WO2014173056A1

WO2014173056A1 - 槐耳多糖蛋白及其制备方法和用途

Info

Publication number: WO2014173056A1
Application number: PCT/CN2013/082674
Authority: WO
Inventors: 徐无为; 陆正鑫
Original assignee: 启东盖天力药业有限公司
Priority date: 2013-04-24
Filing date: 2013-08-30
Publication date: 2014-10-30
Also published as: CN104119429A; CN104119429B

Abstract

本发明提供了一种槐耳多糖蛋白及其制备方法和用途，本发明的槐耳多糖蛋白的单糖组成为岩藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖及甘露糖，其质量比为3.2:2.0:33.5:5.5:1.2:50.4，该多糖蛋白的重均分子量为7.0X10⁵-5.0X10⁶Da，优选为2.69X10⁶Da。本发明的多糖蛋白可以用于制备治疗肿瘤的药物。

Description

槐耳多糖蛋白及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种槐耳多糖蛋白及其制备方法和用途。背景技术

槐耳为多孔菌科真菌槐栓菌 Trametes wbiniophila Muvr: ) 的子实体，是一种重要的民间药用真菌，在中国具有 1600余年的用药历史。 Ainsworth真菌分类系统将其归属于真菌门、担子菌亚门、层菌纲、多孔菌科、栓菌属。槐耳子实体中等至较大，木栓质，无菌柄，生于槐、刺槐等阔叶树的树干上，分布于河北、陕西、辽宁、湖南、广西、福建等地，是一种可以导致树木心材腐朽的木腐菌。本品味苦、辛，性平无毒，有"治风"、 "破血"、 "益力" 的功效，临床上用于治疗多种疾病。由于老龄中国槐日益稀少，导致槐耳资源非常稀少，难以满足临床用药需求，更难以满足槐耳相关产品的工业化生产需求。为了解决槐耳的资源问题，启东盖天力药业有限公司经过长期的研究和实践，攻克了槐耳菌丝体大规模发酵难题，实现了菌丝体的工业化生产，并以槐耳菌质（槐耳菌丝体发酵物）提取物为原料开发了槐耳颗粒和槐杞黄颗粒等药品，满足了临床用药需求。

近年来大量的化学成分及药理活性研究资料证实槐耳菌质提取物的有效成分为槐耳多糖蛋白，其主要功效是治疗或辅助治疗肿瘤性疾病。然而，目前对于槐耳多糖蛋白的组成、结构及制备方法研究很少。在化学成分研究方面，仅粗多糖的单糖组成及比例分析有文献报道，缺乏对其均一多糖的分离纯化和结构研究，如均一多糖蛋白所含的糖残基种类、比例、在主链中的排列次序、蛋白部分所占的比例、组成等，而这些信息对于阐明槐耳菌质真正的药效成分、槐耳多糖蛋白的作用机制及构效关系等至关重要。同样在槐耳多糖蛋白的生物活性研究方面，多以粗多糖作为研究对象，缺乏应用均一多糖组分获得的体内、体外药理学研究数据，导致无法深入了解槐耳多糖蛋白与人体免疫细胞或肿瘤细胞表面相关多糖受体的作用过程，因而无法深入的阐明其作用原理。发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明提供一种槐耳多糖蛋白及其制备方法和用途。本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的。

第一方面，本发明提供一种槐耳多糖蛋白 (又称为 "本发明槐耳多糖蛋白"），该多糖蛋白的单糖组成为岩藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖及甘露糖，其质量比为 3.2： 2.0： 33.5： 5.5： 1.2： 50.4。优选地，所述多糖蛋白的重均分子量为 7.0x l0⁵〜5.0x l0⁶ Da,优选为 2.69x l0⁶ Da。优选地，该多糖蛋白的制备方法包括如下步骤：

( 1 ) 将浓度为 2%〜20 % (质量 /体积），优选为 8% (质量 /体积）的槐耳菌质提取物水溶液采用 Sevage法去除游离蛋白，收集糖类部分；

( 2)将步骤（1 )得到的糖类部分加入无水乙醇中，使其形成醇浓度为 30%〜80% (体积），优选为 30%〜50% (体积），更优选为 40% (体积）的糖溶液，离心，得到沉淀物；

( 3 ) 将步骤（2) 得到的沉淀物加水溶解，过滤，浓縮、透析收集袋内部分；以及

( 4) 使用离子交换柱色谱对步骤（3 ) 收集到的袋内部分进行分离，其中使用的洗脱液为水、 0.1 Mol/L〜1.0 Mol/L NaCl水溶液，优选为 0.1 Mol/L〜0.3 Mol/L NaCl水溶液，更优选为 0.1 Mol/L的 NaCl水溶液。

在本发明中，槐耳菌质提取物包括槐耳菌质的水提取物，尤其是热水（60-100°C ) 提取物。所述槐耳菌质的水提取物可直接使用或浓縮后使用。浓縮的槐耳菌质的水提取物（即槐耳清膏）或未浓縮的槐耳菌质的水提取物可用常规方法制备或购买得到。

