CN102621260A - 一种槐耳菌质提取物的鉴定及检测方法 - Google Patents
一种槐耳菌质提取物的鉴定及检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种槐耳菌质提取物的鉴定及检测的方法。鉴定方法主要是采用阴离子交换色谱方法建立槐耳菌质提取物中多糖蛋白各单糖组成的色谱指纹图谱，通过样品指纹图谱与标准提取物的指纹图谱的相似度对比进行质量控制。检测方法主要是利用阴离子交换色谱法对槐耳菌质提取物的多糖蛋白的各单糖组成及含量进行测定，从而制定其含量限度。利用这种阴离子交换色谱的指纹图谱结合含量测定的方法实现对槐耳提取物及其相关产品质量的有效控制并与其它产品进行有效区分。本发明的方法快速、简便、专属性强。
Description
技术领域
本发明属于分析检测领域，具体而言，涉及一种槐耳菌质提取物的鉴定及检测方法。
背景技术
槐耳(Trametes robiniophila Murr.)学名槐栓菌，是一种重要的民间药用真菌，在中国拥有1600余年的用药历史，Ainsworth真菌分类系统将其归属于真菌门、担子菌亚门、层菌纲、多孔菌科、栓菌属。槐耳子实体中等至较大，木栓质，无菌柄，生于槐、刺槐等阔叶树的树干上，分布于河北、陕西、辽宁、湖南、广西、福建等地，是一种可以导致树木心材腐朽的木腐菌。本品味苦、辛，性平无毒，有“治风”、“破血”、“益力”的功效，临床上用于治疗多种疾病。由于老龄中国槐日益稀少，采集和分离槐耳子实体进行人工培育非常困难，因此，药用槐耳只能通过生物发酵工程获得，目前，临床上主要以其人工培养菌质提取物入药。
近年来大量的化学成分及药理活性研究资料证实槐耳菌质提取物的有效成分为槐耳多糖蛋白。然而，由于糖类检测的种种技术瓶颈限制，现行的槐耳菌质及其相关产品的质量标准中对总蛋白含量进行了测定，对于多糖，仅是采用葡萄糖为对照进行了初步的测定，这样不足以有效控制槐耳菌质提取物中的多糖蛋白类成分。因此，为了有效控制含有槐耳菌质的提取物及其相应制剂的质量，提高其质控水平，需要建立一套快速、简便、专属性强的检测槐耳菌质提取物中多糖蛋白的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种槐耳菌质提取物的鉴定及检测方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一方面，本发明提供一种槐耳菌质提取物的鉴定方法，该鉴定方法包括如下步骤：
(1)采用阴离子交换色谱法测定标准槐耳菌质提取物中多糖蛋白的单糖组成，建立标准谱图A；
(2)采用步骤(1)的阴离子交换色谱法测定待测槐耳菌质提取物中的多糖蛋白的单糖组成，获得谱图B；
(3)将所述谱图B和所述谱图A进行比对；
其中，所述阴离子交换色谱的条件包括：
采用阴离子交换色谱柱进行分离，优选以嵌合烷基季铵盐功能基的苯乙烯基二乙烯基苯为填充剂的色谱柱；
采用1mM～1.5mM，优选为1mM的强碱为流动相；
采用25～40℃，优选为30℃的柱温；以及
采用电化学检测器，优选脉冲安培检测器。
上述鉴定方法中，所述流动相为1mM～1.5mM，优选为1mM的NaOH或KOH。
上述鉴定方法中，所述标准槐耳菌质提取物的制备方法如下：
取槐耳菌质，加水煎煮，过滤，合并提取液，减压浓缩至相对密度为1.35～1.40的清膏，即得。
上述鉴定方法中，所述标准槐耳菌质提取物的制备方法还包括如下步骤：将相对密度为1.35～1.40的清膏与药学上可接受的辅料，诸如蔗糖、糊精、可溶性淀粉或矫味剂混匀、制粒。
上述鉴定方法中，所述多糖蛋白的单糖包含阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和甘露糖中的一种或多种。
上述鉴定方法为定性检测方法，是通过将待测样品的槐耳菌质提取物的谱图与标准槐耳菌质提取物的谱图进行比对，以鉴定样品的真伪。本发明的标准槐耳菌质提取物可以为槐耳清膏或槐耳颗粒，所述槐耳清膏的制备方法如下：
取槐耳菌质，加水煎煮2-5次，水的用量可以为菌质体的4-10倍，每次煎煮时间为1-10小时。合并几次提取液，减压浓缩得提取物。
在一个具体的实施方案中，槐耳清膏的制备方法如下：
取槐耳菌质，加水煎煮3次，第一次加7倍量的水，煮沸6小时，过滤，提取液备用；第二、第三次分别加5倍量水，煮沸6小时，过滤，合并三次提取液，减压浓缩至相对密度为1.35～1.40(55℃)的清膏。
所述槐耳颗粒的制备方法如下：
将清膏与蔗糖、糊精、可溶性淀粉及矫味剂适量混匀，制粒，干燥，过筛，制成颗粒，分装，即得。
在一个具体实施方案中，本发明建立标准槐耳菌质提取物谱图的方法可以如下：
1.色谱条件与系统适用性试验
嵌合烷基季铵盐功能基的苯乙烯基二乙烯基苯填充相，1mM NaOH溶液(淋洗液在线发生器产生)洗脱，流速0.5mL/min，柱温30℃，电化学脉冲安培检测器，理论塔板数按阿拉伯糖峰计，应不低于3000。
2.对照品溶液的制备
取阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、甘露糖对照品适量，加去离子水分别配制成10.0mg/L的溶液作为对照品溶液。
