JP3072321B2

JP3072321B2 - 抗ｈｉｖ活性物質およびその製造方法

Info

Publication number: JP3072321B2
Application number: JP9157153A
Authority: JP
Inventors: 修一岡; 幸苗山崎; 登冨塚; 真美井上; 幸織山本; 康子藤田; 徹大竹; 拓也川畑; 保則福森
Original assignee: Hokuren Federation of Agricultural Cooperative Associations
Current assignee: Hokuren Federation of Agricultural Cooperative Associations
Priority date: 1997-06-13
Filing date: 1997-06-13
Publication date: 2000-07-31
Anticipated expiration: 2017-06-13
Also published as: JPH115745A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、抗ＨＩＶ活性物質
およびその製造方法に関する。また、本発明はそのよう
な抗ＨＩＶ活性物質を含むことを特徴とする抗ＨＩＶ剤
および機能性食品にも関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、後天性免疫不全症候群（ａｃｑｕ
ｉｒｅｄｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｓｙｎ
ｄｒｏｍｅ，ＡＩＤＳ）が急速に広まり、その予防法や
治療法の確立が世界的に必要とされている。ＡＩＤＳは
レトロウィルスの一種であるヒト免疫不全ウイルス（ｈ
ｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｖｉｒ
ｕｓ，ＨＩＶ）によって引き起こされることから、ＨＩ
Ｖの増殖を抑制する薬剤の開発研究が活発に行われてい
る。

【０００３】その結果、これまでに、アジドチミジン、
ジダノシン、インターフェロン、リコンビナントＣＤ
４、プロテアーゼ阻害剤、デキストラン硫酸、カードラ
ン硫酸およびレンチナン硫酸などの化学的修飾多糖など
に抗ＨＩＶ活性があることが報告されている。その中の
幾つかは、現在ＡＩＤＳ治療のために臨床で用いられて
いる。抗ＨＩＶ活性を有する物質として報告されている
もののうち、例えばアジドチミジンやジダノシンはｉｎ
ｖｉｔｒｏで優れた抗ＨＩＶ作用を持ち、ＡＩＤＳ患
者に対する延命効果があることが認められている。しか
しながら、これらの薬剤は造血機能の抑制や膵炎を起こ
すといった副作用が強いうえ、耐性株ＨＩＶが出現する
という問題を抱えている。

【０００４】また、化学的修飾多糖の１種であるデキス
トラン硫酸は、α−グルカンであるデキストランの硫酸
エステル化物であるが、生体内における安定性が極めて
悪いという欠点がある。そのうえ、血液凝固阻害作用が
強いという問題もある。さらに、別の化学的修飾多糖で
あるカードラン硫酸は、β−１，３グリコシド結合のみ
からなるカードランやその低分子体から誘導されるもの
であるが、生体内における半減期が短いために効果が持
続しないという欠点がある。このように、今日までに開
発された抗ＨＩＶ活性物質は、抗ＨＩＶ活性が高いと副
作用も大きいというジレンマを抱えている。このため、
より低毒性でかつ有効性の高い抗ＨＩＶ活性物質を開発
することが急務とされている。

【０００５】一方、古来より我国や中国では、疾病の治
療や予防に生薬や漢方薬を使用している。これらの生薬
や漢方薬は、安全性が十分に確認されており、安心して
服用することができるものが多い。中には、ウイルスの
増殖を阻害する抗ウイルス効果をもつものもあり、注目
を集めている。しかしながら、生薬や漢方薬のＨＩＶに
対する作用を本格的に検討した結果は、カンゾウに含ま
れるグリチルリチンの検討例を除けばほとんど報告され
ていない。このため、多種多様な生薬や漢方薬に由来す
る物質のいずれに抗ＨＩＶ活性があるのかを示唆する報
告は皆無に近い。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】このような状況を踏ま
えて、本発明は、上記の従来技術がかかえる問題点を解
決することを課題とした。すなわち、本発明は、強力な
抗ＨＩＶ活性を有していながら、細胞毒性が極めて低い
という特徴を有する、安全で高活性な抗ＨＩＶ活性物質
を提供することを課題とした。また、本発明は、そのよ
うな抗ＨＩＶ活性物質を製造する簡便な方法を提供する
ことも課題とした。さらに本発明は、この抗ＨＩＶ活性
物質を有効成分とする抗ＨＩＶ剤および抗ＨＩＶ機能性
食品を提供することも課題とした。

【０００７】

【課題を解決するための手段】これらの課題を解決する
ために鋭意研究を進めた結果、本発明者らは、シソ目植
物の水抽出物から得られる特定の成分に強力な抗ＨＩＶ
活性があることを見出して本発明を完成した。すなわ
ち、シソ目植物の水抽出物を、ＤＥＡＥ陰イオン交換ク
ロマトグラフィーにより精製したところ、抗ＨＩＶ活性
が極めて高い画分が得られた。本発明は、この発見に基
づいてなされたものである。

