JPH0351689B2

JPH0351689B2 -

Info

Publication number: JPH0351689B2
Application number: JP61219979A
Authority: JP
Inventors: Michitoku Kubo; Mari Nogami; Yoshio Matsuo; Masaoki Takahashi
Original assignee: KYORITSU YAKUHIN KOGYO KK
Current assignee: KYORITSU YAKUHIN KOGYO KK
Priority date: 1986-09-17
Filing date: 1986-09-17
Publication date: 1991-08-07
Also published as: JPS6372629A

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野本発明は、霊芝から糖蛋白結合体含有の生理活
性エキスを製造する方法、殊に、抗アレルギー性
作用を有する成分を効率的に取得する方法に関す
るものである。従来の技術霊芝（Ganoderma Lucidum）は、漢方医学に
おいて、古くから虚労、咳嗽、失眼などに応用さ
れて来た漢薬の一種である。近年霊芝に関する多
くの研究から、臨床的には、慢性気管支炎、狭心
症、高脂血症、高血圧症、神経衰弱による不眠
症、急性ウイルス性肝炎、網膜色素変性、自律神
経失調症、白血球減少の治療に一定の効果のある
ことが知られている。また霊芝は、抗アレルギー作用、マクロフアー
ジ活性化作用、抗腫瘍作用、血圧降下作用、血糖
降下作用、抗高脂血症作用、抗血栓症作用などの
薬理活性を有することが文献上報告されている。しかしながら、霊芝の有効成分については、多
糖体にマウスのSarcoma 180固型ガンに対する
延命効果があること［水野ら、日本農芸化学会
誌、58、871（1984）］、トリテルペンに属するガル
デノリツク酸類にラツトの肥満細胞からのヒスタ
ミン放出抑制作用があること［Kohda ら、
Chem.Pharm.Bull.，33，1367（1985）］が知られ
ているにすぎない。一方、臨床的、薬理的に多様な作用を示すとい
われる霊芝も、市場には多くの種類があり、実際
にはその形態、産地によつて臨床的、薬理的に異
なる効果を示すといわれており、臨床応用に当つ
ては、野生品、裁培品を問わず産地、形態を吟味
する必要性が喚起されている（近畿大学薬学部久
保研究室編、“霊芝”、三一書房、東京、1985年）。本発明者らは、すでに霊芝の品質を明確にする
ため実験的抗アレルギー作用を指標にした各地産
霊芝の薬効検定を実施した結果、奈良県山域で発
見し、裁培化に成功した霊芝の水抽出エキスに、
各種実験的アレルギーに対して強い抑制作用のあ
ることを見出しており、本発明者らはこれを「共
立１号霊芝」と名付けている。従つて、各地産霊芝の中から有効成分を効率的
に取り出すことができれば、気管炎喘息、アレル
ギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、ジンマ疹、薬剤
アレルギーなどの各種アレルギー疾患の治療剤と
しての利用が期待される。殊に、原料となる霊芝
として、本発明者らは見つけた上述の「共立１号
霊芝」を用いれば、実用化が可能になることとが
期待できる。霊芝から有効成分を抽出分離する方法として、
従来よく知られている熱水による抽出法のほか
に、次のような方法が提案されている。すなわち、特開昭60−34914号公報には、霊芝
の熱水抽出物をさらにアセトンなどの含酸素系溶
媒で抽出する方法が記載されている。また特開昭60−222423号公報には、霊芝の砕片
を熱水で抽出した後濃縮し、同じく霊芝の砕片を
エタノール水溶液を用いて抽出した後濃縮し、両
濃縮液を混合して粉末化する方法が記載されてい
る。発明が解決しようとする問題点しかしながら、霊芝の水抽出エキスには、抗ア