优选地，所述多糖蛋白的制备方法还包括对 NaCl溶液洗脱得到的产品进行透析除盐的步骤。

优选地，所述多糖蛋白的制备方法还包括采用 Sepharase CL-6B琼脂糖凝胶柱对透析除盐后的产品进行分离纯化的步骤。

第二方面，本发明提供一种上述多糖蛋白的制备方法，该制备方法包括如下步骤：

( 1 ) 将浓度为 2%-20 % (质量 /体积），优选为 8% (质量 /体积）的槐耳菌质提取物水溶液采用 Sevage法去除游离蛋白，收集糖类部分；

( 4) 使用离子交换柱色谱对步骤（3 ) 收集到的袋内部分进行分离，其中使用的洗脱液为水、 0.1 Mol/L〜1.0 Mol/L NaCl水溶液，优选为 0.1 Mol/L〜0.3 Mol/L NaCl 水溶液，更优选为 0.1 Mol/L的 NaCl水溶液，即得。

优选地，所述制备方法还包括对 NaCl溶液洗脱得到的产品进行透析除盐的步骤。优选地，所述制备方法还包括采用 Sepharase CL-6B琼脂糖凝胶柱对透析除盐后的产品进行分离纯化的步骤。

在一个具体实施方案中，所述制备方法包括如下步骤：

( 1 )准确称取槐耳菌质提取物槐耳清膏 300g，加入适量蒸馏水将其稀释为浓度约为 8% (质量 /体积）的稀溶液，之后采用 Sevage 法除去游离蛋白，重复操作 5次，收集糖类部分；

( 2) 向步骤（1 ) 得到的槐耳菌质糖类部分中缓缓加入无水乙醇使其成为醇浓度为 40% (体积）的糖溶液， 4°C静置 24小时后，以 3000转 /分钟的速度离心 10分钟，沉淀，得到沉淀物；

( 3 ) 称取适量步骤（2) 得到的沉淀物，将其溶解于 150ml蒸馏水中，过滤，减压浓縮至体积 50ml; 透析收集袋内部分，以及

( 4) 使用 DEAE-52离子交换柱色谱对步骤（3 ) 收集到的袋内部分进行分离，先用水洗脱，再采用 0.1 Mol/L NaCl溶液进行洗脱， 0.1 Mol/L NaCl溶液洗脱部分在浓縮后进行透析除盐，透析过程为对流水透析三天，蒸馏水透析两天；以及

( 5 ) 采用 Sepharase CL-6B琼脂糖凝胶柱对步骤（4) 得到的产品进行分离纯化，直至高效液相色谱法检测为纯品为止。

第三方面，本发明提供上述多糖蛋白在制备治疗肿瘤的药物中的用途。本发明槐耳多糖蛋白，具有显著抗肿瘤活性，有望成为一种新型抗肿瘤药物的活性成分。

第四方面，本发明提供包含槐耳多糖蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物，其中，所述组合物中含有重量比为 0.01%-99.95%的槐耳多糖蛋白作为活性成分，并且以槐耳多糖蛋白的总重量计，所述槐耳多糖蛋白中含有 90wt%-100wt%的本发明第一方面所述的槐耳多糖蛋白。

该药物组合物优选含有重量比为 0.1%-99.9%的槐耳多糖蛋白作为活性成分，较佳地，含有重量比为 0.1%-99.5%的槐耳多糖蛋白作为活性成分，更优选含有重量比为 0.5%-95%的活性成分。

该药物组合物，含有治疗有效量的本发明槐耳多糖蛋白，具有显著的抗肿瘤功效。可将槐耳多糖蛋白与可药用赋形剂、稀释剂等药学上可接受的载体的混合物以片剂、胶囊、颗粒剂、散剂或糖浆剂的形式口服给药或以注射剂的形式非口服给药。上述制剂可通过常规制药方法制备。可用的药学上可接受的载体的例子包括赋形剂 (例如糖类衍生物如乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和山梨糖醇；淀粉衍生物如玉米淀粉、土豆淀粉、糊精和羧甲基淀粉；纤维素衍生物如结晶纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠；阿拉伯胶；右旋糖酐；硅酸盐衍生物如偏硅酸镁铝；磷酸盐衍生物如磷酸钙；碳酸盐衍生物如碳酸钙；硫酸盐衍生物如硫酸钙等)、粘合剂 (例如明胶、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇)、崩解剂 (例如纤维素衍生物如羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮)、润滑剂 (例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、鲸蜡、硼酸、苯甲酸钠、亮氨酸)、稳定剂 (对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯等)、矫味剂 (例如常用的甜味剂、酸味剂和香料等)、稀释剂和注射液用溶剂 (例如水、乙醇和甘油等)。

使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明槐耳多糖蛋白施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约 1微克 /天，而且在大多数情况下不超过约 10毫克 /千克体重。较佳地，该剂量是约 1微克 /天-约 3毫克 /千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是在熟练医师技能范围之内的。

此外，本发明槐耳多糖蛋白可以单药使用，也可以与其它药物联合使用。优选的联合使用包括：与外科手术联合使用，与一种或多种西药联合使用，与中草药联合使用，与放射性治疗联合使用。

本发明的药物组合物的给药途径没有特别限制，其中包括但并不限于：口服给药，注射给药，瘤内给药，植入给药，腔内给药，肛门给药，透皮给药，内外敷；优选的注射给药包括：静脉注射，肌肉注射，皮下注射，腔内注射、瘤内给药。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

