの研究の中で
何の示唆もなされていなかった。

［発明が解決しようとする課題」本発明は、上記従来技術の問題点に鑑みてなされたもの
であり、その目的は、エイズウィルスの増殖を抑制して
免疫機構を正常化し、しかも人体に安全で副作用のない
エイズ治療剤およびその製造方法を提供することにある
。

「課題を解決するための手段」本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究した結
果、担子菌の菌糸体培養物から抽出された成分がエイズ
ウィルスの増殖を効果的に抑制することを見出し、本発
明を完成するに至った。

すなわち、本発明のエイズ治療剤は、担子菌の菌糸体培
養物から抽出された成分からなることを特徴とする。

また、本発明のエイズ治療剤の製造方法は、担子菌の菌
糸体を培養し、この培養物を自己消化させ、熱水抽出す
ることを特徴とする。

以下、本発明についてその好ましい態様を挙げながらさ
らに詳細に説明する。

本発明で使用する担子菌としては、例えば椎茸、カワラ
茸、ヒラ茸、エノキ茸、マンネン茸。

マイ茸など各行のものが挙げられるが、この中でも特に
椎茸が好ましい。

本発明では、これらの担子菌の菌糸体を培養してその培
養物から有効成分を抽出する。この場合、培地としては
固体培地、液体培地のいずれも使用できるが、培地成分
中に禾本科植物から調製された原料を含有することが好
ましい、禾本科植物から調製された原料としては、例え
ばバガス。

麦わら、稲わら、とうもろこしの茎葉、米糠、小麦ふす
まなどが挙げられるが、特にバガスが好ましい、禾本科
植物から調製された原料（よ、担子菌の菌糸体によって
分解され、担子菌の菌糸体成分と一緒になって、エイズ
治療に有効な成分を効果的に形成するものと考えられる
。なお、培地中には、他の栄養成分として、鋸屑、ペプ
トン、イースト、せＬＷ廃糖蜜などを添加混合してもよ
い。

担子菌の菌糸体の培養は、例えば担子菌の胞子を液体培
養して得られる菌糸体ベレットを上記のような培地に接
種して行なう、菌糸体を接種した後、固体培地の場合は
、例えば温度１８〜２５℃、湿度５０〜９０％程度に空
調された培養室で３力月〜６カ月程度培養する。最も理
想的には、温度２０〜２５”ｃ、ｆＡ度６０％に空調し
た培養室で４〜６力月程度培養する。こうして菌糸体が
蔓延した培地は、温度処理室に移して変温処理を行なう
ことが好ましい、変温処理は１例えば最初に３２〜３４
℃で２４〜４８時間加温し、次に低温処理室に移して４
〜８℃、湿度８５％にて５〜７日間低温処理を行なう、
この変温処理は、製品の品質の安定上好ましく採用され
るが、必ずしも必要なものではない、その後、培地を栽
培室に移して放置すると、子実体の発生が始まるが、こ
の時点で培養を終了し、後述するように培養物を粉砕機
により粉砕する。一方、液体培地の場合は、通気培養も
しくは振どう培養により、１５〜３０℃の温度条件で１
週間〜１カ月程度培養を行なう、培養は、培地中に菌糸
体が蔓延した状態で終了する。

培養終了後、菌糸体に内在する酵素を利用して菌糸体を
自己消化させるとともに、代謝産物を抽出する。その好
ましい方法として、固体培地の場合は、まず、培養が終
了した培養物を粉砕し、粉砕物を４０〜９０℃で３〜６
時間程度処理して菌糸体の酵素によって自己消化させる
。最も好ましくは、８０℃前後で３〜４時間、通気加熱
し、酵素反応を促進させ、自己消化させると共に、水分
３〜５％程度まで乾燥させる。次に、この粉砕物に４０
℃以上の温水又は熱水を注いで有効成分を抽出する。最
も好ましい態様を挙げると、上記粉砕物６００ｇに対し
て約５２の水を加え、約１時間煮沸すると共に撹拌する
。この撹拌によって菌糸体の代謝産物および菌糸体細胞
液中に含有されている有効成分が熱水に溶脱される。こ
うして得られた懸濁液を例えばネル布地の濾過袋に充填
し、これを加圧、濾過し、この濾液をさらにメンブラン
フィルタで濾過して除菌し、有効成分が含有された抽出
液を得る。一方、液体培地の場合は、必要に応じて菌糸
体を破砕した後、４０℃〜６０℃に加熱して自己消化を
行なわせ、菌糸体が溶解した液状の懸濁培養物を得る。

この培養物を上記と同様に濾過、除菌して抽出液を（与
ることができる。書られた抽出液は、必要に応じて限外
濾過膜、エバポレータ等の手段でａ＃ｉ！シ、これを凍
結乾燥等にて褐色の粉末体とすることもできる。

本発明のエイズ治療剤は、こうして得られた抽出液また
はその乾燥粉末をそのまま用いることもできるが、エイ
ズウィルス増殖抑制作用を有する有効成分をさらに精製
して用いることもできる。