レルギー作用を示す物質以外に多くの不要夾雑物
が存在することから、各地産の霊芝を原料として
用いて水抽出を行つても満足できる結果は得られ
ず、たとえ本発明者らが見つけた上述の「共立１
号霊芝」を原料霊芝として用いても、なおアレル
ギー疾患治療剤として使用可能な実用レベルにま
では至らない。また、上述の特開昭60−34914号公報や特開昭
60−222423号公報に記載の抽出法によつても、抗
アレルギー作用を示す物質の濃縮分離という点で
は不満足な結果しか得られない。このように霊芝抽出物のアレルギー疾患治療剤
としての利用を考えた場合、より高純度に有効物
質を含有するエキスの製出が強く望まれる。本発明は、霊芝中の抗アレルギー作用を発現す
る有効物質の追究とそれを高純度に含有するエキ
スの効率的製法につき鋭意研究を進めた結果、到
達したものである。問題点を解決するための手段本願発明の霊芝から生理活性エキスを製造する
方法は霊芝（Ganoderma Lucidum）から糖蛋白結合
体含有の生理活性エキスを製造するにあたり、霊芝の子実体を水により抽出温度30〜80℃で抽
出する工程(A)、前工程(A)の抽出液を透析または限外濾過する工
程(B)、および、前工程(B)の内液をデキストラン、アガロースま
たはポリアクリルアミドから選ばれたゲル濾過剤
を担体として用いたカラムクロマトグラフイー
（GPC）に付して分子量15000〜20000の糖蛋白結
合体を分離するか、あるいは、前工程(B)の内液と
アルコール、ケトン、エステルまたはエーテル系
溶剤から選ばれた親水性有機溶剤とを、該親水性
有機溶剤の割合が内液と親水性有機溶剤の合計量
の40〜80v／ｖ％となるように混合し、、析出し
た沈澱を分離する工程(C) を実施することを特徴とするものである。本発明によれば、霊芝中の抗アレルギー作用を
発現する有効物質である糖蛋白結合体を高純度に
含有するエキスを簡便かつ収率よく得ることがで
きる。以下本発明を詳細に説明する。原料本発明において原料となる霊芝は、産地の相違
により所望する薬効も異なり、また裁培霊芝であ
つても裁培条件によつて有効物質の含有量が変動
し、結果的に得られるエキスの品質および収率が
一定しないなどの問題を生じることから、有効物
質の糖蛋白結合体を多量に含む高品質の霊芝を選
択する必要がある。従つて原料霊芝としては、各地産の種々の霊芝
が用いられるけれども、先に述べたように、本発
明者らが奈良県山域で採集した野生霊芝の菌種を
用いて、原木裁培法により裁培化し、量産化に成
功した品質安定型の霊芝（共立１号と命名）を原
料として用いることが特に望ましい。工程 (A) 工程(A)は、霊芝の子実体を水により抽出温度30
〜80℃で抽出する工程からなる。抽出に供する霊芝の乾燥子実体は、そのまま
で、あるいは直径２mm前後に刻んだ状態で、水抽
出処理に付する。抽出に用いる水と子実体の重量比は特に限定は
ないが、後の処理を考慮すると５：１〜10：１の
範囲から選ぶことが好ましい。抽出温度は30〜80℃、好ましくは40〜70℃に設
定されることが必要である。抽出温度が高すぎる
と有効成分である糖蛋白結合体組成中の蛋白質が
変性を受けて難溶性となり、収率が低下する。一
方抽出温度が低すぎると抽出効率が悪くなり、抽
出操作に余分な時間がかかつて生産性が悪くな
る。抽出には１〜３時間を要する。工程 (B) 工程(B)は、前工程(A)で得た抽出液を透析または
限外濾過する工程からなる。透析は通常行われる方法でよく、たとえばヴイ
スキングセルロースチユーブ20／32型（アメリ
カ、ヴイスキング社製）等の透析チユーブを用い
ることができる。限外濾過も通常行われる方法でよく、例えばダ
イフイルターＧ−OST（アメリカ、バイオエ
ンジニアリング社販売）等の限外濾過膜を用いる
ことができる。工程 (C) 工程(C)は、次のまたはのいずれかの工程か
らなる。前工程(B)の内液をデキストラン、アガロース
またはポリアクリルアミドから選ばれたゲル濾
過剤を担体として用いたカラムクロマトグラフ
