KR20070059062A - 정제된 아라비노갈락탄-단백질 조성물 - Google Patents

Abstract

아르게모네 멕시카나(Argemone mexicana) 식물체의 잎 및/또는 줄기로부터 선택적 방법을 통해 분리되는 정제된 아라비노갈락탄-단백질(AGP) 조성물이 기재된다. 또한, 하나 이상의 하기 효과를 갖는, 아르게모네 멕시키나 식물체의 잎 및/또는 줄기로부터 분리되는 정제된 아라비노갈락탄-단백질(AGP) 조성물이 기재된다: 면역억제, 림프구 증식 억제, IL-2 억제, IFN-γ억제, 또는 IL-10 유도와 같은 사이토카인 조절; 케라티노사이트 증식 억제, 각질용해 활성 및 MEST에서의 억제 활성.

건선, 아라비노갈락탄-단백질(AGP), 아르게모네 멕시카나(Argemone mexicana)

Description

정제된 아라비노갈락탄-단백질 조성물{A purified Arabinogalactan-Protein (AGP) composition}

본 발명은 아르게모네 멕시카나(Argemone mexicana) 식물체의 잎 및/또는 줄기로부터 선택적인 방법을 통해 분리되어 정제된 아라비노갈락탄-단백질(AGP) 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 하나 이상의 하기의 효과를 갖는 아르게모네 멕시카나(Argemone mexicana) 식물체의 잎 및/또는 줄기로부터 분리되어 정제된 아라비노갈락탄-단백질(AGP) 조성물에 관한 것이다: 면역억제, 림프구 증식 억제(lymphoproliferation inhibition), IL-2 억제, IFN-γ 억제, 또는 IL-10 유도와 같은 사이토카인 조절; 케라티노사이트 증식 억제, 각질 용해(keratolytic) 활성 및 마우스 귀 부종 테스트(Mouse Ear Swelling Test: MEST)에서 억제 활성.

건선은 표피의 증생(hyperplasia), 비후화를 초래하는 표피 케라티노사이트의 염증 및 비정상적인 과다 증식(hyper-proliferation)과 적색의 인설 반위(red scale plaque)의 존재를 특징으로 한다. 이 만성적인 피부 질환은 가렵고, 벗겨지기 쉬운 피부를 초래하는 백색의 인설로 뒤덮힌 적색의 국한성 패치(circumscribed red patch)를 특징으로 하는 독특한 임상적 증상에 의해 인지된다. 건선은 매우 가 시적인 질병이며 종종 얼굴, 두피, 몸통 및 사지에 영향을 미친다. 이 만성적 질환의 손상(lesion)은 경감 및 악화를 겪는다.

건선은 피부 질환으로 나타나나, 어떠한 이론에도 한정되지 않으면서, 손상된 또는 불완전한 세포-매개 면역성(cell-mediated immunity)의 질환으로 사료된다. 건선의 임상적 양상은 주로 표피 변화에 의해 유발되기 때문에, 건선은 전통적으로 과다한 케라티노사이트 증식 및 비정상적인 분화의 하나로 고려되었다. 현재의 증거는 건선에서 표피 변화는 피부 손상에서 T 림프구의 작용에 의해 유발되고 T 림프구는 그 질병 과정을 유도하거나 유지시키는 것으로 시사한다. 건선은 다수의 사이토카인을 생성하는 활성화된 T-림프구가 이차적인 상피성 이상(epithelial abnormalities)을 초래하는 자가면역 질환으로 이해되고 있다. 이상조절되는(dysregulated) 림프구는 아폽토시스-내성 케라티노사이트의 증식을 촉진하는 사이토카인을 생성한다. 건선성 피부 병변은 T 세포와 호중구가 진피 및 표피에 침투하는 염증 및 표피 과다증식 및 비정상적 케라티노사이트 분화와 관계된 과다한 인설 형성 및 제거(scaling)을 특징으로 한다[Reich K., Garbe C., Blaschke V., Maurer C., Middel P., Westhal G., Lippert U., and Neumann C., J. Invest . Dermatol., 2001, 116, 319].

자가면역 질환은 신체가 자기 자신의 조직에 대해 면역 반응을 일으키는 것에 의해 유발되는 질병이다. 자가면역 질환의 원인은 알려지지 않았으나, 자가면역 질환의 발병에서 다수의 경우에 유전적인 소인(inherited predisposition)이 있는 것으로 보인다.

여러 유형의 자가면역 질환(예를 들면, 류마티즘열)에서, 세균 또는 바이러스가 면역 반응을 유발하고, 정상적인 세포들이 감염성 병균의 구조의 일부를 닮은 부분을 그들의 구조에 포함하고 있기 때문에 항체 또는 T-세포가 정상 세포들을 공격한다.

자가면역 질환은 크게 두 종류로 분류된다: 다수의 기관을 손상시키는 질환(전신성 자가면역 질환), 및 하나의 기관 또는 조직만이 자가면역 반응에 의해 직접적으로 손상되는 질환(국소성 자가면역 질환). 자가면역 질환의 가장 보편적인 종류의 일부를 하기에 요약한다:

전신성 자가면역 질환	국소성 자가면역 질환
류마티즘성 관절염(관절; 드물게는 폐, 피부)	타입 1 당뇨병(췌장의 랑게르한스섬)
루푸스[전신성 홍반성 루푸스] (피부, 관절, 신장, 심장, 뇌, 적혈구, 기타)	하시모토 갑상선염, 그레이브스병(갑상선)
피부 경화증(피부, 장, 드물게는 폐)	셀리악병, 크론씨병, 궤양성 대장염(위장관)
쇼그렌 증후군(침샘, 눈물샘, 관절)	다발성 경화증*, 길리안-바레 증후군(뇌)
구두패스츄어 증후군(Goodpasture's syndrome)(폐, 신장)	애디슨병(부신)
베게너 증후군(Wegener's syndrome) (누, 폐, 신장)	원발성 담즙성 경화증, 경화성 담관염, 자가면역성 간염(간)

염증 과정은 다수의 자극(예를 들면, 감염 매개체, 허혈, 항원-항체 상호작용, 및 열적 손상 또는 기타 신체적 손상)에 의해 유발될 수 있는 일련의 사건들을 포함한다. 각각의 유형의 자극은 주제(theme)에 대한 비교적 경미한 변화에 해당하는 특징적인 패턴의 반응을 유발한다. 거시적 수준에서, 그 반응은 일반적으로 홍반, 부종, 압통(tenderness) 및 통증의 잘 알려진 임상적 징후를 동반한다.

건선 환자에서 발견되는 증상들은 증생 및 표피층에서의 과다 대사(hypermetabolism)에 의한 세포들의 과도한 회전율(turnover)에 의한 표피 세포 들의 비정상적인 각질화, 표피층에서의 염증 반응의 무력증, 혈관확장 및 백혈구 이동 및 표피층으로의 유입을 포함한다. 그러나, 표피 증생은 병소 피부 영역(focal skin region)에서 면역계의 활성화에 대한 반응이고, 이는 뒤이어 질병 상태의 피부에 축적되는 CD8+ 및 CD4+ T-림프구에 의해 매개되는 것으로 이해된다. 실제로, 건선은 인간에서 가장 널리 유행하는 T 세포-매개 염증성 질환으로 알려져 있다. 따라서, 건선의 증상은 케라티노사이트의 과도하게 신속한 성장 및 피부 표면으로부터의 비늘의 탈리(shedding of scales)인 것으로 보인다. 건선 병변 내에서, 케라티노사이트 세포 주기는 약 8배 감소되고(정상 피부에서의 311시간 대비 36시간) 분열하는 세포의 수는 배가되어 증생성 표피(hyperplastic epidermis)를 초래한다. 약물 요법은 이 과정을 늦추는 것을 목표로 한다.

PUVA 요법이 질병 개선과 조화되어 림프구를 고갈시킨다는 것이 알려졌다. 이 데이터는 발병에서 T 세포의 역할과 일치한다. 면역억제제로 알려진 사이클로스포린은 질병 활성에 대해 현저한 효과를 갖는 것으로 확인되었다. 사이클로스포린은 T 세포 활성화에 대해 중요한 억제 효과를 갖기 때문에, 건선은 근본적으로 염증성 질환이라는 주장이 나타나기 시작했다.

건선 판(plaque)을 생성하기 위해 T-림프구는 진피에 침투하고 그 후 케라티노사이트에 부착되어야 한다. 따라서, T 세포 부착 및 소통(trafficking)을 조절하는 분자는 지속적인(tenable) 치료 표적이 되고 병리생리학에서 그의 역할이 매우 중요하다. 혈관내 부착 작용은 케모카인 유발(chemokine triggering)을 차단하거나 또는 인테그린 결합(LFA-1의 ICAM-1으로의 결합)을 차단하는 것에 의해 억제될 수 있다. 인테그린 차단(Integrin blockade) 또는 인테그린의 표면 발현의 감소는 항-건선 요법을 보조하는 림프구 소통을 위한 중요한 작용일 수 있다.

면역억제, 림프구 증식 억제, IL-2 억제, IFN-γ 억제, 또는 IL-10 유도와 같은 사이토카인 조절; 케라티노사이트 증식 억제, 각질 용해(keratolytic) 활성 및 MEST에서의 억제 활성이 항-건선 활성에 관여하는 것으로 알려져 있다.

건선의 완화를 위해 이용되는 상이하고 때때로 유독한 치료제의 수는 이 질병의 내성(resistant nature)을 반영한다. 건선 환자의 대다수(90%)가 이 질환의 한정된 형태를 가지기 때문에, 디트라놀, 타르 제제, 코르티코스테로이드 및 최근에 도입된 비타민 D3 유사체(칼시포트리올, 칼시트리올)를 포함하는 국소 치료제가 이용될 수 있다. 소수(10%)의 건선 환자는 보다 심각한 증상을 가지며, 이에 대해 다수의 전신성 치료 양식(therapeutic modalities)이 이용가능하다. 구체적인 전신 요법제는 UVB, PUVA, 메토트렉세이트, 비타민 A 유도체(아시트레틴) 및 사이클로스포린 A와 같은 면역-억제제가 있다. 사이클로스포린과 FK-506의 건선 치료에 대한 효과는 질병의 주요 원인으로서 T 세포 가설에 대한 지지를 제공한다.

코르티코스테로이드의 국소 이용은 건선의 증상을 경감시킨다. 그러나, 그와 같은 치료에서 요구되는 장기간 동안의 투여는 속성 내성(tachyphylaxis)을 유발하여 투여량이 증가되어야 하거나 또는 보다 강한 약물이 이용되어야 하고, 건선 병소에 국소적으로 적용될 때, 주변의 정상 피부의 위축 및 무색소증(achromasia) 또는 색소형성의 상실을 초래한다.[British National Formulary (BNF), March 2001, No. 41].

광 치료법(자외선 조사) 또는 소랄렌(psoralens)의 외부 또는 내부 적용 및 영향받은 부위에 대한 장파장 자외선의 적용으로 구성되는 광화학요법은 피부의 가속화된 노화 또는 색소 침착 및 발암 유도의 가능성과 같은 단점과 연관된다[British National Formulary (BNF), March 2001, No. 41].

스테로이드에 비해 부작용은 적으나, 석탄 타르(coal tar)의 외용은 번거롭고, 단점으로는 강한 냄새, 피부의 착색을 포함한다. 종종, 자극성 피부염(stimulant dermatitis)을 유발할 수 있다.

메토트렉세이트는 건선 증상을 치료하는 정선된 약물이나, 간 손상을 유발하거나 및/또는 산소를 운반하는 적혈구, 감염에 대항하는 백혈구 및 혈병을 증진시키는 혈소판의 생성을 감소시킬 수 있기 때문에 세심하게 모니터링되어야 한다. 소랄렌 및 메토트렉세이트의 장기간 이용은 건선 환자에서 편평세포암의 위험을 상당히 증가시킨다[Stern R. S., and Laird N., Cancer, 1994, 73, 2759].

에트레티네이트와 같은 레티노이드는 고질적인 건선을 앓는 환자들에 의해 내복된다; 그러나 이는 기형을 유발할 수 있으며 보다 장기간 동안 체내에 축적될 수 있으므로 임산부의 경우에는 복용이 금지된다 [Stern R. S., and Laird N., Cancer, 1994, 73, 2759].

사이클로스포린, 타크롤리무스 및 아스코마이신과 같은 거대고리형 면역억제제(macrocyclic immunosuppressive agen)의 이용은 신장 기능을 손상시키거나 또는 고혈압을 유발할 수 있다. 히드록시우레아의 발생가능한 부작용은 빈혈 및 백혈구 와 혈소판의 감소를 포함한다.

합성 비타민 D3 유사체인 칼시포트리올은 건선에 대해 널리 처방되는 치료제 중 하나가 되었다. 그러나, 이는 강력한 국소용 코르티코스테로이드보다 훨씬 더 많은 피부 염증(skin irritation)을 유발한다. 일반적인 부작용은 병소 또는 병소 주변부(perilesional) 염증, 안면 또는 두피 염증 또는 건선의 악화를 포함한다[Ashcroft D. M., Wan Po A. L., Williams H.C. and Griffiths C.E.M., BMJ, 2000, 320, 963].

건선 치료에 대한 현재의 생물공학적 접근방법은 세포 증식 또는 건선의 면역 성분에 대한 직접적인 약물-매개 공격(direct pharmaceutical-mediated attack)이다. 다양한 단계에서 면역 반응을 차단하는 것으로 알려진 클레놀릭시마브(Clenoliximab), MEDI-507, ICM3, IDEC-114, SMART 항-CD3, 제나팍스, 아마비브, Hul 134, 자넬림(Xanelim), HuMaxCD4, IC747, IDEC-114 IDEC-131, 누비온, DAB389IL-2, ONTAK 및 에트아르네르셉트(Etarnercept)와 같은 면역억제성 면역생물질(immunobiological)이 현재 임상 시험의 상이한 단계들에 있다.

그러나, 전술된 치료제들 중 어느 것도 범용적으로 안전하고 효과적인 것은 아니다. 건선의 영향의 강도는 우울증, 고혈압 및 울혈성 심부전과 같은 기타 질환의 경우와 유사하다. 건선을 치료하는 비용은 미국에서 평균적으로 연간 환자 1인당 800 달러이고, 건선은 생산성의 상당한 손실을 초래할 수 있다[Feldman S.R., American Academy of Dermatology, August 2000].

또한, 산발성(sporadic course) 때문에, 건선은 치료제에 대해 다양한 반응을 나타낼 수 있고, 그 반응은 또한 부작용을 가질 수 있다. 따라서, 건선은 치료 가 어려운 질병이다. 건선의 파괴적인 속성은 그 질병을 앓는 사람이 조만간 다시 재발할 것이라는 것을 알면서도, 그 질병의 경감을 얻기 위해 견디고자 하는 부작용의 정도에 의해 역설된다.

또한, 임상적인 발현 및 불편과는 별개로, 그 질환이 환자의 삶에 미치는 심리적 영향은 엄청나다. 건선은 환자의 감정 및 신체적 쇠약의 모든 측면에 영향을 미치고, 전세계적으로 수백만 명의 사람의 삶의 질을 실질적으로 저하시키는 복합적인 증상이다. 또한, 자주 명확하게 확인되듯이, 건선을 앓고 있는 개인들은 현저한 고통, 당혹감 및 불안을 겪는다[Fortune D. G., Richards H. L., Main C. J., and Griffiths C. E. M., J. Am. Acad . Dermatol., 1998, 39,196].

건선의 안전하고 내성이 양호하며(well-tolerated) 효과적인 치료를 제공하고 또한, 기존의 치료제의 단점 및 한계를 극복하는 식물 기원으로부터 유래된 조성물이 미국 특허출원 공개 제2003/0194456 A1호에 개시되었다.