【０００８】本発明の抗ＨＩＶ活性物質の製造方法は、
（１）シソ目植物を水で抽出する工程と、（２）得られ
た抽出物をＤＥＡＥ陰イオン交換クロマトグラフィーに
よって精製し、溶出される画分を取得する工程を、必須
の工程として含む点に特徴がある。

【０００９】本発明の抗ＨＩＶ活性物質の製造方法に使
用する植物は、管状花目（シソ目）に属するものであれ
ば、その種類はとくに制限されない。したがって、ヒル
ガオ科、ハナシノブ科、ムラサキ科、クマツヅラ科、シ
ソ科、ナス科、コマノハグサ科、ノウゼンカズラ科、ゴ
マ科、ツノゴマ科、ハマウツボ科、イワタバコ科、タヌ
キモ科、キツネノマゴ科、ハマジンチョウ科、ハエドク
ソウ科などに属する植物を広く使用することができる。
この中では、シソ科に属する植物を使用するのが好まし
い。

【００１０】シソ科は、キランソウ亜科、タツナミソウ
亜科、ラベンダー亜科、シソ亜科、ヤマハッカ亜科など
にさらに分類されるが、いずれの亜科に属する植物も好
ましく用いることができる。その中でも特に好ましいの
は、キランソウ亜科、ラベンダー亜科、シソ亜科、ヤマ
ハッカ亜科に属する植物であり、もっとも好ましいのは
シソ亜科に属する植物である。シソ科に属する植物とし
ては、キランソウ属、ニガクサ属、タツナミソウ属、ム
シャリンドウ属、イヌハッカ属、カキドオシ属、カワミ
ドリ属、ウツボグサ属、ジャコウソウ属、オドリコソウ
族、チシマオドリコ属、メハジキ属、イヌゴマ属、アキ
ノタムラソウ属、トウバナ属、イブキジャコウソウ属、
シロネ属、ハッカ属、シソ属、イヌコウジュ属、スズコ
ウジュ属、ナギナタコウジュ属、シモバシラ属、テンニ
ンソウ属、ヤマハッカ属に分類される植物を例示するこ
とができる。

【００１１】本発明で用いることができる植物の例とし
て、青チリメンシソ、赤チリメンシソ、カゴソウ、カッ
ソウ、カキドオシ、キランソウ、ウツボグサ、ハッカ
（メグサ）、メハジキ、エゴマ、カタメンジソ、ナギナ
タコウジュ、ヒキオコシ（エンメイソウ）、コガネバナ
（コガネヤナギ）、セージ（サルビア）、タイム（タチ
ジャコウソウ）、バジル（メボウキ）、ミント、ラベン
ダー、オレガノ（ハナハッカ）、サボリー、レモンバー
ム（セイヨウヤマハッカ）、ローズマリー（マンネンロ
ウ）、キャットニップ（イヌハッカ）、ヒソップ（ヤナ
ギハッカ）およびベルガモット（ヤグルマカッコウ）を
挙げることができる。

【００１２】本発明の製造方法では、これらの植物原料
の葉、茎、種子などを使用することができる。中でも、
大量に入手しやすく活性物質が比較的豊富に含まれてい
る葉を使用するのが好ましい。本発明では、これらの植
物原料を、生のまま使用してもよいし、乾燥して使用し
てもよい。保存性に優れている点を考慮すれば、乾燥し
たものを原料とする方が便利である。これらの植物原料
は、１種類の原料を単独で使用してもよいし、２種以上
の原料を組み合わせて使用してもよい。

【００１３】本発明の製造方法において行なう植物原料
の抽出工程は、周知の方法のいずれかに基づいて行なう
ことができる。抽出の際に用いる溶媒は、水性溶媒の中
から選択する。通常は、蒸留水や水道水を用いるが、水
に少量の無機物や有機物が混入している溶媒も広く使用
することができる。水の温度は特に制限されないが、室
温〜沸騰温度の範囲内にあるものを用いるのが一般的で
ある。抽出効率を上げるためには、ある程度温度が高い
水を用いるのが好ましい。抽出時間はとくに制限されな
い。

【００１４】抽出の際には、植物原料をそのまま水と接
触させてもよいが、効率よく抽出するためには植物原料
に切れ目を入れたり細断したり、あるいは粉末化したり
しておくのが好ましい。これらの処理は、水抽出前にあ
らかじめ行なっておいてもよいし、水抽出中に並行して
行なってもよい。また、植物原料を絞ったり圧縮したり
する工程を入れることによって、さらに抽出効率を上げ
ることもできる。これらの工程の詳細は、使用すること
ができる植物原料の量や、製造しようとしている抗ＨＩ
Ｖ活性物質の量などに応じて、適宜決定すればよい。

【００１５】このようにして得られた抽出成分は、その
まま次のＤＥＡＥ陰イオン交換クロマトグラフィーによ
る精製工程に付してもよいが、その前に構成成分を粗く
分離しておくのが好ましい。例えば、適当なフィルター
を用いて濾過したり、遠心分離したりすることによっ
て、細かい固体成分を簡単に除去することができ、次の
クトマトグラフィーを行なう際にカラムが詰まるなどの
トラブルを防止することができる。