3.供试品溶液的制备
精密称取5.0g槐耳清膏粉末，加水100mL溶解，然后加入400mL无水乙醇，静置2小时，离心，弃去上清液。沉淀加水溶解，转移至100mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀。精密量取上清液5mL，加入浓度为4mol/L三氟乙酸溶液5mL，密闭，90℃水解2小时，放至室温后，精密量取上清液1mL，50℃减压蒸干。残余物加50ml去离子水，超声使溶解。取溶液适量，过孔径0.22μm水系滤膜，进样。
4.测定
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL注入离子色谱仪，测定，记录60分钟的色谱图，即得。
供试品溶液的指纹图谱与对照指纹图谱比较，在相应的保留时间应出现相同的色谱峰，采用指纹图谱软件评价，其相似度应不低于0.9。
上述槐耳菌质提取物可以为槐耳清膏或槐耳颗粒，或其它含有槐耳提取物的制剂。
另一方面，本发明提供一种槐耳菌质提取物的检测方法，该检测方法包括采用阴离子交换色谱法测定槐耳菌质提取物中多糖蛋白中各单糖的含量，其中，所述阴离子交换色谱的条件包括：
采用阴离子交换色谱柱进行分离，优选以嵌合烷基季铵盐功能基的苯乙烯基二乙烯基苯为填充剂的色谱柱；
采用1mM～1.5mM的强碱，例如NaOH或KOH为流动相；
采用25～40℃，优选为30℃的柱温；以及
采用电化学检测器，优选脉冲安培检测器。
上述检测方法中，所述流动相为1mM～1.5mM，优选为1mM的NaOH或KOH。
上述检测方法中，所述槐耳菌质提取物的制备方法如下：
取槐耳菌质，加水煎煮，过滤，合并提取液，减压浓缩至相对密度为1.35～1.40的清膏，即得。
上述检测方法中，所述槐耳菌质提取物的制备方法还包括如下步骤：将相对密度为1.35～1.40的清膏与药学上可接受的辅料，诸如蔗糖、糊精、可溶性淀粉或矫味剂混匀、制粒。
上述检测方法中，所述多糖蛋白的单糖包含阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和甘露糖中的一种或多种。
上述检测方法主要是检测槐耳菌质提取物中多糖蛋白的各单糖组成及其比例关系。本发明的槐耳菌质提取物可以为槐耳清膏或槐耳颗粒，槐耳清膏的制备方法如下：
取槐耳菌质，加水煎煮2-5次，水的用量可以为菌质体的4-10倍，每次煎煮时间为1-10小时。合并几次提取液，减压浓缩得提取物。
在一个具体实施方案中，所述槐耳清膏的制备方法如下：
取槐耳菌质，加水煎煮3次，第一次加7倍量的水，煮沸6小时，过滤，提取液备用；第二、第三次分别加5倍量水，煮沸6小时，过滤，合并三次提取液，减压浓缩至相对密度为1.35～1.40(55℃)的清膏。
所述槐耳颗粒的制备方法如下：
将清膏与蔗糖、糊精、可溶性淀粉及矫味剂适量混匀，制粒，干燥，过筛，制成颗粒，分装，即得。
在本发明的一个具体实施方案中，采用阴离子交换色谱法测定槐耳清膏中多糖蛋白含量的方法具体如下：
1.色谱条件与系统适用性试验
嵌合烷基季铵盐功能基的苯乙烯基二乙烯基苯填充相，1mM NaOH溶液(淋洗液在线发生器产生)洗脱，流速0.5mL/min，柱温30℃，电化学检测器，糖标准四电位波形检测模式，理论塔板数按阿拉伯糖峰计，应不低于3000；
2.对照品溶液的制备
精密称取阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖对照品适量，分别用去离子水溶解成10.0mg/L的对照品溶液，摇匀，即得；
3.供试品溶液的制备
精密称取5.0g槐耳清膏粉末，加水100mL溶解，然后加入400mL无水乙醇，静置2小时，离心，弃去上清液。沉淀加水溶解，转移至100mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀。精密量取上清液5mL，加入浓度为4mol/L三氟乙酸溶液5mL，密闭，90℃水解2小时，放至室温后，精密量取上清液1mL，50℃减压蒸干。残余物加50ml去离子水，超声使溶解。取溶液适量，过孔径0.22μm水系滤膜，进样。
4.测定
分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入离子色谱仪，测定，即得。
本品每克含槐耳多糖蛋白以阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖计应分别不低于5.0mg、3.0mg、5.0mg、6.0mg、2.0mg。
在本发明的另一个具体实施方案中，采用阴离子交换色谱法测定槐耳颗粒中多糖蛋白含量的方法具体如下：
1.色谱条件与系统适用性试验
嵌合烷基季铵盐功能基的苯乙烯基二乙烯基苯填充相，1mM NaOH溶液(淋洗液在线发生器产生)洗脱，流速0.5mL/min，柱温30℃，电化学检测器，理论塔板数按阿拉伯糖峰计，应不低于3000；
2.对照品溶液的制备
精密称取阿拉伯糖、半乳糖、木糖、甘露糖对照品适量，分别用去离子水溶解成10.0mg/L的对照品溶液，摇匀，即得；