本发明首次采用系统的水提取、醇沉淀、去游离蛋白、透析小分子、离子交换色谱及凝胶分子排阻色谱分离的手段从槐耳菌质中分离获得了一个均一的多糖蛋白组分，并综合的应用分子量分析、单糖组成及氨基酸组成分析、红外光谱分析及甲基化分析等手段，对其进行了化学结构特点的确认，明确了其重均分子量、单糖组成及比例、氨基酸组成及比例，以及所含糖残基的连接方式。这样一个结构特点明晰、分子量均一的槐耳菌质多糖组分，是研究槐耳多糖有效成分及其生物活性的理想分子模型，为阐明槐耳多糖的免疫调节及抗肿瘤有效成分和作用机制奠定了基础，本发明将为槐耳菌质深层次开发及相关制剂的质量控制提供科学依据。附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图 1为槐耳菌质提取物槐耳清膏分级醇沉淀流程图；

图 2为槐耳菌质提取物槐耳清膏 40%乙醇沉淀部位 TCP-40柱色谱纯化流程图；图 3为槐耳多糖蛋白 TP-1分子量（Mw) 测定标准曲线；

图 4为槐耳多糖蛋白 TP-1单糖组分分析中对照品溶液的离子色谱图；

图 5为槐耳多糖蛋白 TP-1的 UPLC-GPC图谱；

图 6为槐耳多糖蛋白 TP-1单糖组成分析离子色谱图；图 7为 ³H-TdR掺入法检测小鼠脾细胞增殖，其中， TCP: 粗多糖； TP-1 : 槐耳多糖蛋白 -1 ; TP-2: 槐耳多糖蛋白 -2; TP-3 : 槐耳多糖蛋白 -3; TP-4: 槐耳多糖蛋白 -4; To-1 : 槐耳低分子量组分 -1 ; Το-2: 槐耳低分子量组分 -2; Το-3 : 槐耳低分子量组分 -3 ; Το-4: 槐耳低分子量组分 -4; TFP: 槐耳粗总游离蛋白部分；

图 8为 ³H-TdR掺入法检测小鼠 Τ、 Β淋巴细胞增殖，其中，图 Α为 CD19+细胞；图 B为 CD3+细胞；图 C为小鼠 T淋巴细胞；图 D为小鼠 B淋巴细胞； Dex: 葡聚糖； TCP: 粗多糖； TP-1 : 槐耳多糖蛋白 -1 ; TP-2: 槐耳多糖蛋白 -2; TP-3: 槐耳多糖蛋白 -3； TP-4: 槐耳多糖蛋白 -4; LPS: 脂多糖；

图 9为槐耳多糖刺激后小鼠及人 T、 Β淋巴细胞比例变化，其中，图 Α为小鼠 Τ 淋巴细胞；图 B为小鼠 B淋巴细胞；图 C为人类 T淋巴细胞；图 D为人类 B淋巴细胞； Dex: 葡聚糖（Dextran); TCP: 粗多糖； TP-1 : 槐耳多糖蛋白 -1 ; TP-2: 槐耳多糖蛋白 -2; TP-3 : 槐耳多糖蛋白 -3 ; TP-4: 槐耳多糖蛋白 -4; LPS: 脂多糖；

图 10为槐耳多糖刺激后 T、 Β淋巴细胞表面 CD69的表达，图 Α为槐耳多糖刺激后 T淋巴细胞表面 CD69的表达，图 B为槐耳多糖刺激后 B淋巴细胞表面 CD69的表达，其中 Dex: 葡聚糖（Dextran); TCP: 粗多糖； TP-1 : 槐耳多糖蛋白 -1 ; TP-2: 槐耳多糖蛋白 -2; TP-3: 槐耳多糖蛋白 -3; TP-4: 槐耳多糖蛋白 -4; LPS: 脂多糖；

图 11 为槐耳多糖刺激后小鼠腹腔巨噬细胞 NO 释放变化，其中 Dex: 葡聚糖 (Dextran); TCP: 粗多糖； TP-1 : 槐耳多糖蛋白 -1 ; TP-2: 槐耳多糖蛋白 -2; TP-3: 槐耳多糖蛋白 -3; TP-4: 槐耳多糖蛋白 -4; To-1 : 槐耳低分子量组分 -1 ; To-2: 槐耳低分子量组分 -2; Το-3 : 槐耳低分子量组分 -3 ; Το-4: 槐耳低分子量组分 -4; TFP: 槐耳粗总游离蛋白部分； LPS: 脂多糖；

