KR100538642B1

KR100538642B1 - 목질진흙버섯으로부터 분리한 산성 프로테오-헤테로글리칸추출물을 함유하는 관절염 치료용 또는 예방용 조성물

Info

Publication number: KR100538642B1
Application number: KR10-2002-0036409A
Authority: KR
Inventors: 이재동; 김기영; 이성구
Original assignee: 이재동; 이성구; 김기영
Priority date: 2002-06-27
Filing date: 2002-06-27
Publication date: 2005-12-23
Also published as: KR20040001269A

Abstract

본 발명은, 유효성분으로서 목질진흙버섯으로부터 분리해낸 산성 프로테오-헤테로글리칸을 포함하는 목질진흙버섯 추출물을 함유하는 관절염 치료용 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.

Description

목질진흙버섯으로부터 분리한 산성 프로테오-헤테로글리칸 추출물을 함유하는 관절염 치료용 또는 예방용 조성물{A Composition for Treating or Preventing Arthritis Containing Acidic Proteo-heteroglycan Extract from Phellinus linteus}

본 발명은, 유효성분으로서 목질진흙버섯으로부터 분리한 산성 프로테오-헤테로글리칸을 포함하는 목질진흙버섯 추출물을 함유하는 관절염 치료용 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.

상황버섯이라고도 불리우는 목질진흙버섯(학명: Phellinus linteus)은, 예로부터 독성 없이 독을 다스리며, 부인병, 염증 및 소화기계통의 질환에 탁월한 효과가 있음이 알려져, 한방에서 약용물질로서 이용되어왔다.

한편, 1970년대 들어와서 상황버섯의 항암효과가 96.7%의 종양 억제율을 갖는다는 것이 보고되면서, 상황버섯에 대한 관심이 집중되었다. 그 결과로, 상황버섯은 식도암, 위암, 대장암, 간암, 폐암, 신장암, 자궁암, 난소암, 유방암 등 거의 모든 암에서 커다란 항암효과가 있음이 보고되었다. 이러한 상황버섯의 항암효과에 대한 많은 연구는, 상황버섯이 직접적인 암 치료제라기보다는 치료 보완제, 즉 면역증강제로서 작용한다는 것을 보고하고 있다. 특히, 상황버섯은 초기암의 증식을 막는데 뛰어나며, 특히 암 수술 후 재발 방지, 즉 암 전이에 대한 억제력이 매우 탁월하다는 것이 보고되었다.

이러한 상황버섯의 놀라운 작용으로 그의 약리효과 유발성분에 대한 관심이 고조되었다. 그 결과로, 상황버섯에서 추출한 다당체가 그러한 성분일 것이라는 가설이 대두되었고, 이들의 항종양 작용에 대한 기작은 아직 밝혀진 바가 없지만, 대식세포 또는 보체 시스템(complement system) 등의 면역체계를 활성화시켜 항종양 효과를 나타내는 것으로 보고되어 있다.

최근 연구에 따르면, 상황버섯에서 추출되는 다당체 중 면역증강효과가 가장 큰 성분은 '산성 헤테로글루칸' 성분이라고 밝혀졌다. 쥐에서의 실험 결과로서, 산성 헤테로글리칸은 B 림프구와 T 림프구의 활성을 5배, 자연살해세포(natural killer cell; NK cell)의 활성을 2.5배, 대식세포의 활성을 2배 증가시킬 수 있는 것으로 밝혀졌으며, 이 물질을 투여한 군에서는 수명이 1.8배까지 증가되는 것으로 나타났다.

한편, 관절염은 어떤 원인에 의해서든 관절에 염증성 변화가 발생하여, 뼈와 뼈 사이의 마디를 연결하여 매끈하게 움직이게 하는 연골이 소실되는 질환들을 총괄하여 지칭하는 병명이다. 이러한 관절염의 예로는, 골성 관절염, 류머티스 관절염, 퇴행성 관절염, 대퇴골두 무혈성괴사, 외상성 관절염, 결핵 및 화농성 관절염 등을 포함한다. 관절염 중, 특히 류머티즘 관절염 및 퇴행성관절염 환자가 대부분이며, 젊은 사람보다는 주로 35∼45세의 연령층에게, 남성보다는 여성에게 발병확률이 더 높다. 또한, 전체 인구 중 10∼20%가 관절염으로 고생하고 있으며, 전체 인구 중 약 1%는 류머티스 관절염 환자이다.

당업자의 통상적인 지식에 따르면, 류머티스 관절염은 만성 전신성 자가면역질환으로서, 자신의 면역체계가 연골의 자가항원을 외부침입항원으로 인식하여, 관절에 염증반응을 일으키며, 결과적으로 점진적인 연골 파괴와 골흡수가 유발됨을 특징으로 한다고 알려져 있다.

