CN104280469B

CN104280469B - 质控标志物及其在中草药鉴定中的应用

Info

Publication number: CN104280469B
Application number: CN201410330544.4A
Authority: CN
Inventors: 韩全斌; 陈虎彪; 许军
Original assignee: Hong Kong Baptist University HKBU
Current assignee: Hong Kong Baptist University HKBU
Priority date: 2013-07-12
Filing date: 2014-07-11
Publication date: 2018-03-23
Anticipated expiration: 2034-07-11
Also published as: HK1204362A1; US8999719B2; US20150017734A1; CN104280469A

Abstract

本发明涉及质控标志物，以及这种标志物在定性和定量鉴定兰科石斛属铁皮石斛Dendrobium officinaleKimura et Migo(即广为人知的名为铁皮石斛的名贵中药)的使用方法。

Description

质控标志物及其在中草药鉴定中的应用

本申请要求2013年7月12日提交的美国专利申请号13/940944的优先权益，其内容通过引用合并进入本申请。

发明领域

本发明涉及质控标志物，以及应用这类标志物定性和定量鉴定中草药材（特别适用，但不限于石斛物种的方法。更具体地，本发明涉及化学标志物，以及其在快速、高效、低成本鉴定铁皮石斛(Dendrobium officinaleKimura et Migo)，即广为人知的名贵中药铁皮石斛中的应用。

技术背景

由于中草药材中包含的碳水化合物（特别是多糖和寡糖）结构复杂、分子量大，因此对于这些碳水化合物的质控依旧充满了挑战。通常而言，将中草药中多糖和寡糖进行分离和纯化后进行完整的结构表征是这两种糖的质量评价最可靠的方法。上述表征包括物质均一性和分子量的测定、组成单糖的分析、葡萄糖苷键类型的确认、重复结构单元的推断等。然而，这些方法极其繁琐、复杂和耗时，因此它们不适合发展为常规的质控方法。此外，糖含量测定和糖组成分析这两种分析方法也被广泛应用于中草药材中碳水化合物的质控。然而这两种方法依然存在缺陷。比色法测定全糖含量的特异性非常差，因而无法运用于以定性为目的的分析。糖组成成分分析需要复杂的操作，例如酸解、衍生化、后续的利用HPLC（高效液相色谱）或GC（气相色谱）对糖的衍生物进行定性和定量测定（图1A）。因此，其试验结果往往会受到冗长的操作步骤中诸多因素的影响，例如，温度、反应时间、酸解中酸的浓度；因此结果重复性差。此外，该方法还具有片面性，无法显示水解前多糖和寡糖的原始存在。因此，发展更加简便、合理的中草药材中碳水化合物的质控方法是很有必要的。

石斛属是兰科植物中最大的属之一。已有1100多种石斛属的植物被确认，广泛分布于亚洲、欧洲和澳洲。其中大约30种石斛属植物新鲜或晒干的茎被公认为是一种名贵的滋补中药，中文名为石斛。在中国中药材古籍《神农本草经》中，石斛被记载为一种上品中药材，因其具有传统的滋补功效，例如健胃、活血、增强免疫力，现已被使用数千年之久。其中，取自石斛属铁皮石斛(Dendrobium officinaleKimura et Migo)的干茎，传统上被认为是石斛中的极品，以铁皮石斛(Dendrobii Officinalis Caulis) 著名，具有例如养胃、护喉和明目的功效。在道教经籍《道藏》中，铁皮石斛名列中国九大名药之首。如今，由于其野生来源的极端稀缺和其突出的滋补效果，铁皮石斛已成为最出名、最稀缺的石斛中药材，同时也是世界中药市场上，尤其是东南亚市场上，最名贵的中药之一。铁皮石斛(D. officinale)的茎通在加热后被折叠成螺旋状或弹簧状，并在干燥后在中药市场上出售，名为铁皮枫斗（图2）。和其他石斛加工品相比，铁皮枫斗不具备特征性的形貌，且价格高昂，导致掺假、种类混淆、仿冒品的发生。因此，铁皮枫斗的鉴定和质量评估以确保药材的安全和功效就显得至关重要。