图 12槐耳多糖蛋白对肿瘤血管形成内皮细胞增殖的抑制作用，其中 TP-1 : 槐耳多糖蛋白 -1。具体实施方式

下面通过实施例详细说明本发明，应当理解，下述实施例仅用于说明本发明，而不以任何方式限制本发明的范围。实施例 1 : 槐耳多糖蛋白（TP-1 ) 的分离纯化方法

准确称取槐耳菌质提取物槐耳清膏（由启东盖天力药业有限公司提供） 300g，加入适量蒸馏水将其稀释为浓度约为 8% (质量 /体积）的稀溶液，之后采用 Sevage 法去游离蛋白，重复操作 5次，分别收集糖类部分（TCP)及槐耳粗总游离蛋白部分（TFP), 槐耳粗总游离蛋白部分真空干燥备用，槐耳菌质糖类物质部分（TCP ) 在减压浓縮去除残存的氯仿及正丁醇后，进行分级醇沉淀。首先向 TCP中缓缓加入无水乙醇使其成为醇体积浓度为 40% (体积）的糖溶液， 4°C静置 24小时后， 3000转 /分钟离心 10 分钟，沉淀编号为 TCP-40, 减压干燥以备进一步分离纯化，之后向上清液中继续加入适量无水乙醇使其成为含醇 60% (体积）的糖溶液， 4°C静置 24小时后， 3000转 /分钟，离心 10分钟，沉淀编号为 TCP-60, 减压干燥以备进一步分离纯化，在此之后继续向上清液中加入适量无水乙醇至乙醇浓度达到 80% (体积）， 4°C静置 24小时后， 3000 转 /分钟离心 10分钟，弃去上清，沉淀编号为 TCP-80, 减压干燥以备进一步分离纯化，具体分级醇沉淀流程图见图 1。

称取适量的槐耳清膏 40 % (体积）乙醇沉淀部位 TCP-40, 将其溶解于 150ml蒸馏水中，经 0.45μηι水系滤膜过滤后，减压浓縮至体积 50ml，透析收集袋内部分及袋外部分，袋外部分为槐耳低分子量组分 -1 ( TO-1 ), 袋内部分通过 DEAE-52 离子交换柱色谱分离，分别采用蒸馏水及 O. lM NaCl溶液、 0.5M NaCl洗脱，每个部位收集 3.0L, 水洗脱部分直接浓縮至干，氯化钠洗脱部分均在浓縮后进行透析除盐，透析过程为对流水透析三天，蒸馏水透析两天。然后各段分别采用 Sepharose CL-6B琼脂糖凝胶柱进行分离纯化，直至高效液相色谱法检测为纯品为止，经过上述柱色谱分离过程，分别从 TCP-40 离子交换柱色谱 0.1 Mol/L NaCl 洗脱部位纯化获得了 UPLC (超高效液相色谱）验证为均一组分的多糖蛋白 TP-1 ( 397mg) 以及从 0.5 Mol/L NaCl洗脱部位获得了均一多糖蛋白 TP-2 ( 1212 mg) ，分离流程图见图 2。

称取适量的槐耳清膏 60 % (体积）乙醇沉淀部位 TCP-60, 将其溶解于 150ml蒸馏水中，过滤，经减压浓縮至体积 50ml，透析收集袋内部分及袋外部分，袋外部分为槐耳低分子量组分 -2 ( TO-2 ) , 袋内部分通过 DEAE -52 离子交换柱色谱分离，分别采用蒸馏水及 l .O Mol/LNaCl溶液洗脱，每个部位收集 3.0L, 水洗脱部分直接浓縮至干，氯化钠洗脱部分均在浓縮后进行透析除盐，透析过程为对流水透析三天，蒸馏水透析两天。然后各段分别采用 Sepharose CL-6B琼脂糖凝胶柱进行分离纯化，直至高效液相色谱法检测为纯品为止，经过上述柱色谱分离过程，分别从 TCP-60 离子交换柱色谱 l .O Mol/L NaCl 洗脱部位纯化获得了 UPLC (超高效液相色谱）验证为均一组分的多糖蛋白 TP-3 ( 12.1g

称取适量的槐耳清膏 80 % (体积）乙醇沉淀部位 TCP-80, 将其溶解于 150ml蒸馏水中，过滤，减压浓縮至体积 50ml，透析收集袋内部分及袋外部分，袋外部分为槐耳低分子量组分 -3 ( TO-3 ) , 袋内部分通过 DEAE -52 离子交换柱色谱分离，分别采用蒸馏水及 1.0 Mol/L NaCl水洗脱，每个部位收集 3.0L, 水洗脱部分直接浓縮至干，氯化钠洗脱部分均在浓縮后进行透析除盐，透析过程为对流水透析三天，蒸馏水透析两天。然后各段分别采用 Sepharase CL-6B琼脂糖凝胶柱进行分离纯化，直至高效液相色谱法检测为纯品为止，经过上述柱色谱分离过程，分别从 TCP-80 离子交换柱色谱 l .O Mol/LNaCl 洗脱部位纯化获得了 UPLC (超高效液相色谱）验证为均一组分的多糖蛋白 TP-4 ( lO.Og) , 收集槐耳清膏 80 % (体积）乙醇沉淀上清液部分得槐耳低分子量组分 -4 ( TO-4) (图 1 )。实施例 2: 槐耳多糖蛋白（TP-1 ) 化学结构的研究

本实施例研究了实施例 1制备的槐耳多糖蛋白 TP-1的化学结构。

一、槐耳多糖蛋白（TP-1 ) 化学结构研究方法

1、纯度及分子量的测定

UPLC-GPC-ELSD仪器配置及色谱条件：美国 Waters UPLC, TSK-3000 GPC色谱柱，自动进样器， Millipore超纯水离子交换器制备高纯水（0.45μηι醋酸纤维素膜过滤）；流速 0.3 ml/mino