한편, 항원에 대한 면역반응, 특히 염증반응은 미성숙(naive) T 세포로부터 분화된 성숙 효과세포가 생산하는 사이토카인의 양상에 의하여 결정된다고 알려져 있다. 구체적으로, CD⁴⁺ Th1 세포는 세포내 병원체의 제거에 필요한 사이토카인인 IL-2, IFN-γ 및 TNF-β를 생산하며, Th2 세포는 세포외 병원체의 제거에 필요한 체액성 면역반응을 조절하고 세포매개 면역반응을 억제하는 사이토카인인 IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 및 IL-13을 생산하며, 이러한 두 부류의 사이토카인들은 상호간에 억제적으로 작용한다. 또한, 미성숙 T 세포로부터 Th1 또는 Th2 형의 효과세포(effective cells)로의 발달은 T 세포 초기자극(priming)시에 특정한 사이토카인의 존재에 의하여 결정된다. 즉, IL-12는 Th1 형으로의 분화에 필요하며, Th2 형으로의 분화는 IL-4의 존재에 의존한다.

한편, 사람에게서의 수종의 자가면역질환 및 이의 실험동물 모델에서 밝혀진 바에 따르면, 이러한 질환들은 Th1 세포에 의해 의존적으로 매개된다. 류머티스 관절염 환자 및 콜라겐-유도 관절염(collagen-induced arthritis, 이하 'CIA'라 약함) 실험동물 모델의 T 세포 아형 분석에서도, Th2 세포에 비하여 Th1 세포가 이들의 지배적인 매개수단임을 나타내고 있다. 이러한 이유로, 콜라겐-특이 항체도 Th1 사이토카인에 의하여 생산이 촉진되는 IgG2a 아이소타입인 것이 많으며, Th2 사이토카인에 의하여 생산이 촉진되는 IgG1 아이소타입인 것은 적다. 따라서, 이를 이용하여, 항체의 아이소타입에 대한 정량도 류마티스 관절염 억제효과의 유무를 판정하는데에 하나의 방법이 될 수 있다. 류머티스 관절염에 대한 연구 중 많은 부분은, 염증 및 관절손상의 매개분자들에 대해서 집중적으로 이루어져 왔으며, 이들 물질들로는 TNF-α와 IL-1 등의 사이토카인이 이용되고 있다. 이들은 활액 섬유아세포(fibroblasts)로부터 프로스타글란딘(prostaglandin) E2(PGE2)와 콜라겐나아제(collagenase)의 유리를 유도하고, 조직에서 림프구와 호중구(neutrophil)의 침윤을 유도하는 혈관부착분자들의 발현을 항진시켜, 연골의 파괴와 골흡수(bone resorption)를 촉진한다. 이러한 실험 결과들은, 류머티스 관절염의 병태생리에 TNF-α가 중요한 매개인자이라는 것을 나타낸다.

이러한 관점에서, TNF-α의 활성에 초점을 맞춘 신약들이 현재 개발되고 있으며, TNF-α를 중화시킬 수 있는 생물학적 제제들이 임상에 이용되고 있다. 그러나, TNF-α를 단독으로 사용하여서는, 류머티스 관절염의 치료에 충분하지 못하며, 따라서 TNF-α의 활성 또는 생산의 감소와 더불어, IL-1까지도 활성 또는 생산을 감소시킬 수 있는 약제의 개발이 요구되고 있다.

또한, 마우스 모델에서, IL-12와 IL-18의 투여가 CIA의 발생을 촉진시킬 수 있으며, 이는 IL-4의 전신 투여에 의해 CIA가 효율적으로 치료되었다는 보고도 있다.

상기에서 설명한 바와 같이, 사이토카인의 활성을 조절하여, 자가면역질환을 치료하고자 하는 시도가 당업계에서 이루어지고 있으며, 이에 대한 화학합성 약제가 개발되어왔다. 그러나, 개발된 또는 개발되고 있는 많은 화학합성 약제들은 심각한 독성 및 부작용을 갖고 있어, 임상에서의 적용이 어렵다. 따라서, 사이토카인의 활성을 조절하여 관절염을 치료할 수 있는 약리작용을 가지면서도, 독성이나 부작용이 없는 생약물질의 개발이 사회적으로 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들 또한 사이토카인의 활성을 조절할 수 있어, 관절염 치료 또는 예방에 이용될 수 있으면서도, 생체 독성 또는 부작용이 없는 생약물질을 개발하고자 많은 연구를 집중적으로 수행한 결과, 암환자에게서 면역능을 향상시켜 부작용 없이 뛰어난 항종양 효과를 나타내는 것으로 알려진 목질진흙버섯(일명 '상황버섯')으로부터 분리해낸 다당추출물인 산성 프로테오-헤테로글리칸을 포함하는 목질진흙버섯 추출물이, 부작용 없이 사이토카인의 활성 또는 생산을 조절하여 관절염 치료 또는 예방에 유용하게 이용할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 관절염 치료용 또는 예방용 조성물을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위해, 본 발명에 따른 관절염 치료용 또는 예방용 조성물은 목질진흙버섯으로부터 분리해낸 약 120,000∼180,000 범위 내의 분자량, 바람직하게는 약 150,000의 분자량을 갖는 산성 프로테오-헤테로글리칸을 포함하는 목질진흙버섯 추출물을 유효성분으로서 함유함을 특징한다.