已有的方法不能有效地对铁皮石斛的质量进行定性和/或定量的分析，因为这种中草药具有独特的化学特点。除一些小分子（诸如联苄、菲等）外，其包含的碳水化合物含量可达70%。针对小分子的质量评价方法无法将铁皮石斛和其它石斛属物种有效区分开，而且被检测的成分往往只占到整个中草药材总成分的0.21%。换句话说，这些样品中多于99%的成分无法被这些方法检测。另一方面，碳水化合物含量最高并已被证明具有较好的生物活性，自然应该是铁皮石斛质控的主要目标。但是，如上所述，和其它以糖类为主的中药材一样，对铁皮石斛中碳水化合物的质控面临着方法瓶颈。

中国专利CN102370891A公开了一种针对小分子和使用GPC柱和UV检测器的方法。然而此方法复杂且繁琐，并不适于快速、高效、低成本的应用。因此，上述公开的发明很难推广至商业规模的应用。在另外一篇中国专利CN101716283A和一篇由Xu J等所著刊登于期刊Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis上题为Comparison ofpolysaccharides from different Dendrobium using saccharide mapping的文章中，都将目标指向了大分子多糖，与本发明中的目标分子一致。但是，他们所使用的化学标志物并非原始的石斛多糖，而是其酶解得到的产物。两片文献中公布了由石斛多糖酶解所产生的寡糖的指纹图谱。此过程须经复杂且耗时的流程，包括水提取、乙醇沉淀、去蛋白质、酶解、电泳或HPLC分析。

因此，发展可对铁皮石斛进行质控和鉴定且具有以下特点的方法依然存在需求:1)快速、低成本；2）原理易懂； 3）简单；4）具有满意的可重复性和再现性；5）同时适用于定性分析和定量分析；6）对于大批量样品具有可靠性；7）适用于商业应用。

本章节或本申请的其它章节对于任何文献的引用和鉴别，不应被理解为承认该文献可作为本申请的现有技术。

发明概述

本发明第一方面提供了鉴定含有碳水化合物的中草药材样品的方法，包括：基于分子量分布，提供样品中碳水化合物化学指纹图谱；鉴定样品中碳水化合物一种或多种主要多糖成分；分离该一种或多种主要的多糖成分；和发展化学标志物以鉴定中草药材。

在第一方面的实施方案中，提供化学指纹图谱的步骤通过包括尺寸排阻色谱进行。

在第一方面的实施方案中，尺寸排阻色谱为高效凝胶渗透色谱。

在第一方面的实施方案中，在提供化学指纹图谱的步骤前样品被溶剂提取。

在第一方面的实施方案中，分离步骤通过包括过滤和沉淀的方法进行。

在第一方面的实施方案中，过滤为离心超滤。

在第一方面的实施方案中，沉淀通过使用10-90% v/v的乙醇进行。

在第一方面的实施方案中，发展化学标志物的步骤是高效凝胶渗透色谱分离步骤后，通过分析一种或多种主要多糖成分进行。

在第一方面的实施方案中，所述中草药材包含石斛属物种。

在第一方面的实施方案中，所述石斛属物种包含铁皮石斛。

本发明第二方面提供了用以定性或定量鉴定含碳水化合物的中草药材样品的化学标志物的制备方法，包括基于分子量分布，提供样品中碳水化合物的化学指纹图谱；鉴定样品中碳水化合物的一种或多种主要多糖成分；分离该一种或多种主要多糖成分以形成一种或多种已分离的主要多糖成分；和分析已分离的主要多糖成分。