标准曲线的制备：分别称取适量的右旋糖苷标准品，加入去离子水，将其配置成浓度 0.5mg/ml 的对照品溶液，之后逐一进行 UPLC检测，结果见图 3。

样品溶液制备：分别称取一定量的 TP-1 , 加入适量去离子水，将其配制成浓度为 lmg/ml 的溶液， Millipore 0.22μηι水系滤膜过滤，进样检测。

2、单糖组成分析

完全酸水解：精密称取 TP-1 (10 mg) 放入厚壁耐压瓶中，加入 4ml的 2 MoVL 三氟乙酸（TFA) , 充氮气，封管后， 100°C水解 2小时，减压蒸干。

样品的离子色谱分析

仪器配置及色谱条件： Dionex ICS 3000 型离子色谱， CarboPac PA20 分析柱， 150x3mm, S/N 002823 , CarboPac PA20保护柱， 50*3mm， S/N 002652, 淋洗液组成及流速 l-25min， Im Mol/L KOH; 25.1-32 min, 30m Mol/L KOH; 32.1-35 min, Im Mol/L KOH; 0.45mL/min, 进样 10μΙ^。

对照品溶液的制备：取岩藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖对照品适量，用去离子水溶解成各含 10.0 mg/L的对照品溶液，摇匀，即得。

标准曲线制备：精密吸取对照品混合贮备液适量，分别用去离子水将其稀释成 0.5 mg/L 、 lmg/L、 5 mg/L、 10 mg/L、 15 mg/L 的标准溶液， 0.45 μηι微孔滤膜过滤之后依次进行离子色谱测定，离子色谱条件为： Dionex ICS 3000型离子色谱， CarboPac PA20 分析柱， 150x3mm， S/N 002823 , CarboPac PA20保护柱， 50*3mm， S/N 002652, 淋洗液组成及流速 l-25min, Im Mol/L KOH; 25.1-32 min, 30m Mol/L ΚΟΗ, ; 32.1-35 min, Im Mol/L KOH; 0.45mL/min, 进样 10μ 。以峰面积积分值为纵坐标（Υ)、以各标准品浓度为横坐标（X) , 绘制各对照品标准曲线并计算回归方程，结果见表 1和图 4。

供试品溶液制备：将槐耳多糖蛋白 TP-1完全酸水解产物复溶于 50ml去离子水，超声 10分钟使溶解，取溶液适量，过孔径 0.22μηι水系滤膜及 DIONEX RP II 固相萃取小柱。

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各 ΙΟμΙ^, 注入离子色谱仪，即得。

表 1 线性关系考察结果

对照品名称相对保留时间回归方程相关系数 (R) 岩藻糖 0.20 Υ=1.282Χ+0.055 99.9724 阿拉伯糖 0.67 Υ=1.848χ-0.100 99.9973 半乳糖 0.85 Υ=2.138χ-0.170 99.9765 葡萄糖 1.00 Υ=2.297χ-0.164 99.9630 木糖 1.20 Υ=2.629χ-0.176 99.9620 甘露糖 1.30 Υ=1.911χ-0.147 99.9826

3、甲基化分析

多糖蛋白完全甲基化：槐耳多糖蛋白 TP-1(10 mg )于反应瓶中，放入真空干燥箱中干燥 5h ( 50°C )，加入经过分子筛处理过的 DMSO 2ml, 超声振荡 5分钟，待样品完全溶解后，加入研磨成粉状 NaOH 20mg，同时用氮气赶尽瓶中空气，室温下超声 10分钟，静置 90分钟，待反应瓶中的 DMSO完全冰冻后，逐滴加入 0.1ml碘甲烷（此过程大约需要 15〜20分钟），同时反应物会慢慢解冻，并逐渐澄清，直至成为亮黄色。然后超声 10分钟，静置 30分钟。室温减压蒸馏，去尽过量的碘甲烷，用水透析一天，减压蒸至 2ml左右。冷冻干燥后再于干燥器中干燥 5小时，重复上述操作 2次后，取少量样品进行红外检测，如果红外光谱中原 3300cm-¹ 处强而宽的羟基峰消失，而 2900cm- ¹处甲基峰显著增强，表明样品的全甲基化反应已经完成。

部分甲基化阿尔迪醇乙酰酯制备：将已经完全甲基化的样品溶于 3mL 体积分数为 90%的甲酸溶液中，封管， 100°C下解聚 6h，向反应瓶中加入 2〜3mL 甲醇， 40°C下减压浓縮蒸干，重复以上操作三次以除尽过量甲酸，然后向解聚后的样品中加入 2 Mol/L TFA溶液 4mL，密封后于 110°C下水解 2h，反应瓶中的溶液于 40°C下减压蒸干，再加入 2〜3mL 甲醇，蒸干，重复以上操作多次以除尽过量的 TFA。水解后的样品用 3〜4mL蒸馏水溶解后，加入约 20mg NaBH₄于室温下还原 3h，然后用冰醋酸调 pH 值到 5左右，加入 l〜2mL甲醇及一滴冰醋酸后，再减压蒸干，重复上述操作多次以除尽过量的乙酸。经上述处理的样品置于 P₂0₅真空干燥器中减压干燥一天，再于 110°C干燥 10〜15min 后，加入 3mL醋酐， 110°C反应 lh，向反应液中加入 2mL甲苯，振荡后 40°C下减压蒸去未反应的醋酐，如此重复多次以除尽醋酐。然后将乙酰化后的样品溶于氯仿中，再加入等体积的蒸馏水洗涤氯仿层 3 次，除尽水层，氯仿层加入无水硫酸钠干燥 lOmin, 过滤，将氯仿溶液室温减压浓縮至 O. lmL 左右后，进行气质联用分析 ( GC-MS )。气质的条件为：起始温度 50°C，升温程序为 40°C/min，至 215 °C，保持 40min, 检测器温度 250°C， DB-5 毛细管 GC-MS色谱柱检测。