이하, 더욱 구체적으로 본 발명을 설명한다.

본 발명에 따른 조성물 내에 포함되는 약 120,000∼180,000 범위 내의 분자량, 바람직하게는 약 150,000의 분자량을 갖는 산성 프로테오-헤테로글리칸을 포함하는 목질진흙버섯 추출물(이하, '산성 프로테오-헤테로글리칸 추출물'이라 함)은, 목질진흙버섯을 물로 추출한 후, 물추출물을 음이온 교환크로마토그래피에 적용하여 산성의 다당 추출물 분획을 분리해 낸 다음, 수득된 산성의 다당 추출물 분획을 겔 여과 크로마토그래피에 적용하여 추출됨을 특징으로 한다.

특히, 목질진흙버섯의 산성 프로테오-헤테로글리칸 추출물은, 예를 들어 다음의 단계들을 포함하는 방법에 의해서 추출할 수 있다.

1) 목질진흙버섯을 끓는물로 추출하여 물추출물을 얻는단계;

2) 상기 물추출물을 에탄올로 침전시키는 단계;

3) 상기 에탄올 침전물을 투석하는 단계;

4) 상기 투석물을 동결건조시키는 단계;

5) 상기 동결건조물을 음이온 교환 크로마토그래피를 적용하여, 산성 다당 추출물 분획을 분리해내는 단계;

6) 상기 단계 5)에서 얻어지는 분획을, 겔 여과 크로마토그래피에 적용하여, 약 120,000∼180,000 사이의 분자량, 바람직하게는 약 150,000의 분자량을 갖는 산성 프로테오-헤테로글리칸 분획을 얻어내는 단계.

본 발명의 산성 프로테오-헤테로글리칸 추출물을 얻기 위해 이용되는 목질진흙버섯의 추출부위는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 자실체를 사용하는 것이 바람직하다.

한편, 목질진흙버섯을 물로 추출하여 목질진흙버섯의 수용성 성분, 특히 다당체 물질을 얻을 수 있으며, 이러한 열수추출물에 포함된 단백질, 지질 및 저분자물질 등의 불순물의 제거는 에탄올 침전 및 투석에 의해 수행될 수 있다.

또한, 본 발명에서는 목질진흙버섯의 열수추출물로부터 산성 프로테오-헤테로글리칸을 얻기 위해서, 산성 다당체 물질들을 분리한 후, 적당한 분자량을 갖는 물질을 분리한다. 산성 다당체 물질의 분리는 예를 들어 음이온 교환 크로마토그래피, 특히 DEAE-셀룰로오스 컬럼을 이용하는 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 수행되며, 적당한 분자량을 갖는 물질을 얻기 위해서는 예를 들어 겔 여과 크로마토그래피, 바람직하게는 CL-4B 컬럼을 이용하는 겔 여과 크로마토그래피를 수행한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 목질진흙버섯 추출물, 즉 산성 프로테오-헤테로글리간 추출물은, DEAE-셀룰로오스 컬럼(3 x 45㎝)을 이용하여 음이온 교환크로마토그래피를 수행하였을 때, 약 0.4M NaCl 농도(Fraction nos. 21-27)의 용매에서 용출된다. 또한, 본 발명의 목질진흙버섯 추출물은, CL-4B 컬럼(1.5 x 105㎝)을 이용하여 겔 여과 크로마토그래피를 수행하는 경우에, 약 0.01M의 인산 나트륨 용액에서 용출되었으며(Fraction nos. 55-60), 이는 dextran-1662(분자량: 41,272)와 dextran-5251(분자량 473,000) 사이의 분자량을 갖는 것을 나타낸다.

한편, FT-IR 분석 및 NMR 분석에 의하면, 본 발명의 목질진흙버섯 추출물은 β-글루칸만을 함유하고 있는 기존의 다른 버섯추출물과는 달리, α- 및 β-글루칸을 모두 포함하고 있는 다당체 추출물, 즉 산성 프로테오-헤테로글리칸 추출물이다. 또한, 본 발명의 추출물은 α- 및 β-글루칸을 약 6.5 : 3.5의 비율로 함유하고 있다.

한편, 본 발명에 따른 관절염 치료용 또는 예방용 조성물은 상기의 방법에 의해서 제조된 산성 프로테오-헤테로글리칸 추출물을 유효성분으로서 포함한다.