在第二方面的实施方案中，提供化学指纹图谱的步骤包括使用尺寸排阻色谱。

在第二方面的实施方案中，尺寸排阻色谱为高效凝胶渗透色谱。

在第二方面的实施方案中，在提供化学指纹图谱的步骤前样品被溶剂提取。

在第二方面的实施方案中，分离步骤通过包括过滤和沉淀的方法进行。

在第二方面的实施方案中，过滤为离心超滤。

在第二方面的实施方案中，沉淀通过使用10-90% v/v的乙醇进行。

在第二方面的实施方案中，所述中草药材包含石斛属物种。

在第二方面的实施方案中，所述石斛属物种包含铁皮石斛。

附图简述

本发明的上述及其它目标和特征，将通过结合以下对本发明的描述与所配附图而显而易见：

图1为流程图，显示传统的糖组成分析方法（A）；根据本发明的高效凝胶渗透色谱（HPGPC）的方法（B），用于中草药材中碳水化合物的质控。

图2为下列原始植物的图片铁皮石斛Dendrobiumofficinale (A), 流苏石斛Dendrobium fimbriatum (C), 金钗石斛Dendrobium nobile(D), 鼓槌石斛Dendrobium chrysotoxum(E), 球花石斛Dendrobium thyrsiflorum (F) 和铁皮枫斗(B)，其是铁皮石斛的商用产物。

图3显示来自铁皮枫斗真品（A）；其它石斛属物种(B)；和商品铁皮枫斗样品（C）的水提取提物的HPGPC色谱图。

图4显示多糖标志物的制备（峰I）。

图5显示下列样品的组成单糖分析的HPLC色谱图：混合的单糖标品（A）、铁皮枫斗真品和商品样品，以及其它石斛属物种样品（B）。

图6 显示铁皮枫斗真品和商品样品，以及其它石斛属物种样品基于指纹谱图分析的鉴定结果。

图7 显示通过HPGPC定量分析得到被测石斛属物种样品中多糖标志物的含量。

优选实施方案详述

高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）是一种基于分子大小分离分析物的尺寸排阻色谱法。此方法被设计用来分析和制备性分离水溶性聚合物、寡聚物和生物物质，诸如多糖、核酸、蛋白质、肽等。该方法通过应用HPGPC对色谱峰的定性鉴定和借助已建立的保留时间-分子量关系标准曲线计算所得结果，测定经纯化的多糖和寡糖的物质均一性和分子量。但据我们所知，此方法从未被应用于中草药材中碳水化合物的质控和定量测定。

本发明的一个实施方案中，以铁皮石斛为例，发展了一种新颖快速的基于HPGPC的方法，用于中草药材中碳水化合物的质控。首先，确立了基于碳水化合物成分的分子量分布的HPGPC指纹图谱，以对铁皮石斛进行定性鉴定。其次，HPGPC谱图中主要多糖的峰被分离，其被视为独特的化学标志物，通过对其定量测定进行铁皮石斛的碳水化合物质量评价。（参见图1中路线Ｂ）。除此之外，也实施和比较了传统的糖组成分析方法（示于图1路线Ａ），结果示于表１。

实施例

材料和化学药品：铁皮枫斗商品样品购自中国不同地方。铁皮枫斗真品样品和其它石斛属物种样品，包括流苏石斛D. fimbriatum, 金钗石斛D. nobile, 鼓槌石斛D. chrysotoxum和球花石斛D. thyrsiflorum（示于图2），产自中国大陆数个经过认证的产地，并且通过传统的糖组成分析和HPGPC定量分析的鉴定，其结果示于表1。凭证标本储存于香港浸会大学中医药学院。

HPGPC定量分析

用于高效液相色谱(HPLC)分析的乙腈和醋酸氨购买自Merck（Darmstadt，Germany）。去离子水通过Millipore Milli Q-Plus系统（Millipore, Bedford, MA, USA）制备得到。用于酸解碳水化合物的三氟醋酸（TFA）得自Riedel-de Haën (HoneywellInternational Inc., Germany)。用于单糖衍生化的1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮（PMP）购自Sigma(St. Louis, MO, USA)。参比物Ｄ-半乳糖醛酸一水合物(GalA)、D-葡萄糖醛酸(GlcA)、Ｌ-阿拉伯糖(Ara)、 D-甘露糖(Man)、Ｄ-半乳糖(Gal)、Ｄ-葡萄糖（Glc）、L-鼠李糖一水合物（Rha）、D-岩藻糖（Fuc）、D-核糖（Rib）和一系列具有不同分子量的葡聚糖（1kDa、5kDa、12kDa、25kDa、 50kDa、80kDa、150kDa、270kDa、410kDa和670kDa）购自Sigma(St.Louis, MO, USA)。