イー（GPC）に付して分子量15000〜20000の
糖蛋白結合体を分離する工程。（以下、工程
（C1）という。）前工程(B)の内液とアルコール、ケトン、エス
テルまたはエーテル系溶剤から選ばれた親水性
有機溶剤とを、該親水性有機溶剤の割合が内液
と親水性有機溶剤の合計量の40〜80v／ｖ％と
なるように混合し、析出した沈澱を分離する工
程。（以下、工程（C2）という。）工程（C1）得られた内液から、有効成分である糖蛋白結合
体を高純度に含有する生理活性エキスを得るに
は、内液を凍結乾燥した後、上記特定のゲル濾過
剤を担体とするカラムクロマトグラフイーの方法
を用いればよい。ゲル濾過剤としては、たとえば、セフアデツク
スＧ−100〜Ｇ−200（スウエーデン、フアル
マシア社製、デキストラン系ゲル濾過剤）、セフ
アロース 2B〜6B（同社製、アガロース系ゲ
ル濾過剤）、バイオゲルＰ−30〜Ｐ−300（アメ
リカ、バイオラド、ラボラトリーズ社製、ポリア
クリルアミド系ゲル濾過剤）等があげられる。溶出のための溶媒としては、水が最も好まし
い。溶出液を常法通り凍結乾燥することにより該エ
キスを得ることができる。工程（C2）得られた内液から、有効成分である糖蛋白結合
体を高純度に含有する生理活性エキスを得るため
のもう一つの方法としては、内液と親水性有機溶
剤とを混合し、析出した沈澱を分離する方法があ
げられる。親水性有機溶剤としては、アルコール、ケト
ン、エステルまたはエーテル系溶剤から選ばれた
少なくとも１種の溶剤が用いられ、特にエタノー
ル、メタノール、アセトンなどが使用される。内液と親水性有機溶剤との混合割合は、後者の
割合が両者の合計量の40〜80v／ｖ％、好ましく
は45〜75v／ｖ％になるように選択する。このよ
うに混合割合を選ぶことにより、効率的に目的成
分が沈澱する。生じた沈澱を適当な溶剤、たとえばアセトンで
洗浄した後、減圧乾燥することにより、目的とす
るエキスを得ることができる。本工程（C2）による方法は、前述の工程（C1）
による方法に比し、エキス中の糖蛋白結合体含有
量は低いが、全体としての収率は高く、また大量
に処理にできるので、工業的にはより優れている
方法であるということができる。安全性本発明の方法により得られる糖蛋白結合体含有
生理活性エキスの安全性を試験すべく、ddy系マ
ウス（体重24〜25g、１群７匹）に実施例１によ
る生理活性エキスを１週間わたり経口投与して毒
性症状を観察した。その結果、LD₅₀値は1000
mg／Kg以上で、安全性が高いことが確認された。用途本発明の方法により得られる糖蛋白結合体含有
生理活性エキスは、すぐれた抗アレルギー作用を
有するので、抗アレルギー剤として特に有用であ
る。そのほか従来法のところで述べたような種々
の薬理活性も併せ有するので、他の薬剤としての
用途も期待できる。作用本発明者らは、上記本発明の方法によつて取得
される生理活性エキス中の抗アレルギー作用を発
現する有効物質が、分子量15000〜20000の糖と蛋
白質の結合体であることを見い出している。このものが糖と蛋白質の結合体であることは、
糖蛋白結合体を含むエキスをDEAE−セルロース
カラムクロマトグラフイー処理して糖と蛋白質を
分離させることにより、抗アレルギー作用が消失
してしまうことから確認された。本発明の方法により得られる糖蛋白結合体含有
生理活性エキスの生理活性については、実施例の
後に詳述する。実施例実施例１霊芝の乾燥子実体１Kgを粉砕機（ハンマークラ
ツシヤー：ホウライ鉄工）で粗砕し、水７中、
60℃で時々撹拌しながら２時間抽出した後、吸引
濾過し、濾液を第１抽出液とした。濾過残渣を60
℃の温水４で時々撹拌しながら１時間抽出した
後、吸引濾過し、濾液を第２抽出液とした。第１、第２抽出液を合し、液量が約７になる
まで減圧濃縮した。この濃縮液をヴイスキングセ
ルースチユーブ（20／32型）に入れ、流水下に２
昼夜透析した後、透析チユーブ内の液を集め、こ
れを遠心分離して上澄液と沈澱を分けた。この上