본 발명의 관절염 치료용 또는 예방용 조성물에서 유효성분인 목질진흙버섯 추출물의 유효량은 투여방법, 제제형태, 환자의 나이, 환자의 체중, 환자의 감수성 및 질환의 상태에 따라 적절하게 선택되어질 수 있으며, 구체적으로 제한되는 것은 아니지만, 일반적으로 목질진흙버섯 추출물을 0.05∼500mg/㎏의 농도로 경구투여되도록 제형 될 수 있다. 물론, 유효성분의 투여량이 상기범위를 벗어난 양일 수도 있다.

목질진흙버섯 추출물을 상기한 범위 내로 투여하기 위한 제제는 통상의 형태를 가질 수 있으며, 예를 들면 알약, 캅셀 형태나 드링크제, 의약품 등의 형태로 사용할 수 있다. 이들은 경구 또는 각종의 비경구 투여경로를 통해 관절염 치료를 위해 투여될 수 있으며, 투여제형에 따라 적합한, 그리고 당업자에게 이미 주지되어 있으며 당업자가 용이하게 선정할 수 있는 각종의 부형제, 담체 또는 희석제 등을 함유할 수 있다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 목질진흙버섯 추출물은 관절염 발생시 유발되는 Th1형 사이토카인, 특히 TNF-α 및 INF-γ의 활성증가를 mRNA 및 단백질 수준에서의 발현감소에 의해 억제할 수 있으며, 특히 응축수 임파선(draining lymph nodes)에서 그 효과가 현저하다. 본 발명의 목질진흙버섯 추출물은, 이러한 Th1형 사이토카인의 활성억제로 인하여, 관절염 발생시 이러한 사이토카인에 의해서 분비가 촉진되는 IgG2a 항체 또한 감소시킬 수 있다. 결과적으로, 본 발명의 목질진흙버섯 추출물은 상기와 같은 생리기전으로 인해, 류마티스 관절염 등의 관절염을 억제할 수 있다.

또한, 본 발명에 따르면, 본 발명의 목질진흙버섯 추출물을 관절염 유발 전에 투여하면 관절염을 예방할 수 있으며, 관절염 유발 후에 투여하면 관절염이 치료할 수 있다.

이하, 하기의 실시예를 참조로 하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위가 이에 의해 한정되는 것은 아니며, 당업계의 통상적인 지식에 따라 다양한 변형 등을 수행할 수 있으며, 이 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다는 것이 당업자에게 자명할 것이다.

[실시예 1] 목질진흙버섯 추출물의 분리

300g의 목질진흙버섯 자실체를 끓는 물로 30분간 6회 추출하였다. 추출액에 대해 3배 부피의 95% 에탄올(즉, 3X)을 상기 물추출액에 첨가한 다음, 4℃에서 4일간 방치한 후, 고속원심분리하여 침전물을 회수하였다. 수득된 조다당 침전물을 증류수에 녹인 후, 투석막(MWCO 50,000)에 넣고 3차 증류수에서 4일간 투석하였다. 그런 다음, 투석액을 동결건조기를 이용하여 동결건조하였다.

수득된 동결건조 정제물 약 3g을 적당한 용매에 녹여서 DEAE-셀룰로오스 음이온 교환 크로마토그래피(3 x 45㎝, Pharmtec)에 전개한 후, 평형화시키고 0-2M의 NaCl로 용출하였다. 유속은 분당 1㎖로 하여, 분획당 5㎖씩 용출하였다. 다당 성분을 포함하고 있는 활성 분획을 DNS 방법을 이용하여 확인하였다. 당성분이 존재하는 분획은 약 0.43 M NaCl에서 용출되었다. 상기 음이온 교환 크로마토그래피 결과는 도 1에 나타내었다.

상기에서 얻어지는 다당 성분을 포함하고 있는 활성 분획을 세파로오스 CL-4B 컬럼(1.5 x 105㎝; Pharmtec)을 이용하는 겔 여과 크로마토그래피에 적용하였다. 특정 분자량 부위를 갖는 분획은 0.01M의 인산 나트륨 완충액(pH 6.4)에서 용출되었다. 상기 겔 여과 크로마토그래피의 결과는 도 2에 나타내었다. 도 2에서 표준곡선을 작성하기 위해 블루 덱스트란(blue dextran; 분자량 2,000,000), 덱스트란 D5251(분자량 473,000), 덱스트란 D1062(분자량 41272)를 이용하여 표준곡선을 작성하였다.

상기 실험에서, 크로마토그래피를 수행하기 위해 사용되는 수지는 모두 시그마사로부터 구입하였으며, 수지는 팜텍(Pharmtec)으로부터 구입하였다.

[실시예 2] 목질진흙버섯 추출물의 구조분석

1. 목질진흙버섯 추출물의 당 구성성분의 확인

목질진흙버섯의 정제된 다당을 포함하는 실시예 1에서 얻어진 상기 추출물을, 2M 트리플르오로아세트산(TFA)으로 산 가수분해시킨 후, ELSD 검출기(Waters)를 이용하는 HPLC 분석을 통해 상기 추출물을 이루는 당 성분의 구성을 분석하였으며, 분석결과는 하기 표 1에 나타내었다.