3.供试品溶液的制备
精密称取槐耳颗粒5袋的内容物，研细，精密称取细粉5.0g，加入100ml水溶解，之后加入无水乙醇400ml，静置，离心，弃去上清液。沉淀加80ml水溶解，转移至100ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，离心，精密量取上清液5ml，加入浓度为4mol/L三氟乙酸溶液5毫升，密闭，90℃水解2小时，放至室温后，精密量取上清液1ml，50℃减压蒸干。残余物加50ml去离子水，超声10分钟溶解，取溶液适量，过孔径0.22μm水系滤膜，进样；
4.测定
分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入离子色谱仪，测定，即得。
本品每包装(袋)含槐耳多糖蛋白以阿拉伯糖、半乳糖、木糖、甘露糖计应分别不低于30.0mg、20.0mg、50.0mg、10.0mg。
需要说明的是，由于槐耳颗粒中含有蔗糖和淀粉等辅料，会影响槐耳多糖蛋白中葡萄糖含量的测定，所以只检测阿拉伯糖、半乳糖、木糖和甘露糖这四种单糖的含量。
本发明的检测方法至少具有以下有益效果：
本发明采用阴离子交换色谱法对槐耳菌质提取物，例如槐耳清膏或槐耳颗粒中多糖蛋白进行了定性、定量检测，可以有效控制槐耳菌质提取物中有效成分的含量，提高质量标准。
本发明的离子交换色谱法快速、简便、专属性强。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1为槐耳清膏多糖蛋白类成分单糖组成对照指纹图谱，其中1号峰为阿拉伯糖峰(9.4min)，2号峰为半乳糖峰(11.9min)，3号峰为葡萄糖峰(14.1min)，4号峰为木糖峰(16.9min)，5号峰为甘露糖峰(18.3min)；
图2为不同洗脱条件下标准单糖混合物(阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖)的离子色谱图，其中：a表示以1mM NaOH等度洗脱，b表示以2mM NaOH等度洗脱，c表示以5mM NaOH等度洗脱；
图3为槐耳颗粒多糖蛋白类成分单糖组成对照指纹图谱，其中1号峰为阿拉伯糖峰(9.4min)，2号峰为半乳糖峰(11.9min)，3号峰为葡萄糖峰(14.1min)，4号峰为木糖峰(16.9min)，5号峰为甘露糖峰(18.3min)。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。
实施例1
一、槐耳清膏多糖蛋白类成分单糖组成指纹图谱检测标准
1.色谱条件与系统适用性试验
嵌合烷基季铵盐功能基的苯乙烯基二乙烯基苯填充相，1mM NaOH溶液(淋洗液在线发生器产生)洗脱，流速0.5mL/min，柱温30℃，电化学脉冲安培检测器，理论塔板数按阿拉伯糖峰计，应不低于3000。
2.对照品溶液的制备，取阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、甘露糖对照品适量，加去离子水分别配制成10.0mg/L的溶液作为对照品溶液。
3.供试品溶液的制备，精密称取5.0g槐耳清膏粉末，加水100mL溶解，然后加入400mL无水乙醇，静置2小时，离心，弃去上清液。沉淀加水溶解，转移至100mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀。精密量取上清液5mL，加入浓度为4mol/L三氟乙酸溶液5mL，密闭，90℃水解2小时，放至室温后，精密量取上清液1mL，50℃减压蒸干。残余物加50ml去离子水，超声使溶解。取溶液适量，过孔径0.22μm水系滤膜，进样。
4.测定
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL注入离子色谱仪，测定，记录60分钟的色谱图，即得。
供试品溶液的指纹图谱与对照指纹图谱比较，在相应的保留时间应出现相同的色谱峰，采用指纹图谱软件评价，其相似度应不低于0.9。
槐耳清膏多糖蛋白类成分单糖组成对照指纹图谱如图1所示，其中1号峰为阿拉伯糖峰(9.4min)，2号峰为半乳糖峰(11.9min)，3号峰为葡萄糖峰(14.1min)，4号峰为木糖峰(16.9min)，5号峰为甘露糖峰(18.3min)。
二、槐耳清膏中多糖蛋白的各单糖含量测定
1.测定成分的选择
槐耳多糖蛋白是一种含有蛋白质的杂多糖蛋白，由岩藻糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖和木糖组成。由于糖类检测的种种技术瓶颈限制，现行的质量标准含量测定项中只对总蛋白含量进行了测定，这样不能够充分体现槐耳清膏中有效成分的含量，为了有效控制槐耳清膏的质量，本实施例提供了槐耳清膏多糖蛋白类成分的单体组成及其含量测定方法。
2.测定方法的选择
离子色谱法在单糖组成及比例分析方面与以往常用的薄层色谱法、高效液相色谱法、气相色谱法相比，具有分离能力强、样品用量少、环保、不用柱前柱后衍生化、分离能力强、灵敏度高等优势，因此本实施例选择该方法作为槐耳清膏多糖蛋白的测定方法。