澄液を噴霧乾繰し、粗エキス70gを得た。この粗エキス1gを水５mlに溶かし、これをセ
フアデツクスG100デキストラン系ゲル濾過剤を
充填したカラム（φ3.6×50cm）に添加し、水1000
mlで溶出し、３mlずつ分画し、50番から100番ま
での区分を合せて凍結乾燥し、以上の操作を数回
くり返して褐色の生理活性エキス粉末50gを得
た。この生理活性エキス粉末の組成は下記のとおり
であり、有効物質の糖蛋白結合体を比較的高率に
含有するものであつた。総蛋白質 56.2％糖分 35.3％脂肪０％繊維 0.1％灰分 0.2％水分 4.2％また、本エキス中の糖蛋白結合体を構成する蛋
白質部分のアミノ酸組成は次のとおりであつた。アスパラギン酸 2.50％スレオニン 1.40％セリン 1.35％グルタミン酸 2.20％プロリン 0.95％グリシン 1.42％アラニン 1.10％シスチン０％バリン 0.87％メチオニン０％イソロイシン 0.60％ロイシン 0.80％チロシン 0.35％フエニルアラニン 0.63％リジン 0.80％ヒスチジン 0.50％アルギニン 0.90％トリプトフアン 0.50％実施例２霊芝の乾燥子実体500gを水５中に、60℃で
時々撹拌しながら３時間放置した後、加圧濾過
し、濾液を第１抽出液とした。この濾過残渣を60
℃の温水５で時々撹拌しながら１時間放置した
後、加圧濾過し、濾液を第２抽出液とした。第１、第２抽出液を合し、液量が３になるま
で減圧濃縮した。この濃縮液をヴイスキングセル
ロースチユーブ（20／32型）に入れ、流水下に２
昼夜透析した後、透析チユーブ内の液を集め、こ
れを遠心分離して上澄液と沈澱を分けた。この上澄液を99％エタノール５中に常法で激
しく撹拌しながら10分間かけて除々に加え、その
まま30分間撹拌を続けた後、生じた沈澱を減圧濾
過により濾取し、この沈澱を99％アルコールで洗
浄し、80℃以下で減圧乾燥して褐色の生理活性エ
キス粉末1.5gを得た。この生理活性エキス粉末の組成は下記のとおり
であり、有効物質の糖蛋白結合体を比較的高率に
含有するものであつた。総蛋白質 56.5％糖分 36.3％脂肪０％繊維０％灰分 0.1％水分 3.9％また、本エキス中の糖蛋白結合体を構成する蛋
白質部分のアミノ酸組成は次のとおりであつた。アスパラギン酸 2.20％スレオニン 1.30％セリン 1.31％グルタミン酸 2.15％プロリン 0.85％グリシン 1.31％アラニン 1.03％シスチン０％バリン 0.84％メチオニン０％イソロイシン 0.55％ロイシン 0.77％チロシン 0.34％フエニルアラニン 0.58％リジン 0.75％ヒスチジン 0.40％アルギニン 0.73％トリプトフアン 0.33％試験例実施例１で得られた糖蛋白結合体含有生理活性
エキスにつき、その生理活性（抗アレルギー作用
など）と安全性の確認の試験を行つた。（なお実
施例２のエキスもほぼ同様の結果が得られる。） (1) ラツト腹腔肥満細胞からのヒスタミン遊離抑
制作用 Uvnasらの方法［Exp.Cell.Res.，18，512
（1959）］に準じて分離調製したラツト腹腔肥満細
胞を、フオスフエートバツフアー生理液（PBS）
に2.9×10⁶Cells／mlとなるように遊離させ、被検
物質およびヒスタミン遊離物質［Compound
48／80あるいは卵白アルブミン液（EWA）］とと
もに37℃、10分間インキユベートした後、PBS
中および細胞中のヒスタミン含量をShoreらの方
法［J.Pharmacol.Exp.Ther.，124，182（1959）］
に準じて蛍光法で測定した。ヒスタミン遊離率は細胞の総ヒスタミン量に対
するPBS中のヒスタミン含量の百分率として算
出し、次式により被検体中のヒスタミン遊離抑制
率を求めた。遊離抑制率（％）＝（１−Ａ−Ｃ／Ｂ−Ｃ）×100 Ａ：被検体存在下のヒスタミン遊離率Ｂ：被検体非存在下のヒスタミン遊離率Ｃ：自発遊離率なお対照薬として、ダイソデユウムクロモグ
ライケート（DSCG）を用いた。結果を第１表に示す。