함량	만노오스	갈락토오스	글루코오스	아라비노오스	자일로오스
PHG^*	41.6	23.4	23.8	5.8	4.2
* PHG: 정제된 산성 프로테오-헤테로글리칸

2. 목질진흙버섯의 아미노산 구성성분 분석

목질진흙버섯의 정제된 다당을 포함하는 실시예 1에서 얻어진 상기 추출물을 상기와 같은 방법에 의해서 산 가수분해시킨 후, 생성된 분해물을 아미노산 분석기(Biochrom 20 amino acid analyzer; Pharmacia, CA)를 이용하여 분석하였으며, 분석결과는 표 2에 나타내었다.

아미노산	M%	아미노산	M%
아스파트산	9.0	메티오닌	1.0
트레오닌	6.9	이소루신	2.9
세린	11.8	루신	5.6
글루탐산	11.1	타이로신	1.6
글리신	12.0	페닐알라닌	8.4
알라닌	12.7	히스티딘	1.2
시스틴	0.7	리신	4.2
발린	5.1	아르기닌	2.8
		프롤린	3.0

3. FT-IR 스펙트럼

실시예 1에서 얻어진 추출물 내에 포함된 다당의 구조를 확인하기 위해서, 표준물질로서 표고버섯 유래의 β-글루칸을 이용하여, 이들의 FT-IR(Magna-IR 560, 관능기의 확인을 위해 KBr disc방법 사용) 흡수파장을 비교하여 구조를 확인하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에서 바는 바와 같이, 3300-3400 cm^-1에서 당고리의 전형적인 특징인 O-H의 스트레칭(stretching) 흡수 피크가 수소결합에 의해 이동되어 나타나고, 2900 cm^-1부근에서는 C-H 스트레칭 진동이 일어나며, 1630 cm^-1에서 C-O 스트레칭 진동이 일어나고, 100-1100 cm^-1에서는 -H와 C-O 벤딩(bending) 진동이 일어난다는 것을 확인하였고, 이는 표준 β-글루칸의 피크와 거의 일치하는 전형적인 다당임을 확인하였다.

4. NMR 스펙트럼

실시예 1에서 얻어진 추출물에 대하여, NMR을 수행하고, 그 결과를 그 결과를 도 5에 나타내었다. ¹H-NMR의 시그널은 4.42, 4.15, 3.80, 3.60, 3.38, 3.29 ppm이었고, 이에 해당하는 수소는 C-1, C-6, C-5, C-4, C-3, C-2 위치에 있는 수소임을 알 수 있었다. 또한, 많은 부위에서 메틸화가 일어나 있음을 확인하였다. ¹C-NMR의 시그널은 103.4, 89.4, 76.34, 65.45, 60.7 ppm이었고, 이에 해당하는 탄소는 C-1, C-3, C-5, C-2, C-4, C-6위치에 해당되는 탄소임을 할 수 있었다. 또한, 98.8 ppm에서 피크가 형성되었고, 이는 특이적인 α결합이 이루어져 있음을 나타낸다. 이러한 결과를 통해, 본 발명의 추출물이 α-글루칸과 β-글루칸이 약 6.5:3.5의 비율로 혼합된 다당임을 확인하였다.

5. 결과

본 발명의 목질진흙버섯 추출물은 약 0.43 M의 NaCl에서 추출되었으며, 분자량은 120,000∼180,000 범위의 분자량 분포를 나타내었고, 특히 약 150,000 정도의 분자량이 가장 많았다. FT-IR 분석은 본 발명의 추출물에 대한 결과가 일반적인 버섯추출물의 다당 성분, 즉 β-글루칸과 흡수대 파장과 거의 일치하여, 이들 추출물의 성분이 대부분 다당임이 확인하였다. 또한, NMR 분석은 기존의 버섯추출물이 β-글루칸인 것과는 달리, 본 발명의 목질진흙버섯 추출물은 α- 및 β-콜루칸이 혼합된 다당임이 보여준다. 또한, NMR 분석을 통해서 103.4 ppm의 β결합 피크와 98.8 ppm의 α결합 피크 비율을 확인한 결과, 본 발명의 추출물은 α- 및 β-콜루칸이 약 6.5:3.5의 비율로 혼합된 다당임이 나타낸다.

[실시예 3] 목질진흙버섯 추출물의 관절염 억제 효과

본 실시예에서는 본 발명의 추출물이 염증치료, 특히 관절염치료에 효과가 있는지에 대해서 확인하고자 하였다. 현재 가장 많이 사용되고 있는 관절염 실험 동물 모델로서 콜라겐-유도 관점염 마우스(collagen-induced mouse; 이하, 'CIA')에 II형 콜라겐을 주사하여 관절염을 유도하고, 이들에게 본 발명의 상황버섯 추출물을 경구투여하여 관절염 억제효과를 확인하고자 하였다.