4、氨基酸分析：

称取适量槐耳多糖蛋白 TP-1 ( 10 mg) 放入试管中，加入 4ml的 6 Mol/L HC1在 100°C下水解 6小时，蒸去 HC1，离心，过滤，滤液用氨基酸分析仪进行分析。

5、 IR光谱分析：

称取 lmg样品，真空干燥过夜，次日用溴化钾压片法进行 IR检测。

二、槐耳多糖蛋白（TP-1 ) 化学结构研究结果

根据第一部分的研究方法对实施例 1制备的槐耳多糖蛋白（TP-1 )的化学结构进行了研究，研究结果如下：

1、纯度及分子量

TP-1为淡黄色粉末状物质，易溶于水、 DMSO, 不溶于高浓度的甲醇、乙醇等有机溶剂，该多糖蛋白的 UPLC-ESLD图谱呈现一个对称的窄的色谱峰，提示其为一个纯的多糖蛋白物质，与分子量标准品对比，该多糖蛋白的分子量为 2.69x l0⁶ Da (见图 5 )。 Lowry反应呈阳性，紫外扫描 280nm处有弱的吸收，表明该物质含有蛋白。 TP-1 的红外光谱在 1735cm-¹处无吸收，提示 TP-1不含糖醛酸。

2、单糖组成分析

TP-1完全酸水解之后，水解产物一部分直接进行了离子色谱分析，与标准单糖对照，分析结果表明该多糖由岩藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖及甘露糖组成，在检测过程中没有发现与糖醛酸及氮乙酰氨基糖相关的色谱峰显示出来，提示其为一中性多糖（见表 2和图 6)。

表 2 槐耳多糖蛋白 TP-1单糖组成及质量比例离子色谱分析结果

通过单糖组成分析可以看出，槐耳多糖蛋白 TP-1含有 6种单糖，其中以半乳糖及甘露糖的含量最高，木糖、岩藻糖、阿拉伯糖及葡萄糖含量较少。 3、甲基化分析

为了确认 TP-1中的糖残基连接方式，采用 Needs法对 TP-1进行了甲基化，在三次甲基化之后，将其用 90%的甲酸解聚，以 2 Mol/L TFA完全酸水解， NaBH₄还原和醋酐乙酰化制备成阿尔迪醇乙酸酯衍生物，进行 GC-MS分析，结果见表 3。

通过甲基化分析表明，槐耳多糖蛋白 TP-1的结构非常复杂。含有 10种不同连接的糖残基，其中阿拉伯糖以 1位， 1，2位羟基与其它糖残基形成糖苷键连接，木糖以 1 位羟基与其它糖残基形成糖苷键连接，葡萄糖以 1，2位羟基与其它糖残基形成糖苷键连接，半乳糖以 1，3 位、 1，6位及 1，2，6位羟基与其它糖残基形成糖苷键连接，而甘露糖则以 1位、 1，6位羟基与其它糖残基形成糖苷键连接，具体糖残基之间的峰面积百分比见表 3。

表 3 TP-1甲基化分析结果

连接方式峰面积百分比

非还原末端连接木糖残基 1%

非还原末端连接阿拉伯糖残基 1%

1， 2位连接阿拉伯糖残基 4%

1，3位连接岩藻糖残基 9%

非还原末端连接甘露糖残基 22%

1，2位连接葡萄糖残基 4%

1，3位连接半乳糖残基 5%

1，6位连接甘露糖残基 8%

1，6位连接半乳糖残基 30%

1，2，6位连接半乳糖残基 16% 上述甲基化分析结果与单糖组成分析结果存在差异与反应过程中不同糖残基损失程度不同有关。

4、氨基酸分析：

为了分析槐耳多糖蛋白 TP-1中的氨基酸组成及比例，采用盐酸水解结合日立自动氨基酸分析仪，对其进行了氨基酸组成及比例分析，结果见表 4。

表 4槐耳多糖蛋白 TP-1氨基酸组成分析结果

氨基酸名称含量 g/mg

天冬氨酸 1.94 苏氨酸 1.15

丝氨酸 0.82

谷氨酸 2.31

甘氨酸 1.18

丙氨酸 1.86

缬氨酸 1.90

蛋氨酸 0.61

异亮氨酸 0.56

亮氨酸 1.53

酪氨酸 0.52

苯丙氨酸 0.92

赖氨酸 1.08

组氨酸 0.00

精氨酸 0.74

脯氨酸 1.03

天冬氨酸 1.94

苏氨酸 1.15

丝氨酸 0.82

5. IR光谱分析

TP-1的红外光谱在 1735cm-¹处无吸收，提示 TP-1不含糖醛酸。实施例 3槐耳清膏及所含化学成分体内免疫活性研究

1、样品来源

槐耳清膏由启东盖天力药业有限公司提供。粗多糖 TCP, 均一多糖 TP-1、 ΤΡ-2、 ΤΡ-3、 ΤΡ-4, 低分子量组分 ΤΟ-1、 ΤΟ-2、 ΤΟ-3、 ΤΟ-4由实施例 1制备。