【００１６】また、沈殿剤を用いて沈殿を形成させ、そ
の沈殿物から水溶性成分を溶出させることによって分離
を行なうこともできる。沈殿剤としては、例えばセチル
ピリジニウムクロライドを用いることができる。形成し
た沈殿物に添加する溶媒は、水性溶媒であればその種類
は問わない。水性溶媒は、植物原料抽出時に用いた水性
溶媒と同じであっても異なっていてもよい。

【００１７】これらの工程を経ることによって得られた
組成物は、ＤＥＡＥ陰イオン交換クロマトグラフィーに
よる精製工程に付する。本発明の製造方法において使用
するＤＥＡＥ陰イオン交換クロマトグラフィーの充填剤
は、ジエチルアミノエチル基を有する多様な陰イオン交
換体の中から選択する。クロマトグラフィーの具体的な
実施方法は、当業者に周知な方法のいずれかによる。

【００１８】ＤＥＡＥ陰イオン交換クロマトグラフィー
において、溶出液として塩化ナトリウム水溶液を用いた
場合に溶出される画分には、極めて高い抗ＨＩＶ活性が
認められることが、本発明者らによって初めて見出され
た。溶出液として用いる塩化ナトリウム水溶液の濃度は
とくに制限されないが、０．５〜２Ｍ程度、特に１Ｍ程
度であるものを用いるのが好ましい。

【００１９】この画分から溶媒を除去することによって
得られる抗ＨＩＶ活性物質は、糖及びアミノ酸を構成要
素として含んでおり、分子量は約１０，０００〜約５
０，０００である。この画分の中には、分子量約１３，
５００の抗ＨＩＶ活性物質（実施例１の抽出物Ａ）が含
まれている。この抗ＨＩＶ活性物質は、後述する実施例
１の表１に示すように、この抗ＨＩＶ活性物質には、ア
ミノ酸として、グリシン、アラニン、グルタミン酸また
はグルタミンが比較的多く含まれている。また、その他
のアミノ酸として、バリン、アスパラギン酸またはアス
パラギン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニ
ン、プロリン、アルギニン、リジン、フェニルアラニ
ン、チロシン、ヒスチジ、シスチンが含まれている。

【００２０】この抗ＨＩＶ活性物質は、水およびメタノ
ールに容易に溶解し、酢酸エチルおよびｎ−ブタノール
に溶解しない。また、ＤＥＡＥ陽イオン交換樹脂に吸着
することから、酸性物質であることがうかがえる。さら
に、カルバゾール−硫酸法による試験が陽性であったこ
とから、ウロン酸が含まれているものと推定される。

【００２１】ＤＥＡＥ陰イオン交換クロマトグラフィー
において、溶出液としてアセトン／水混合溶液を用いた
場合に溶出される画分にも、抗ＨＩＶ活性がある。この
画分は、上記の塩化ナトリウム水溶液による溶出を行な
った後に取得するのが好ましい。使用する混合溶液にお
けるアセトンと水の比率は適宜調節することが可能であ
り、例えばアセトンと水を１：１で混合したものを用い
ることができる。この比率は適宜変化させながら溶出し
てもよい。

【００２２】この画分から溶媒を除去することによって
得られる抗ＨＩＶ活性物質（実施例１の抽出物Ｂ）は、
ポリクラールＡＴによって沈殿を生成することから、ポ
リフェノール類であるものと考えられる。また、ＴＬＣ
にスポットし、ＦｅＣｌ₃／Ｋ₃Ｆｅ（ＣＮ）₆溶液を噴
霧すると青色を呈したことから、フェノール官能基の存
在が確認された。分子量は、５００〜１００，０００の
範囲内、特に１０，０００〜１００，０００の範囲内に
ある。この抗ＨＩＶ活性物質は、わずかに水に溶解し、
酢酸エチルおよびｎ−ブタノールに溶解しない。また、
ＤＥＡＥ陽イオン交換樹脂に吸着することから、酸性物
質であることがうかがえる。

【００２３】ＤＥＡＥ陰イオン交換クロマトグラフィー
において、溶出液としてアセトン／塩酸混合溶液を用い
た場合に溶出される画分にも、抗ＨＩＶ活性がある。こ
の画分は、上記の塩化ナトリウム水溶液による溶出と、
上記のアセトン／水混合溶液による溶出を行なった後に
取得するのが好ましい。使用する混合溶液におけるアセ
トンと塩酸の比率は適宜調節することが可能であり、例
えば０．１Ｎ塩酸とアセトンを１：１で混合したものを
用いることができる。この比率は適宜変化させながら溶
出してもよい。

【００２４】この画分から溶媒を除去した抗ＨＩＶ活性
物質（実施例１の抽出物Ｃ）は、ポリクラールＡＴによ
って沈殿を生成することから、ポリフェノール類である
ものと考えられる。また、ＴＬＣにスポットし、ＦｅＣ
ｌ₃／Ｋ₃Ｆｅ（ＣＮ）₆溶液を噴霧すると青色を呈した
ことから、フェノール官能基の存在が確認された。分子
量は、５００〜１００，０００の範囲内、特に１０，０
００〜１００，０００の範囲内にある。この抗ＨＩＶ活
性物質は、わずかに水に溶解し、酢酸エチルおよびｎ−
ブタノールに溶解しない。また、ＤＥＡＥ陽イオン交換
樹脂に吸着することから、酸性物質であることがうかが
える。