水提取：在100 ^oC下，将干燥的样品粉末（０.10 g）用水提取（5mL×1h×2次）。将提取液在3500 rpm下离心10分钟，合并上清液做进一步分析。

HPGPC条件：制备得到的石斛样品水提物可直接在连接着蒸发光散射检测器(ELSD)的Agilent 1100 series HPLC-DAD系统上（Agilent Technologies, Palo Alto,CA）通过HPGPC分析法分析。该分离在４0 ^oC下，通过两个串联的TSK GMPWXL柱（300 mm×7.8mm,内径 10 μm）系统实现。以醋酸氨水溶液（20 mM）为流动相，流速为0.6 mL/min。通过Agilent 35900E界面，ELSD产生的信号传输至Agilent Chemstation进行处理。ELSD的参数设置如下：漂移管的温度为1２0 ^oC，喷雾器氮气流速为3.2L/min，不分流模式。注入20 μL溶液进行分析。UV检测波长设置为260 nm和280 nm。

使用相同条件，将配制好的含有不同分子量的葡聚糖（2 mg/mL）（1kDa、 5kDa、12kDa、25kDa、50kDa、80kDa、150kDa、270kDa、410kDa和670kDa）和葡萄糖的水溶液分别注入HPGPC，通过各分析物的峰面积对数值相对保留时间作图，以建立分子量-保留时间校正曲线。

化学标志物分离：铁皮枫斗HPGPC指纹图谱中的主峰为铁皮枫斗中含量最多的多糖，可通过离心超滤或通过乙醇（10-90% v/v）沉淀分离得到（截留分子量（MWCO）为10 kDa,其中分子量在至少10 kDa和10 kDa以上的被分离和收集）[Millipore, Billerica, MA]。具体细节如下：将铁皮石斛的水提取液（15 mL）转移至离心超滤管中，然后在4000×g下离心８次（每次１５分钟）。最后，将所得物重新溶解于15 mL水中，经冷冻干燥后，做进一步分析。沉淀步骤操作如下：首先将乙醇（>90% v/v）加入水提物中，充分混合至乙醇浓度达到10-90% v/v。放置过夜，合并沉淀，经最后冷冻干燥后做进一步分析。

HPGPC定量分析方法验证：HPGPC法定量分析多糖标志物（HPGPC谱图中的主峰）从线性关系、灵敏度、精确度、准确性和稳定性这几方面进行验证。

化学标志物的水溶液被稀释至适当的浓度用以绘制校正曲线。６种浓度的溶液被分三等分被测试。校准曲线通过峰面积的对数和标志物浓度的对数作图获得。

存储溶液用水溶液稀释至一系列合适浓度，吸取稀释液注入HPLC进行分析。在本实验条件下的检测限（LODs）和定量限（LOQs）分别以大约３和10的S/N（信噪比）确定。

选择日内和日间变化以确定本检测方法的精确度。在日内变化测试中，铁皮枫斗样品 ATF-03（示于表１中）在一日内被提取并分析了６次。在日间变化测试中，同一样品在连续的三天内分为两等分被测试。峰面积对数的变化以数据的RSDs形式表现。

加样回收试验被用以评价此方法的准确度。称取大约0.05g具有已知目标化学标志物含量的石斛样品(ATF-03)。向样品加入不同量的标志物（高、中、低三个水平），分三等分提取后分析。加样回收率按照下述公式计算：

加样回收率（％）＝（检出总量－原始量）／加标量×100%

稳定性测试通过在2h、4h、6h、8h、12h、24h时分析样品ATF-03的提取物，取标志物峰面积对数的RSD值用以检测稳定性。

糖组成分析

酸解水提物：将制备好的水提物溶液（0.50 mL）与2.50 mL三氟醋酸(TFA)(终浓度2 M)溶液在螺口小瓶中混合，并在120 ^oC下水解2h。冷却后，水解物在55 ^oC下用旋转蒸发仪蒸干。加入1 mL水溶液溶解水解物，离心（15700×g, 5min）后去除沉淀，取上清进行1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮（PMP）衍生化。