미국 특허출원 공개 제2003/0194456 A1호는 선택적으로 쿠미눔 시미눔(Cuminum cyminum)의 과실로부터 수득된 추출물과 조합된, 아그레모네 멕시카나의 잎 및/또는 줄기로부터 수득된 수출물을 포함하는 건선 및 기타 질환의 치료 및 예방에 유용한 약제/조성물의 생체 내 및 생체 외에서 유용한 면역학적 활성 및 약학적 활성을 개시한다. 수성, 에탄올계 또는 수성-에탄올계 추출물일 수 있는 추출물은 유용한 면역학적 및 약학적 활성을 보이는 것 외에 정상적인 허용가능한 한계 내에서 보다 양호한 내성으로 PASI(Psoriasis Area and Severity Index) 점수 등급의 유의성 있는 감소를 제공한다. 만성적인 판형 건선(plaque type psoriasis)를 가진 환자들을 대상으로 수행된 개념 연구(concept study)의 증거에서, 전술된 추출물을 포함하는 조성물을 경구로 투여하는 경우 PASI 점수가 6.33±2.84에서 0.90±1.27로 감소되었고 치료 8주 후에 일부 환자들에서 질병 제거상태(disease free state)가 관찰되었다.

미국 특허출원 공개 제2003/0194456 A1호는 또한 식물체인 아르게모네 멕시카나의 잎 및/또는 줄기로부터 수득된 추출물을 마우스 및 랫트에 경구 및 복강 내 경로를 통해 투여하고 평가하여 급성 독성(LD₅₀)이 50% 사망율로 1000 mg/kg 동물의 체중을 초과하는 양인 것으로 보고한다.

본 명세서에서 아르게모네 멕시카나 식물체는 다양한 화합물들로 구성되며, 특히(inter alia)하기의 화합물을 포함하는 것으로 기재될 수 있다:

i) 프로토핀, 프로토핀 니트레이트, 베르베린, 베르베린 니트레이트, 크립토핀, 알로크립토핀, 콥티신, 산귀나린, 디히드로산귀나린, 노르산귀나린, 6-아세토닐 디히드로산귀나린, 디히드로켈에리트린, 켈에리트린, 노르켈에리트린, 6-아세토닐 디히드로켈에리트린, (-)-케일란티오폴린, (-)-β-스코울레린 메토히드록시드, (-)-α-스틸로핀 (-)-α 및 β-스틸로핀 메토히드록시드, (-)-케일란티오폴린, 6-아세토닐 디히드로산귀나린, (-)-α-테트라히드로팔마틴 메토히드록시드, 레티큘린, 탈리폴린, 뮤라민, 아르게모닌, 노르아르게모닌, 아르게멕시카인(argemexicaine) A, 아르게멕시카인 B, N-디메틸옥시산귀나린; (+)-1,2,3,4-테트라히드로-1-(2-히드록시메틸-3,4-디메톡시페닐메틸)-6,7-메틸렌디옥시-이소퀴놀린, 헬레리트린, 및 옥시히드라스티닌과 같은 알칼로이드;

ii) 이소람네틴(isorhmnetin), 이소람네틴-3-글루코시드; 이소람네틴-3-O-글루코시드, 이소람네틴-3,7-디글루코시드; 3-메톡시 퀘르세틴, 퀘르세틴 5,3',4' 트리메틸 에테르; 루테올린, 아르게멕시틴 및 에리오딕티올과 같은 플라보노이드;

iii) 팔미틱, 스테아릭, 아라키딕, 올레익, 리놀레익, 라우릭, 베헤닉, 리그노세릭, 헥사데세노익, 리시놀레익, 11-옥소-트리아콘타노익 및 11-히드록시 트리아콘타노익과 같은 지방산;

iv) 히스티딘, 라이신, 글루탐산, 글리신, 알라닌, 루이신, 발린, 페닐알라닌, 티로신, 쓰레오닌, 아르기닌, 세린, 아르파라긴, 시스테인, 메티오닌, 트립토판, 히드록시프롤린, 프롤린, L-글루타민, 히드록시프롤린, β-알라닌 및 아스파르트산과 같은 아미노산;

v) 글루코오스 및 프럭토오스 및 글리코시드와 같은 탄수화물;

vi) 숙신산, 시트르산, 타르타르산, 말레산 및 말산과 같은 유기산; 및

(vii) 세릴 알코올, β-시토스테롤, 포타슘 니트레이트, 칼슘 포스페이트 및 칼슘 술페이트와 같은 기타 화합물.

미국 특허출원 공개 제2003/0194456 A1호에 개시된 물, 에탄올 및 그의 혼합물을 이용한 추출, 예를 들면, 침수(maceration) 및 삼출(percolation) 방법을 이용하여 아르게모네 멕시카나 식물체의 잎 및/또는 줄기로부터 수득된 추출물은 실질적으로 전술된 화합물 모두를 포함한다. 다시 말하면, 추출물은 추출을 위해 이용된 식물체의 부분에 존재하는 모든 화합물들로 구성되며, 즉, 추출물은 알칼로이 드, 플라보노이드, 지방산, 유기산, 아미노산, 당 및 염의 혼합물로 구성된다.

미국 특허출원 공개 제2003/0194456 A1호에 기재된 방법에 따라 수득된 추출물은 생체 외 및 생체 외 면역학적 및 약학적 활성, 예를 들면, 면역억제, 림프구 증식 억제, IL-2 억제, IFN-γ 억제, 또는 IL-10 유도와 같은 사이토카인 조절; 케라티노사이트 증식 억제, 각질 용해 활성, 내피세포 증식 억제, ICAM-1과 같은 세포 부착 분자(cell adhesion molecule) 발현의 억제, MEST 억제 및 항-건선 활성에 관여하는 것으로 알려진 p60src 티로신 키나아제와 같은 효소 억제를 보이는 것으로 관찰되었다.

또한, 미국 특허출원 공개 제2003/0194456 A1호는 아르게모네 멕티카나 식물체의 잎 및/또는 줄기의 전술된 추출물은 n-부탄올 및 메탄올과 같은 알코올계 용매를 이용하여 분획화(fractionation)될 수 있고 수득된 그의 분획은 항-건선 활성을 포함한 체외 및 체내 면역학적 및 약학적 활성을 보이는 것으로 교시한다.

미국 특허출원 공개 제2003/0194456 A1호에 기재된, 아르게모네 멕시카나 식물체의 잎 및/또는 줄기의 수성 추출물의 분획화 과정은 다-단계, 액체-액체 분배 크로마토그래피 및 추출물의 건조를 통해 이루어지고 주요 성분으로서 실질적으로 상이한 종류의 화합물들을 포함하는 분획들을 제공한다.

예를 들면, 미국 특허출원 공개 제2003/0194456 A1호에 개시된 방법에 따라, n-부탄올 가용성 분획은 아르게모네 멕시카나의 잎 및/또는 줄기의 수성 추출물에 n-부탄올을 첨가하고, 상기 n-부탄올 층을 수성상으로부터 분리하는 단계, 및 뒤이어 상기 n-부탄올층을 물로 세척하고 감압하에 용매를 증발시켜 n-부탄올-가용성 분획을 점성이 있는 덩어리(viscous mass)로 제공하는 단계에 의해 제조된다. 상기 수성층을 메탄올과 혼합하고, 이때 고형 물질의 침전이 이루어진다. 상기 고형 물질을 분리하고 그 물질을 물에 용해하고 동결건조하여 메탄올-불용성 분획을 생성한다. 메탄올-물 혼합물로부터 증발에 의해 메탄올-불용성 침전물을 분리하여 수득된 여과물은 메탄올-가용성 분획을 고형물질로서 제공했다.

통상적으로, 아르게모네 멕시카나 식물체는 약 3-4.5%의 n-부탄올-가용성 분획; 46-54%의 290-340의 총 밑수(total base number)를 갖는 메탄올-가용성 분획; 및 24-30%의 350-380의 총 밑수를 갖는 메탄올-불용성 분획을 생성했다. 본 명세서에서 사용되는 밑수(base number)는 1g의 시료에 존재하는 모든 염기성 구성성분들을 중화시키기 위해 필요한 산의 양이다.

전술된 바와 같이, 3개의 분획들은 그 내부에 포함되어 있는 화합물들의 구성이 실질적으로 상이하다. n-부탄올 가용성 분획은 알칼로이드, 플라보노이드 및 기타 저분자량 화합물을 포함하는 것으로 확인되고; 메탄올-가용성 분획은 아미노산, 유기산 및 산을 포함하는 것으로 확인되었으며; 메탄올-불용성 분획은 당, 유기산 및 염을 포함하는 것으로 확인되었다.

수년간에 걸친 아르게모네 멕시카나 식물체의 상이한 부분들에 대한 광범위한 화학적 조사는 다수의 알칼로이드, 플라보노이드, 아미노산, 유기산, 지방산 등의 분리를 가져왔으나, 이 식물체에 존재하는 다른 주성분들의 분리 및 확인에 대한 체계적인 연구가 수행되고 보고된 적은 없다.

식물계에서 보편적으로 발견되는 하나의 그와 같은 주성분은 아라비노갈락탄 -단백질(AGP)이고, 이는 본질적으로 탄수화물이 단백질과 결합 또는 연결되어 있는 다당류(polysaccharide)의 거대분자이다. AGP는 주로 아라비노오스 및 갈락토오스 잔기들로 구성된다. 이들은 식물체에서 다양한 양의 단백질과 결합된 다당류로 존재하고 일반적으로 높은 비율의 탄수화물 및 상대적으로 더 낮은 비율, 일반적으로 10 미만의 단백질을 포함하나, 보다 높은 비율의 단백질을 갖는 AGP가 또한 알려져 있다. AGP는 에키나세아 푸르푸레아(Echinacea purpurea), 니코티나 알라타(Nicotiana alata), 비티스 비니페라(Vitis vinifera) 디오스피로스 카키(Diospyros kaki), 글라디올루스 간다벤시스(Gladiolus gandavensis), 롤리움 멀티플로룸(Lolium multiflorum)[Anderson, R.L., Clarke, A.E., Jermyn, M.A., Knox, R.B. and Stone, B.A., Australian J. Plant Physiol., 1977, 4, 143-158], 파세올루스 불가리스(Phaseolus vulgaris)[Hawes, G. B., Adams, G.A., Phytochemistry, 1972, 11, 1461-1465] 및 아카시아 아라비카(Acacia arabica) [Classen, B., Witthohn, K., and Blaschek, W., Carbohydrate Research, , 2000, 327, 497-504]와 같은 보다 고등 식물체의 대부분에 광범위하게 분포된다.

AGP는 부착성 및 함수성(water holding property)을 가지며 식물체에서 상처 및 감염에 대응한다. 이들은 세포적 동일성(identity) 및 특이적 상호작용을 결정한다. 그들은 또한 세포 및 조직 분화뿐 아니라 체세포 배발생 제어에서 역할을 수행한다. 그들은 또한 다양한 생물학적 활성을 가진 것으로 인정된다[WO 01/00682 A1, 2001]. 두 종류의 AGP, 즉, AGP I 및 AGP II가 있다. 후자, 즉, AGP II는 갈락토오스 심부(core)를 포함하고 고도로 분지되어 있으며(branched), 일반적으로 10% 미만의 단백질을 포함하고 아라비노푸라노실 잔기 및 종종 람노오스, 글루코오스, 만노오스 등과 같은 기타 당에 의해 고도로 치환된 곁사슬을 갖는다. 우론산 및 치환된 유도체의 존재가 또한 보고되었다.

전술된 바와 같이, 아르게모네 멕시카나의 모든 부분들의 화학적 연구가 수행되었으나, 이 식물체의 특정 부분에 존재하는 AGP의 분리, 특성 규명 및 그의 생물학적 특성들의 이해에 관한 연구는 없었다.

본 명세서에서 이용된 약자/부호의 설명

아라비노갈락탄-단백질 : AGP

고분자량 아라비노갈락탄-단백질 : AGP - HM

저분자량 아라비노갈락탄-단백질 : AGP - LM

본 발명은 미국 특허출원 공개 제2003/0194456 A1호에 개시된 식물체 아르게모네 멕시카나의 잎 및/또는 줄기의 추출물 및 분획에 비해 훨씬 탁월한 항-건선 활성 및 기타 유용한 면역학적 및 약학적 활성을 보이는, 식물체 아르게모네 멕시카나의 잎 및/또는 줄기로부터 수득된 추출물로부터 정제된 형태로 AGP를 분리하는 선택적인 방법을 제공한다. 특히, 상기 선택적인 방법에 의해 수득되는 정제된 AGP에 의해 발휘되는 훨씬 탁월한 항-건선 활성은 그 AGP를 포함하는 조성물의 제조에서 매우 유용하며 그에 의해 안전하고 효과적이며 양호한 내성의(well-tolerated) 치료제를 제공하고 본 발명의 근거를 형성하는 것으로 파악된다.

따라서, 본 발명의 일 양태는 아르게모네 멕시카나 식물체의 잎 및/또는 줄기로부터 고순도의 제형으로 정제된 아라비노갈락탄-단백질(AGP) 조성물을 분리하는 선택적인 방법을 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 아르게모네 멕시카나 식물체의 잎 및/또는 줄기로부터 분리된 10 KD 내지 150 KD의 평균 분자량 범위를 갖는 정제된 아라비노갈락탄-단백질(AGP) 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태는 매우 안전하고 효과적이며 양호한 내성을 가지면서 기존의 치료 계획(therapeutic regimen)의 단점 및 한계를 극복하는 것인 아르게모네 멕시카나 식물체의 잎 및/또는 줄기로부터 수득되는 항-건선 조성물 및 건선 치료제를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태는 면역억제, 림프구 증식 억제, IL-2 억제, IFN-γ 억제, 또는 IL-10 유도와 같은 사이토카인 조절; 케라티노사이트 증식 억제, 각질 용해 활성 및 MEST 억제 중 하나 이상과 같은 유용한 면역학적 및 약학적 특성을 갖는 아르게모네 멕시카나 식물체의 잎 및/또는 줄기로부터 선택적인 방법을 통해 분리된 정제된 아라비노갈락탄-단백질(AGP) 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태는 피부염; 피부경화증; 습진; 건선성 관절염, 류마티즘성 관절염, 크론씨병, 다발성 경화증, 과민성 장 질환(irritable bowel disease), 강직성 척추염(ankylosing spondilitis), 전신 홍반성 루푸스 및 쇼그렌 증후군과 같은 염증성 질환 및 기타 자가면역 질환; 및/또는 천식 및 만성 폐쇄성 폐질환과 같은 과민증과 같은 하나 이상의 질환의 치료 또는 예방을 위한, 아르게모네 멕시카나 식물체의 잎 및/또는 줄기로부터 선택적인 방법을 통해 분리되는 정제된 아라비노갈락탄-단백질(AGP) 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태는 아르게모네 멕시카나 식물체의 잎 및/또는 줄기로부터 선택적인 방법을 통해 분리되는 정제된 아라비노갈락탄-단백질(AGP) 조성물을 포함하는, 전술된 질환 및 증상의 치료 및/또는 예방을 위해 이용될 수 있는 약학적 조성물을 제공한다.

발명의 상세한 설명

달리 정의되지 않으면, 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 보편적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.

본 명세서에서 사용되는 "정제된 아라비노갈락탄-단백질(AGP) 조성물"이라는 구는 본질적으로 본 발명에 따른 아르게모네 멕시카나 식물체의 줄기 및/또는 잎의 추출물로부터 수득된 미량의 다른 성분들을 포함할 수 아라비노갈락탄-단백질로만 구성된 조성물을 의미한다. 정제된 AGP 조성물은 AGP 조성물을 포함하는 약학적 조성물과 구별되는데, 이는 정제된 AGP 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제를 전혀 포함하지 않기 때문이다.