DBA/1 마우스를 3개의 그룹(n=5), 즉, 목질진흙버섯 추출물을 콜라겐 처리 전에 투여하는 전-투여 그룹(- ○-), 콜라겐 처리 후에 투여하는 후-투여 그룹(- ▼-), 목질진흙버섯 추출물을 처리하지 않는 대조군 그룹(-△-)으로 나누었다.

3개의 그룹 모두에서 II형 콜라겐에 의한 CIA의 유발은, 100㎍의 II형 콜라겐을 아주반트(complete adjuvent, sigma)와 섞어서, 꼬리 기저부를 통해 내피투여로 1차 주사하고(7일째), 28일째에 관절부위에서 부스터링 효과(boostering effect)를 얻기 위해, 발바닥에 다시 II형 콜라겐과 아주반트(incomplete adjuvent, sigma)를 2차 주사하여 수행하였다.

한편, 전-투여 그룹은 0일째에 5㎎의 목질진흙버섯 추출물(실시예 1에서 얻어지는 추출물)을 경구로 투여하였고, 후-투여 그룹은 35일째에 2㎎의 목질진흙버섯 추출물을 전-투여 그룹과 동일하게 투여하였으며, 대조군 그룹에 대해서는 목질진흙버섯 추출물을 투여하지 않았다.

각 그룹의 마우스에서 관절염 유발정도는, 관절염 유발 부위의 관찰을 통해 하기 표 3과 같은 관절염 지수로 평가되었다:

관절염 지수	관절염 유발정도
4	관절염의 발병
3	3다리에서 종창(swelling), 심각한 병태
2	온화: 두 다리에서 종창, 온화한 병태
1	발병정도가 미비함

상기 표 3의 관절염 지수에 의해서, 3개의 각 마우스 그룹에서 관절염 유발에 대한 결과는 도 6에 나타내었다.

도 6에서 보는 바와 같이, 전-투여 그룹의 마우스에서는 관절염이 유도되지 않았으며, 후-투여 그룹의 마우스에서도 관절염 지수가 급격히 낮아지는 치유효과를 나타내었다.

이러한 결과는, 본 발명의 목질진흙버섯 추출물을 포함하는 조성물이 관절염 치료효과 뿐만이 아니라, 예방효과도 가질 수 있다는 것을 나타낸다.

[실시예 4] 목질진흙버섯 추출물의 사이토카인에 대한 효과

본 실시예에서는, 실시예 3에서 확인한 목질진흙버섯 추출물의 관절염 치료효과에 대해, 세포 내에서 발생하는 생화학적 반응 수준에서 상기 추출물의 효과를 확인하고자 하였다.

1. 목질진흙버섯 추출물의 Th 세포(T-helper cell)에 대한 영향

관절 부위의 염증유발은, 대식세포나 수지상 세포(dendritic cells)가 분비하는 IL-12 또는 TNF-α에 의해 다른 많은 면역세포가 과다하게 증식하게 되며, 특히 T 세포 중 Th1형 세포가 자극을 우선적으로 받아서 IFN-γ를 과다하게 분비하게 된다. 그 후, 이들 사이토카인에 의해 다른 관절활막 세포나 연골세포들이 과다하게 증식되어, 자가자신의 활막을 공격함으로써 파괴를 유발한다. 따라서, 본 실험에서는 목질진흙버섯 추출물의 관절염의 치유효과를 확인하기 위해서, 그들의 Th 세포에 대한 영향을 확인하고자 하였다. 특히, Th2형 사이토카인에 의해서는 IgG1 계열의 이소타입(isotype) 항체가 주로 생성되며, Th1형 사이토카인에 의해서는 IgG2a 계열의 이소타입 항체가 주로 생성된다는 사실에 기초하여, 관절염 유발 마우스에서 IgG1 계열의 항체 및 IgG2a 계열의 항체의 역가(titer)를 측정함으로써, 목질진흙버섯 추출물이 어떤 Th 세포에 주로 영향을 미치는지 확인하고자 하였다.

본 실험에서, II형 콜라겐에 의한 CIA의 유발 및 목질진흙버섯 추출물의 투여는 상기 실시예 3과 유사하게 수행하였다. 음성 대조군으로는 PBS를 투여하였다.

부스터링 효과를 얻기 위한 2차 투여 후, 40일째에, 마우스로부터 시료 혈청을 분리하였다. 혈청은 마우스 눈 아랫부분의 정맥에 모세혈관을 찔러서 피를 채취한 후, 실온에서 1시간 방치한 다음, 원심분리하여 혈청만을 회수하여 얻었다. 시료 혈청을 1/100,000으로 PBS에 희석하고, 뮤린 2형 콜라겐으로 코팅된 웰에서 배양하였다. 이소타입에 따라 특이적으로 결합하는 마우스 항체(R&D Systems, Minneapolis, MN)를 결합시킨 후, 비오틴-콘쥬게이트된 항-래트 전체 IgG 항체(R&D Systems, Minneapolis, MN)를 사용하여, 각각의 이소타입에 따른 항체 역가를 측정하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에서 각 그룹은 n = 3이며, *는 p<0.05로 결과가 통계학적으로 유의적 차이를 나타낸다는 것을 나타낸다.