【表】第１表から明らかなように、本発明の方法によ
り得られる生理活性エキスは、ラツト腹腔肥満細
胞からのヒスタミン遊離抑制作用を有する。 (2) モルモツト受身皮膚アナフラキシー反応に対
する効果 Hartley系雄性モルモツト（体重250〜300g）
の背部皮内に、江田らの方法［アレルギー、22，
640（1973）］で調整した抗EWA家兎血清を注射
し、感作した。４時間後EWA2mgを含む１％エヴ
アンスブルー溶液を静脈内投与し、30分後に背部
皮膚の青染部の漏出色素量を、Katayamaらの方
法［Microbiol.Immunol.，22，89（1978）］に準
じて測定した。なお、被検体はEWA静注の１時間前に経口投
与した。結果を第２表に示す。

【表】注＊５％の危険率でコントロール群に
比べて有位差あり。
(3) ラツト受身皮膚アナフラキシー反応 Wistar系雄性ラツト（体重150〜180g）の背部
皮内にStotlandらの方法［Cand.J.Physiol.
Pharmacol.，52，1114（1974）］に準じて調整し、
40倍に希釈した抗EWAラツト血清を注射し、48
時間後EWA10mgを含む１％エヴアンスブルー液
を注射した。30分後に背部皮膚青染部の漏出色素
量を測定した。被検体はEWA静注の１時間前に
経口投与した。結果を第３表に示す。