【００２５】本発明の製造方法によって取得した抗ＨＩ
Ｖ活性物質は、そのまま抗ＨＩＶ活性成分として使用す
ることもできるが、さらに精製して使用してもよい。と
くにヒアルロニダーゼ固定化担体を利用したアフィニテ
ィクロマトグラフィーを行なえば、さらに効率よく精製
することができる。たとえば、塩化ナトリウム水溶液に
よって溶出される上記抗ＨＩＶ活性物質は、さらに以下
の方法によって精製することができる。

【００２６】すなわち、抗ＨＩＶ活性物質をメタノール
／水混合溶液に溶解し、得られた溶液に対してシリカゲ
ルクロマトグラフィーを行なう。このとき、メタノール
／水混合溶液で溶出する画分を取得することによって精
製物を得ることができる（実施例２の精製物ａ）。使用
する混合溶液のメタノールと水の混合比率は適宜調節す
ることが可能であり、例えばメタノールと水を１：１で
混合したものを用いることができる。

【００２７】また、このようにして得られた精製物を、
さらにトヨパールＨＷやセルロファインＧＣ−７００な
どの多孔性セルロースゲルをゲル濾過用担体として用い
たゲル濾過カラムクロマトグラフィーによって精製する
ことができる。このとき、溶出液として例えば０．０１
％の３−〔（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモ
ニオール〕−１−プロパンスルフォネート（ＣＨＡＰ
Ｓ）水溶液を用いた場合に溶出する画分を取得すること
によって精製物を得ることができる（実施例２の精製物
ｂ）。溶出液としては、この他にＴｗｅｅｎ１００など
の界面活性剤を用いることもできる。

【００２８】さらに、このようにして得られた精製物
を、さらにヒアルロニダーゼ固定化担体を用いてアフィ
ニティークロマトグラフィーを行なうことによって精製
することができる。ヒアルロニダーゼを固定化する担体
は、当業界で通常使用されているものの中から適宜選択
することができる。たとえば、ＡＦ−トレシルトヨパー
ルなどを使用することができる。溶出画分を取得する際
の溶出液には、塩化ナトリウムを溶解したトリス塩酸緩
衝液を使用することができる。このとき、塩化ナトリウ
ム濃度は例えば０．５Ｍに設定し、溶出液のｐＨは約８
に設定することができる。このようにして得られた精製
物（実施例２の精製物ｃ）は褐色固体であり、図１に示
す紫外線吸収スペクトルと図２に示す赤外線吸収スペク
トルを有する。

【００２９】本発明の抗ＨＩＶ活性物質の製造方法に
は、上記工程の他にさらに通常用いられている精製方法
を組み合わせて使用することができる。例えば、合成吸
着樹脂、活性炭、上記以外のイオン交換樹脂、セファデ
ックス、バイオゲルなどのゲル濾過剤、上記以外の充填
剤によるカラムクロマトグラフィーを適宜組み合わせる
ことによって、さらに精製効率や純度を上げることがで
きる。

【００３０】これらの方法によって得られる物質は、い
ずれも強力な抗ＨＩＶ活性を有するとともに、細胞毒性
が低いという極めて望ましい特徴を有する。例えば、上
記のＤＥＡＥ陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに
おいて塩化ナトリウム水溶液で溶出される物質は、抗Ｈ
ＩＶ剤の活性成分として使用されているデキストラン硫
酸と同等な抗ＨＩＶ活性を有する。その一方で、細胞毒
性はアジドチミジンの１／５００程度であり、安全性は
極めて高い。このように、本発明の抗ＨＩＶ活性物質
は、抗ＨＩＶ活性が強力な物質は細胞毒性も高いという
従来のジレンマを解消した極めて有用な物質である。

【００３１】したがって、本発明の抗ＨＩＶ活性物質は
医薬品や食品に安全かつ有効に使用することができる。
本発明には、このような本発明の抗ＨＩＶ活性物質を含
む抗ＨＩＶ剤および抗ＨＩＶ機能性食品も含まれる。使
用する抗ＨＩＶ活性物質は、１種類を単独で使用しても
よいし、２種以上のものを組み合わせて使用してもよ
い。

【００３２】本発明の抗ＨＩＶ剤は、ＨＩＶへの感染や
発症を予防し、治療する際に有用である。本発明の抗Ｈ
ＩＶ剤の投与形態は特に制限されず、経口的または非経
口的に投与することが可能である。例えば、直腸投与、
鼻内投与、頬側投与、舌下投与、膣内投与、筋肉内投
与、皮下投与、静脈内投与を行なうことが可能である。
中でも、本発明の抗ＨＩＶ剤は、経口投与、皮下投与ま
たは経皮投与するのが好ましい。