3.仪器与材料
色谱仪：美国Dionex ICS3000系列离子色谱仪(GP四元梯度泵，AS自动进样器，DC柱温箱，安培检测器，EG淋洗液在线发生器)；
固相萃取柱：DIONEX RP Ⅱ固相萃取小柱；
旋转蒸发仪：日本EYELA 1000型；
试剂：去离子水由Milli-Q纯化系统制得，分析纯甲醇、无水乙醇、三氟乙酸为北京化工厂产品；
槐耳清膏样品：启东盖天力药业有限公司提供，具体制备方法为：取槐耳菌质，加水煎煮3次，第一次加7倍量的水，煮沸6小时，过滤，提取液备用；第二、第三次分别加5倍量水，煮沸6小时，过滤，合并三次提取液，减压浓缩至相对密度为1.35～1.40(55℃)的清膏。
对照品：阿拉伯糖、木糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖对照品为美国Sigma公司产品(纯度大于99％)。
4.色谱条件与系统适用性试验
色谱柱：美国Dionex CarboPac PA20分析柱150×3mm；
流动相：1mM NaOH去离子水溶液(由只加水系统自动生成)
柱温：30℃；
流速：0.5mL/min；
检测器：电化学检测器，糖四电位波形模式。
(1)色谱柱的考察：Dionex CarboPac PA20分析柱是美国戴安公司针对低分子量糖类研发的一种阴离子交换色谱柱，目前国内外均有大量的成功应用此色谱柱分离、分析低分子糖类物质的文献发表，因此选用该色谱柱检测槐耳清膏中多糖蛋白的含量。
(2)流动相与洗脱梯度的考察：由于槐耳清膏多糖蛋白中所含的五种单糖均为中性多糖，因此采用NaOH水液为流动相进行等度洗脱的方法较为理想，本实施例共对戴安(DIONEX)离子色谱工作站专家模式中所提供的三种最常用的单糖分离碱液浓度进行了对比分析，三种浓度分别为1mMNaOH、2mM NaOH和5mM NaOH。从五种标准单糖混合物(阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖)离子色谱图可以看出，1mM NaOH等度分离的条件下，5个色谱峰之间的分离度均能达到1.7以上，并且基线平整，且特征峰可在60分钟内出完，而在2mMNaOH等度洗脱的条件下阿拉伯糖与半乳糖无法实现基线分离，5mM NaOH等度洗脱的条件下，木糖与甘露糖无法实现基线分离(如图2所示)。综合对比色谱峰分离度、保留时间、基线优劣等因素，最终选定1mM NaOH等度洗脱进行检测。
(3)柱温考察：在流动相与洗脱梯度的考察项中可以明显看出，使用DIONEX CarboPac PA20分析柱(150×3mm)在30℃的温度下可以将槐耳多糖蛋白中所包含的5种单糖较好的分离开，且基线平稳，因此选择30℃这一离子色谱法最为常用的温度进行槐耳清膏多糖蛋白含量的检测。
(4)检测器的选择：由于糖类物质在紫外下仅有末端吸收，没有特征吸收，因此常规的紫外检测器不适用于单糖组成分析。脉冲安培检测器是一种基于电化学反应原理的检测器，在糖类物质的检测过程中具有灵敏度和选择性强的特点，因此选用脉冲安培检测器进行槐耳清膏多糖蛋白含量的检测。
5.方法学考察
(1)供试品溶液的制备：精密称取相当于5.0克清膏干粉的槐耳清膏，加水100ml溶解，加入400ml无水乙醇，离心10分钟，弃去上清液。沉淀加80ml水溶解，转移至100ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，静置2小时。精密量取上清液5ml，加入浓度为4mol/L三氟乙酸溶液5毫升，密闭，90℃水解2小时，放至室温后，静置1小时，精密量取上清液1ml，置100ml茄形瓶中，50℃减压蒸干。残余物加50ml去离子水，超声10分钟使溶解，取溶液适量，过孔径0.22μm水系滤膜，进样。
(2)对照品混合贮备液的制备：精密称取阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖对照品适量，分别用去离子水稀释成浓度为10.0mg/L的对照品混合储备液。
(3)标准曲线与线性关系考察：精密吸取对照品混合贮备液适量，分别用去离子水将其稀释成0.5mg/L、1mg/L、5mg/L、10mg/L、15mg/L的标准溶液，0.45μm微孔滤膜过滤之后根据前述的色谱条件进行测定，以峰面积积分值为纵坐标(Y)、以各标准品浓度为横坐标(X)，绘制各对照品标准曲线并计算回归方程：结果见表1。
表1 线性关系考察结果
| 对照品 | 保留时间 | 回归方程 | 相关系数(R) |
| 阿拉伯糖 | 9.73 | Y＝1.848x-0.1 | 99.9973 |
| 半乳糖 | 12.42 | Y＝2.138x-0.17 | 99.9765 |
| 葡萄糖 | 14.58 | Y＝2.297x-0.164 | 99.963 |
| 木糖 | 17.52 | Y＝2.629x-0.176 | 99.962 |
| 甘露糖 | 19.02 | Y＝1.911x-0.147 | 99.9826 |