미국 특허출원 공개 제2003/0194456 A1호에서, 본 발명자들은 아르게모네 멕시카나 식물체의 잎 및/또는 줄기로부터 추출물을 수득하고 그 추출물을 n-부탄올 및 메탄올로 분획화하여 n-부탄올-가용성, 메탄올-가용성 및 메탄올-불용성 분획을 생성하는 방법을 개시했다.

미국 특허출원 공개 제2003/0194456 A1호에 개시된 아르게모네 멕시카나 식물체의 줄기 및/또는 잎의 다양한 분획을 제조하는 방법은 하기의 단계들을 포함한다:

i) 다수의 추출 절차, 그러나 바람직하게는 물, 에탄올 또는 그의 혼합물을 이용한 실온에서의 다-단계, 연속적인 침수(maceration) 및 삼출(percolation)을 통해, 알칼로이드, 플라보노이드, 아미노산, 유기산, 당 및 염으로 구성된 상응하는 추출물을 얻는, 아르게모네 멕시카나 식물체의 줄기 및/또는 잎의 추출물을 제조하는 단계. 이 추출물은 그 자체로 이용되거나 또는 동결건조되어 동결건조된 제형(lyophilized mass)으로 생성되고, 양자 모두는 분획화를 위해 이용되었다;

ii) 상기 단계 i)에서 수득된 추출물 또는 물에 용해된 상기 동결건조된 제형의 용액을 n-부탄올에 의해 분배하고, n-부탄올층을 수성상으로부터 분리하는 단계 및 뒤이어 상기 n-부탄올 층을 물로 세척하고 감압 하에 용매의 증발에 의해 주로 알칼로이드, 플라보노이드 및 기타 저분자량 화합물로 구성된 n-부탄올-가용성 분획의 점성 있는 제형(viscous mass)을 생성하는 단계;

iii) 상기 단계 ii)로부터의 수성층을 그 부피의 약 6배 내지 7배의 메탄올과 혼합 및 교반하고 침전된 고형물을 여과/원심분리하고 건조하여 주로 다당류, 유기산 및 염으로 구성된 메탄올-불용성 분획을 생성하는 단계. 이 물질은 물에 용해되고 동결건조되어 동결건조된 분말을 생성한다; 및

iv) 상기 단계 iii)의 여과액, 즉, 수성 메탄올계 용액(aqueous methanolic solution)을 감압 하에 농축하여 주로 아미노산, 유기산 및 무기 염으로 구성된 메탄올-가용성 분획의 고체 제형을 생성하는 단계.

미국 특허출원 공개 제2003/0194456 A1호에 개시된 방법에 따라 제조된 메탄올-불용성 분획은 약 33%의 수율로 분리되었다. 상기 명세서에 그 분획은 당, 유기산 및 염으로 구성된다라는 기재가 있으나, 이 성분들은 당시에는 규명되지 않았었다.

본 연구는 미국 특허출원 공개 제2003/0194456 A1호에 개시된 방법에 따라 수득된 메탄올-불용성 분획은 (수성 추출물의) 중량 기준으로 약 3%의 AGP를 포함하고, 나머지 성분들은 유기산, 아미노산 및 무기염이며, 즉, 미국 특허출원 공개 제2003/0194456 A1호에 개시된 방법에 따라 수득된 메탄올-불용성 분획은 다른 성분들과의 혼합물로 AGP를 포함한다. 메탄올-불용성 분획은 낮은 농도이며 고도로 불순한 제형이기는 하나, AGP를 포함한다.

본 발명자들은 아르게모네 멕시카나의 줄기 및/또는 잎에 대해 약 0.06%의 수율로 또는 고도의 선택적 방법을 통해 그로부터 제조된 동결건조된 수성 추출물에 대해 약 1%의 수율로 정제된 제형의 AGP가 분리될 수 있고 분리된 AGP는 미국 특허출원 공개 제2003/0194456 A1호에 개시된 방법을 통해 수득된 것에 비해 훨씬 탁월한 항-건선 활성을 보인다는 것을 확인하였다.

아르게모네 멕시카나 식물체의 잎 및/또는 줄기로부터 정제된 제형으로 AGP를 분리하는 선택적인 방법은 하기의 단계들을 포함한다:

a) 1 중량부(wt part)의 아르게모네 멕시카나 식물체의 잎 및/또는 줄기를 1 내지 10 중량부의 물, C₁-C₃ 알코올 또는 그 혼합물로 추출하여, 부분적으로 또는 완전히 농축되거나 또는 동결건조될 수 있으나, 반드시 농축 또는 동결건조될 필요는 없는 수성 추출물을 얻는 단계;

b) 상기 단계 a)에서 수득된 수성 추출물, 부분적으로 농축된 추출물, 완전히 농축된 추출물 또는 동결건조된 추출물의 수용액으로부터 염기성 성분 및 산성 성분을 제거하기 위해 상기 부분적으로 농축된 추출물 또는 상기 농축된 추출물의 수용액에 대해 이온교환 크로마토그래피를 수행하여 중성의 수성 추출물을 수득하는 단계;

c) 상기 단계 b)에서 수득된 중성의 수용성 추출물을 분획화하여 n-부탄올-가용성 분획을 생성하는 단계;

d) 상기 단계 c)로부터의 수성 세척물(aqueous washes)을 메탄올 또는 에탄올과 혼합 및 교반하고 침전된 고형물을 분리하여 메탄올 또는 에탄올-불용성 분획을 수득하는 단계; 및

e) 상기 단계 d)에서 수득된 메탄올 또는 에탄올-불용성 분획에 대해 연속적으로 겔 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피를 수행하여 정제된 아라비노갈락탄-단백질(AGP)를 수득하는 단계.

정제된 AGP를 분리하는 선택적인 방법이 도 1에 요약된다.

추출을 위해, 아르게모네 멕시카나 식물체의 잎, 줄기 또는 양자 모두가 사용될 수 있다. 바람직하게는, 신선한 잎, 줄기 또는 양자 모두가 이용되고, 이들은 추출 전에 거친(coarse) 페이스트 또는 고운(fine) 페이스트로 분쇄한다.

본 발명의 구체예에서, 1 중량부의 아르게모네 멕시카나의 분쇄된 신선한 잎 및/또는 줄기가 1 내지 10 중량부의 물, C_{1 -3} 알코올 또는 그의 혼합물로 2 내지 4회 추출되고 합쳐진 추출물은 20EC 내지 45EC의 온도에서 2 내지 20시간 동안 삼출된다.

또 다른 구체예에서, 1 중량부의 아르게모네 멕시카나의 분쇄된 신선한 잎 및/또는 줄기는 1 내지 3 중량부의 물, C_{1 -3} 알코올 또는 그의 혼합물로 2 내지 4회 추출되고 합쳐진 추출물은 20EC 내지 45EC의 온도에서 2 내지 16시간 동안 삼출된다.

또 다른 구체예에서, 1 중량부의 아르게모네 멕시카나의 분쇄된 신선한 잎 및/또는 줄기는 1 내지 1.5 중량부의 물, C_{1 -3} 알코올 또는 그의 혼합물로 2 내지 4회 추출되고 합쳐진 추출물은 실온에서 16시간 동안 삼출된다.

C₁-C₃ 알코올은 메탄올, 에탄올, 1-프로판올 및 2-프로판올로부터 선택되고, 바람직하게는 에탄올이다.

삼출 후에, 추출물을 여과하거나 원심분리하고 여과액은 추출물의 원래 부피 대비 특정 부피까지 부분적으로 농축되거나 또는 건조될 때까지 농축되거나 또는 동결건조될 수 있다.

추출물이 부분적으로 농축되는 경우, 추출물의 원래 부피의 1/5 내지 1/10의 부피까지 농축된다. 원래의 추출물이 건조될 때까지 농축되거나 또는 동결건조되는 경우, 건조된 추출물 또는 동결건조된 분말은 이온 교환 크로마토그래피 전에 1 중량부의 건조/동결건조된 제형에 대해 중량 기준으로 12 내지 50배의 물에 재용해될 수 있다.

바람직한 구체예에서, 동결건조된 수성 추출물은 이온 교환 크로마토그래피 전에 12배의 물에 용해되었다.

그 후, 부분적으로 농축된 추출물의 용액 또는 최초 추출물의 완전한 농축으로 수득된 농축된 또는 동결건조된 추출물의 수용액에 대해 양이온 수지 상에서의 이온 교환 크로마토그래피 및 뒤이어 음이온 교환 수지 상에서의 크로마토그래피를 순차적으로 수행하거나 또는 또 다른 구체예에서 음이온 교환 수지 상에서의 이온 교환 크로마토그래피 및 뒤이은 양이온 교환 수지 상에서의 크로마토그래피를 수행하여 중성의 수성 추출물을 생성한다.

양이온 및 음이온 교환 수지는 이용된 추출물의 부피에 대해 1 중량부 내지 50 중량부의 비율로 이용한다.

이용될 수 있는 적합한 양이온 교환 수지는 술폰화된 폴리스티렌 강산 양이온 교환기 및 카르복시산-형 약산 양이온 교환기를 포함한다. 적합한 양이온 교환 수지는 상업적으로 구매가능하고 통상적으로 이용되는 AG 50W(Bio-Rad, USA), Amberlite IR-20(Rohm and Haas, USA), Dowex 50W(Dow Chemical Co., USA), Duolite 225(Dia-Prosim Ltd), Permutit RS(Permutit AG, Germany), 및 Permutite C50D(Philips and Pain-Vermorel, France)와 같은 술폰화된 폴리스티렌 강산 양이온 교환기; 및 Amberlite IRC-50(Rohm and Haas, USA), Bio-Rex 70(Bio-Rad, USA), Chelax 100 (Bio-Rad, USA), Duolite 436(Dia-Prosim Ltd), Permutit C(Permutit AG, Germany), 및 Permutit H and H-70(Permutit Co., USA)과 같은 카르복시산-형 약산 양이온 교환기를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이용될 수 있는 적합한 음이온 교환기는 지방성 아민(aliphatic amine)-형 약염기 음이온 교환기 및 강염기 음이온 교환기를 포함한다. 음이온 교환 수지는 상업적으로 구매가능하고 통상적으로 이용되는 Amberlites IR-45 및 IRA-67(Rohm and Haas, USA), Dowex 3(Dow Chemical Co., USA), Permutit E(Permutit AG, Germany), Permutit A 240A(Philips and Pain-Vermorel, France)와 같은 지방성 아민-형 약 염기 음이온 교환기; 및 AG 2x8(Bio-Rad, USA), Amberlite IRA-400(Rohm and Haas, USA), Dowex 2x8(Dow Chemical Co., USA), Duolite 113(Dia-Prosim Ltd), Permutit ESB(Permutit AG, Germany), 및 Permutite 330D(Philips and pain-Vermorel, France)와 같은 강 염기 음이온 교환기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

그에 의해 수득되는 중성의 수성 추출물은 동결건조될 수 있고 동결건조된 제형은 다음의 분획화 단계를 위해 n-부탄올과 물 사이에 분배될 수 있다. 대안적으로, 중성의 수성 추출물은 n-부탄올에 의한 분획화를 위해 그 자체로 이용될 수 있다. 비용-효율성을 위해, n-부탄올에 의한 분획화를 위해 양이온 및 음이온 교환 수지를 통과한 후 수득된 중성의 분획의 용액을 이용하는 것이 바람직하다.

통상적으로, 전술된 중성 추출물의 동결건조된 제형은 1 중량부(1 part)의 동결건조된 제형에 대해 물과 n-부탄올의 혼합물에서 분배된다. 상기 용액을 방치하여 n-부탄올 층이 수성상으로부터 분리되게 한다. 그 단계를 2회 내지 4회 반복하고 합쳐진 수성층을 메탄올 또는 에탄올에 의한 추가적인 분획화를 위해 이용한다.

본 발명의 실시예에서, 양이온(Amberlite IR 120) 및 음이온(Amberlite IRA 400) 교환 수지를 통과한 후 수득되는 중성의 수성 분획의 용액의 단위 부피부(1 part by volume)를 약 10 부피부의 n-부탄올에 첨가한다. 상기 상들을 혼합하고 방치하여 n-부탄올 층이 수성상으로부터 분리되게 한다. 그 단계를 2회 내지 4회 반복하고 합쳐진 수성층을 메탄올 또는 에탄올에 의한 추가적인 분획화를 위해 이용한다.

전술된 단계에서 수득된 합쳐진 수성 상을 메탄올 또는 에탄올과 혼합하고 메탄올/에탄올-불용성 분획을 침전시키기 위해 흔들어준다. 통상적으로, 메탄올 또는 에탄올은 수성 추출물의 1 부피부 당 1 내지 20배의 부피로 이용된다.

AGP를 포함하는 침전된 고형물을 경사분리(decantation), 여과, 원심분리 등과 같은 통상적인 수단에 의해 분리하고 건조하여 갈색의 무정형 분말을 생성한다.

정제된 AGP-HM 및 AGP-LM을 수득하기 위해 AGP-HM 및 AGP-LM을 포함하는, 그에 의해 수득된 고형의 AGP에 대해 순차적인 겔 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피를 수행한다.

겔 크로마토그래피는 통상적인 기법 및 XAD-2, XAD-4 또는 XAD-7, 바람직하게는 XAD-7과 같은 Amberlite 흡착제와 같은 폴리머 흡착제를 이용하여 수행한다. 불순한 고형의 AGP를 필요한 컬럼의 상부에 좁은 밴드로 적용하고 물인 이동상에 의해 세척한다. AGP를 포함하는 분획을 회수한다.

불순한 AGP를 포함하는 용리액을 대상으로 통상적인 기법을 이용하여 추가적으로 크기 배제 크로마토그래피를 수행한다. 본 발명의 정제된 AGP, AGP (HM) 및AGP (LM)을 수득하기 위해 세파크릴(1:25-1:50)이 이용될 수 있다. 상업적으로 구매가능한 Sephracyl S-100, S-200 HR 및 S-300 HR이 이용될 수 있고, 바람직한 것은 S-200 HR이다. 세파크릴은 겔 크로마토그래피 후에 수득된 AGP 용액의 25 내지 250 부피부에 대해 1 내지 2 중량부의 비율로 이용될 수 있다.

일 구체예에서, 정제되지 않은 AGP (100mg)를 물에 용해시키고 세파크릴 S-200 (25ml)에 적재(load)한다. 컬럼을 0.5ml/분의 속도로 용리시키고 50개의 분획들을 채취하였다. 모든 분획들을 HPLC-ELSD로 모니터링하였다. HPLC에 근거하여 10번에서 20번까지의 분획들을 결합하여 AGP-HM을 생성하고 25번에서 35번의 분획들을 결합하여 AGP-LM을 생성하였고, AGP 조성물의 성분들은 10 KD 내지 150 KD의 평균 분자량 범위를 가졌다.

크기 배제 크로마토그래피 후에, 본 발명의 정제된 AGP는 증발, 동결건조, 분사 건조, 동결 건조 등과 같은 통상적인 기법을 통해 수용액으로부터 분리될 수 있다.