上記抽出液から有効成分を精製する方法としては、次の
ような方法が採用される。

上記乾燥粉末に、好ましくはｌＯ倍量程度の水を加え、
懸濁液をｐｌ＋７．２程度に調製し、この懸濁液にエヂ
ルアルコール（他の低級アルコールでもよい）を加え、
沈殿物を得る。後述する実施例からも明らかなように、
エイズウィルスに対する増殖抑制作用は、特にアルコー
ル濃度３７．５％で可溶であり、アルコール濃度５０％
で不溶となる画分に強く認められる。したがって、アル
コール濃度３７．５％可溶、５０％不溶画分を採取する
ことが特に好ましい。

また、こうして得られたアルコール沈殿物をさらに各行
のクロマトカラムにかけて活性画分を分取することもで
きる。クロマトカラムとしては、例えばＣｏｎ　Ａ　５
ｅｐｈａｒｏｓｅカラム、Ｌｅｎｔｙｌ　１ｅｃｔｉｏ
ｎＳｅｐｈａｒｏｓｅカラム、　Ｐｈｅｎｙｌ　５ｅｐ
ｈａｒｏｓｅ　ＣＬ−４Ｒカラム、　Ｈｙｄｒｏｘｙ　
ａｐａｔｉｔｅカラムなどが挙げられる。

そして、アルコール沈殿物をこれらのクロマトカラムに
吸着させ、所定の溶出液で溶出してくる画分を分取すれ
ばよい、カラムクロマト分画のより好ましい態様におい
ては、アルコール沈殿物をフェニルセファロースカラム
に通し、７５％エチレングリコールで溶出する画分を分
取する。この画分は、エイズウィルスに対する増殖抑制
作用がより顕著に認められる。

「作用」本発明のエイズ治療剤は、後述する実施例から明らかな
ように、エイズウィルスに対する優れた感染阻止効果を
有しており、しかも、天然物から得られたものであるた
め１合成化７薬品などにおける副作用の心配は全くない
。

本発明のエイズ治療剤がエイズウィルスに対する１憂れ
た感染阻止効果を有する理由は、未だ詳細にはわからな
いが、推測によれば、本発明のエイズ治療剤がエイズウ
ィルスの宿主細胞に対する吸着１引害および逆転写酵素
活性を阻害するためと考えられる。

また１本発明のエイズ治療剤の製造方法によれば、エイ
ズウィルスに対する増殖抑制作用を有する成分を効果的
に抽出し、必要に応じてさらに濃縮、精製することがで
きる。

「実施例」実施例１ｉｌ＋椎茸菌糸体の培養バガス９０％、米糠５％、ふすま等の栄養源５％を配合
した固体培地を常法により殺菌し、これに椎茸の固体種
菌（又は液体培養した菌糸体へレット）を接種する。そ
の後、培地を温度２０〜２５℃、湿度６０％に空調した
培養室内に移して４〜６力月培養する。培地中に菌糸体
が蔓延した後、温度処理室に移して３２〜３４℃で２４
〜４８時間加温し１次に低ン島処理室に移して５〜８℃
、湿度８５％にて５〜７日間低温処理を行なう、その後
、培地を栽培室に移して放置し、培地表面から子実体が
発生し始めたら、培地を取り出して粉砕機で破砕する。

（２）培養物からの荷動成分の抽出上記破砕物を８０℃前後で３〜４時間通気加熱し酵素反
応を促進させ、菌糸体の自己消化を行なうと共に、水分
３〜５％まで乾燥する。この破砕物６００ｇに対して約
５２の水を加え、約１時間煮沸すると共に撹拌する。こ
の撹拌によって菌糸体の代謝産物および菌糸体細胞液中
に含有されている有効成分が水に溶脱される。

こうして得られた懸濁液をネル布地の濾過袋に充填し、
これを加圧、濾過して濾液を得る。この濾液をさらにメ
ンブランフィルタで濾過して除菌し抽出液を得る。この
抽出液を限外濾過膜等によって加圧濃縮し、凍結乾燥等
にて褐色の粉末を得る。以下、この粉末なＬ　Ｅ　Ｍ　
−ＨＴとする。

上記Ｌ　Ｅ　Ｍ　−ＨＴの成分を分析した結果、糖：４
４．０％、蛋白質：　２４．６％、その他：３１．４％
であった。なお、糖はフェノール／＆Ａ酸法で定量し、
蛋白質はローリｉＬｏｗｒｙｉ　法で定量した。

また、ＬＥＭ−ＨＴの主要成分をなす多糖成分の糖組成
をガスクロマトグラフィーによって定量した結果、グル
コース：２フ、５３、１％，マンノース二６．７％，キシロース：　３０
．９％，アラビノース：３０．５％，フコース：０．７
％。

ラムノース二０．６％であった。

（３）エイズウィルスの培養ヒトＴ細胞系におけるＬＥ
Ｍ−ＨＴの感染阻止効果 ■実験方法Ｈ　Ｔ　Ｌ　Ｖ　−　１陽性（７）ＭＴ−４細胞（培養
ヒトＴ細胞系）に、　ｌ−１　１　Ｖを感染多重度０．
００１　（細胞＋０００に対しウィルスｌの割合）で感
染させ、細胞数をｌＯ％ＦＣ３ｊ１０ＲＰＭＩ−１６４
０培養液で２×１０’／ｍｌに調整した後，これを２４
穴の組織培養ブレートの所定のウェルにそれぞれ分注す
る。