【表】

【表】 (4) モルモツト実験的喘息に対する効果江田らの方法［Jap.J.Pharmacol.，30，559
（1980）］に準じて行つた。 Hartley系雄性モルモツト（体重250〜300g）
に抗ベンヂルペニシロイルボビン、γ−グロブリ
ン（BPO−BGG）・IgE血清の0.25ml／モルモツ
トを心臓内に投与して受動的に感作させ、48時間
後、500μg／Kgのベンヂルペニシロイルボビンシ
ーラムアルブミン（BPO−BSA）を静脈内投与
し、呼気性の喘息発作を誘起した。呼吸波の測定
は、気管カニユーレより、トランジユーサを介し
てひずみ圧力ポンプに入力して行つた。被検体は
BPO−BSA投与20分前に経口投与した。結果を第４表に示す。

【表】

【表】注＊５％の危険率でコントロール群に
比べて有位差あり。
＊＊１％の危険率でコントロール群に
比べて有位差あり。
(5) 免疫溶血反応に対する抑制効果森らの方法［薬学雑誌、95，1477（1975）］に準
じて、新鮮ヒツジ赤血球（SRBC）の免疫溶血反
応を検定した。ゼラチンベロナールバツフアーで調整した10％
SRBC浮遊液に被検体、抗SRBC家兎血清、補体
（モルモツト新鮮血清）を順に加え37℃、90分間
インキユベートした。氷冷後、上清の540nmにお
ける吸光度を測定し、0.1％炭酸ソーダ液を加え
た場合の吸光度を完全溶血とし、これに対する吸
光度比を溶血率として求めた。結果を第５表に示す。

【表】

【表】 (6) 糸球体腎炎に対する効果永松らの方法［日薬理誌、78，491（1981）］に
準じて行つた。ウサギ血清アルブミン（RSA）で予備免疫し
たDonryu系雄性ラツト（体重150g前後）に、
RSAの１mg／ラツトを隔日に８週間静注し、糸
球体腎炎惹起した。被検体を30日間経口投与し、
尿中蛋白排泄量、腎糸球体組織像及び総頚動脈圧
を測定した。結果を第６表に示す。

【表】注＊５％の危険率でコントロール群に比べて有位
差あり。
＊＊１％の危険率でコントロール群に比べて有位
差あり。
(7) ピクリルクロライドによる接触性皮膚炎に対
する効果 Ashersonらの方法（Immunology，15，405
（1968）］に準じて行つた。 ddY雄性マウス（体重25g前後）の腹部に、７
％ピクリルクロライド（PC）のエタノール溶液
0.1mlを塗布して感作し、さらに７日後に両耳朶
に１％PCオリーブ油溶液を0.02mlづつ塗布して、
マウス接触性皮膚炎を誘発した。被検体を誘発直
前および16時間後に経口投与し、誘発24時間後の
耳朶の厚さおよび誘発直前の耳朶の厚さの差を腫
脹度（×10^-3cm）として計測し、次式により腫脹
抑制率を求めた。抑制率（％）＝（１−Ａ／Ｂ）×100 Ａ：被検体投与群平均腫脹度Ｂ：コントロール群平均腫脹度結果を第７表に示す。なお対照薬としてはプレ
ドニゾロンを用いた。

【表】第７表から明らかなように、生理活性エキスは
ピクリルクロライドによる接触性皮膚炎抑制作用
を有する。発明の効果本発明の方法によれば、霊芝の子実体の水抽出
物のうちの不要夾雑物が除かれ、抗アレルギー性
作用を有する成分（糖蛋白結合体）を高純度に含
有するエキスが得られる上、このエキスは安全性
が高いものである。従つて本発明の方法により取
得される目的物は、抗アレルギー剤として特に有
用である。しかもこの有効成分を効率的に取得することが
できるので、医薬品としての量産化にとどまら
ず、服用しやすいかたちに加工ができるという利
点がある。よつて、本発明は工業的に極めて価値あるもの
である。

Claims

【特許請求の範囲】１霊芝（Ganoderma Lucidum）から糖蛋白結
合体含有の生理活性エキスを製造するにあたり、霊芝の子実体を水により抽出温度30〜80℃で抽
出する工程(A)、前工程(A)の抽出液を透析または限外濾過する工
程(B)、および、前工程(B)の内液をデキストラン、アガロースま
たはポリアクリルアミドから選ばれたゲル濾過剤
を担体として用いたカラムクロマトグラフイー
（GPC）に付して分子量15000〜20000の糖蛋白結
合体を分離するか、あるいは、前工程(B)の内液と
アルコール、ケトン、エステルまたはエーテル系
溶剤から選ばれた親水性有機溶剤とを、該親水性
有機溶剤の割合が内液と親水性有機溶剤の合計量
の40〜80v／ｖ％となるように混合し、析出した
沈澱を分離する工程(C) を実施することを特徴とする霊芝から生理活性エ
キスを製造する方法。