상기 도 7에서 보는 바와 같이, 본 발명의 목질진흙버섯 추출물을 마우스에 경구투여하였을 때, IgG1 이소타입 항체의 양에는 큰 영향을 미치지 않으나, IgG2a이소타입 항체의 양은 급격히 감소됨을 확인하였다.

이러한 결과로부터, 본 발명의 목질진흙버섯 추출물이 Th1형 사이토카인 중에서 IFN-γ의 분비량을 감소시키거나, TNF-α의 분비량을 감소시켜, 관절염의 치유에 기여하는 것으로 추정할 수 있다.

2. 사이토카인의 mRNA 발현에 대한 목질진흙버섯 추출물의 영향

본 실험에서는 본 발명의 목질진흙버섯 추출물이 사이토카인의 발현에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.

우선, 상기 실시예 3과 동일하게 CIA를 유도하고 본 발명의 추출물을 처리한 마우스의 각 그룹로부터, 면역세포가 밀집한 지역인 응축수 임파선(draining lymph nodes; dLN), 장간막 임파선(mesenteric lymph nodes; mLN) 및 파이에르판(Peyers patch; PP) 조직을 분리하고, 이들에서 TNF-α 및 IFN-γ의 mRNA 발현량을 확인하였다. 그 결과는 각각 도 8에 나타내었다.

사이토카인 mRNA의 발현량은 각 조직으로부터 mRNA을 분리한 후, PCR을 통해 확인하였다. 보다 구체적으로는, 전체 RNA를 TRIZOL(Life Technologies, Poole, U.K.)을 이용해서 분리하고; MMLV(Maloney murine leukemia virus-reverse transcriptase)의 역전사효소(40 units), 2-디옥시뉴클레오사이드-5-트리포스페이트(dNTPs), 리보뉴클레아제(RNase) 억제제(8 유닛) 및 램덤 헥사머(random hexamers)(최종농도 2.5mM)를 함유하는 반응액에 상기 분리한 전체 RNA를 넣고, 37℃에서 60분간 반응시킨 후, 99℃에서 5분간 방치하여 반응을 정지시킴으로써, cDNA를 합성하며; 합성된 cDNA를 MgCl₂ (최종농도 2mM), PCR 완충액 Taq. DNA 폴리머라아제(0.5 unit), 프라이머(Bioneer, KR)를 넣고, 33 사이클을 적당한 PCR 조건(예컨대, 94℃에서 45초, 56℃에서 42초, 72℃에서 30초, Perkin-Elmer Cetus DNA thermal cycler의 PCR 반응기)하에서 수행하고; PCR 산물을 아가로스 겔에서 정량하여 각 사이토카인 mRNA의 발현량을 확인하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에서 보는 바와 같이, Ⅱ형 콜라겐에 의한 관절염 유도후, dLN에서는 강하게 TNF-α및 IFN-γ mRNA의 발현이 억제됨을 확인하였다. 이러한 사이토카인은 다른 면역 세포의 침윤을 증가시켜 관절을 파괴시키는 것으로 알려져 있다. 따라서, 도 9의 결과는 본 발명의 목질진흙버섯 추출물이 상기 사이토카인들의 발현을 억제시켜, 면역세포의 침윤을 억제함으로써 관절파괴는 막는다는 것을 나타낸다.

3. 사이토카인의 단백질 발현에 대한 목질진흙버섯 추출물의 영향

DBA/1 마우스를 3개의 그룹(n ≥3), 즉, 목질진흙버섯 추출물을 콜라겐 처리 전에 투여하는 전-투여 그룹, 콜라겐 처리 후에 투여하는 후-투여 그룹, 목질진흙버섯 추출물을 처리하지 않는 대조군 그룹으로 나누었다.

3개의 그룹 모두에서 II형 콜라겐에 의한 CIA의 유발은, 100㎍의 II형 콜라겐을 아주반트(Complete adjuvent, sigma)와 섞어서, 꼬리 기저부를 통해 내피투여로 1차 주사하고(7일째), 21일째에 관절부위에서 부스터링 효과(boostering effect)를 얻기 위해, 발바닥에 다시 II형 콜라겐과 아주반트를 2차 주사하여 수행하였다.

한편, 전-투여 그룹은 0일째에 2㎎의 목질진흙버섯 추출물(실시예 1에서 얻어지는 추출물)을 경구로 투여하였고, 후-투여 그룹은 28일째에 5㎎의 목질진흙버섯 추출물을 전-투여 그룹과 동일하게 투여하였으며, 대조군 그룹에 대해서는 목질진흙버섯 추출물을 투여하지 않았다.