方、ＬＥＭ−ＨＴを最終濃度０．１　ｍｇ／ａ＋１　、
０．２５Ｈ／ｍｌ　、　０．５ｍｇ／ｍｌとなるように
上記プレートの所定のウェルにそれぞれ注入し、５％Ｃ
Ｏ，加の加湿空気中に３７℃で維持した。培地は３日毎
に交換し、ＬＥＭ−ＨＴはその度毎に培地に添加した。

３日毎に間接蛍光抗体法により、ＨＩＶ抗原の発現した
細胞数を測定し、ＬＥＭ−ＨＴを添加しない対照群と比
較した。

■実験結果実験結果は、第１図に示す通りである。なお、第１図中
、縦軸は蛍光陽性の細胞の割合（％）、横軸は感染後の
日数を表わしている。

対照群は培１１３日日には９０％の細胞がＨＩＶ抗原陽
性となり、培養９日目で殆んど死滅したがＬＥＭ−ＨＴ
は、　ＨＩＶのＭＴ−４細胞に対する感染に対し、用量
依存的に阻止効果が認められた。この感染阻止効果は、
０．５ｍｇ／ｍｌの濃度において１２日間はぼ完全に聞
出することができた。

（４）　アルコール沈殿による精製第２図に示すフローチャートに従ってＬＥＭ−１１′Ｆ
の精製を行なった。

■Ｌ　Ｅ　Ｍ−ＨＴを２００ｍ１の水に溶解させ、６０
００回転で２０分間遠心分雌する。こうしてアルコール
濃度０％の下で得られた沈殿を凍結乾燥し、これをＥ−
０とした。

■次に、■で得られた上澄液２００＠ｌに対して２０ａ
ｌｌのエチルアルコールを加えてアルコール濃度ｌＯ％
とし、４℃で２０分間静置した後、７０００回転で２０
分間遠心分離する。こうしてアルコール濃度０〜ｌＯ％
の範囲で得られた沈殿を凍結乾燥し、これをＥ−１とし
た。

■次に、■で得られた上澄液２００ｎ＋１に対して２０
■ｌのエチルアルコールを加えてアルコール濃度２０％
とし、７０００回転で２０分間遠心分離する。こうして
アルコール濃度ｌＯ〜２０％の範囲で得られた沈殿を凍
結乾燥し、これをＥ−２とした。

■次に、■で得られた上澄液２００ｍ１に対して２０霞
ｌのエチルアルコールを加えてアルコール濃度３０％と
し、７０００回転で２０分間遠心分離する。こうしてア
ルコール濃度２０〜３０％の範囲で得られた沈殿を凍結
乾燥し、これをＥ−３とした。

０次に、■で得られた上澄液２００ｍ１に対して２０ｍ
１のエチルアルコールを加えてアルコール濃度４０％と
し、７０００回転で２０分間遠心分離する。こうしてア
ルコール濃度３０〜４０％の範囲で得られた沈殿を凍結
乾燥し、これをＥ−４とした。

０次に、■で得られた上澄液２００ｍ１に対して２０ｇ
ｏ１のエチルアルコールを加えてアルコール濃度５０％
とし、７０００回転で２０分間遠心分離する。こうして
アルコール濃度４０〜５０％の範囲で得られた沈殿を凍
結乾燥し、これをＥ−５とした。

（５）上記Ｅ−３の沈殿画分を用いた抗エイズウイルス
作用の実験 ■実験方法ＡＴＨ８細胞（）ＩＴＬＶ−１陽性ヒトＴ細胞）にエイ
ズウィルスを感染させると生細胞は次第に減少する。そ
こで、ＡＴＨ８細胞（２ｘ　ｌｏ’ｐｅｒｃｕｌｔｕｒ
ｅｌの培養液に、上記分画標品Ｅ−３を０、１〜２００
　ｕ　ｇ／ｖｓｌとなルヨうに添加し、ＨＩＶ（２００
０ｖｉｒｕｓ　ｐａｒｔｉｃｌｅ　ｐｅｒｃｅｌｌｌを
接種し、生細胞の減少をＨＩ　Ｖと接触させなかったコ
ントロール群と比較した。

■実験結果実験結果を第３図に示す０図から明らかなように１本物
１Ｋ（Ｅ−３）２００μｇ７ｍｌをターゲット細胞に添
加した場合には、ＨＩＶの感染による生細胞の減少を完
全に阻止することができ、明らかな抗ウィルス作用が認
められた。

＋６１　　ＬＥＭ−ＨＴの免疫賦活作用についての実験 ■実験方法モルモットの腹腔内に液状パラフィンを注入し、滲出し
てくるマクロファージを採取し、Ｅａｇｌｅ　ＭＥＭ培
地で５　ｘ　１０’　ｃｅｌｌ／ａｌｌに調整した。