2、促进小鼠脾细胞增殖

1 ) 检测槐耳多糖是否能刺激小鼠脾细胞增殖

方法：槐耳清膏各组分（粗多糖 TCP; 槐耳多糖 TP-1、 ΤΡ-2、 ΤΡ-3、 ΤΡ-4; 低分子量组分 ΤΟ-1、 ΤΟ-2、 ΤΟ-3、 ΤΟ-4; 槐耳粗总游离蛋白部分 TFP) 及阴性对照药品葡聚糖（Dextnm) 与小鼠脾细胞共培养， 42h后，掺入 ³H-TdR， 48h后采用细胞收集器 Filtermate harvester检测其增殖指数。结果如图 7。结论：从 ³H-TdR结果看，由槐耳清膏中提取的多糖成分（包括粗多糖 TCP, 多糖组分 TP-1， TP-2, TP-3 , TP-4) 均能刺激小鼠脾细胞增殖；低分子量组分除 TO-3 外均不能刺激脾细胞增殖。

2) 槐耳多糖能刺激小鼠 B细胞增殖，而非 T细胞

方法：粗多糖 TCP、槐耳多糖 TP- 1、 TP-2、 TP-3、 TP-4与阴性对照品葡聚糖（ Dextran) (浓度梯度为 100μ_§/ηι1， 30μ_§/ηι1, 10μ_§/ηι1) , 阳性对照脂多糖（LPS) 与纯化的 T、 Β淋巴细胞共培养， 42h掺入 1H-TdR， 48h后采用细胞收集器 Filtermate harvester检测其增殖指数。结果见图 8。

结论：磁珠分选获得高纯度的1\ B细胞，与槐耳多糖共孵育 48h后， ³H-TdR结果显示，槐耳多糖组分 TP-1、 TP-2, TP-3、 TP-4, TCP刺激的是 B细胞，而非 T细胞。且这种刺激作用呈剂量相关性。

3 ) 槐耳多糖刺激小鼠脾细胞及人外周血单个核细胞（PBMC) 后， Τ、 Β 细胞比例变化

方法：粗多糖 TCP、槐耳多糖 TP-1、 TP-2、 TP-3、 TP-4与葡聚糖 ( Dextran) (浓度为 50μ_§/ηι1)、脂多糖（LPS ) 与小鼠脾细胞及人外周血 PBMC共培养， 24小时后，流式检测1\ B细胞比例。结果见图 9。

结论：槐耳多糖 TP-1、 TP-2, TP-3、 TP-4刺激小鼠脾细胞或人外周血 PBMC后，与对照药物葡聚糖（Dextran)相比， B细胞比例明显上调，而 T细胞比例无明显变化。

4) 槐耳多糖刺激小鼠脾细胞后， T， Β细胞上 CD69的表达

方法：粗多糖 TCP、槐耳多糖 ΤΡ-1、ΤΡ-2、ΤΡ-3、ΤΡ-4与对照多糖葡聚糖（Dextran) (浓度为 50μ_§/ηι1)、脂多糖（LPS ) 与小鼠脾细胞共培养， 6小时后，流式检测 T、 Β 细胞表面 CD69的表达。结果见图 10。

结论：槐耳多糖刺激小鼠脾细胞 6h后， B细胞开始高表达 CD69, 而 T细胞无明显变化。

3、促进巨噬细胞释放 NO

方法：小鼠腹腔巨噬细胞体外培养，加入粗多糖 TCP、槐耳多糖 TP-1、 TP-2、 ΤΡ-3、 TP-4, 低分子量组分 ΤΟ-1、 ΤΟ-2、 ΤΟ-3、 ΤΟ-4、槐耳粗总游离蛋白部分 TFP与对照多糖葡聚糖（De_Xtnm)、脂多糖（LPS ) 共培养， 48小时后，用格里斯试剂盒（Griess Reagent kit) 检测细胞培养上清中 NO的含量，结果见图 11。

结论： NO检测结果显示，槐耳多糖能够刺激小鼠巨噬细胞分泌 NO, 且分泌量与多糖浓度呈剂量相关性。低分子量组分刺激后 NO的分泌则没有显著变化。实施例 4槐耳多糖蛋白对肿瘤血管形成内皮细胞增值的抑制作用

一、实验方法与步骤：

1、实验材料

细胞：人类肿瘤来源的血管内皮细胞

试剂： M199培养基，双抗，胎牛血清（FBS)，碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)，明胶（ gelatin)。

待测样品： TP-1: 槐耳多糖蛋白 -1

2、实验步骤：

(1) 用排枪将 0.2%明胶加入 96孔板内，每孔 40微升，摇匀。放入培养箱孵育 30分钟以上。

(2) 取出 96孔板，用排枪吸出明胶，用 PBS洗一遍，放于超净台备用。

(3) 配制 20%FBS，加双抗的 M199培养液。

(4) 取复苏的人类肿瘤来源的血管内皮细胞，吸出培养液，用 PBS洗一次，离心后用 10%血清的 M199重悬计数，调整细胞浓度为 40000-50000/ml。