그에 의해 수득되는 정제된 AGP는 10 KD 내지 150 KD의 평균 분자량 범위를 보이는 것으로 확인된다. 정제된 AGP는 다음 중 하나 이상의 효과를 보이는 것으로 확인된다: 면역억제, 림프구 증식 억제, IL-2 억제, IFN-γ 억제, 또는 IL-10 유도와 같은 사이토카인 조절, 케라티노사이트 증식 억제, 각질 용해 활성 및 MEST 억제. 이들은 염증성 질환, 자가면역 질환 및 과민증에 관여하는 것으로 알려져 있다. 이들은 또한 항-건선 활성, 피부염, 피부 경화증, 습진 및 비늘처럼 벗겨지고 가려운 패치(scaly itchy patch)에 관여하는 것으로 알려져 있다. 염증성 질환 및 자가면역 질환은 건선성 관절염, 류마티즘성 관절염, 크론씨병, 다발성 경화증, 과민성 장 질환, 강직성 척추염, 전신 홍반성 루푸스 및 쇼그렌 증후군을 포함한다. 건선의 유형은 판형 건선(plaque psoriasis), 점상(guttate) 건선, 농포성 건선(pustular psoriasis) 및 손발톱의 건선을 포함한다. 과민증은 천식 및 만성 폐쇄성 폐질환을 포함한다. IL-10 유도는 또한 피부 림프구 항원(CLA) 또는 피부 백혈구 항원(cutaneous leukocyte antigen)이 관여되는 기타 만성, 재발성 및 기타 피부 질환에서 유용하다.

정제된 아라비노갈락탄-단백질(AGP) 조성물은 IL-10 유도를 통해 매개되는 체외 및 체내에서 탁월한 항-건선 활성을 보인다.

예를 들면, 세파크릴 상에서의 크기 배제 크로마토그래피 후에 수득된 본 발명의 정제된 (수용성인) AGP는 분자량이 상이한 수 개의 분획들로 구성된다. 그와 같은 분획들은 최고 115 내지 150 KD 및 최저 10 내지 15 KD의 평균 분자량을 갖는다. 고 분자량의 AGP는 AGP-HM으로 지칭하고, 저 분자량의 AGP는 AGP-LM으로 지칭한다. 통상적인 AGP 조성물은 따라서 다양한 비율의 AGP-HM 및 AGP-LM으로 구성된다. 전술된 AGP는 생물발생학적 경로(biogenetic pathwa)를 통해 형성되며, 이 때 탄수화물/단당류가 지속적으로 단백질에 대해 공유 결합 형성을 추구하여, 궁극적으로 저 분자량 AGP(AGP-LM) 및 고 분자량 AGP(AGP-HM)를 생성한다. 그와 같은 공유 결합 형성은 지속적으로 전파되고, 하나의 특정한 방법에서 10 KD 미만의 평균 분자량을 갖는 AGP-LM을 생성하는지 또는 150 KD을 초과하는 평균 분자량을 갖는 AGP-HM을 생성하는지 여부는 여러 인자들에 의해 좌우되고 이 인자들은 일부 예를 들면, 이용되는 식물체의 부위의 속성, 즉, 아르게모네 멕시카나 식물체의 신선한 잎 또는 줄기가 추출을 위해 사용되었는지 여부, 잎의 수확 조건들, 즉, 우기에 수확되었는지 여부 등이다. 따라서, 전술된 인자들에 따라, 본 발명의 방법을 이용하여 10 KD 내지 150 KD 범위의 외부에 속하는 평균 분자량을 갖는 정제된 AGP 조성물이 수득되는 것이 가능하다. 전술된 바를 고려할 때, 10 KD 내지 150 KD 범위의 외부에 속하는 평균 분자량을 갖는 AGP 조성물도 여전히 본 발명의 범위 내에 속할 것이다. 그와 같은 AGP 조성물의 예들은 9 KD의 평균 분자량 하한을 갖는 조성물 또는 155 KD의 평균 분자량 상한을 갖는 조성물이 있다.

본 발명에 의해 수득되는 AGP의 대부분은 보다 소량의 단백질과 함께 탄수화물로 구성된다. AGP의 탄수화물 성분은 본 명세서의 표 I 및 표 II로부터 명확히 알 수 있는 바와 같이, 아스파라긴, 글루타민, 히드록시프롤린, 세린, 글리신, 히스티딘, 아르기닌, 쓰레오닌, 알라닌, 프롤린, 티로신, 발린, 메티오닌, 이소루이신, 루이신, 라이신, 페닐알라닌 등으로 확인되는 다양한 아미노산으로 구성된 단백질 성분에 연결된, 아라비노오스, 람노오스, 메틸화된 우론산, 만노오스, 갈락토오스, 글루코오스 및 기타 미확인(unidentified) 당이다.

AGP-HM 및 AGP-LM의 글리코실 조성물이 유사하고, 즉, 그들은 그 내부에 존재하는 단당류 및 단백질의 비율에 있어서 유사성을 보이며 또한 양 경우 모두에서 글리코실 결합(glycosyl linkage)도 유사하다는 것이 주목된다.

또한, 고 분자량과 저 분자량 성분들 모두의 생물학적 활성은 유사하고 큰 변동을 보이지 않는다는 것도 주목된다. 즉, 10 KD의 분자량을 갖는 정제된 AGP-LM은 하나 이상의 면역억제, 림프구 증식 억제, IL-2 억제, IFN-γ 억제, 및 IL-10 유도와 같은 사이토카인 조절; 케라티노사이트 증식 억제, 각질 용해 활성, MEST 억제 효과 및 가장 중요하게는 150 KD의 분자량을 갖는 정제된 AGP-HM에 의해 발휘되는 것에 유사한 항-건선 활성을 보인다.

본 발명의 AGP 조성물은 식물체의 추출물에 존재하는 기타 성분들, 알칼로이드, 플라보노이드, 유기산, 아미노산, 당, 다당류, 단백질, 프로테오글리칸(AGP 제외) 및 염의 혼합물이 실질적으로 제거된 AGP(AGP-HM 및AGP-LM)로 구성된다. 본 명세서에서 사용되는 "실질적으로 제거된(substantially free)"이라는 용어는 식물체의 추출물의 다른 기타 성분들을 중량기준으로 약 0.0001% 내지 약 10%로 포함하는 AGP 조성물을 포함하는 것으로 의도된다.

n-부탄올 분획은 (프로토핀, 프로토핀 니트레이트, 베르베린, 베르베린 니트레이트, 크립토핀, 알로크립토핀, 콥티신, 산귀나린, 디히드로산귀나린, 노르산귀나린, 6-아세토닐 디히드로산귀나린, 디히드로켈에리트린, 켈에리트린, 노르켈에리트린, 6-아세토닐 디히드로켈에리트린, (-)-케일란티오폴린, (-)-β-스코울레린 메토히드록시드, (-)-α-스틸로핀 메토히드록시드, 6-아세토닐 디히드로산귀나린, (-)-α-테트라히드로팔마틴 메토히드록시드, 레티큘린, 탈리폴린, 뮤라민, 아르게모닌, 노르아르게미닌(norargeminine), 헬레리트린, 및 옥시히드라스티닌과 같은)알칼로이드, (이소람네틴, 이소람네틴-3-글루코시 및 이소람네틴-3,7-디글루코시드와 같은) 플라보노이드 및 기타 저 분자량 화합물을 포함하고;

메탄올-가용성 분획은 (히스티딘, 라이신, 글루탐산, 글리신, 알라닌, 루이신, 발린, 페닐알라닌, 티로신, 트레오닌, 아르기닌, 세린, 아르파라긴, 시스테인, 메티오닌, 트립토판, 히드록시프롤린, 프롤린 및 아스파르트산과 같은) 아미노산, 당 및 일부 염을 포함하며;

메탄올-불용성 분획은 (숙신산, 시트르산, 타르타르산, 및 말산과 같은) 일부 유기산, 단당류, 다당류, 프로테오글리칸(AGP 포함) 및 염을 포함한다.

본 발명의 일 구체예에서, AGP 조성물은 식물체의 추출물의 다른 성분들을 중량 기준으로 1% 미만 포함한다.

본 발명의 방법에 의해 분리되는 정제된 AGP 조성물은 ConA 활성화된 인간 PBMC에서 IL-10에 대한 탁월한 유도 물질(inducer)인 것으로 확인된다. 상기 AGP 조성물은 200 ㎍/ml의 농도에서 약 371%의 유도를 생성했고, 이는 미국 특허출원 공개 제2003/0194456 A1호에 개시된 방법을 통해 수득된 메탄올-불용성 분획에 의해 동일한 농도인 200 ㎍/ml에서의 약 171% 유도에 비해 훨씬 탁월하다.

보다 특별하게는, 분리된 AGP 조성물은 0.2 내지 2.0 ㎍/ml의 매우 낮은 농도에서도 미국 특허출원 공개 제2003/0194456 A1호에 개시된 방법을 통해 수득된 메탄올-불용성 분획에 보여지는 것과 동일하거나 또는 더 큰 IL-10 유도 효과를 보인다는 점에서 주목할 만하다.

본 발명의 AGP의 농도의 ConA 유도 인간 PBMC에 의한 IL-10 유도에 대한 효과와 미국 특허출원 공개 제2003/0194456 A1호에 개시된 방법을 통해 수득된 메탄올-불용성 분획에 의한 효과의 비교가 하기의 표 IA에 요약된다.

표 IA

ConA 유도 인간 PBMC 에 의한 IL -10 유도에 대한 본 발명의 AGP 조성물의 효과와 미국 특허출원 공개 제2003/0194456 A1호에 기재된 방법에 의해 제조된 메탄올-불용성 분획의 효과 비교.

일련 번호	본 발명의 AGP 조성물의 농도(㎍/ ml )	평균 퍼센트 유도	미국 특허출원 공개 제2003.0194456 A1호의 방법에 의해 수득 된 메탄올-불용성 분획의 농도	평균 퍼센트 유도 (미국 특허출원 공개 제2003.0194456 A1호의 표 8에 주어진 바와 같음)
01	200.00	371.40	200.00	171.10
02	20.00	303.80	20.00	162.10
03	2.00	237.30	2.00	98.30
04	0.20	137.20	0.20	24.60
05	0.02	114.30	0.02	-4.00
06	0.002	106.00	0.002	-5.00
07	0.0002	102.60	0.0002	--

*값들은 대조구 대비 기준값(basal)으로부터의 퍼센트 증가로 표현된다.

** 미국 특허출원 공개 제2003/0194456 A1호에 개시된 방법을 통해 수득된 메탄올-불용성 분획에 의해 발휘된 평균 % 유도는 200 ㎍/ml의 농도에서 171%였다.

본 명세서에서 전술된 방법에 방법에 의해 수득된 AGP에 의한 그와 같이 훨씬 강력한 활성은 AGP가 미국 특허출원 공개 제2003/0194456 A1호에 개시된 방법을 통해 수득된 추출물/분획을 이용하여 투여되어야 하는 투여량의 1/100 내지 1/1000의 실질적으로 감소된 농도로 투여될 수 있게 하고, 이에 의해, 건선 및 기타 질환에 대한 비용-효과적이고 내성이 양호한 치료제를 제공한다.

본 발명은 약학적으로 허용가능한 부형제와 혼합된, 전술된 선택적 방법에 의해 아르게모네 멕시카나의 잎 및/또는 줄기로부터 분리된 10 KD 내지 150 KD의 평균 분자량 범위를 갖는 정제된 아라비노갈락탄-단백질(AGP) 조성물의 유효량을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 안전하고, 효과적이며 내성이 양호하다.

본 발명에서의 이용에 적합한 약학적 조성물은 활성 성분이 원하는 목적을 달성하기 위한 유효량으로 포함된 조성물을 포함한다. 유효량(effective amount)이라는 용어는 대상이 되는 조직, 세포, 계(system), 동물, 인간을 제외한 포유 동물, 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응을 일으킬 AGP 조성물의 양을 의미한다. 이는 그들이 본 명세서에 기재된 질병 및/또는 증상의 진행의 둔화, 차단, 저지, 또는 중단일 수 있는 상황을 의미하도록 의도되나, 반드시 모든 질병 및 증상의 완전한 제거를 의미하지는 않고, 그러나 질병 및/또는 증상의 예방적 치료를 포함한다.

본 발명의 AGP 조성물은 담체, 희석제, 충전제 등과 같은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제와 혼합되어 적합한 투여 제형으로 제조될 수 있다. 적합한 투여 제형은 경구 투여 또는 국소 투여에 적합한 제형이다. 그와 같은 투여 제형의 비-한정적인 예들은 액체, 건조 분말 또는 분말화된 농축액, 캡슐, 정제, 펠렛, 과립, 겔, 연고, 크림, 유제, 현탁액, 분산액, 로션, 알약 등이다.

일반적으로 경구 투여용의 통상적인 약학적 조성물은 활성 성분으로서 50-5000 mg, 바람직하게는 200 mg의 양으로 AGP 조성물을 포함한다.

일반적으로 국소 투여용의 통상적인 약학적 조성물은 활성 성분으로서 중량 기준으로 0.1-10%, 바람직하게는 중량 기준으로 2%의 양으로 AGP 조성물을 포함한다.

AGP 조성물 또는 AGP 조성물을 포함하는 조성물의 예방적 또는 치료적 투여량은 1일 50 mg 내지 5000 mg, 바람직하게는 1일 200 mg이다. 투여량은 단일 투여량 또는 분리된 투여량으로 투여될 수 있다.

그러나, 정확한 제제, 투여 경로 및 투여량은 환자의 조건 및 환자가 현재 그 질병 또는 증상을 가지고 있는지 여부 또는 치료가 예방목적인지 여부를 고려하여 환자 또는 의료 전문가에 의해 선택될 수 있다. 예방적 투여량은 질병이나 증상이 발생할 위험에 있는 환자에게 투여될 수 있다. 위험 인자들은 유전적 위험 인자 및 환경적 위험 인자를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 약학적 조성물을 불필요한 부작용을 유발하지 않으면서 원하는 결과를 생성할 수 있는 투여량으로 투여하는 것이 바람직하다. 본 명세서에서 사용되는 "환자(patient)"라는 용어는 동물, 인간을 제외한 포유 동물, 또는 인간을 의미한다.

약학적으로 허용가능한 담체와 혼합된 본 발명의 AGP 조성물을 포함하는 경구 투여 및 국소 적용용 투여 제형이 제조될 수 있다.

경구 투여의 적합한 제형은 정제, 캡슐, 분말화된 농축제, 시럽, 엘릭시스 또는 현탁액을 포함한다. 국소 적용의 적합한 제형은 연고, 크림, 로션, 오일 또는 경피 약물 전달 시스템을 포함한다.

적합한 약학적으로 허용가능한 부형제는 락토오스, 수크로오스, 만니톨, 솔비톨 및 자일리톨과 같은 당; 옥수수 전분, 타피오카 전분 및 감자 전분과 같은 전분; 셀룰로오스 및 소디움 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 및 메틸 셀룰로오스와 같은 그 유도체; 디칼슘 포스페이트 및 트리칼슘 포스페이트와 같은 칼슘 포스페이트; 소디움 술페이트; 칼슘 술페이트; 폴리비닐피롤리돈; 폴리비닐 알코올; 스테아르산; 낙화생유, 면실유, 참기름, 올리브유 및 옥수수유와 같은 식물성 오일; 비-이온성, 양이온성 및 음이온성 계면활성제; 에틸렌 글리콜 폴리머; β-사이클로덱스트린; 지방산 알코올; 가수분해된 곡물 고형물; 및 기타 무독성 융화성(compatible) 충전제, 결합제, 붕해제, 완충제, 보존제, 항산화제, 윤활제, 향미제 등을 포함한다.

본 발명의 조성물은 그 기술 분야에서 공지된 통상적인 기법에 따라 제조된다.

조성물은 약학적으로 허용가능하며 이는 인간 및/또는 동물에 대해 적용하기에 적합하다는 것을 의미한다.

본 발명의 AGP 조성물 및 약학적 조성물은 본 명세서에 기재된 질병 및 증상의 치료 및/또는 예방에 유용하다.