このマクロファージの細胞浮遊液に、Ｌ　Ｅ　Ｍ　−Ｈ
Ｔを１２５〜１０（ＩＱＬＬ　ｇ／＋ｓｌの濃度になる
ように加え、３７℃で６時間培養した。培養後、培地で
２回洗浄してＬ　Ｅ　Ｍ　−ＨＴを除き、１０％ＦＣ３
加εａｇｌｅＭＥＭで４２時間培養し、ＬＥＭ−ＨＴ処
理のマクロファージ培養土清中に含まれるインタロイキ
ン（ＩＬ−１）をチモサイトブロリファレイションアツ
セイ（ｔｈｙ＋５ｏｃｙＬｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉ
ｏｎ　ａｓｓａｙ）により測定した。すなわち、Ｃ３Ｈ
／　Ｈｅ　Ｊマウス胸腺から得た細胞にＬＥＭ−ＨＴ処
理をしたマクロファージ培養上清を加え、２μｇ／ｍｌ
のｐｈｙｔｏ−ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎを添加して
４８時間培養した。その後、ＩｇＣｉ／ｍｌの”　Ｈ−
ｔｈｙ＋ｗｉｄｉｎｅを添加してさらに２４時間培養し
た。そして、　　”　Ｈ−ｔｈｙ＋＋＋１ｄｉｎｅの酸
不溶性分画への取込み量を液体シンチレーションカウン
タで測定した。

■実験結果図から明らかなように、ＬＥＭ−ＨＴは１２５ｕ　ｇ／
ｍ１以上の濃度でマクロファージを刺激し、ＩＬ−１産
生活性を増強した。このことは、ＬＥＭ　−ＨＴがマク
ロファージ系細胞に作用してＩＬ−１の産生を増強し、
リンパ球の能力を質的に高めて抗体を作る能力を向上さ
せることを示す。

＋７１　　ＬＥＭ−ＨＴのマウス牌細胞に対するマイト
ゲン効果についての実験 ■実験方法ラットから牌臓を取出し、生理食塩水中で細かく切断し
、８０メツシユのステンレスワイヤ上で濾過する。濾過
水を遠心分離し、得られたベレットを０．３５％食塩水
中に懸濁させて瀉血処理する。この懸濁液を遠心分離し
上清を除去する０次に、沈殿細胞をカナマイシンｆ６０
　ｕｇ／ｌ１ｌｌが含有されているハンクス液で洗浄す
る。洗浄した細胞を、２０％＋Ｖ／Ｖ＋牛脂児血清（Ｆ
ＢＳ、　Ｍ、＾、　Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔ社製）および
０．００６％（育／Ｖｌ硫酸カナマイシンを含有するＴ
Ｃ１９９培地１Ｄｉｆｃｏ社製）にＩＯ’ｃｅｌｌ／ｍ
ｌとなるように分散する。この懸濁液をウェルプレート
の所定のウェルに１００μｍずつ分注し、！ｇＡ々の濃
度に調製したＬ　Ｅ　Ｍ　−）Ｉ　Ｔ溶液を１００＋＋
＋１ずつ同様に分注し、５％ＣＯ□存在下、３７℃で２
４時間培養する。さらに、［ＭｅＬｈｙｌ−３ｔｌ］　
ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ　ｔ［３１１１−ＴｄＲＡｍｅｒｓ
ｈａｍ　Ｊａｐａｎ社）をｌウェル当たり０．１　μｃ
ｉずつ添加して２４時間培養する。これらの細胞をグラ
スファイバメンブランにシート状に凝集させ、冷生理食
塩水・冷５％ｆｗ／ｖｌ　　トリクロロ酢酸で３回、９
５％の冷エチルアルコールで２回、さらに冷ジエチルエ
ーテルで１回洗浄して風乾する。最後に、この放射活性
を液体シンチレーションカウンタで測定した。

■実験結果実験結果は次表に示す通りである。なお、表中、±Ｏｎ
　−＋は下式で求められたものである。

±ａｎ−＋　＝ＪΣ（Ｘ　ｊ　−Ｘ）　”／　ｉｎ　−
１）表この表から、ＬＥＭ−ＨＴは０．４μｇノｃｕｌｔｕｒ
ｅ以上の４度でマウス牌細胞の幼若化を促進し、明らか
なマイトゲン効果を有することがわかる。

以上のように、ＬＥＭ−ＨＴは、エイズウィルスの感染
阻止並びに増殖を抑制する直接的な効果が期待できると
同時に、生体に反応して免疫力を強化し、治療効果を有
することが確認された。すなわち、■エイズウィルスの
感染によるＴ−リンパ球の減少を抑制すること、■マク
ロファージを活性化させ、ＩＬ−１産生活性を増強し、
抗体産生な促進すること、■牌細胞に対するマイトゲン
活性を有することなどから、Ｌ　Ｅ　Ｍ　−）Ｉ　Ｔは
免疫担当細胞を賦活化し、エイズウィルスの感染および
増殖抑制に対して極めて効果的であると考えられる。

＋８１　　ＬＥＭ−ＨＴの急性毒性試験ＳＤ系ラットを
用いてＬＥＭ−ＨＴの経口、皮下ならびに腹腔内投与に
おける急性毒性試験を行なった。その結果、ＬＤ、。値
は次の通りであった。