【００３３】また、本発明の抗ＨＩＶ剤の剤型も特に制
限されず、投与経路等に応じて適宜選択することができ
る。例えば、経口投与に適した製剤として、錠剤、カプ
セル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤など
を挙げることができ、非経口投与に適した製剤として、
注射剤、点滴剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、経粘膜吸
収剤、貼付剤などを挙げることができる。注射剤は、静
脈注射、筋肉注射、皮下注射、点滴などのいずれに用い
るものであってもよい。本発明の医薬は、特に経口用製
剤、注射剤、貼付剤のいずれかであるのが好ましい。

【００３４】本発明の抗ＨＩＶ剤には、必要に応じて薬
理学的および製剤学的に許容しうる添加物を添加するこ
とができる。例えば、賦形剤、崩壊剤または崩壊補助
剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、
基剤、溶解剤または溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調節
剤、安定化剤、噴射剤、粘着剤、湿潤剤などを使用する
ことができる。これらの添加剤を適宜組み合わせて使用
することによって、本発明の抗ＨＩＶ剤にさまざまな付
加的機能を持たせることができる。例えば、必要に応じ
て抗ＨＩＶ活性物質が徐放されるように設計することが
できる。また、体内の必要な個所において抗ＨＩＶ活性
物質が集中的に放出されるように設計することもでき
る。このような徐放性製剤やドラッグデリバリーシステ
ムは、製剤業界において周知の方法にしたがって設計の
うえ製造することができる。

【００３５】また、本発明の抗ＨＩＶ剤には、有機物ま
たは無機物の担体を使用することができる。そのような
担体として、乳糖、でんぷん、植物性および動物性脂肪
や油脂を例示することができる。本発明の抗ＨＩＶ剤に
は、抗ＨＩＶ活性物質を０．０１〜１００重量％の範囲
内で使用することができる。さらに、本発明の抗ＨＩＶ
剤には、本発明の抗ＨＩＶ活性物質以外の抗ＨＩＶ活性
物質を組み合わせて使用することもできる。

【００３６】本発明の抗ＨＩＶ剤の投与量は、治療また
は予防の目的、患者の性別、体重、年齢、疾患の種類や
程度、剤型、投与経路、投与回数などの種々の条件に応
じて適宜決定する。例えば、経口投与する場合には、
０．５μｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ体重／日で、一日一回から
数回に分けて投与することができるが、この範囲に限定
されるものではない。

【００３７】本発明の抗ＨＩＶ活性物質は、各種食品に
含ませることができる。例えば、紅茶、清涼飲料水、ジ
ュース、あめ、澱粉質食品、各種加工食品等に添加する
ことができる。抗ＨＩＶ活性物質の添加量は、約０．１
〜９９重量％の範囲内に設定することができる。また、
必要に応じて、ゲル化剤などの添加剤を加えることもで
きる。

【００３８】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明する。以下の実施例に示す材料、試薬、割合、操
作等は、本発明の精神から逸脱しない限り適宜変更する
ことができる。したがって、本発明の範囲は以下の実施
例に示す具体例に制限されるものではない。

【００３９】［実施例１］本実施例において、シソ葉か
ら抗ＨＩＶ活性物質を取得する方法を説明し、取得した
抗ＨＩＶ活性物質の抗ＨＩＶ活性および細胞毒性を試験
した結果を記載する。

【００４０】（抗ＨＩＶ活性抽出物の調製）乾燥したシ
ソ葉（種類：青チリメンシソ）１００ｇに水１リットル
を加え、１５分間煮沸した。その後、熱水抽出液を冷却
し、減圧下で吸引濾過することによって、固体成分を除
去した。得られた水溶液５００ｍｌにセチルピリジニウ
ムクロライドを添加して、３０℃で１２時間放置するこ
とによって沈澱を生成させた。生成した沈澱物をエタノ
ール／水混合溶液（１５：８５）１００ｍｌで洗浄し、
１０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離することによっ
て試薬を除去した。その後、沈澱物に５０ｍｌの水を添
加して、水溶性成分を溶出させた。

【００４１】得られた溶出液を、５０ｍＭホウ酸緩衝液
（ｐＨ７．４）で平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａ
ｒｌカラム（東ソー株式会社製）に充填し、ホウ酸緩衝
液（ｐＨ７．４）で洗浄した後、溶出液として１Ｍ塩化
ナトリウム水溶液、０．１Ｎ塩酸、アセトン／水混合溶
液（１：１）、アセトン／０．１Ｎ塩酸混合溶液（１：
１）により順次溶出した。各溶出液で溶出された画分の
溶媒を減圧乾固することによって、抽出物を得た。１Ｍ
塩化ナトリウム水溶液で溶出された抽出物を抽出物Ａ、
アセトン／水混合溶液（１：１）で溶出された抽出物を
抽出物Ｂ、アセトン／０．１Ｎ塩酸混合溶液（１：１）
で溶出された抽出物を抽出物Ｃとした。