(5) 用排枪将细胞加入 96孔板，每孔 100微升，边缘孔加等量 PBS。放入培养箱。

(6) 12小时后，配制含 1%-5%FBS， 10-lOOng/mlbFGF的 M199培养基。

(7) 取出 96孔板，用排枪吸出培养基，加入含 1%-5%FBS以及 bFGF的 M199 与药物，每孔 100微升，设对照组与调零组。并加入待测样品，分别为 TCP、 TP-1、 ΤΡ-2、 ΤΡ-3与 ΤΡ-4。每一样品设 4个浓度，分别为 l(^g/L、 10(^g/L、 50(^g/L、与 100(^g/L。然后在 37°C， 5%的 C0₂下连续孵育。

(8) 72小时后，吸去培养基，加 MTT浓度 0.5 mg/ml，过滤除菌)，孵育 4-6小时。

(9) 吸去 MTT, 加 100微升 DMSO， 570 nm测 OD.

二、实验结论：

槐耳多糖蛋白 -1 (TP-1) 对肿瘤血管内皮细胞的增殖具有显著的抑制作用。结果见图 12。图中数值显示为均数 ±标准差。各给药组与对照组相比较后，并经方差分析及事后 T检验。 *P<0.05，表示两组比较有显著性差异。 ***P<0.001，表示两组比较有极显著差异。

Claims

权利要求书

1、一种槐耳多糖蛋白，该多糖蛋白的单糖组成为岩藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖及甘露糖，其质量比为 3.2: 2.0： 33.5： 5.5： 1.2： 50.4。

2、根据权利要求 1所述的多糖蛋白，其特征在于，所述多糖蛋白的重均分子量为 7.0x l0⁵〜5.0x l0⁶ Da，优选为 2.69x l0⁶ Da。

3、根据权利要求 1或 2所述的多糖蛋白，其特征在于，该多糖蛋白的制备方法包括如下步骤：

( 1 ) 将浓度为 2%〜20% (质量 /体积），优选为 8% (质量 /体积）的槐耳菌质提取物水溶液采用 Sevage法去除游离蛋白，收集糖类部分；

( 4) 使用离子交换柱色谱对步骤（3 ) 收集到的袋内部分进行分离，其中使用的洗脱液为水、 0.1 Mol/L〜1.0 Mol/L NaCl水溶液，优选为 0.1 Mol/L 〜0.3 Mol/L NaCl 水溶液，更优选为 0.1 Mol/L的 NaCl水溶液。

4、根据权利要求 3所述的多糖蛋白，其特征在于，所述多糖蛋白的制备方法还包括对 NaCl溶液洗脱得到的产品进行透析除盐的步骤。

5、根据权利要求 4所述的多糖蛋白，其特征在于，所述多糖蛋白的制备方法还包括采用 Sepharose CL-6B琼脂糖凝胶柱对透析除盐后的产品进行分离纯化的步骤。

6、一种权利要求 1至 5中任一项所述的多糖蛋白的制备方法，该制备方法包括如下步骤：

( 4) 使用离子交换柱色谱对步骤（3 ) 收集到的袋内部分进行分离，其中使用的洗脱液为水、 0.1 Mol/L〜1.0 Mol/L NaCl水溶液，优选为 0.1 Mol/L 〜 0.3 Mol/L NaCl 水溶液，更优选为 0.1 Mol/L的 NaCl水溶液，即得。

7、根据权利要求 6所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括对 NaCl 溶液洗脱得到的产品进行透析除盐的步骤。

8、根据权利要求 7 所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括采用 Sepharose CL-6B琼脂糖凝胶柱对透析除盐后的产品进行分离纯化的步骤。

9、根据权利要求 6至 8中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

( 1 )准确称取槐耳菌质提取物槐耳清膏 300g，加入适量蒸馏水将其稀释为浓度约为 8%的稀溶液，之后采用 Sevage 法去除游离蛋白，重复操作 5次，收集糖类部分；

( 2) 向步骤（1 ) 得到的槐耳菌质糖类部分中缓缓加入无水乙醇使其成为醇浓度为 40%的糖溶液， 4°C静置 24小时后，以 3000转 /分钟的速度离心 10分钟，沉淀，得到沉淀物；

( 4)使用 DEAE-52离子交换柱色谱对步骤（3 )收集到的袋内部分进行分离，采用 0.1 Mol/L NaCl溶液进行洗脱，洗脱部分在浓縮后进行透析除盐，透析过程为对流水透析三天，蒸馏水透析两天；以及

( 5 ) 采用 Sepharose CL-6B琼脂糖凝胶柱对步骤（4) 得到的产品进行分离纯化，直至高效液相色谱法检测为纯品为止。

10、权利要求 1至 5中任一项所述的多糖蛋白在制备治疗肿瘤的药物中的用途。

11、一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含槐耳多糖蛋白和药学上可接受的载体，其中，所述组合物中含有重量比为 0.01%-99.95%的槐耳多糖蛋白作为活性成分，并且以槐耳多糖蛋白的总重量计，所述槐耳多糖蛋白中含有 90wt%-100wt% 的权利要求 1至 5中任一项所述的槐耳多糖蛋白。