♂　　　　　　　　♀ 経口投与　　　　　１７，２　　　　１５．８皮下投与
　　　　　　４．５　　　　　５．２腹腔内投与　　　
　：１．３　　　　　３．１（１４１位ｇ／ｋｇｌ死亡状況は、経口ならびに皮下投与で雌雄ともそれぞれ
１日と２日以内であったのに対し、腹腔的投与では雄２
日以内、１１ｆｆ３日以内と雌ａＪこ差か見られた。ま
た、大ｌのＬ　Ｅ　Ｍ　−ＨＴ投与により各投与部位で
それぞれ強い炎症反応を示した。すなわち、経口投与は
消化管に出血、皮下は大腿部に壊死、腹腔内は肝と横隔
膜の塗着が見られた。

このような死亡状況を見ると、投与による急激なな変化
に対応しきれず体力が衰弱し、死亡したものと推察され
る。

上記のような急性毒性試験の結果、ＬＥＭ−）ＩＴは一
般食品と同等の安全性であることが確認された。

（９）エイズ患者に対する臨床試験Ｌ　Ｅ　Ｍ　−ＨＴを用いて、少数ではあるがエイズ患
者に対し臨床試験を行なった。試験施設および実施者は
次の通りである。

試験施設：　　Ｅｍｐｅｒｏｒ’ｓ　ｃｏｌｅｇｅ　ｏ
ｆ　ＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＯｒｉｅｎｔａｌ　Ｍｅｄ
ｉｃｉｎｅ　（米国）実施者・　　叶、　Ｍ、　Ｍｏ５
ｌｅｋＯｒ、　Ｋｅｖｉｎ　Ｌａｎｃｅ　Ｊｏｎｅｓ■
ケース１発熱および疲労感かひどいことから診断を受け、検査の
結果ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−Ｈ＋抗体が認められ、エイズと詮
所された。ＬＥＭ−ＨＴ投与前の′ｒ４細胞数は１２５
０個／ｌｌ１１３であった。ＬＥＭ−）ＩＴを毎日６ｇ
ずつ経口投与したところ、３０日後のＴ４細胞数は２０
４５個／ｌｌ１１！となり、６０日後のＴ４細胞数は２
５４２個／１ｍｖａ３となり、自覚症状も改善された。

■ケース２エイズ感染によるカボジ肉腫患者であり、ＬＥＭ−）Ｉ
Ｔ投与前のＴ４細胞数は８２２個／１ａ１１３であった
。ＬＥＭ−ＨＴを毎日９ｇずつ経口投与したところ、Ｔ
、細胞数は１０５０個／ｆｌＨｍｓまで増加して回復に
向かったが、肺炎を併発して死亡した。

■ケース３自覚症状がなく検査の結果ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−ＨＩの感染
が認められた。いわゆるキャリヤの状態である。

ＬＥＭ−ＨＴを毎日６ｇずつ経口投与した。６０日間投
与の結果、ウィルス抗原が消失した。

なお、上記臨床検査の結果、実施者である博士らは、Ｌ
ＥＭ−）ＩＴは１００％天然物に由来しているので安全
であり、患者に対して副作用は全（認められなかったと
報告している。

実施例２ｉｌｌ　ＬＥＭ−ＨＴの分画前記実施例１と同様にしてＬＥＭ−ＨＴを調製した。こ
のＬ　Ｅ　Ｍ　−ＨＴを第５図に示すフローに従って分
画した。

■Ｌ　Ｅ　Ｍ　−ＨＴに１０倍量の水を加え、この懸濁
液をｐｌ！７．２に調整する。

■この懸濁液にエチルアルコールを加えてアルコール濃
度５０％とし、遠心分離して得られた沈殿物をｒＰＰＴ
ＩＪとする。

■この沈殿物をＣｏｎ　Ａ　５ｅｐｈａｒｏｓｅカラム
にかけて吸着させ、ｌ　Ｍ　ＮａＣ１ｊ５よび０．２　
ｋＡａ　−ＭｅｔｈｙｌＩＪａｎｎｏｓｊｄｅを含有す
るリン酸緩衝液（ｐＨ７，２１で溶出させる。

■溶出液をさらにＬｅｎＬｙｌ　Ｉｅｃｔｉｏｎ　５ｅ
ｐｈａｒｏｓｅカラムに通し、０．１Ｍ塩化ナトリウム
を含有する１０　ｍｌＪ酢酸緩衝液１ｐＨ６，０）で溶
出する画分を［ＥＣＬ−ＩＪとする。

■さらに吸着物をｌ　Ｍ　ＮａＣ１，０，２Ｍ−ａ　−
ＭｅｔｈｙｌＭａｎｎｏｓｉｄｅを含むリン酸ＭＩ術液
で溶出し、この画分をｒＥｃＬ−２Ｊとする。

■ＬＥＭ−）ＩＴに１０倍量の水を加え、この懸濁液を
ｐｌ＋７．２に調整した後、エチルアルコールを３７５
％の濃度になるように加え、遠心分離して沈殿物を除去
する。この上清にさらにエチルアルコールを５０％の濃
度になるように加え、遠心分離して沈殿物を得る。こう
してアルコール濃度３７．５％可溶、５０％不溶画分を
分取し、これをｒｎｅ。