(4)精密度试验取槐耳清膏(批号JK15)样品一份，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，连续进样6次，分别计算各单糖峰面积的相对标准偏差，结果见表2。结果表明，仪器精密度良好。
表2 精密度试验结果
(5)稳定性试验取槐耳清膏(批号JK15)样品一份，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、12小时内检测，结果见表3。结果表明：12小时内供试品稳定。
表3 稳定性试验结果
| 色谱峰 | 峰面积RSD(％) |
| 阿拉伯糖 | 0.6 |
| 半乳糖 | 0.6 |
| 葡糖糖 | 3.2 |
| 木糖 | 1.5 |
| 甘露糖 | 1.6 |
(6)重复性试验取槐耳清膏(批号JK15)样品一份，按供试品溶液制备方法平行制备6份供试品溶液，分别测定峰面积，计算含量，结果见表4。结果表明：方法重复性良好。
表4 重复性试验结果
| 色谱峰 | 含量变化RSD(％) |
| 阿拉伯糖 | 4.3 |
| 半乳糖 | 2.7 |
| 葡糖糖 | 7.5 |
| 木糖 | 5.3 |
| 甘露糖 | 2.7 |
(7)回收率试验取已知含量的同一批号样品(批号KF23)按前述操作程序制备成样品溶液，之后精密吸取2份每份一毫升的样品溶液至于5mL量瓶中，分别精密加入等体积的另配制不同浓度的的阿拉伯糖(2.0mg/L，2.8mg/L)、半乳糖(2.0mg/L，2.8mg/L)、葡萄糖(3.5mg/L，4.9mg/L)、木糖(2.5mg/L，3.5mg/L)、甘露糖(5.0mg/L，10.0mg/L)混合对照品溶液1.0mL摇匀。按前述色谱条件测定，进样量为10μL，按以下公式计算回收率，结果见表5。结果表明，加样回收率在91.8-113.5％之间。
表5 回收率试验结果
6.槐耳清膏样品含量测定
根据前述确定的方法对启东盖天力药业有限公司提供的3批次槐耳清膏粉末进行了含量测定，结果见表6。
表6 3批次槐耳清膏样品中槐耳多糖蛋白中各单糖的含量测定(mg/g)
| 批号 | 阿拉伯糖 | 半乳糖 | 葡萄糖 | 木糖 | 甘露糖 |
| KF20A | 6.541394 | 4.69256 | 7.572235 | 8.394721 | 3.439134 |
| KF20B | 6.796801 | 4.478189 | 8.737589 | 9.070189 | 3.881127 |
| KF21A | 5.582709 | 5.086352 | 10.28163 | 7.16357 | 3.894858 |
| 平均值 | 6.30697 | 4.752367 | 8.863818 | 8.20949 | 3.738373 |
根据上述结果，暂定本品每克含槐耳多糖蛋白以阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖计应分别不低于5.0mg、3.0mg、5.0mg、6.0mg、2.0mg。
7.结果与讨论
本实施例以离子色谱法为技术手段，以多糖蛋白类成分为指标成分，针对启东盖天力药业有限公司生产的槐耳清膏建立了一套高效、专属的含量测定方法，由于大分子多糖蛋白类成分与小分子天然产物活性成分存在本质的区别，因此以下将对本实施例含量测定方法的某些具体细节加以详细说明。
通过实验研究发现，槐耳多糖蛋白的单糖组成及比例与市售主流的多糖药物存在明显差别，如香菇多糖、冬虫夏草多糖、猴头多糖主要由葡聚糖组成、黄芪多糖主要含有阿拉伯半乳聚糖类多糖、麦冬多糖主要含有果聚糖，而槐耳多糖是一种由岩藻糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、木糖、甘露糖组成的杂多糖，因此可以将槐耳多糖蛋白的单糖组成及比例作为其定性、定量检测标准。
本研究供试品溶液制备过程中乙醇沉淀操作的目的在于去除样品中的小分子糖类物质，因为大分子多糖蛋白类成分难溶于高浓度有机溶剂如(80％乙醇、80％甲醇等)，而小分子的单糖、二糖及寡糖类物质在80％乙醇水溶液中溶解性良好，因此采用该方法去除样品中不具备生物活性的单糖、二糖类物质，该步骤在去除杂质的同时，还能够发挥防伪的作用，如若在样品中人为添加了与盖天力药业有限公司生产的槐耳清膏组成、比例、含量相同的单糖类成分进行造假，醇沉淀步骤就可以将其比例打乱，反应其中所含的多糖类成分的单糖组成、比例及含量，实现防伪的目的。
槐耳多糖蛋白主要由岩藻糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、木糖、甘露糖组成，本发明采用离子色谱法对槐耳多糖蛋白进行单糖组成及比例研究发现槐耳多糖蛋白的单糖组成与文献报导一致，但在定量分析过程中发现相对于半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、木糖、甘露糖而言，岩藻糖的含量过少，致使部分批次的金克槐耳清膏未能检出相关信号，能够检出岩藻糖信号的批次样品图谱中该糖信号受噪音及样品中氨基酸类成分信号的干扰过大，导致峰型不对称，积分困难，因此本研究未将岩藻糖作为槐耳清膏多糖蛋白类成分单糖组成指纹图谱及含量测定研究的特征峰及定量检测指标。