【００４２】（分子量の測定）抽出物Ａ、抽出物Ｂおよ
び抽出物Ｃの分子量を、限外濾過膜法および還元法によ
って測定した。限外濾過膜法（アミコン社製セントリプ
レップ）により分子量を測定したところ、抽出物Ａ、抽
出物Ｂおよび抽出物Ｃはすべて分子量１００，０００の
フィルターを通過したが、分子量１０，０００のフィル
ターは通過しなかった。したがって、抽出物Ａ、抽出物
Ｂおよび抽出物Ｃの分子量はいずれも１０，０００〜１
００，０００の範囲内であることが確認された。

【００４３】さらに、抽出物Ａについて、ポリアクリル
アミドゲルによる電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＡ）によ
って分子量を測定した。すなわち、抽出物Ａを９５℃で
５分間熱処理することによって変性させ、バッファー
（０．０６Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）、１．７
１％ＳＤＳ、６％グリセロール、０．１Ｍジチオスライ
トール、０．００２％ブロモフェノールブルー）を用い
て５ｍＡで６０分間通電した後、８〜１０ｍＡで１５０
分間電気泳動した。このとき、標準分子量の蛋白質マー
カーを同時に電気泳動させた。電気泳動後は、銀染色に
より蛋白質を染色し、ＰＡＳ染色により多糖類を染色し
た。分子量約１３，５００に単一のバンドが観察された
ことから、抽出物Ａの分子量は約１３，５００であるこ
とが確認された。

【００４４】（溶解性試験）抽出物Ａ、抽出物Ｂおよび
抽出物Ｃの溶解性を試験したところ、抽出物Ａは容易に
水およびエタノールに溶解し、抽出物ＢおよびＣはわず
かに水に溶解することが確認された。また、抽出物Ａ、
抽出物Ｂおよび抽出物Ｃは、いずれも酢酸エチルおよび
ｎ−ブタノールで抽出されなかった。

【００４５】（吸着性試験）抽出物Ａ、抽出物Ｂおよび
抽出物Ｃの吸着性を試験したところ、いずれもＤＥＡＥ
陰イオン交換カラムに吸着し、カルボキシメチルセルロ
ース陽イオン交換樹脂に吸着した。したがって、抽出物
Ａ、抽出物Ｂおよび抽出物Ｃは酸性物質であることが確
認された。

【００４６】（呈色反応試験）抽出物Ａについて、フェ
ノール硫酸法による呈色反応試験を行なったところ陽性
であったことから、抽出物質Ａには糖が含まれているこ
とが確認された。さらに、抽出物Ａについて、カルバゾ
ール−硫酸法による試験を行なったところ陽性であった
ことから、抽出物Ａにはウロン酸が含まれていることが
推定された。

【００４７】（フェノール官能基確認試験）抽出物Ｂお
よびＣをＴＬＣにスポットし、ＦｅＣｌ₃／Ｋ₃Ｆｅ（Ｃ
Ｎ）₆溶液を噴霧するといずれも青色を呈した。したが
って、抽出物ＢおよびＣにはフェノール官能基が存在す
ることが確認された。

【００４８】（ポリクラールＡＴによる試験）抽出物Ｂ
および抽出物ＣをポリクラールＡＴで処理したところ、
沈澱が生成した。上記各性質を考慮すると、抽出物Ｂお
よび抽出物Ｃはポリフェノール類であると推定される。

【００４９】（アミノ酸分析試験）抽出物Ａを６Ｎ塩酸
を用いて１１０℃で２４時間加水分解した後、アミノ酸
分析した結果を以下の表に示した。分析結果は、アラニ
ンを１重量部とした相対値で示した。なお、本分析では
トリプトファンを検出することはできない。

【００５０】

【表１】

【００５１】（糖組成分析試験）抽出物Ａを２Ｎ塩酸を
用いて１００℃で４時間加水分解した後、糖組成分析を
行なった結果を以下の表に示した。分析結果は、ガラク
トースを１重量部とした相対値で示した。

【００５２】

【表２】

【００５３】〔実施例２〕本実施例において、実施例１
で調製した抽出物Ａをさらに３段階精製する方法を記載
する。（精製工程１）抽出物Ａをセントリプレップ（アミコン
社製）で濃縮した後、メタノール／水混合溶液（１：
１）を等量添加して溶解した。得られた溶液に対して、
メタノール／水混合溶液（１：１）を展開液とするシリ
カゲルカラムクロマトグラフィーを行なった。溶出液を
減圧下で濃縮し、精製物ａを得た。

【００５４】（精製工程２）精製物ａに対して、セルロ
ファインＧＣ−７００（チッソ株式会社製）を用いたゲ
ル濾過カラムクロマトグラフィーを行った。０．０１％
の３−〔（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニ
オール〕−１−プロパンスルフォネート（ＣＨＡＰＳ）
水溶液で溶出し、溶出液を減圧下で濃縮することによっ
て精製物ｂを得た。