ＰＰＴＩＪとする。

■ｎｅｏＰＰＴｌをＰｈｅｎｙｌ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ
　ＣＬ−４８カラムに通し、１Ｍｆｆ１安を含むリン酸
緩衝液（ｐＨ６，８１で溶出してくる画分をｒＥＰＩＪ
とする。

■さらにリン酸緩衝液（ｐＨ６，８１で溶出して（る画
分をｒＥＰ２Ｊとする。

■さらに７５％エチレングリコールで溶出してくる画分
をｒＥＰ３Ｊとする。

＠ＥＰ２をｌ１ｙｄｒｏｘｙ　ａｐａｔｉｔｅカラムに
吸着させ、リン酸緩衝液１ｐ）１６．８１　で溶出して
くる画分をｒ　Ｅ　Ｐ　２　ＨＩ　Ｊとする。

■ＥＰ３をＨｙｄｒｏｘｙ　ａｐａｔｉｔｅカラムに吸
着させ、リン酸Ｍｉ　南Ｍ　ｆｐｕａ、　８１　で溶出
してくる画分をｒＥＰ３）１６Ｊとする。

＠ＥＰ３をＣｏｎ　Ａ　５ｅｐｈａｒｏｓｅカラムに吸
着させ、ｌ　Ｍ　Ｎａ（：ｌ、０．２１ｄ−ａ−Ｍｅｔ
ｈｙｌ−Ｍａｎｎｏｓｉｄｅを含むリン酸緩衝液で溶出
してくる画分をｒＥＰ３Ｃ」とする。

（２）各分画のエイズウィルスに対する感染阻止効果の
実験 ■実験方法Ａ　’ｒＨ８細胞にＨＩ　Ｖを感染させると生細胞は次
第に減少する。そこで、ＡＴＨ８細胞（２×１０’ｐｅ
ｒ　ｃｕｌＬｕｒｅｌの培養液に、上記それぞれの分画
を０〜２００　ｕ　ｇ／ｍｌのｌＩ々の濃度となるよう
に添加し、ＨＩ　Ｖ　　（２０００ｖｉｒｕｓ、　ｐａ
ｒｔｉｃｌｅ　ｐｅｒｃｅｌｌｌを接神し、生細胞の減
少をＨＩＶと接触させなかったコントロール群と比較し
た。

■実験結果実験結果を第６図に示す１図中、■はＨ　Ｉ　Ｖと接触
させた群１口はコントロール群であり、図の縦軸は生細
胞数（Ｘ　１ＯＳ）を表わし、横軸は試料の添加濃度（
μｇ／ｍｌ）を表わす。

図から明らかなように、ＬＥＭ−ＨＴの各分画は一様に
抗）１１　Ｖ活性を認めることができた。

特にＥＰ３区においては２０〜５０μｇ／ｍｌの濃度に
おいてＨＩＶの感染による生細胞の減少を完全に阻止す
ることができた。

また、ＥＰ２区、ＥＰ３Ｃ区およびＥＰ３）１６区にお
いても優れた抗ＨＩＶ効果を認めることができた。

このように、ＬＥＭ−ＨＴの各分画は、　２０〜５０μ
ｇ／ａ＋１程度の低濃度においても優れた抗ＨＩＶ効果
を示した。

（３）本発明物質の作用機作な解明する実験■実験方法エイズウィルスから調製した逆転写酵素（Ｒｅｖｅｒｓ
ｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、　ＲＴ　ｌに、ｎｅ
ｏＰＰＴ　ＩおよびＥＰ３をＯ〜２００　μｇ／ｍ１Ｏ
）　Ｍｌ　’／　ノａ度となるように添加し、それぞれ
の濃度における逆転写酵素の活性を測定した。

■実験結果実験結果を第７図に示す１図中、△・・・ΔはｎｅｏＰ
ＰＴｌの結果であり、０・０はＥＰ３の結果である。ま
た、図の縦軸はＤＮＡに取り込まれた標識ナタレオチド
の量を表わし、横軸はｎ　ｅ　ｏ　Ｐ　Ｐ　Ｔｌまたは
ＥＰ３の濃度を表わしている。

この結果から明らかなように、ｎｅｏＰＰＴｌは低濃度
においてそれはどＲＴ阻害効果は認められなかったが、
ＥＰ３においてはｌＯμｇ／＋ｓｌでも優れた阻害効果
が認められた。このことは、ＥＰ３にあっては低濃度に
おいてもエイズウィルスのＲＮＡゲノムからＤＮＡに転
写する逆転写酵素の活性を阻害し、ウィルスの増殖を阻
止することを示すものである。

１４１ＥＰ３の分析ＥＰ３について元素分析および無機成分の分析を行なっ
た。

■元素分析結果元素分析の結果は、　Ｃ：　４４．９７％、ｌ−１：　
３．８１％、Ｎ　：　１．８８％、灰分：５．７０％、
Ｏ：　４３．６４％であった。

■無機成分の分析結果上記灰分について誘導結合プラズマ法および原子吸光分
析法によって組成を分析した結果、Ｐ：０．５２％、　
　Ｓ：０．３４％、　　Ｍｇ：０．０３　％、　　（：
ａ：０．２１　　％。