实施例2
一、槐耳颗粒多糖蛋白类成分单糖组成指纹图谱检测标准
1.色谱条件与系统适用性试验
嵌合烷基季铵盐功能基的苯乙烯基二乙烯基苯填充相，1mM NaOH溶液(淋洗液在线发生器产生)洗脱，流速0.5mL/min，柱温30℃，电化学检测器，糖标准四电位波形检测模式，理论塔板数按阿拉伯糖峰计，应不低于3000。
2.对照品溶液的制备
取阿拉伯糖、半乳糖、木糖、甘露糖对照品适量，分别用去离子水溶解成10.0mg/L的对照品溶液，摇匀，即得。
3.供试品溶液的制备
精密称取槐耳颗粒5袋的内容物，研细，精密称取细粉5.0g，加入100ml水溶解，加入无水乙醇400ml，离心10分钟，弃去上清液。沉淀加80ml水溶解，转移至100ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，离心10分钟，精密量取上清液5ml，加入浓度为4mol/L三氟乙酸溶液5毫升，密闭，90℃水解2小时，放至室温后，静置1小时，精密量取上清液1ml，50℃减压蒸干。残余物加50ml去离子水，超声10分钟使溶解，取溶液适量，过孔径0.22μm水系滤膜，进样。
4.测定
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL注入离子色谱仪，测定，记录60分钟的色谱图，即得。
供试品溶液的指纹图谱与对照指纹图谱比较，在相应的保留时间应出现相同的色谱峰，采用指纹图谱软件评价，其相似度应不低于0.9。
槐耳颗粒多糖蛋白类成分单糖组成对照指纹图谱如图3所示，其中1号峰为阿拉伯糖峰(9.4min)、2号峰为半乳糖峰(11.9min)、3号峰为葡萄糖峰(14.1min)、4号峰为木糖峰(16.9min)、5号峰为甘露糖峰(18.3min)。
二、槐耳颗粒中多糖蛋白单糖组成及含量的测定
1.测定成分的选择
槐耳多糖蛋白是一种含有蛋白质的杂多糖蛋白，由岩藻糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖、木糖组成。由于糖类检测的种种技术瓶颈限制，现行的质量标准含量测定项中只对总蛋白含量进行了测定，这样不能够充分的体现槐耳颗粒中有效成分的含量，为了有效地控制槐耳颗粒的质量，本实施例提供了槐耳颗粒多糖蛋白各单糖组成及含量测定方法。
2.测定方法的选择
离子色谱法在单糖组成及比例分析方面与以往常用的薄层色谱法、高效液相色谱法、气相色谱法相比，具有分离能力强、样品用量少、环保、不用柱前柱后衍生化、灵敏度高等优势，因此本实施例选择该方法作为槐耳颗粒多糖蛋白的单糖含量测定方法。
3.仪器与材料
色谱仪：美国Dionex ICS3000系列离子色谱仪(GP四元梯度泵，AS自动进样器，DC柱温箱，安培检测器，EG淋洗液在线发生器)；
固相萃取柱：DIONEX RP Ⅱ固相萃取小柱；
旋转蒸发仪：日本EYELA 1000型；
试剂：去离子水由Milli-Q纯化系统制得，分析纯甲醇、无水乙醇、三氟乙酸为北京化工厂产品；
槐耳颗粒样品：启东盖天力药业有限公司提供，具体制备方法为：将槐耳清膏与蔗糖、糊精、可溶性淀粉及矫味剂适量混匀，制粒，干燥，过筛，制成颗粒，分装，即得。
对照品：阿拉伯糖、木糖、半乳糖、甘露糖对照品为美国Sigma公司产品
4.色谱条件与系统适用性试验
色谱柱：美国Dionex CarboPac PA20分析柱150×3mm；
流动相：1mM NaOH去离子水溶液(由只加水系统自动生成)
柱温：30℃；
流速：0.5mL/min；
检测器：电化学检测器，糖四电位波形模式。
(1)色谱柱的考察：Dionex CarboPac PA20分析柱是美国戴安公司针对低分子量糖类研发的一种阴离子交换色谱柱，目前国内外均有大量的成功应用此色谱柱分离、分析低分子糖类物质的文献发表，因此选用该色谱柱检测槐耳颗粒中多糖蛋白的含量。
(2)流动相与洗脱梯度的考察：由于槐耳颗粒多糖蛋白中所含的五种单糖均为中性多糖，因此采用NaOH水液为流动相进行等度洗脱的方法较为理想，本实施例共对戴安(DIONEX)离子色谱工作站专家模式中所提供的三种最常用的单糖分离碱液浓度进行了对比分析，三种浓度分别为1mMNaOH、2mM NaOH和5mM NaOH。从五种标准单糖混合物(阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖)离子色谱图可以看出，1mM NaOH等度分离的条件下，5个色谱峰之间的分离度均能达到1.7以上，并且基线平整，且特征峰可在60分钟内出完，而在2mMNaOH等度洗脱的条件下阿拉伯糖与半乳糖无法实现基线分离，5mM NaOH等度洗脱的条件下，木糖与甘露糖无法实现基线分离(如图2所示)。综合对比色谱峰分离度、保留时间、基线优劣等因素，最终选定1mM NaOH等度洗脱进行检测。
(3)柱温考察：在流动相与洗脱梯度的考察项中可以明显看出，使用DIONEX CarboPac PA20分析柱(150×3mm)在30℃的温度下可以将槐耳多糖蛋白中所包含的五种单糖较好的分离开，且基线平稳，因此选择30℃这一离子色谱法最为常用的温度进行槐耳颗粒多糖蛋白含量的检测。