【００５５】（精製工程３）精製物ｂに対してアフィニ
ティークロマトグラフィーを行なった。このアフィニテ
ィークロマトグラフィーに用いた担体は次のようにして
製造した。ＡＦ−トレシルトヨパール〔親水性ビニルポ
リマーを基材としたゲル濾過用充填剤であるトヨパール
ＨＷ６５（商品名、東ソー株式会社製）にトレシンクロ
ライドを導入した活性担体〕２ｇを、混合水溶液（炭酸
水素ナトリウム０．１Ｍ、塩化ナトリウム０．５Ｍ含
有、ｐＨ７．８）２０ｍｌに懸濁し、同じ混合水溶液で
洗浄した。その後、ヒアルロニターゼ１９４ｍｇを前記
混合水溶液５ｍｌに溶解した溶液を添加して、４℃で２
４時間穏やかに震盪した。次いで、０．５Ｍ塩化ナトリ
ウム水溶液１００ｍｌで１回洗浄し、さらに０．１Ｍト
リス塩酸緩衝液（塩化ナトリウム０．５Ｍ含有、ｐＨ
８．０）で２回洗浄した。その後、前記混合水溶液４０
ｍｌを添加して４℃で４時間穏やかに震盪することによ
って、ヒアルロニダーゼ固定化−トレシルトヨパール担
体を製造した。

【００５６】得られたヒアルロニダーゼ固定化−トレシ
ルトヨパール担体を、０．１Ｍ酢酸緩衝液（塩化ナトリ
ウム０．１Ｍ含有、ｐＨ４．０）で緩衝化した。その
後、この固定化担体に精製物ｂを添加し、次いで前記酢
酸緩衝液で洗浄した後、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（塩
化ナトリウム０．５Ｍ含有、ｐＨ８．０）で溶出するこ
とによってアフィニティークロマトグラフィーを行なっ
た。得られた溶出物を水に対して十分に透析した後、エ
バポレータを用いて減圧下で濃縮乾固することによっ
て、褐色の精製物ｃを得た。〔α〕_D＝−０．４（ｃ＝０．２５，Ｈ₂Ｏ）精製物ｃの紫外線吸収スペクトルおよび赤外線吸収スペ
クトルは、それぞれ図１および図２に示すとおりであっ
た。

【００５７】［実施例３］本実施例において、注射剤の
製造例を示す。以下に示す量の抽出物Ａ、塩化ナトリウ
ムおよびベンジルアルコールを蒸留水に溶解した。この
溶液をフィルター（孔径０．２μｍ）を通して濾過する
ことによって、注射剤を製造した。また、抽出物Ａの代
わりに、実施例１で調製した抽出物ＢおよびＣ、実施例
２で調製した精製物ａ〜ｃを使用して同様に注射剤を製
造した。

【００５８】

【表３】

【００５９】［実施例４］本実施例において、カプセル
剤の製造例を示す。以下に示す各成分を以下に示す量で
混合して、十分に攪拌した。この混合物をゼラチンカプ
セルに充填することによってカプセル剤を製造した。ま
た、抽出物Ａの代わりに、実施例１で調製した抽出物Ｂ
およびＣ、実施例２で調製した精製物ａ〜ｃを使用して
同様にカプセル剤を製造した。

【００６０】

【表４】

【００６１】［実施例５］本実施例において、抗ＨＩＶ
活性物質を含むティーパックの製造例を示す。市販の紅
茶葉を粉砕して６等分した。これらの粉砕紅茶葉に実施
例１で得られた抽出物Ａ、ＢおよびＣ、および実施例２
で得られた精製物ａ、ｂおよびｃを、３重量％になるよ
うに添加してよく混合した。これらの各混合物をティー
パックに詰めて６種類のティーパックを製造した。この
ティーパックを熱湯で滲出することによって、抗ＨＩＶ
活性物質が紅茶に溶出した抗ＨＩＶ機能性紅茶を調製す
ることができた。抽出物Ａの代わりに実施例１で得られ
た抽出物ＢおよびＣ、および実施例２で得られた精製物
ａ〜ｃを用いて、同様にディーバックと紅茶を調製し
た。

【００６２】〔実施例６〕本実施例において、抗ＨＩＶ
活性物質を含むオレンジジュースの製造例を示す。市販
のオレンジジュース１Ｋｇを３つ用意した。各々のオレ
ンジジュースに対して実施例１で得られた抽出物Ａ、Ｂ
およびＣ、および実施例２で得られた精製物ａ、ｂおよ
びｃを、３重量％になるよう添加してよく混合し、抗Ｈ
ＩＶ活性物質を含む６種のオレンジジュースを製造し
た。

【００６３】［試験例］本試験例において、実施例１で
得られた抽出物Ａ〜Ｃ、および実施例２で得られた精製
物ａ〜ｃの抗ＨＩＶ活性および細胞毒性を試験した結果
を記載する。

【００６４】（試験方法）ＭＴ−４細胞にＨＩＶ−１
（ＬＡＶ−１株）を０．００１ＴＣＩＤ₅₀／個の割合で
１時間感染させ、その後、ＲＰＭＩ−１６４０培養液
（１０％ウシ胎児血清、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ス
トレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ含有）を用いて１回
洗浄した。このＨＩＶ−１感染ＭＴ−４細胞を、抽出物
Ａを含むＲＰＭＩ−１６４０培養液に１×１０⁵個／ｍ
ｌの濃度で浮遊させ、５日間培養した。培養は、９６穴
の平底培養プレートにて行ない、１ウェルあたり２００
μｌの量で培養した。培養液中の抽出物Ａの濃度は、最
大値を１０００μｇ／ｍｌに設定し、１／２ずつ段階希
釈したものを用意して検討を行なった。