Ｅ：０．３４％、　Ｎａ：２．１７％であった。

このように、ＥＰ３は、有機物以外にｐ、　ｓ。

Ｍｇ、　Ｃａ、　Ｋ、　Ｎａの各元素を構成成分とする
物質であることが同定できた。

「発明の効果」以上のような試験結果および臨床試験から明らかなよう
に、本治療剤はエイズウィルスに対して充分な効果を有
することが確認された。また、本発明において特筆すべ
きことは、従来の抗ウィルス作用を有する物質は強烈な
毒性を有し、副作用があるため実用化を断念せざるを得
なかった場合が多かったが、本治療剤は１００％天然物
から抽出したものであるため、安全性が非常に高いとい
う点である。さらに、本治療剤は、低濃度においてもエ
イズウィルスの逆転写酵素の活性を阻害するので、これ
によってエイズウィルスの増殖を抑制し、エイズに対す
る優れた予防あるいは治療効果を期待することができる
。

【図面の簡単な説明】

第１図はエイズウィルスの感染に対するＬＥＭ−ＨＴの
阻止効果を示す図、第２図はＬＥＭ−ＨＴをアルコール
沈殿法で分画するフローチャート、第３図はＬＥＭ−Ｈ
Ｔ　（Ｅ−３）のエイズウィルス感染阻止効果を示す図
、第４図はインターロイキン−１活性の増強作用を示す
図、第５図はＬ　Ｅ　Ｍ　−ｔｌ　Ｔ分画のフローチャ
ート、第６図は上記分画により得られた各区の１（ＩＶ
に対する感染阻止効果を示す図、第７図はｎｅｏＰＰＴ
１区とＥＰ３区の逆転写酵素に対する阻害効果を示す図
である。特許出願人　　　野田食菌工業株式会社同代理人　　　
弁理士　松茸　茂第２図３Ｈ−丁ｄＲ（ｄｐｍ　ｘ　＋Ｏ′／ｗｅｌｌ）第図ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（Ａｇ／ｍｌ）ＮＵＭＢＥ
ＲＯＦ　ＶＩＡ日ＬＥ　ＣＥＬＬＳ（ｘｌＯ’）腰手糸売ネ山ｉ−、Ｅ書（自発）発明の名称エイズ治療剤およびその製造方法３、補正をする者事件との関係　　特許出願人住　所　　千葉県野田市清水１２１番地代表者　飯塚　
千代吉第３大里ビル５０１号　電話０：ｌ−８５１−７１０４
氏名（８６６８）弁理士松茸　茂補正により増加する請求項の数なし６、補正の対象明細書の発明の詳細な説明の欄７、補正の内容ｆｉｌ明細書第１６頁、第７行〜第８行のｒ２０ｍｌの
エチルアルコール」をｒ２２．２ｍｌのエチルアルコー
ル」と補正する。（２）明細書簡１６ｒＴ、第１３行〜第１４行のｒ　２
０＋ｓｌのエチルアルコール」をｒ　２５＋ｓｌのエチ
ルアルコール」と補正する。（３）明細書第１６頁、第１８行〜第１９行のｒ２０ｍ
ｌのエチルアルコール」をｒ　２８．６ｍｌのエチルア
ルコール」と補正する。（４）明細書第１７頁、第３行〜第４行の１２０ｍ１の
エチルアルコール」をｒ　３３．３＋ｓｌのエチルアル
コール」と補正する。（５）明細書第１７頁、第８行〜第９行のｒ２０ｍｌの
エチルアルコール」を「４０ｍ１のエチルアルコール」
と補正する。（６）明細書第２３頁、下から第２行の［（９）エイズ
患者に対する臨床試験」を「（９）エイズ患者に対する
臨床試験−１」と補正する。（７）明細書第２５頁、第９行と第１Ｏ行との間に次の
文章を挿入する。ｒ　ｔｉｏ＋エイズ患者に対する臨床試験−２■試験施
設及び試験担当医（試験施設）　　　　　　（試験担当医）産業医ト１大
学　　　　　　白幡　聡東北大学医学部　　　　　森　和夫浜の町病院　　　　　　　岸１）邦雄鹿児島大学医学部　　　　火山　細部 ■試験方法上記４施設において、ＬＥＭ−１１７を投与されている
１８名の血友病患者のうち、すでに３ヶ月以上Ｌ　Ｅ　
Ｍ　−ＨＴを投与された１３例（血友病Ａ　　１１例、
　Ｂ２例）を対象とした。対象例の年齢は１３歳から４
９歳までで、ＡＣ（＾ｓｙｍｐＬｏｍａｔｉｃ　ｃａｒ
ｒｉｅｒ、無症候性キャリア）９例、ＡＲＣ（ＡＩＤＳ
−ｒｅｌａｔｅｄＣｏａ＋ｐｌｅｘ、　ＡＩＤＳ関連症
候群）１例、　ＡＩＤＳｔＡｃｑｕｉｒａｄ　Ｉｍｍｕ
ｎｅ　Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　Ｓｙｎｄｒｏｍｅ、後天
性免疫不全症候群）２例、ＨＩＶ抗体陰性者１例であっ
た。ＬＥＭ−ＨＴは１日９ｇを１日３回に分けて服用さ
せた。そして、これらの血友病旧Ｖ感染者の免疫能に及
ぼす１．　Ｅ　Ｍ　−Ｈ　’ｒの効果を検討した。 ■結果（ａ）　ＣＤ４／Ｈ比はＡＣ９例中３例で増加、２例で
減少、残りの４例中１例で一過性の増加が観察された。ＡｌＩＣとＡＩＤＳの３例では明らかな変動はみられな
かった。ｉｂｌ　ＣＤ、絶対数はＡＣ’１例中２例で増加、３例
で減少、残りの４例中１例で一過性の増加が認められた
。　ＡＩｔＣの１例は不変であったが、　ＡＩＤＳの２
例では減少傾向がみられた。ｌｅｔ　ＰＨＡ、　Ｃｏｎ　Ａ、　ＰＷＭによるリンパ
球幼若化反応は、ＡＣ８例中５例で増加、１例で低下、
２例では不変であった。　ＡｌＩＣの症例も不変であっ
たが。ＡＩＤＳの２例では著しく増加し、臨床的にカンジダ症
の軽減をみた。ｔｄ）　ＨＩＶ抗体陰性（７）１例では、Ｌ　Ｅ　Ｍ　
−１−１１’　（７）投与後、　ＣＤ、／。比、ＣＤ４
絶対数、リンパ球幼若化反応のいずれもｇしく増加した
。ｔｅ１本剤によると考えられる副作用は認められなかっ
た。 ■結論Ｌ　Ｅ　Ｍ　−Ｈ　Ｔは特にリンパ球幼若化反応に対す
る影響が顕著であった。一部の症例ではＣＤ４の増加も
認められ、ＡＩＤＳの症例ではいずれも臨床的改冴効果
も（りられたことから、本則は発症予防あるいは治療薬
として試みる価値の高い薬剤と考えられる。」（８）明細書第２９頁、第１５行の「ナクレオチド」を
「ヌクレオチド」と補正する。以上