본 발명의 AGP 조성물 또는 본 발명의 AGP 조성물을 포함하는 약학적 조성물은 판형 건선, 점상 건선, 농포성 건선 및 손발톱의 건선을 포함하는 건선과 같은 건선 피부 질환의 치료 및/또는 예방에서 이용될 수 있고, 이는 그와 같은 치료를 필요로 하는 포유 동물 또는 건선 피부 질환을 가질 위험이 있는 포유 동물에게 AGP 조성물 또는 정제된 아라비노갈락탄-단백질(AGP) 조성물의 치료적 유효량을 포함하는 약학적 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명의 AGP 조성물 또는 본 발명의 AGP 조성물을 포함하는 약학적 조성물은 염증성 질환; 건선성 관절염, 류마티즘성 관절염, 크론씨병, 다발성 경화증, 과민성 장 질환, 강직성 척추염, 전신 홍반성 루푸스 및 쇼그렌 증후군과 같은 자가면역 질환; 천식 및 만성 폐색성 폐질환과 같은 과민증의 치료 또는 예방에서 이용될 수 있다. 치료 또는 예방은 그와 같은 치료를 필요로 하는 포유동물 또는 이와 같은 질환 또는 질병 중 하나가 발병하거나 또는 그 발병을 경험할 위험에 있는 포유 동물에게 AGP 조성물 또는 치료적 유효량의 정제된 아라비노갈락탄-단백질(AGP) 조성물를 포함하는 약학적 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.

면역억제를 유발하는 본 발명의 조성물은 또한 기관 이식을 받을 것으로 예상되거나 또는 기관 이식을 받은 환자에게 유용한다.

AGP 조성물의 구조적 설명 및 특징 규명

AGP 조성물의 탄수화물 함량 결정

본 발명의 AGP 조성물의 총 탄수화물 함량은 D-갈락토오스를 표준으로 이용한 페놀-황산 방법(phenol-sulphuric acid method)에 의해 결정하였다. AGP 조성물, AGP-HM 및 AGP-LM을 각각 증류수에 0.16 mg/ml의 농도로 용해시켰다. 상기 세 개의 용액 각각의 1 ml에 1 ml의 5% 페놀 용액 및 10 ml의 황산을 첨가하였다. 이들을 볼텍싱하여 혼합하고 실온까지 냉각시켰다. 480 nm에서 흡광도를 측정하였다. AGP 조성물의 탄수화물 함량은 갈락토오스 표준을 기초할 때 각각 45-98%인 것으로 확인되었다.

AGP 조성물의 단백질 함량 결정

본 발명의 AGP 조성물의 총 단백질 함량은 브래드포드(Bradford) 방법에 의해 결정하였다. AGP 조성물, AGP-HM 및 AGP-LM의 단백질 함량은 2-20%였다. AGP 조성물의 아미노산 구성은 표준을 이용한 아미노산 분석기에 의해, 아스파라긴, 글루타민, 히드록시프롤린, 세린, 글리신, 히스티딘, 아르기닌, 쓰레오닌, 알라닌, 프롤린, 티로신, 발린, 메티오닌, 이소루이신, 루이신, 라이신 및 페닐알라닌인 것으로 확인되었다.

가수분해 및 TLC에 의한 AGP 조성물의 글리코실 및 아미노산 함량 확인

크기 배제 크로마토그래피 후에 수득된 20 mg의 중성 분획을 폐쇄된 바이알에 넣고 2M 트리플루오로 아세트산(TFA, 200 ml)으로 가수분해시켰다. 그 바이알을 100℃에서 1시간 동안 가열하고 농축 및 동결건조시켰다. 그 혼합물의 박막 크로마토그래피(TLC)를 표준 당 및 아미노산 시료와 함께 전개시켰다. 수득된 결과는 아라비노오스, 갈락토오스, 글루코오스, 람노오스 및 만노오스와 같은 단당류의 존재를 보여주었다. 발린, 페닐알라닌, 세린, GABA, 이소루이신 및 히스티딘과 같은 아미노산도 관찰되었다.

AGP 조성물의 글리코실 함량 확인

글리코실 조성물 분석은 AGP-HM 및 AGP-LM으로부터 산성 메탄 분해(acidic methanolysis)에 의해 생성된 단당류 메틸 글리코시드의 퍼-O-트리메틸실릴(per-O-trimethylsilyl:TMS) 유도체의 통합된 기체 크로마토그래피/질량 스펙트럼(GC/MS)에 의해 수행하였다.

먼저, AGP의 건조 상태 시료로부터 80℃에서 메탄올에 담긴 1M HCl에서의 메탄 분해(18-22시간) 및 뒤이어 메탄올에 담긴 피리딘 및 아세트산 무수물에 의한 재-N-아세틸화(re-N-acetylation)에 의해 메틸 글리코시드를 제조하였다(아미노 당의 검출). 그 후, 시료를 80℃에서 (0.5시간 동안) 트리-실(Pierce)로 처리하여 퍼-O-트리메틸실릴화시켰다. 이 절차는 York, W. S., Darvill, A. G., McNeil, M., Stevenson, T. T., and Albersheim, P., Methods Enzymol ., 1985, 230, 1-15 and Methods Enzymol ., 1985, 118, 3-40에 기재된 바에 따라 수행하였다.

TMS 메틸 글리코시드의 GC/MS 분석은 All Tech EC-1 용융 실리카 모세관(fused silica capillary column)(30m x 0.25 mm ID)을 이용하여, 5970 MSD와 인터페이스된 HP 5890 GC 상에서 수행하였다.

표 I은 AGP 조성물의 글리코실 성분들을 요약한다.

표 I

AGP 조성물의 글리코실 성분

성분	AGP 조성물 (몰 %)
아라비노오스(Ara)	34.00
람노오스(Rha)	3.40
메틸화된 우론산(MUA)	5.00
만노오스(Man)	2.20
갈락토오스(Gal)	48.90
글루코오스(Glu)	검출되지 않음
미확인된 당	6.50

AGP 조성물의 글리코실 결합(glycosyl linkage)의 결정

NaOH 방법: 글리코실 결합 분석을 위해, AGP 조성물의 시료를 퍼메틸화(permethylated)하고, 단량체로 분해하고, 환원시키고, 아세틸화하고; 결과물인 부분적으로 메틸화된 알디톨 아세테이트(PMAA)을 전술된 바와 같이 기체 크로마토그래피-질량 분석법(GC-MS)에 의해 분석하였다[York, W. S., Darvill, A. G., McNeil, M., Stevenson, T. T., and Albersheim, P., Methods Enzymol ., 1985, 230, 1-15 ; York, W. S., Darvill, A. G., McNeil, M., Stevenson, T. T., and Albersheim, P., Methods Enzymol ., 1985, 118, 3-40].

먼저, 시료의 분량을 건조 DMSO에 담긴 소디움 히드록시드 및 메틸 요오디드에 의한 처리를 포함하는, Ciukanu and Kerek, Carbohydr . Res., 1984, 131, 209-217의 방법에 의해 퍼메틸화시켰다. 폴리머의 완전한 메틸화를 보조하기 위해 퍼메틸화를 2회 반복하였다. 시료 워크업 후에, 퍼메틸화된 물질을 2M 트리플루오로아세트산을 이용하여 가수분해시키고(121℃ 밀봉된 튜브에서 2 시간), NaBD₄로 환원시키며, 아세트산 무수물/피리딘을 이용하여 아세틸화시켰다. 결과물인 PMAA를 5970 MSD(질량 선택적 검출기, 전자 충격 이온화 모드)와 인터페이스된 Hewlett Packard 5890 GC 상에서 분석하고; 분리는 30 m Supelco 2330 결합된 상 용융 실리카 모세관(bonded phase fused silica capillary column) 상에서 수행하였다.

표 II는 백분율로 글리코실 결합을 요약한다.

표 II

AGP 조성물의 글리코실 결합

글리코실 잔기	AGP 조성물에 존재하는 백분율
말단 람노피라노실 잔기(t-Rha p)	3.00
말단 아라비노푸라노실 잔기(t-Ara f)	22.00
말단 아라비노피라노실 잔기(t-Ara p)	1.00
혼합물 1 3-람노피라노실 잔기(3-Rha p) 4-람노피라노실 잔기(4-Rha p)	1.00
말단 글루코피라노실 잔기(t-Glc p)	3.00
말단 갈락토피라노실 잔기(t-Gal p)	5.00
5-결합된(linked) 아라비노푸라노실 잔기(5-Ara f)	5.00
2-결합된 만노피라노실 잔기(2-Man p)	미량
2-결합된 글루코피라노실 잔기(2-Glc p)	미량
3-결합된 갈락토피라노실 잔기(3-Gal p)	16.00
4-결합된 갈락토피라노실 잔기(4-Gal p)	1.00
6-결합된 글루코피라노실 잔기(6-Glc p)	2.00
6-결합된 갈락토피라노실 잔기(6-Gal p)	8.00
3,6-결합된 글루코피라노실 잔기(3,6-Glc p)	2.00
3,6-결합된 갈락토피라노실 잔기(3,6-Gal p)	31.00

AGP 조성물의 분자량 결정

AGP 조성물, AGP-HM 및 AGP-LM을 통합된 용매 및 시료 관리 유닛 및 보다 양호한 기준선 안전성을 위한 역류 열 교환기(counter current heat exchanger)를 갖는 열적으로 차단된 플로우 셀(thermally shielded flow cell) 및 광학장치(optics)를 포함하는 굴절 지수 검출기(refractive index detector)를 갖춘 Waters aqueous GPC 장치인, Model Alliance 2690을 이용하여 분석하였다. 크로마토그래피 워크스테이션은 데이터 획득 및 제어 소프트웨어 및 데이터 프로세싱 용 Millenium 소프트웨어를 포함했다. 친수성 폴리머에 기초한 반-경질 겔(semi-rigid gel)로 구성된 GPC 컬럼은 Tosoh Corporation(TSK-GEL PW Type) 제품이었다. 다당류(덱스트란)의 배제 한계는 분자량 1,000 내지 7,000,00이었다. 이 컬럼들은 합성된 수용성 폴리머, 올리고머 및 다당류, 핵산, 단백질, 펩티드 등과 같은 생물학적 물질의 분석 및 제조(preparative)용 분리를 위해 설계된 것이었다. 풀루란(The pullulan) 키트는 컬럼 보정(calibration)을 위한 상이한 분자량의 다당류 시료들로 구성된다.

상이한 다공성(porosity) 컬럼, 이동상의 농도 및 속성, 유속, 검출기 민감도 등과 같은 분석 조건들을 변화시켜가면서 GPC 방법을 개발하였다. 다당류 시료의 최적의 분리는 0.2M 질산나트륨 용액을 이용하여 수득되며, 다음은 다당류에 기반한 약물 분자의 특성규명(characterization)을 위한 적합한 분석 조건이었다.

AGP 조성물의 분자량은 크기 배제 크로마토그래피를 이용한 용리 시간의 비교에 의해 결정하였다. 비교에 의하면, AGP 조성물의 평균 분자량 범위는 10 KD 내지 150 KD인 것으로 확인되었다.

AGP-LM 및 AGP-HM의 분자량도 유사한 방식으로 결정하였다. 비교에 의하면, 그 성분들의 평균 분자량은 각각 13KD 및 115KD인 것으로 확인되었다.

AGP 조성물의 포우리에 변환 적외선 (FT-IR) 스펙트럼

KBr 펠렛에 담긴 Nujol 멀(mull)을 이용한 포우리에 변환 적외선 분광분석계(8201 PC Shimadzu)에 의해 측정된 본 발명의 AGP-HM의 IR 스펙트럼은 히드록실 기의 존재를 나타내는 3400cm^-1 및 CH 결합의 신장(stretching)을 나타내는 2850-2960 cm^-1에서 넓은 흡수 밴드를 보인다.

h) AGP 조성물의 ¹H 핵 자기 스펙트럼

본 발명의 AGP의 ¹H NMR 스펙트럼을 Bruker DRX 500 Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer로 500 MHz, D₂O에서 기록하였다.

메틸화 분석에 의해 검출된 모든 주요한 결합 유형들의 광범위한 양성자 지정(assignment)을 수행하였다. ¹H NMR 스펙트럼에서, β-D-Gal-p 잔기 (δ 4.22-4.47) 및 α-L-Ara-f 잔기(δ 5.17-5.33)에 해당하는 H-1 신호가 검출되었다. β-D-Gal-p 잔기의 H-2 내지 H-6, α-L-Ara-f 잔기의 H-2 내지 H-5 및 글루코오스, 람노오스 및 만노오스의 작은 잔기의 H-2 내지 H-5에 해당하는 δ3.53-4.22로부터의 다수의 신호들이 있었다. 이 신호들을 분해하여 특정 잔기들에 지정하기 위해, 2D 호모- 및 헤테로뉴클리어 실험을 수행하였다. 2D 스펙트럼에서 확인된 스핀 시스템 각각에 상이한 결합 유형들을 지정하는 것은 표 II의 결합 데이터 및 다른 AGP에 관한 문헌에서 보고된 NMR 데이터와의 비교에 의해 지지되었다.

아노머 양성자( Anomeric protons ): δ 5.33 및 δ 5.17에서 관찰된 아노머 양성자는 각각 말단 및 5-결합 α-L-Ara f 잔기에 지정되었다. δ 5.17에서의 신호는 또한 말단 α-L-Rha p에, δ 5.10에서의 신호는 4-결합 α-L-Rha p에 지정되었다. 마찬가지로, δ 4.61에서의 신호는 3-결합 α-L-Rha p에 지정되었다. δ 4.56에서의 신호는 6-결합 β-D-Gal에 지정되었다. δ 4.61에서의 신호는 3-결합 β-D-Gal에 지정되고 δ 4.56 및 4.57에서의 신호는 말단 β-D-Gal p 및 3-, 6-결합 β-D-Gal p에 지정되었다.

H-2 양성자: δ 4.31 및 4.22에서의 신호는 각각 말단 및 5-결합 α-L-Ara f 잔기의 H-2에 지정되었다. 또한, δ3.45에서의 신호는 말단 β-D-Gal p에 지정되고 δ3.74에서의 신호는 3-, 6,- 및 3,6- 결합 β-D-Gal p잔기에 지정되었다. δ 4.03, 3.74 및 3.57에서의 신호들은 각각 4-결합, 3-결합 및 말단 α-L-Rha p에 지정되었다.

H-3 양성자: δ 4.03에서의 신호는 말단 및 5-결합 α-L-Ara f 잔기들에 지정되었다. 또한, δ 3.81에서의 신호는 말단 및 6-결합 β-D-Gal p에 지정되었다. 마찬가지로, δ 4.31에서의 신호는 3- 및 3,6-결합 β-D-Gal p 모이어티에 지정되었다. δ 3.93, 3.63 및 3.57에서의 신호는 각각 4-결합, 말단 및 3-결합 α-L-Rha p에 지정되었다.

H-4 양성자: δ4.22에서의 신호는 말단 및 5-결합 α-L-Ara f 에 지정되었다. δ 3.63에서의 신호는 3- 및 6-결합 β-D-Gal p 잔기들에 지정되었다. 또한, δ 3.86 및 4.03에서의 신호들은 각각 말단 및 3, 6-결합 β-D-Gal p에 지정되었다. 마찬가지로, δ 3.63, 3.09 및 2.82에서의 신호들은 4-결합, 3-결합 및 말단 α-L-Rha p 모이어티에 지정되었다.

H-5 양성자: δ3.81에서의 신호는 6- 및 3, 6-결합 β-D-Gal p에 지정되었다. 마찬가지로, δ4.03에서의 신호는 말단 및 3-결합 β-D-Gal p에 지정되었다. δ3.91 및 3.93에서의 신호들은 각각 말단 및 5-결합 α-L-Ara f에 지정되었다. δ4.22, 4.03 및 3.09에서의 신호들은 말단, 4-결합 및 3-결합 α-L-Rha p의 H-5에 지정되었다. δ4.03, 3.45 및 4.03에서의 신호들은 각각 3-결합 β-D-Gal p 및 말단 β-D-Gal p잔기의 H-5에 배정될 수 있었다.