【００６５】５日間培養した後、ＨＩＶ感染によるバル
ーニングや巨核細胞出現などのＭＴ−４細胞変性効果
（ＣＰＥ）を顕微鏡により観察した。ＣＰＥが認められ
た場合は、ＨＩＶ増殖抑制効果なしと判定した。この判
定基準にしたがって、ＨＩＶ増殖抑制効果が認められる
最小試料濃度を決定した（ＨＩＶに対する最小増殖抑制
濃度）。また、上記の方法と同様にしてＭＴ−４細胞に
対する細胞毒性の有無も検討した。細胞観察の結果、細
胞生育障害または細胞死が認められた場合は、ＭＴ−４
細胞に対する細胞毒性ありと判定した。この判定基準に
したがって、細胞毒性が認められる最小試料濃度を決定
した（ＭＴ−４細胞に対する最小細胞障害濃度）。比較
のために、アジドチミジンとデキストラン硫酸について
も同じ試験を行なった。

【００６６】（試験結果）試験結果は、以下の表に示す
とおりであった。

【表５】

【００６７】抽出物ＢおよびＣ、精製物ａ〜ｃについて
も上記と同じ試験を行なったところ、有意なＨＩＶ増殖
抑制効果が認められ、ＭＴ−４細胞に対する毒性も小さ
いことが確認された。

【００６８】抽出物Ａ〜Ｃは１００℃で３０分間熱処理
しても安定であり、この熱処理後も抗ＨＩＶ活性が確認
された。また、抽出物Ａ〜Ｃは３０℃においてトリプシ
ンを１５分間作用させても安定であり、同様に抗ＨＩＶ
活性が確認された。

【００６９】また、ＩＣＲマウスを用いて抽出物Ａ、抽
出物Ｃおよび精製物ｃのＬＤ₅₀を検討したところ、いず
れも２ｇ／Ｋｇ以上であることが確認された。

【００７０】

【発明の効果】本発明の抗ＨＩＶ活性物質は、優れた抗
ＨＩＶを示す一方で低毒性であるという特徴を有する。
このため、本発明の抗ＨＩＶ活性物質は、抗ＨＩＶ剤や
抗ＨＩＶ機能性食品などの活性物質として広く使用する
ことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例２において調製した精製物ｃの紫外線吸
収スペクトルである。

【図２】実施例２において調製した精製物ｃの赤外線吸
収スペクトルである。

フロントページの続き (72)発明者岡修一茨城県つくば市東１丁目１番３工業技術院生命工学工業技術研究所内 (72)発明者山崎幸苗茨城県つくば市東１丁目１番３工業技術院生命工学工業技術研究所内 (72)発明者冨塚登茨城県つくば市東１丁目１番３工業技術院生命工学工業技術研究所内 (72)発明者井上真美茨城県牛久市岡見町960−144 (72)発明者山本幸織茨城県稲敷郡江戸崎町蒲ヶ山６−５ (72)発明者藤田康子茨城県つくば市千現１−５−５片桐ハイツ102 (72)発明者大竹徹奈良県奈良市西大寺野神町１−６−31− 103 (72)発明者川畑拓也大阪府堺市百舌鳥夕雲町２−210 (72)発明者福森保則北海道札幌市中央区北４条西１丁目３番地ホクレン農業協同組合連合会内審査官鶴見秀紀 (56)参考文献特開平９−20672（ＪＰ，Ａ) ＡｎｔｉｖｉｒａｌＲｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．11，ｎｏ．５−６，ｐ263 −273，1989 ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮａｔｕｒａｌＰｒｏｄｕｃｔｓ，ｖｏｌ．56，ｎｏ．８，ｐ1426−1430，1993 ＣｈｅｍｉｃａｌＡｂｓｔｒａｃｔｓ，ｖｏｌ．126，ｎｏ．25，ｐ584, 1997，ａｂｓｔｒａｃｔｎｏ．329560 ｕ (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61K 35/78 A61P 31/18 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】シソ科に属する植物を水で抽出し、得ら
れた抽出物をＤＥＡＥ陰イオン交換クロマトグラフィー
によって精製し、塩化ナトリウム水溶液、アセトンと水
の混合溶液、またはアセトンと塩酸の混合溶液によって
溶出される画分を取得する工程を含むことを特徴とす
る、抗ＨＩＶ活性物質の製造方法。
【請求項２】請求項１の製造方法によって製造される
抗ＨＩＶ活性物質。
【請求項３】図１に示す紫外線吸収スペクトルを有
し、図２に示す赤外線吸収スペクトルを有する抗ＨＩＶ
活性物質。
【請求項４】シソ科に属する植物の水抽出物から得ら
れ、糖およびアミノ酸を含み、分子量が約１０，０００
〜５０，０００である抗ＨＩＶ活性物質。