35일째에, 마우스를 희생시킨 후, 그들의 dLN, mLN 및 PP 조직으로부터 백혈구 세포를 분리하였다. 백혈구 세포의 분리는 각 조직을 슬라이드 글라스(slide glass)로 세밀하게 갈아 단세포를 만든 후, 이를 피콜 검사법(Ficoll assay)을 이용하여 단핵 백혈구 세포(mononuclear leukocytes)만을 분리하였다. 그런 다음 in vitro에서 3일간 배양한 후 상등액을 취하여, ELISA를 시행하였다. ELISA에 사용한 항체는 R&D R&D Systems, Minneapolis, MN에서 구입하였으며, 이러한 ELISA에 의해, 각 조직에서의 TNF-α및 IFN-γ의 단백질 발현량을 확인하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다. 결과는 평균±표준편차로 나타내었으며, *은 t-test에 의해서 PBST 결과에 대해 통계학적으로 유의적인 차이가 있다는 것을 나타낸다.

도 9에서 보는 바와 같이, Ⅱ형 콜라겐에 의한 관절염 유도후, dLN에서는 강하게 TNF-α및 IFN-γ 단백질의 발현이 억제됨을 확인하였다. 이러한 결과는 상기 mRNA 발현 결과와 일치한다. 따라서, 본 발명의 목질진흙버섯 추출물은 Th1형 사이토카인인 TNF-α및 IFN-γ의 mRNA 및 단백질 발현량을 억제하여, 관절염 발생시 유발되는 여러 면역작용을 억제함으로써 관절염을 치료할 수 있다는 것을 의미한다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 목질진흙버섯으로부터 신규히 분리해낸 본 발명에 따른 목질진흙버섯 추출물은 관절염 치료효과가 매우 우수하며, 특히 Th1형 사이토카인인 TNF-α및 IFN-γ의 mRNA 및 단백질 발현량을 응축수 임파선(dLN)에서 강력하게 억제하여, 관절염 치료효과를 나타냄을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 목질진흙버섯 추출물은, 관절염으로 고생하는 환자에게 치료적으로 또는 예방적으로 투여하여, 관절염 억제시킬 수 있다.

도 1은 목질진흙버섯 자실체의 물추출물로부터 다당 성분을 포함하고 있는 활성분획을 얻기 위해서, DEAE-셀룰로오스 컬럼(3 x 45㎝)을 이용하는 음이온 교환 크로마토그래피를 수행한 결과이고(여기에서, 은 다당 성분의 함량을, 은 NaCl 농도 구배를 나타냄),

도 2 및 도 3은 다당 성분 중 특정한 분자량을 갖는 산성 프로테오-헤테로글리칸을 얻기 위해서, 세파로오스 CL-4B 컬럼(1.5 x 105㎝)을 이용한 겔 여과 크로마토그래피를 수행한 결과이며,

도 4 및 도 5는 본 발명의 목질진흙버섯 추출물에 대해 FT-IR 분석 및 NMR 분석을 각각 수행한 결과이고,

도 6은 콜라겐에 의해 유도된 관절염 마우스에 본 발명의 목질진흙버섯 추출물을 투여할 때, 관절염이 치료 및 예방됨을 보여주는 결과이며,

도 7은 본 발명의 목질진흙버섯 추출물이 효과적으로 IgG2a 이소타입 항체의 역가를 줄임을 보여주는 결과이고,

도 8 및 도 9는 본 발명의 목질진흙버섯 추출물이 Th1형 사이토카인인 TNF-α 및 INF-γ의 mRNA 및 단백질의 발현을 응축수 임파선에서 현저하게 억제함을 보여주는 도면이다.

Claims

목질진흙버섯으로부터 분리해낸 120,000-180,000 사이의 분자량을 갖는 산성 프로테오-헤테로글리칸을 포함하는 목질진흙버섯 추출물을 유효성분으로서 함유함을 특징으로 하는 류머티스 관절염 치료용 또는 예방용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 목질진흙버섯 추출물은 목질진흙버섯을 물로 추출한 후, 물추출물을 음이온 교환크로마토그래피에 적용하여 산성의 다당 추출물 분획을 분리해 낸 다음, 수득된 산성의 다당 추출물 분획을 겔 여과 크로마토그래피에 적용하여 추출됨을 특징으로 하는 류머티스 관절염 치료용 또는 예방용 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 목질진흙버섯은 목질진흙버섯 자실체임을 특징으로 하는 류머티스 관절염 치료용 또는 예방용 조성물.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 목질진흙버섯 추출물을 0.05∼500mg/㎏의 농도로 함유함을 특징으로 하는 류머티스 관절염 치료용 또는 예방용 조성물.