H-6 양성자: δ3.93에서의 신호들은 6- 및 3, 6-결합 β-D-Gal p에 지정되었다. δ3.91 및 3.81에서의 신호들은 각각 말단 및 3-결합 β-D-Gal p에 지정되었다. δ1.03, 1.34 및 1.40에서 관찰된 메틸 양성자는 3-결합, 4-결합 및 말단 α-L-Rha p 모이어티에 지정될 수 있었다.

전술된 지정은 HOMOCOSY 실험을 수행하여 확인하였다.

아미노산 잔기 : 아미노산인 발린, 루이신 및 이소루이신의 메틸 기는 δ1.03에서 관찰되었고 쓰레오닌 및 알라닌에 지정가능한 메틸은 각각 δ1.34 및 1.40에 위치했다.

아르기닌, 아르파라긴, 글루타민, 이소루이신, 루이신, 라이신, 메티오닌, 프롤린 및 발린의 Cα, Cβ(C-H, CH₂), Cγ(CH₂) 및 Cδ(CH₂) 양성자는 δ1.3-2.8에서 관찰되었다.

아스파라긴, 히스티딘, 페닐알라닌 및 티로신의 C-β(CH₂, CH), Cγ, Cδ 양성자는 δ 2.8-3.5에서 관찰되었다.

알라닌, 아르기닌, 글루타민, 글리신, 이소루이신, 루이신, 라이신, 메티오닌, 쓰레오닌 및 발린의 Cα양성자는 δ 3.5-3.9에서 관찰되었다.

아스파라긴, 히스티딘, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 티로신의 Cα 양성자 및 세린 및 쓰레오닌의 Cβ양성자는 δ 3.90-4.2에서 관찰되었다.

δ 6.6-7.5로부터의 다운필드(downfield)에 있는 약한 신호는 페닐알라닌 및 티로신의 N-H 및 방향족 양성자에 지정되었다.

i) AGP 조성물의 ¹³C 핵 자기 스펙트럼

아노머 탄소: ¹³C NMR 스펙트럼에서, δ109.10 및 107.37에서의 신호들은 말단 및 5-결합 α-L-Ara f 모이어티의 아노머 탄소에 지정되었다. δ103-102의 신호들은 말단, 3-결합, 6-결합 및 3,6-결합 β-D-Gal p 잔기의 아노머 탄소에 지정되었다. δ103-102의 동일한 중복 신호들은 4-결합 β-D-Glu p, 4-결합 β-D-xyl p, 말단 β-D-Glc p 및 3-결합 α-L-Rha p의 아노머 탄소에 지정되었다.

C-2 : δ 81.97에서의 신호는 5-결합 α-L-Ara f 모이어티에 지정되었다. δ72.94 및 72.72에서 관찰되는 C-2에 대한 신호는 각각 말단 및 6-결합 β-D-Gal p에 지정되었다. δ 72.56에서의 신호는 3- 및 3,6-결합 β-D-Gal p 잔기에 지정되었다. 마찬가지로, 말단 및 6-결합 β-D-Glc p에 지정될 수 있는 C-2 신호는 각각 δ 74.81, 74.60 및 73.33에서 관찰되었다. 말단, 3-결합 및 4-결합으로 지정될 수 있는 α-L-Rha p 잔기의 C-2 신호들은 각각 δ 80.02, 76.55 및 70.68에서 관찰되었다. δ 81.24 에서의 신호는 2-결합 β-D-Man p 잔기에 지정되었다.

C-3 : δ 76.55에서의 신호는 말단 및 5-결합 α-L-Ara f에 지정되었다. δ 74.81에서의 신호는 말단 및 6-결합 β-D-Gal p 에 지정되었다. 또한, δ 81.97에서의 신호는 3- 및 3,6-결합 β-D-Gal p 잔기에 지정되었다. δ 76.55 및 74.81에서의 신호는 말단, 4-결합 및 6-결합 β-D-Glc p 모이어티에 지정되었다. 마찬가지로, δ 80.02, 76.55 및 70.6에서의 신호는 각각 말단, 3-결합 및 4-결합 α-L-Rha p 모이어티에 지정되었다.

C-4 : δ 83.85에서의 신호는 말단 및 5-결합 α-L-Ara f 모이어티에 지정되었다. δ 70.15에서의 신호는 말단 β-D-Gal p 잔기에 지정되었다. δ 70.68에서의 신호는 3- 및 6-결합 β-D-Gal p 잔기에 지정되었다. δ 73.33에서의 신호는 3, 6-결합 β-D-Gal p 잔기에 지정되었다. δ 80.02, 70.68 및 70.15에서의 신호는 각각 6-결합 및 말단 β-D-Glc p 모이어티의 C-4에 지정되었다. δ 81-83에서의 신호들은 3-결합, 4-결합 및 말단 α-L-Rha p 모이어티의 C-4에 지정되었다.

C-5 : 5-결합 α-L-Ara f 의 C-5에 의한 신호가 δ69.17에서 관찰되었고, 말단 α-L-Ara f의 C-5에 의한 신호는 δ61.25에서 관찰되었다. 3-결합, 6-결합 및 말단 β-D-Gal p 잔기에 의한 C-5 신호는 δ74-77에서 관찰되고, 반면에, β-D-Glc p 모이어티의 경우, 말단 잔기에 의한 C-5 신호는 δ75-76에서 관찰되었다.

C-6 : 6- 및 3,6-결합 β-D-Gal p 잔기에 의한 C-6 신호는 δ69.17에서 관찰되고, 반면에, 3-결합- 및 말단 신호들은 각각 δ60.93 및 61.25에서 관찰되었다. 말단에 대한 β-D-Glc p 잔기에 있는 C-6에 의한 신호는 δ60-62에서 관찰되고 6-결합에 대한 신호는 δ70.1에서 관찰되었다.

메틸: δ16.7, 19.9 및 22.2에서 관찰되는 신호들은 α-L-Rha p의 메틸 기에 지정되었다.

전술된 지정은 HETCOR 실험을 수행하여 확인되었다.

아미노산: δ16.70에서의 신호는 발린의 Cγ및 Cδ메틸, 알라닌의 Cβ메틸 및 메티오닌의 Cδ메틸에 지정되었다. δ19.97에서의 신호는 쓰레오닌의 Cγ메틸에 지정되었다. δ22.22에서의 신호는 아르기닌, 루이신, 이소루이신, 라이신의 Cγ(CH₂), Cγ(C-H) 및 루이신의 Cδ및 Cε메틸에 지정되었다.

δ31.01에서의 신호는 아르기닌, 메티오닌, 라이신, 프롤린의 Cβ(CH₂) 및 글루타민의 Cγ(CH₂)에 지정되었다. δ48.45에서의 신호는 알라닌, 아스파라긴, 루이시의 Cα및 프롤린의 Cδ에 지정되었다.

δ38.05에서의 신호는 아스파라긴, 루이신, 페닐알라닌, 티로신의 Cβ(CH₂), 글리신의 Cα및 아르기닌과 라이신의 Cδ(CH₂)에 지정되었다.

δ59.81에서의 신호는 아르기닌, 시스틴, 글루타민, 히스티딘, 이소루이신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 세린 및 티로신의 Cα양성자에 지정되었다. δ60.9에서의 신호는 발린 및 쓰레오닌의 Cα양성자에 지정되고 반면에 δ61.25에서의 신호는 프롤린의 Cα양성자 및 세린의 Cβ양성자에 지정되었다.

δ68.38에서의 신호는 쓰레오닌의 Cβ(CH)에 지정되었다.

δ108-140에서의 신호는 히스티딘의 올레핀 양성자(olefinic proton) 및 페닐알라닌의 방향족 양성자에 지정되었다.

δ155.64에서의 신호는 아르기닌의 Cε 및 티로신의 C-4에 지정되고 δ166.19에서의 카르보닐 신호는 글루타민에 지정되었다.

다운필드 영역에서, δ 171-175에서 관찰되는 신호들은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소루이신, 루이신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 쓰레오닌 및 티로신의 카르보닐 기에 지정되었다.

결론적으로, AGP-HM의 구조는 백본의 6-결합-갈락토피라노오스 및 3,6-결합 갈락토피라노오스 및 말단 위치에 있는 아라비노푸라노실, 아라비노피라노실, 람노피라노실, 글루코피라노실 및 갈락토피라노실 잔기로 구성된다. AGP는 또한 메틸 우론산을 따라 3-결합, 4-결합 람노피라노실, 2-결합-만노피라노실, 2-결합-글루코피라노실, 3-결합-, 4-결합 갈락토피라노실, 6-결합-, 3,6-결합-글루코피라노실 및 4-결합 자일로피라노실 잔기들을 포함한다. AGP 조성물의 아미노산 구성성분은 아스파라긴, 글루타민, 히드록시프롤린, 세린, 글리신, 히스티딘, 아르기닌, 쓰레오닌, 알라닌, 프롤린, 티로신, 발린, 메티오닌, 이소루이신, 루이신, 라이신 및 페닐알라닌으로 확인되었다. 그러나, 아미노산의 부착 부위는 결정되지 않았다. AGP-LM은 또한 유사한 구조를 가지나 분자량이 상이하다. 전술된 데이터에 기초해, AGP 조성물에 대해 다음의 구조가 제안되었다(도 2). AGP-HM 및 AGP-LM은 모두 유사한 생물학적 활성을 가지며, 따라서, AGP 조성물이 모든 생물학적 연구에서 이용되었다.

AGP 조성물의 면역학적 및 약학적 특성

IL-2, IFN-γ, IL-10와 같은 사이토카인 분석 및 기니어 피그에서의 지연성 과민 반응(delayed type hypersensitivity:DTH)과 같은 체내 활성이 이하에 설명된다. 미국 특허출원 공개 제2003/0194456 A호에 개시된 방법에 의해 수득된 수성 추출물과 본 발명의 AGP 조성물의 생물학적 활성의 비교가 표 III에 주어진다.

표 III

미국 특허출원 공개 제2003/019446 A1호에 개시된 방법에 의해 수득된 수성 추출물(1)과 본 발명의 AGP 조성물(2)의 생물학적 효능 비교

일련 번호	파라미터	수성 추출물 (1)	AGP 조성물(2)
1	IL-10 유도(EC50 in mg/ml)	2.54	1.075
2	IL-2 억제(20ng/ml에서의 % 억제)	29.32±5.26	51.10±4.33
3	IFNγ 억제(20 ng/ml에서의 % 억제)	33.27±6.52	54.50±4.00
4	TNFα 억제(2 ㎍/ml에서의 % 억제)	44.34±6.64	60.68±9.03
5	GMCSF 억제(200ng/ml에서의 % 억제)	35.57±9.45	43.28±6.21
6	TPA 유도 피부 증생 (ED50mg/kg)	36.3	2.31
7	DTH 모델(ED50 mg/kg)	4.34	0.58
8	MEST(ED50 mg/kg)	14.0	6.43

AGP 조성물에 대한 독성학적 연구

마우스 및 랫트에서 경구 및 정맥 경로를 통해 AGP 조성물의 급성 독성(LD₅₀)을 평가하였다. 투여량 당 경로 당 각 종으로부터의 10마리의 동물로 구성된 군을 대상으로 AGP 조성물을 투여하고 15일 차에 결과를 계산하였다.

AGP 조성물에 대해 하기의 값들이 관찰되었다.

마우스 p.o.(경구 투여) 의 LD₅₀ : >5000mg/kg b.wt.

마우스 i.v.(정맥 투여)의 LD₅₀ : >1000mg/kg b.wt.

랫트 p.o.의 LD₅₀ : >5000mg/kg b.wt.

랫트 i.v.의 LD₅₀ : > 250mg/kg b.wt.

AGP 조성물의 생물학적 분석

인간 IL-10 생성에 대한 평가 방법의 설명

AGP 조성물의 건선에서의 치료적 잠재력을 평가하기 위해, 체외 IL-10 유도에서의 그의 역할을 ConA 유도 PBMC에 의한 IL-10 생성 분석에 의해 평가하였다[Raychudhuri S. P., Farber E. M., Raychudhuri S. K., Int . J. Immunopharmacol., 1999, 21,609].

먼저, 인간 PBMC(Peripheral blood homonuclear cell)를 분리하고 다양한 농도의 AGP 조성물과 함께 10 ㎍/ml ConA로 자극하고 5% CO₂의 CO₂ 인큐베이터에서 37℃로 48시간 동안 방치하였다. 상층액을 회수하고 ELISA에 의한 정량 전까지 -70℃에서 동결시켜 보관하였다. 사용된 인간 IL-10 ELISA 키트는 배양 상층액에 존재하는 IL-10를 검출하기 위한 R 및 D 시스템으로부터 유래된 것이었다. 퍼센트 유도는 대조구를 기준으로 계산하였다. 그 결과를 표 IV에 요약한다.

아르게모네 멕시카나로부터 분리된 AGP 조성물은 0.0002 ㎍/ml 내지 200 ㎍/ml의 범위에서 ConA 활성화된 인간 PBMC에서 IL-10 생성의 증가를 보였다(도 3). IL-10은 건선 치료에서 조절성 사이토카인(regulatory cytokine)으로 확인되었으며 항-건선 치료법을 유도하는 것으로 알려져 있다.

IL-10 유도는 건선, 피부염, 피부경화증, 염증성 질환 및 건선성 관절염, 판형 건선, 점상 건선, 류마티즘성 관절염, 크론씨병, 다발성 경화증, 과민성 장 질환, 강직성 척추염, 전신 홍반성 루푸스 및 쇼그렌 증후군과 같은 자가면역 질환, 천식 및 만성 폐색성 폐질환과 같은 과민증 및 습진 및 벗겨지고 가려운 패치와 같은 관련 증상의 치료 및/또는 예방에 유용하다. IL-10 유도는 또한 피부 림프구 항원 또는 피부 백혈구 항원이 관여되는 기타 만성, 재발성 및 기타 피부 질환에 유용하다.

표 IV

AGP 조성물의 ConA 유도 인간 PBMC 에 대한 효과

추출물의 농도 (㎍/ ml )	평균 % 유도
200	371.40
20	303.80
2	237.30
0.2	137.20
0.02	114.30
0.002	106.00
0.0002	102.60

*값은 대조구에 대비하여 기준값으로부터의 퍼센트 증가로 표현된다.

인간 IL-2 및 IFN-γ 생성의 평가방법 설명

건선에서의 치료적 잠재력에 대해 AGP 조성물의 효능을 평가하기 위해, 체외 IL-2 및 IFN-γ 조절에서의 그 역할을 피토헤마글루틴(PHA) 유도 PBMC에 의한 IL-2 및 IFN-γ 생성 억제 분석에 의해 평가하였다[Brynskov J, Tvede N., Gut., 1990, 31(7), 795].

본 연구의 목적은 인간 림프구로부터의 PHA 유도 IL-2 및 IFN-γ 생성에 대한 AGP의 효과를 평가하는 것이었다. 먼저, 건강한 개인으로부터 PBMC(peripheral blood mononuclear cell)를 수득하였다. 백만개의 PBMC/ml를 아르게모네 멕시카나로부터 분리된 다양한 농도의 AGP 조성물과 함께 PHA(5 ㎍/ml)로 5% CO₂의 CO₂ 인큐베이터에서 37℃로 48시간 동안 자극하였다. 상층액을 회수하고 -70℃에서 동결시켰다. 사용된 인간 IL-2 및 인간 IFN-γ ELISA 키트는 배양 상층액에 있는 IL-2 및 IFN-γ의 검출을 위한 R 및 D 시스템으로부터 유래했다. 퍼센트 억제는 대조구를 기준으로 계산하였다.