Claims

【特許請求の範囲】

（１）担子菌の菌糸体培養物から抽出された成分からな
ることを特徴とするエイズ治療剤。
（２）担子菌の菌糸体を禾本科植物から調製された原料
を含有する培地を用いて培養して得られた請求項１記載
のエイズ治療剤。
（３）担子菌の菌糸体として椎茸の菌糸体を用いて得ら
れた請求項１または２記載のエイズ治療剤。
（４）菌糸体培養物の菌糸体を自己消化させ、代謝産物
を熱水抽出して得られた請求項１〜３のいずれか１つに
記載のエイズ治療剤。
（５）熱水抽出物をアルコール沈殿させて得られた請求
項４記載のエイズ治療剤。
（６）熱水抽出物のアルコール濃度３７．５％可溶。５０％不溶画分から得られた請求項５記載のエイズ治療
剤。
（７）糖、蛋白および無機成分の混合物からなる請求項
１〜６のいずれか１つに記載のエイズ治療剤。
（８）無機成分としてＰ．Ｓ．Ｍｇ．Ｃａ．Ｋ．Ｎａを
含有する請求項７記載のエイズ治療剤。
（９）Ｃ：４４．９７％、Ｈ：３．８１％、Ｎ：１．８
８％、灰分：５．７０％、Ｏ：４３．６４％の元素組成
を有し、無機成分としてＰ：０．５２％、Ｓ：０．３４
％、Ｍｇ：０．０３％、Ｃａ：０．２１％、Ｋ：０．３
４％、Ｎａ：２．１７％含有する請求項８記載のエイズ
治療剤。
（１０）担子菌の菌糸体を培養し、この培養物を自己消
化させ、熱水抽出することを特徴とするエイズ治療剤の
製造方法。
（１１）担子菌の菌糸体を禾本科植物を含有する培地を
用いて培養する請求項１０記載のエイズ治療剤の製造方
法。
（１２）担子菌の菌糸体として椎茸の菌糸体を用いる請
求項１０または１１記載のエイズ治療剤の製造方法。
（１３）熱水抽出物をアルコール沈殿させる請求項１０
〜１２のいずれか１つに記載のエイズ治療剤の製造方法
。
（１４）熱水抽出物のアルコール濃度３７．５％可溶、
５０％不溶画分を分取する請求項１３記載のエイズ治療
剤の製造方法。
（１５）熱水抽出物をアルコール沈殿させ、この沈殿物
をクロマトカラムにて分画し、活性画分を分取する請求
項１３または１４記載のエイズ治療剤の製造方法。
（１６）熱水抽出物をアルコール沈殿させ、この沈殿物
をフェニルセファロースカラムに通し、７５％エチレン
グリコールで溶出する画分を分取する請求項１５記載の
エイズ治療剤の製造方法。