(4)检测器的选择：由于糖类物质在紫外下仅有末端吸收，因此常规的紫外检测器不适用于单糖组成分析。脉冲安培检测器是一种基于电化学反应原理的检测器，在糖类物质的检测过程中具有灵敏度和选择性强的特点，因此选用脉冲安培检测器进行槐耳颗粒多糖蛋白含量的检测。
5.方法学考察
(1)供试品溶液的制备：精密称取槐耳颗粒5袋的内容物，研细，精密称取细粉5.0g，加入100m1水溶解，加入无水乙醇400ml，离心10分钟，弃去上清液。沉淀加80ml水溶解，转移至100ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，离心10分钟，精密量取上清液5ml，加入浓度为4mol/L三氟乙酸溶液5毫升，密闭，90℃水解2小时，放至室温后，静置1小时，精密量取上清液1ml，50℃减压蒸干。残余物加50ml去离子水，超声10分钟使溶解，取溶液适量，过孔径0.22μm水系滤膜，进样。
(2)对照品混合贮备液的制备：精密称取阿拉伯糖、半乳糖、木糖和甘露糖对照品适量，分别用去离子水稀释成浓度为10.0mg/L的对照品混合储备液。
(3)标准曲线与线性关系考察：精密吸取对照品混合贮备液适量，分别用去离子水将其稀释成0.5mg/L、1mg/L、5mg/L、10mg/L、15mg/L的标准溶液，0.45μm微孔滤膜过滤之后根据前述的色谱条件测定，以峰面积积分值为纵坐标(Y)、以各标准品浓度为横坐标(X)，绘制各对照品标准曲线并计算回归方程：结果见表7。
表4 线性关系考察结果
(4)精密度试验取槐耳颗粒(批号GC90)样品一份，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，连续进样6次，根据测定值，计算出连续进针6次的同一批次样品中各单糖含量，分别各单糖的相对标准偏差，结果见表8，结果表明，仪器精密度良好。
表8 精密度试验结果
| 色谱峰 | 峰面积RSD(％) |
| 阿拉伯糖 | 0.8 |
| 半乳糖 | 0.5 |
| 木糖 | 0.8 |
| 甘露糖 | 0.8 |
(5)稳定性试验 取槐耳颗粒(批号GC90)样品一份，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、12小时内检测，结果见表9。结果表明：12小时内供试品稳定。
表9 样品稳定性试验结果
| 色谱峰 | 峰面积RSD(％) |
| 阿拉伯糖 | 4.4 |
| 半乳糖 | 3.4 |
| 木糖 | 2.8 |
| 甘露糖 | 2.9 |
(6)重复性试验 取槐耳颗粒(批号GC90)样品一份，按供试品溶液制备方法平行制备6份供试品溶液，分别测定峰面积，计算含量，结果见表10。结果表明：方法重复性良好。
表10 样品重复性试验结果
| 色谱峰 | 峰面积RSD(％) |
| 阿拉伯糖 | 4.1 |
| 半乳糖 | 2.3 |
| 木糖 | 2.7 |
| 甘露糖 | 2.7 |
(7)回收率试验取已知含量的一批号样品(批号GL09)按前述操作程序制备成样品溶液，之后精密吸取2份每份1mL的样品溶液至于5mL量瓶中，分别精密加入等体积另配制不同浓度的的阿拉伯糖(0.5mg/L，0.7mg/L)、半乳糖(0.5mg/L，0.7mg/L)、木糖(1.0mg/L，1.4mg/L)、甘露糖(0.25mg/L，0.35mg/L)混合对照品溶液1.0mL摇匀。按前述色谱条件测定，进样量为10μL，按以下公式计算回收率，结果见表11。结果表明，加样回收率在87.0％～104.1％之间。
表11 回收率实验结果
6.槐耳颗粒样品含量测定
前述确定的方法对3个批次的槐耳颗粒进行了含量测定测定，结果见表12。
表12 3批次槐耳颗粒多糖蛋白中各单糖的含量测定结果(单位mg/袋)
| 批号 | 阿拉伯糖 | 半乳糖 | 木糖 | 甘露糖 |
| HF05A | 36.66807 | 23.17002 | 56.61674 | 23.46646 |
| HF05B | 43.50366 | 27.14773 | 64.11783 | 24.22345 |
| JG23A | 45.32206 | 29.50692 | 61.52507 | 27.72747 |
| 平均值 | 41.83126 | 26.60822 | 60.75321 | 25.13913 |
根据上述测定结果，暂定本品每包装(袋)含槐耳多糖蛋白以阿拉伯糖、半乳糖、木糖、甘露糖计应分别不低于30.0mg、20.0mg、50.0mg、10.0mg。
7.结果与讨论
本实施例以离子色谱法为技术手段，以多糖蛋白类成分为指标成分，针对启东盖天力药业有限公司生产的槐耳清膏及颗粒建立了一套高效、专属的指纹图谱检测方法及含量测定方法，由于大分子多糖蛋白类成分与小分子天然产物活性成分存在本质的区别，因此以下将对本实施例含量测定方法的某些具体细节加以详细说明。