아르게모네 멕시카나의 잎 및/또는 줄기로부터 분리된 AGP 조성물은 0.002㎍/ml 내지 20㎍/ml에서 미토겐 유도 IL-2 생성을 억제하는 것으로 확인되었다(도 4). 미토겐 IL-2 생성에 대한 억제 활성은 면역을 억제하는 것으로 알려져 있고 건선의 치료 및/또는 예방에 유용한 것으로 정립되어 있다. 결과는 표 V에 요약된다.

표 V

AGP 조성물의 PHA 유도 인간 PBMC 에 의한 IL -2 생성에 대한 효과

AGP 조성물의 농도(㎍/ ml )	평균 % 억제
20.00	54.53
2.00	54.49
0.20	53.97
0.02	51.10
0.002	30.56
0.0002	10.87
0.00002	3.75

*값은 대조구 대비 퍼센트 억제로 표현된다.

아르게모네 멕시카나로부터 분리된 AGP 조성물은 0.0002㎍/ml 내지 2㎍/ml의 범위에서 미토겐 유도 IFN-γ 생성을 억제하는 것으로 확인되었다(도 5). 미토겐 유도 IFN-γ 생성에 대한 이 억제 활성은 면역을 억제하는 것으로 알려져 있고 건선의 치료 및/또는 예방에 유용한 것으로 정립되어 있다. 결과는 표 VI에 요약된다.

표 VI

AGP 조성물의 PHA 유도 인간 PBMC 에 의한 IFN -γ 생성에 대한 효과

AGP 조성물의 농도(㎍/ ml )	평균 % 억제
20.00	55.19
2.00	57.07
0.20	53.69
0.02	54.50
0.002	38.62
0.0002	15.34
0.00002	4.04

*값은 대조구 대비 퍼센트 억제로 표현된다.

인간 GMCSF 및 TNF-알파 생성에 대한 평가 방법의 설명

건선에서의 치료적 잠재력에 대해 본 발명의 AGP 조성물의 효능을 평가하기 위해, 체외 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GMCSF) 및 TNF-α 조절에서의 그의 역할을 ConA 및 LPS로 자극된 PBMC에 의한 GMCSF 및 TNF-α 생성 억제에 의해 평가하였다.

먼저, 인간 PBMC를 건강한 지원자들의 혈액으로부터 분리하고, 다양한 농도의 AGP 조성물과 함께 10㎍/ml의 ConA로 자극하고 37℃, 5% CO₂의 CO₂ 인큐베이터에서 48시간 동안 방치하였다. 5㎍/ml의 LPS를 첨가하고 동일한 조건 하에 24시간 동안 방치하였다. 상층액을 회수하고 ELISA를 이용한 사이토카인의 정량 전까지 동결상태로 보관하였다. 퍼센트 억제는 대조구를 기준으로 계산하였다.

아르게모네 멕시카나로부터 분리된 AGP 조성물은 0.02㎍/ml 내지 2㎍/ml의 범위에서 미토겐 유도 GMCSF 생성을 억제하는 것으로 확인되었다(도 6). 미토겐 유도 GMCSF 생성에 대한 이 억제 활성은 면역을 억제하는 것으로 알려져 있고 건선의 치료 및/또는 예방에 유용한 것으로 정립되어 있다. 결과는 표 VII에 요약된다.

표 VII

AGP 조성물의 ConA 및 LPS 유도 인간 PBMC 에 의한 GMCSF 생성에 대한 효과

AGP 조성물의 농도(㎍/ ml )	평균 % 억제
2.00	32.31
0.20	43.28
0.02	35.41

*값은 대조구 대비 퍼센트 억제로 표현된다.

아르게모네 멕시카나로부터 분리된 AGP 조성물은 0.002㎍/ml 내지 2㎍/ml의 범위에서 미토겐 유도 TNF-α 생성을 억제하는 것으로 확인되었다(도 7). 미토겐 유도 TNF-α 생성에 대한 이 억제 활성은 면역을 억제하는 것으로 알려져 있고 건선의 치료 및/또는 예방에 유용한 것으로 정립되어 있다. 결과는 표 VIII에 요약된다.

표 VIII

AGP 조성물의 ConA 및 LPS 유도 인간 PBMC 에 의한 TNF -α 생성에 대한 효과

AGP 조성물의 농도(㎍/ ml )	평균 % 억제
2.00	60.68
0.20	46.18
0.02	22.02
0.002	10.30

*값은 대조구 대비 퍼센트 억제로 표현된다.

NGF 유도 인간 케라티노사이트 증식에 대한 AGP 조성물의 효과

케라티노사이트를 GIBCO(USA)로부터 구입하여 성장 인자가 보충된 케라티노사이트-무혈청 배지(GIBCO, # 10744-019)에서 유지시켰다. 96 웰 편평 플레이트의 각 웰에 2000개의 세포들을 포함하는 KGM(케라티노사이트 성장 배지) 150 ㎕를 첨가하였다. 다음 날, 배지를 1:2 부피비의 KGM:KBM(케라티노사이트 기초 배지)로 교체하였다. 희석된 AGP 조성물 30 마이크로리터를 세포 대조구 웰(cell control well)을 제외하고 3개의 웰을 1조로(in triplets) 각 웰에 첨가하였다. 각 웰에 NGF(신경 성장 인자) 100 ng/ml을 첨가하였다. 8일의 배양 후에 배지를 제거하였다. 세포를 PBS로 세척하였다. LDH(락테이트 디히드로게나아제) 발생 용해 용액(development lysis solution)을 첨가하고 37℃에서 10분간 방치하였다. 492 nm의 파장에서 ELISA 판독기로 OD를 측정하였다. 퍼센트 증식/억제를 계산하였다. 결과를 표 IX에 요약한다.

표 IX

AGP 조성물의 NGF 유도 인간 케라티노사이트 증식에 대한 효과

AGP 조성(㎍/ ml )	평균 % 억제
40.00	79.15
8.00	74.53
1.60	71.49
0.32	66.78
0.064	55.75
0.0128	26.78
0.0025	15.36
0.0005	6.18
0.0001	3.03

* 상기 값들은 대조구 대비 퍼센트 억제로 표현된다.

아르게모네 멕시카나로부터 분리된 AGP 조성물은 0.0001㎍/ml 내지 40㎍/ml의 범위에서 NGF 유도 인간 케라티노사이트 증식을 억제하는 것으로 확인되었다(도 8 및 도 9). NGF 유도 인간 케라티노사이트 증식에 대한 이 억제 활성은 면역을 억제하는 것으로 알려져 있고 건선의 치료 및/또는 예방에 유용한 것으로 정립되어 있다.

기니어 피그에서 지연성 과민증(DTH)을 이용한 체내 면역억제의 평가 방법 설명

이 표준 절차는 기니어 피그에서 정제된 단백질 유도체(PPD) 유도 지연성 과민증을 억제하는 능력에 대한 AGP 조성물의 체내 효능 평가를 위해 이용되었다. 먼저, 프로인트 완전 보조제(Freund's complete adjuvant)와 함께 100 ㎍의 PPD를 피부내로 주사하여 기니어 피그를 감작시켰다(sensitize). 프로인트 불완전 보조제와 함께 100 ㎍의 PPD의 2회의 부스터를 1주일 간격으로 투여하였다. 28일 동안 1일 1회씩 AGP 조성물을 경구로 투여하였다. 28일 차에 그 동물들에 100㎍의 PPD를 투여하고(challenge) 그 투여 24시간 후에 대조구와 PPD 주사된 피부 두께의 차이를 버어니어 캘리퍼스로 측정하였다. 동일한 기니어 피그에서 식염수 주사된 피부 두께를 차감하여 피부 두께의 차이를 계산하였다. 퍼센트 억제는 식염수 감작된 동물을 기준으로 계산하였다.

아르게모네 멕시카나로부터 분리된 AGP 조성물은 0.10-100 mg/kg p.o의 투여량에서 20-65.89 %의 범위로 PPD 감작된 기니어 피그 및 PPD 테스트된(challenged) 기니어 피그에 대해 면역 억제 활성을 가지는 것으로 확인되었다. PPD로 테스트된(PPD challenged) 기니어 피그에서 피부 두께의 50% 억제를 유발하는 유효한 투여량(ED₅₀)은 0.508mg/kg p.o로 확인되었다(도 10). 강력한 면역억제 특성은 정립되어 있으며 항-건선 치료에 유용하다.

DTH 모델에서의 면역 억제는 건선, 피부염, 피부 경화증, 염증성 질환 및 건선성 관절염, 판형 건선 및 점상 건선과 같은 기타 자가면역 질환과 같은, 면역 억제가 요구되는 여러 질병을 위해 유용한 모델이다. 결과들은 표 X에 요약된다.

표 X

PPD 로 테스트된 기니어 피그에서 피부 두께에 대한 AGP 조성물의 효과

AGP 조성물의 농도 mg / kg	퍼센트 반응
0.01	0.000
0.10	20.000
1.00	62.680
10.00	67.930
30.00	61.510
100.00	65.880

TPA 평가 방법의 설명

실험 5일 전에 Balb/C 마우스를 임의로 추출하여 우리(cage)에서 적응시켰다. Anne French 국소 적용을 이용하여 제모하고 세척하였다. 각 군은 6 마리의 마우스로 구성했다. 아세톤 대조군과 TPA(12-O-테트라데카노일포르볼-13-아세테이트) 대조군들을 테스트 약물 군과 함께 평가에 포함시켰다. AGP 조성물을 권고된 비히클(아세톤)에 용해하고 4일 동안 1일 1회 경구로 동물에게 투여하였다 20 마이크로리터의 100 nM TPA를 2일 차에 세척된 피부 표면에 적용하고 흡수시켰다. TPA 적용 후 72시간 경과 시 동물들을 희생시켰다. 피부 조각을 3일 동안 10% 포포르말린으로 고정했다. 병리학적 슬라이드를 표준 방법에 따라 제조하였다. 표피 두께를 10개 이상의 상이한 영역에서 오큘로미터(oculometer)를 이용하여 측정하고 결과를 퍼센트 억제로 표현했다(도. 11). 결과는 표 XI에 요약된다.

표 XI

TPA 모델에 대한 AGP 조성물의 효과

그룹	투여량( mg / kg , p.o.)	표피 두께의 증가(㎛)	% 억제
아세톤 대조구	-	23.08	-
TPA 대조구	-	52.88	0.00
AGP 조성물	30.00	25.38	92.30
	10.00	29.67	77.89
	3.00	35.63	57.90
	1.00	50.08	9.37
	0.30	52.63	0.84
	0.10	52.67	0.70

*값은 TPA 대조구에 대비한 퍼센트 억제로 표현된다.

MEST를 이용한 체내 면역억제 평가 방법의 설명

마우스에서 DNFB 유도 지연성 과민증을 억제하는 능력에 대한 AGP 조성물의 체내 효능의 평가를 위해 이 표준 절차를 이용하였다[Cornacoff J. B, House R. V, Dean J. H., Fundam. Appl . Toxicol ., 1988, 10(1), 40; Fundam. Appl. Toxicol., 1992, 19(1), 157].

먼저, 테스트를 위해 C57BL6 마우스를 이용했다. 마우스의 등에 0.2% DNFB (1:4의 올리브유 및 아세톤에 포함됨)를 적용하여 마우스를 감작시켰다. 3회의 부스터 DNFB 적용을 매 3일마다 수행하였다. 마우스의 귓바퀴에 0.2% DNFB(1:4의 올리브유 및 아세톤에 포함됨)를 적용하여 마우스를 (면역성에 대해) 테스트하였다. 24시간 후에 버어니어 캘리퍼스를 이용하여 귀의 중앙에서 귀 두께를 측정하였다. 음성 대조구 대비 퍼센트 억제를 계산하여 경구로 투여된 상이한 투여량에 대해 분석을 수행하였다. 결과는 표 XII에 요약된다.

표 XII

암컷 C57/BL6 마우스에서 DNFB 유도 MEST에 대한 AGP 조성물의 효과

일련 번호	처리	퍼센트 억제
1	Milli Q 워터 10 ml/kg, p.o. AGP 조성물에 대한 음성 대조구	0.00
2	2% Tween 80, 10 ml/kg, p.o. 사이클로스포린에 대한 음성 대조구	0.00
3	AGP 조성물 - 0.1 mg/kg, p.o.	0.00
4	AGP 조성물 - 1 mg/kg, p.o.	18.00
5	AGP 조성물 - 3 mg/kg, p.o.	33.05
6	AGP 조성물 - 10 mg/kg, p.o.	43.62
7	AGP 조성물 - 30 mg/kg, p.o.	58.52
8	AGP 조성물 -100 mg/kg, p.o.	69.51
9	사이클로스포린 25 mg/kg, p.o.	65.16

데이터는 7-12마리의 동물들 각각에 의한 퍼센트 억제로 표현됨. AGP 조성물은 Milli Q 워터 처리군과 비교되고 사이클로스포린은 2% Tween 80으로 처리된 동물들과 비교됨 .

아르게모네 멕시카나의 잎 및/또는 줄기로부터 유래된 AGP 조성물은 DNFB 감작된 C57BL6 마우스에 대해 면역 억제 활성을 갖는 것으로 확인되었다. AGP 조성물의 ED₅₀은 6.43 mg/kg으로 결정되었다(도 12). 강력한 면역억제 특성이 정립되고 건선의 치료 또는 예방에 유용하다.

MEST 모델에서 면역 억제는 면역 억제가 요구되는 여러 질병들, 예를 들면, 건선, 피부염, 피부경화증, 염증성 질환 및 건선성 관절염, 판형 건선, 점상 건선, 류마티즘성 관절염, 크론씨병, 다발성 경화증, 강직성 척추염, 전신 홍반성 루푸스 및 쇼그렌 증후군과 같은 자가면역 질환, 천식 및 만성 폐색성 폐질환과 같은 과민증 및 습진 및 벗겨지고 가려운 패치와 같은 관련 증상의 치료 및/또는 예방에 유용하다.

도 1은 정제된 AGP 조성물을 분리하는 선택적 방법을 요약하는 차트를 도시 한다.

도 2는 AGP 조성물의 제안된 구조를 도시한다.

도 3은 IL-10 유도에 대한 AGP 조성물의 효과를 도시한다.

도 4는 퍼센트 IL-2 억제에 대한 AGP 조성물의 효과를 도시한다.

도 5는 퍼센트 IFN-γ 억제에 대한 AGP 조성물의 효과를 도시한다.

도 6은 GMCSF 억제에 대한 AGP 조성물의 효과를 도시한다.

도 7은 인간 TNF-α 억제에 대한 AGP 조성물의 효과를 도시한다.

도 8은 NGF 유도 인간 케라티노사이트 증식에 대한 AGP 조성물의 효과를 도시한다.

도 9는 NGF 유도 인간 케라티노사이트 증식에 대한 AGP 조성물의 효과를 도시한다.

도 10은 PPD 테스트된 기니어 피그(PPD challenged guinea pig)에서 피부 두께에 대한 AGP 조성물의 효과를 도시한다.

도 11은 Balb/c 마우스에서 TPA(12-O-테트라데카노일포르볼-13-아세테이트)에 의해 유도된 표피 두께의 억제에 대한 AGP 조성물의 효과를 도시한다.

도 12는 암컷 C 57/BL 6 마우스에서 DNFB 유도 MEST에 대한 AGP 조성물의 효과를 도시한다.

본 발명은 하기의 실시예들에 의해 보다 상세하게 예시된다.

실시예 1

AGP 조성물, AGP - HM 및 AGP -LM의 분리

10 Kg의 아르게모네 멕시카나의 신선한 잎을 분쇄하고 탈염수(15 리터)로 추출하였다. 슬러리를 원심분리하고 수성 추출물을 진공 하에 40% 미만으로 농축시켰다. 농축된 물질을 동결건조시켜 0.54 Kg의 건조된 고형물을 생성했다. .