通过实验研究发现，槐耳多糖蛋白的单糖组成及比例与市售主流的多糖药物存在明显差别，如香菇多糖、冬虫夏草多糖、猴头多糖主要由葡聚糖组成、黄芪多糖主要含有阿拉伯半乳聚糖类多糖、麦冬多糖主要含有果聚糖，而槐耳多糖是一种由岩藻糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、木糖、甘露糖组成的杂多糖，因此可以将槐耳多糖蛋白的单糖组成及比例作为其定性、定量检测标准。
本研究供试品溶液制备过程中乙醇沉淀操作的目的在于去除样品中的小分子糖类物质，因为大分子多糖蛋白类成分难溶于高浓度有机溶剂如(80％乙醇、80％甲醇等)，而小分子的单糖、二糖及寡糖类物质在80％乙醇水溶液中溶解性良好，因此采用该方法去除样品中不具备生物活性的单糖、二糖类物质，该步骤在去除杂质的同时，还能够发挥防伪的作用，如若在样品中人为添加了与盖天力药业有限公司生产的槐耳清膏及颗粒组成、比例、含量相同的单糖类成分进行造假，醇沉淀步骤就可以将其比例打乱，反应其中所含的多糖类成分的单糖组成、比例及含量，实现防伪的目的。
槐耳多糖蛋白主要由岩藻糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、木糖、甘露糖组成，本发明采用离子色谱法对槐耳多糖蛋白进行单糖组成及比例研究发现槐耳多糖蛋白的单糖组成与文献报导一致，但在定量分析过程中发现相对于半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、木糖、甘露糖而言，岩藻糖的含量过少，致使部分批次的槐耳颗粒未能检出相关信号，能够检出岩藻糖信号的批次样品图谱中该糖信号受噪音及样品中氨基酸类成分信号的干扰过大，导致峰型不对称，积分困难，因此本研究未将岩藻糖作为槐耳颗粒多糖蛋白类成分单糖组成指纹图谱及含量测定研究的特征峰及定量检测指标。
此外，由于槐耳颗粒的辅料中含有淀粉类成分，该类成分为葡聚糖，会对槐耳多糖中的葡萄糖检测造成干扰，因此在供试品溶液制备的过程中采用高速离心法将其尽可能的去除，同时含量测定检测标准中不将其作为检测指标。
Claims (10)
1.一种槐耳菌质提取物的鉴定方法，该鉴定方法包括如下步骤：
(1)采用阴离子交换色谱法测定标准槐耳菌质提取物中多糖蛋白的单糖组成，建立标准谱图A；
(2)采用步骤(1)的阴离子交换色谱法测定待测槐耳菌质提取物中多糖蛋白的单糖组成，获得谱图B；
(3)将所述谱图B和所述谱图A进行比对；
其中，所述阴离子交换色谱的条件包括：
采用阴离子交换色谱柱进行分离，优选以嵌合烷基季铵盐功能基的苯乙烯基二乙烯基苯为填充剂的色谱柱；
采用1mM～1.5mM，优选为1mM的强碱为流动相；
采用25～40℃，优选为30℃的柱温；以及
采用电化学检测器，优选脉冲安培检测器。
2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其中，所述流动相为1mM～1.5mM，优选为1mM的NaOH或KOH。
3.根据权利要求1或2所述的鉴定方法，其中，所述槐耳菌质提取物的制备方法如下：
取槐耳菌质，加水煎煮，过滤，合并提取液，减压浓缩至相对密度为1.35～1.40的清膏，即得。
4.根据权利要求3所述的鉴定方法，其中，所述槐耳菌质提取物的制备方法还包括如下步骤：将相对密度为1.35～1.40的清膏与药学上可接受的辅料，诸如蔗糖、糊精、可溶性淀粉或矫味剂混匀、制粒。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的鉴定方法，其中，所述多糖蛋白的单糖为阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和甘露糖中的一种或多种。
6.一种槐耳菌质提取物的检测方法，该检测方法包括采用阴离子交换色谱法测定槐耳菌质提取物中多糖蛋白中各单糖的含量，其中，所述阴离子交换色谱的条件包括：
采用阴离子交换色谱柱进行分离，优选以嵌合烷基季铵盐功能基的苯乙烯基二乙烯基苯为填充剂的色谱柱；
采用1mM～1.5mM的强碱，例如NaOH或KOH为流动相；
采用25～40℃，优选为30℃的柱温；以及
采用电化学检测器，优选脉冲安培检测器。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述流动相为1mM～1.5mM，优选为1mM的NaOH或KOH。
8.根据权利要求6或7所述的检测方法，其中，所述槐耳菌质提取物的制备方法如下：
取槐耳菌质，加水煎煮，过滤，合并提取液，减压浓缩至相对密度为1.35～1.40的清膏，即得。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其中，所述槐耳菌质提取物的制备方法还包括如下步骤：将相对密度为1.35～1.40的清膏与药学上可接受的辅料，诸如蔗糖、糊精、可溶性淀粉或矫味剂混匀、制粒。
10.根据权利要求6至9中任一项所述的检测方法，其中，所述多糖蛋白的单糖为阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和甘露糖中的一种或多种。
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