500 g의 건조된 수성 추출물을 6 리터의 물에 용해시키고 원심분리한 후 경사분리시켰다. 상층액을 10 ml/분의 속도로 양이온 교환 컬럼(5 리터) 상에 적재하였다. 용출액(7.5 리터)을 회수하고 농축하여(2.5 리터) 음이온 교환 컬럼(5 리터) 상에 적재하였다. 용출액(3 리터)를 약 1.5리터까지 농축시켰다. 새로이 0.5kg의 물질(수성 추출물)로 실험을 반복하였다.

각 용출액(1.5 리터)를 합쳐서 혼합하고 2.5 리터까지 농축하고 양이온 교환 컬럼 상에 적재하였다. 용출액(3 리터)를 1.2 리터까지 농축하고 음이온 교환 컬럼 상에 적재하였다. 용출액'(1.5 리터)를 동결건조하여 42.39g의 분말을 생성했다.

42 g의 전술된 분말을 600 ml의 물에 용해하고 n-부탄올(3 X 400 ml)과 물 사이에 분배시켰다. n-부탄올 층을 경사분리시켰다. 고형물이 침전되면 3 리터의 메탄올을 수성층(600ml)에 첨가했다. 그 용액을 원심분리하고 상층액을 경사분리하여 제거하였다. 상층액을 약 300 ml의 부피까지 농축시켰다. 메탄올 불용물을 침전시키기 위해 메탄올(1 리터)을 다시 첨가했다. 그 용액을 원심분리하고 상층액을 경사분리로 제거하였다. 양 실험으로부터 수득된 침전 고형물을 동결건조시켰다(8.75 g). 건조된 물질을 물에 용해시키고 XAD-2 컬럼에 2회 적용시켰다. 물 용 출액을 동결건조시켜 6.10g의 AGP 조성물을 생성했다. 수득된 조성물에 대해 세파크릴 크로마토그래피를 더 수행하여 5 mg의 AGP-HM 및 10.3 mg의 AGP-LM을 생성했다.

실시예 2

AGP 조성물, AGP - HM 및 AGP -LM의 분리

22Kg의 아르게모네 멕시카나의 신선한 잎을 분쇄하고 탈염수(36 리터)로 추출하였다. 슬러리를 원심분리하고 수성 추출물을 진공 하에 40% 미만으로 농축시켰다. 농축된 물질을 동결건조시켜 1.25 Kg의 건조된 고형물을 생성했다. .

1.2 kg의 건조된 수성 추출물을 12 리터의 물에 용해시키고 원심분리한 후 경사분리시켰다. 상층액을 10 ml/분의 속도로 양이온 교환 컬럼(5 리터) 상에 적재하였다. 용출액(15.5 리터)을 회수하고 농축하여(5.5 리터) 음이온 교환 컬럼(5 리터) 상에 적재하였다. 용출액(6.25 리터)를 약 3.2리터까지 농축시켰다.

용출액(3.2 리터)를 합쳐서 혼합하고 2.6 리터까지 농축하고 양이온 교환 컬럼 상에 적재하였다. 용출액(4 리터)를 1.5리터까지 농축하고 음이온 교환 컬럼 상에 적재하였다. 용출액'(1.6리터)를 동결건조하여 54g의 분말을 생성했다.

40 g의 전술된 분말을 700 ml의 물에 용해하고 n-부탄올(3 X 500 ml)과 물 사이에 분배시켰다. n-부탄올 층을 경사분리시켰다. 고형물이 침전되면 4 리터의 메탄올을 수성층(675ml)에 첨가했다. 그 용액을 원심분리하고 상층액을 경사분리하여 제거하였다. 상층액을 약 400 ml의 부피까지 농축시켰다. 메탄올 불용물을 침전 시키기 위해 메탄올(3 리터)을 다시 첨가했다. 그 용액을 원심분리하고 상층액을 경사분리로 제거하였다. 수득된 침전 고형물을 동결건조시켰다(7.3 g). 그에 의해 수득된 건조된 물질을 물에 용해시키고 XAD-2 컬럼에 2회 적용시켰다. 물 용출액을 동결건조시켜 5.5g의 AGP 조성물을 생성했다. 수득된 조성물에 대해 세파크릴 크로마토그래피를 더 수행하여 4.5mg의 AGP-HM 및 12.4 mg의 AGP-LM을 생성했다.

실시예 3

표 XIII

본 발명의 AGP 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 캡슐 제제의 단위 처방서( Unit Formulae )

일련번호	성분	강도( mg /캡슐)
01	AGP	50	200
02	미정질 셀룰로오스 USNF (Avicel PH 102)	39	39
03	크로스카르멜로오스 소디움 USNF (Ac-Di-SOL)	10	10
04	콜로이드성 이산화규소USNF (Aerosil 200)	0.5	0.5
05	마그네슘 스테아레이트 USNF	0.5	0.5
	합계	100	250
06	경질 캡슐	1 (오렌지색 본체 및 오렌지색 캡으로 구성된 사이즈 '2')	1 (오렌지색 본체 및 적색 캡으로 구성된 사이즈 '00')

표 XIII에 주어진 전술된 성분들을 균일해질 때까지 혼합하고 크기 '00'의 경질 캡슐에 충전할 수 있다. 처리 영역은 바람직하게는 18-22 EC 및 40±5% RH 하에서 이상적으로 유지시킨다.

본 발명의 조성물을 제조하는 통상적인 방법을 하기에 설명한다:

활성 성분인 미정질 셀룰로오스, 크로스카스멜로오스 소디움, 마그네슘 스테아레이트 및 콜로이드성 이산화규소를 균일해질 때까지 혼합한다. 그들을 크기 '0'의 경질 캡슐로 충전된다. 처리 영역은 바람직하게는 18EC 내지 22 EC 및 40% RH 하에서 이상적으로 유지시킨다.

국소 적용이 이루어지는 경우, 아르게모네 멕시카나 식물체의 양은 추출물의 중량 기준으로 0.1% 내지 10%의 범위이다.

AGP 및 담체를 포함하는 국소 적용용 연고에 대한 단위 처방서가 표 XIV에 요약된다.

표- XIV

본 발명의 AGP 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 국소 적용용 연고의 단위 처방서

일련 번호	성분	양
01	AGP	1.0 gm
02	물	100 ml
03	히드록시프로필 메틸 셀룰로오스	4.0 gm

국소 적용용 연고를 제조하는 통상적인 방법은 통상적인 방법에 의해 모든 성분들을 혼합하여 고르게 이겨진 겔을 제조하는 단계 및 튜브로 충전하는 단계를 포함한다.

Claims (31)

1. 하기의 단계들을 포함하는 방법에 의해 수득가능한 아르게모네 멕시카나(Argemone mexicana) 식물체의 잎 및/또는 줄기로부터 분리된, 10 KD 내지 150 KD의 평균 분자량 범위를 갖는 정제된 아라비노갈락탄-단백질(AGP) 조성물:

   i) 1 중량부의 아르게모네 멕시카나의 잎 및/또는 줄기를 1 내지 10 중량부의 물, C_{1 -3} 알코올 또는 그의 혼합물로 추출하여 수성 추출물을 수득하고; 상기 추출물을 부분적으로 또는 완전히 농축하거나 또는 동결건조하는 단계;

   ii) 상기 단계 i)에서 수득된 상기 수성 추출물, 부분적으로 농축된 수성 추출물 또는 상기 완전히 농축되거나 또는 동결건조된 추출물의 수용액에 대해 연속적으로 이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 중성의 수성 추출물을 수득하는 단계;

   iii) 상기 단계 ii)에서 수득된 상기 중성의 수성 추출액을 n-부탄올로 분획화하고 상기 수성 상 및 상기 n-부탄올 상을 분리하는 단계;

   iv) 상기 단계 iii)에서 수득되는 상기 수성상을 메탄올 또는 에탄올과 혼합 및 교반하고, 침전된 고형물을 분리하여 불용성 분획을 수득하는 단계; 및

   v) 상기 단계 iv)에서 수득된 상기 불용성 분획에 대해 연속적으로 겔 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피를 수행하여 정제된 아라비노갈락 탄-단백질(AGP) 조성물을 수득하는 단계.
2. 제1항에 있어서, 상기 C_{1 -3} 알코올은 메탄올, 에탄올, 1-프로판올 또는 2-프로판올로부터 선택되는 것인 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 이온 교환 크로마토그래피는 양이온 교환 크로마토그래피 및 뒤이은 음이온 교환 크로마토그래피인 것인 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 이온 교환 크로마토그래피는 음이온 교환 크로마토그래피 및 뒤이은 양이온 교환 크로마토그래피인 것인 조성물.
5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피는 술폰화된 폴리스티렌 강산 양이온 교환기 또는 카르복시산-형 약산 양이온 교환기 상에서 수행되는 것인 조성물.
6. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피는 지방성 아민-형 약 염기 음이온 교환기 또는 강 염기 음이온 교환기 상에서 수행되는 것인 조성물.
7. 제1항에 있어서, 아르게모네 멕시카나 식물체의 잎 및/또는 줄기에 존재하는 기타 알칼로이드, 플라보노이드, 아미노산, 유기산, 지방산, 및 기타 화합물이 실질적으로 제거된 것인 조성물.
8. 제1항에 있어서, 백본에 6-결합-갈락토피라노오스 및 3,6-결합 갈락토피라노오스 및 말단 위치에 있는 아라비노푸라노실, 아라비노피라노실, 람노피라노실, 글루코피라노실 및 갈락토피라노실 잔기, 및 메틸 우론산을 따라 3-결합, 4-결합 람노피라노실, 2-결합-만노피라노실, 2-결합-글루코피라노실, 3-결합-, 4-결합 갈락토피라노실, 6-결합-, 3,6-결합-글루코피라노실 및 4-결합 자일로피라노실 잔기들을 포함하는 것인 조성물.
9. 제1항에 있어서, 중량 기준으로 45-98%의 탄수화물을 포함하는 것인 조성물.
10. 제 1항에 있어서, 중량 기준으로 2-20%의 단백질을 포함하는 것인 조성물.
11. 아라미노갈락탄-단백질(AGP) 조성물을 분리하는 방법으로서, 상기 방법은:

    i)1 중량부의 아르게모네 멕시카나의 잎 및/또는 줄기를 1 내지 10 중량부의 물, C_{1 -3} 알코올 또는 그의 혼합물로 추출하여 수성 추출물을 수득하고 상기 추출물 을 부분적으로 또는 완전히 농축하거나 또는 동결건조하는 단계;

    ii) 상기 단계 i)에서 수득된 상기 수성 추출물, 부분적으로 농축된 수성 추출물 또는 상기 완전히 농축된/동결건조된 추출물의 수용액에 대해 연속적으로 이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 중성의 수성 추출물을 수득하는 단계;

    iii) 상기 단계 ii)에서 수득된 상기 중성의 수성 추출액을 n-부탄올로 분획화하고 상기 수성 상 및 상기 n-부탄올 상을 분리하는 단계;

    iv) 상기 단계 iii)에서 수득되는 상기 수성상을 메탄올 또는 에탄올과 혼합 및 교반하고, 침전된 고형물을 분리하여 불용성 분획을 수득하는 단계; 및

    v) 상기 단계 iv)에서 수득된 상기 불용성 분획에 대해 연속적으로 겔 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피를 수행하여 정제된 아라비노갈락탄-단백질(AGP) 조성물을 수득하는 단계;를 포함하는 것인 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 C_{1 -3} 알코올은 메탄올, 에탄올, 1-프로판올 또는 2-프로판올로부터 선택되는 것인 방법.
13. 제11항에 있어서, 상기 이온 교환 크로마토그래피는 양이온 교환 크로마토그래피 및 뒤이은 음이온 교환 크로마토그래피인 것인 방법.
14. 제11항에 있어서, 상기 이온 교환 크로마토그래피는 음이온 교환 크로마토그 래피 및 뒤이은 양이온 교환 크로마토그래피인 것인 방법.
15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피는 술폰화된 폴리스티렌 강산 양이온 교환기 또는 카르복시산-형 약산 양이온 교환기 상에서 수행되는 것인 방법.
16. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피는 지방성 아민-형 약 염기 음이온 교환기 또는 강 염기 음이온 교환기 상에서 수행되는 것인 방법.
17. 제11항에 있어서, 상기 겔 크로마토크래피는 암벌라이트(Amberlite) 폴리머 흡착제 상에서 수행되는 것인 방법.
18. 제11항에 있어서, 상기 크기 배제 크로마토그래피는 세파크릴 상에서 수행되는 것인 방법.
19. 제11항에 있어서, 상기 겔 크로마토그래피는 XAD-2, XAD-4 및 XAD-7로부터 선택된 암벌라이트 폴리머 흡착제 상에서 수행되는 것인 방법.
20. 제11항에 있어서, 상기 크기 배제 크로마토그래피는 세파크릴 S-100, 세파크 릴 S-200 HR, 및 세파크릴 S-300 HR로부터 선택된 세파크릴 상에서 수행되는 것인 방법.
21. 치료적 유효량의 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 정제된 아라비노갈락탄-단백질(AGP) 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
22. 제21항에 있어서, 무-독성의 융화가능한(compatible) 충전제, 결합제, 붕해제, 완충제, 보존제, 항산화제, 윤활제, 또는 향미제 중 하나 이상을 더 포함하는 것인 조성물.
23. 제21항에 있어서, 상기 약학적으로 허용가능한 부형제는 당, 전분, 셀룰로오스 및 그의 유도체; 칼슘 포스페이트, 소디움 술페이트; 칼슘 술페이트; 폴리비닐피롤리돈; 폴리비닐 알코올; 스테아르산; 식물성 오일; 비-이온성, 양이온성 및 음이온성 계면활성제; 에틸렌 글리콜 폴리머; β-사이클로덱스트린; 지방산 알코올; 또는 가수분해된 곡물 고형물로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
24. 아르게모네 멕시카나 식물체의 잎 및/또는 줄기로부터 분리되고, 10 KD 내지 150 KD의 평균 분자량 범위를 갖는 정제된 아라비노갈락탄-단백질(AGP).
25. 치료적 유효량의 제59항의 정제된 아라비노갈락탄-단백질(AGP) 및 약학적으 로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
26. 아르게모네 멕시카나 식물체의 잎 및/또는 줄기로부터 분리되고, 10 KD 내지 150 KD의 평균 분자량 범위를 갖는 정제된 아라비노갈락탄-단백질(AGP).
27. 포유 동물에서 건선, 염증성 질환, 자가면역 질환, 과민증, 습진 또는 벗겨지고 가려운 패치, 또는 피부 질환을 치료하기 위한 약제의 제조에서 제1항 내지 제10항, 제24항 또는 제26항 중 어느 한 항에 따른 정제된 아라비노갈락탄-단백질(AGP)의 용도.
28. 포유 동물에서 건선, 염증성 질환, 자가면역 질환, 과민증, 습진 또는 벗겨지고 가려운 패치, 또는 피부 질환을 치료하기 위한 약제의 제조에서 제21항 내지 제23항 또는 제25항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
29. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 질환은 피부염; 피부 경화증; 습진; 건선성 관절염, 류마티즘성 관절염, 크론씨병, 다발성 경화증, 과민성 장 질환, 강직성 척추염, 전신 홍반성 루푸스, 쇼그렌 증후군 및 벗겨지고 가려운 패치로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 용도.
30. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 과민증은 천식 또는 만성 폐색성 폐질환 인 것인 용도.
31. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 건선은 판형 건선, 점상 건선, 농포성 건선 및 손발톱의 건선으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 용도.

Images