单糖的PMP衍生化：糖衍生化的方法通过由J. Xu等所著刊登于期刊Journal

of Pharmaceutical and Biomedical Analysis上名为Comparison ofpolysaccharides from different Dendrobium using saccharide mapping中的方法经修改得来。简言之，将酸解物(100 μL)与同体积的氨水，及200 μL 0.5 M的PMP甲醇溶液混合。此混合物在70 ^oC下反应30 min,然后冷却到室温。随后，相继加入100 μL冰醋酸和500μL氯仿，以分别中和反应液，并除去过量PMP反应试剂。剧烈摇动后在15700×g下离心5分钟，丢弃有机相。重复上述操作5次，将最终的水相稀释10倍，并通过 0.22 μm的注射式过滤器(Agilent Technologies, USA)过滤后可进行液相色谱-二极管阵列检测器(LC-DAD)分析。含有7种单糖(Rha, Ara, Fuc, Man, Glu, Gal 和Rib)和2种糖醛酸(GlcA and GalA)的标准溶液也通过上述操作处理。

HPLC分析：对石斛水提物经酸解后生成的单糖的PMP衍生物的分析在配备真空除气器、二元泵、自动进样器和二极管阵列检测器的Agilent 1100 series HPLC-DAD(Agilent Technologies, Palo Alto, CA)系统上进行。5 μL样品被注入在30 °C下运行的Grace AlltimaTM C18 column-W (250 mm × 4.6 m，内径 5 μm)。通过100 mM 醋酸铵水溶液 (A) (pH=5.58) 和乙腈 (B) 在 1.0 mL/min的流速下: 0~5 min, 17~20 % B; 5~30min, 20~28 % B; 30-35 min, 28% B的梯度洗脱实现分离。UV检测器的波长设置在245nm。

HPLC法定量分析组成单糖也将从其线性关系、灵敏度、精确度、准确性和稳定性这几方面进行校验。

数据分析：使用Simca-P+ 9 (Umetrics, AN MKS company, Sweden)进行三维图形主成分分析(3D-PCA)，以评价被测的石斛样品质量的一致性，其包含了一系列“步骤”，诸如画图、统计、报告、处理、制表，这些步骤保证了简单、迅速的数据评价。

结果及讨论

糖组成分析：被测石斛样品水提物中的组成单糖通过已建立的HPLC法测定。所有石斛样品水提物经酸解后释放出的单糖的典型色谱图和计算出的含量分别总结于图5和表1中。分析表明所有石斛样品中糖的组成从定性上看显示出了高度的一致性。在石斛样品水提物中主要有两种组成单糖Man和Glc。此外，某些样品中这两种组成单糖的定量结果也十分相似。这很清楚地证明糖组成分析法的选择性较差，因此可能妨碍了其对铁皮石斛的鉴定和质量评价。除此之外，试验步骤也过于繁琐，以致定量结果会受到诸多因素的影响。

表1 被测铁皮枫斗样品和石斛物种样品基于糖组成分析和HPGPC分析所得的碳水化合物成分定量结果（mg/g）

（表1上半部）

（表1下半部）

HPGPC定性分析：所有石斛样品都通过HPGPC进行定性分析。首先，十批次铁皮枫斗真品的样品（示于表1）的水提物通过HPGPC-DAD-ELSD进行分析和比较，选择UV 260 nm 和280 nm来监测与糖缀合的核酸和/或肽。主要的峰在此检测条件下未见明显的吸收（数据未列出）。十批次铁皮枫斗样品的GPC色谱图示于图3A中。令人惊讶的是其结果显示出极其相似的色谱特征。根据GPC色谱图可发现，这些铁皮枫斗的样品基于其分子分布有三个峰，通过已建立的分子量-保留时间校正曲线计算可得峰 I (MW>15.92 kDa)，峰 II (MW: 0.65-15.92 kDa)，和峰III (MW<0.65 kDa)。其中峰 I 为主要物。这些结果可初步证明十批次的铁皮枫斗真品的样品质量呈现出一致性，且色谱图可作为HPGPC指纹图谱用于铁皮枫斗的定性鉴定。

随后，分析其它四种常用石斛物种的样品，包括金钗石斛D. nobile, 球花石斛D. thyrsiflorum, 流苏石斛D. fimbriatum 和鼓槌石斛D. chrysotoxum。结果显示在分子大小范围和峰型方面，它们的GPC色谱图迥异于铁皮石斛的谱图，（图3B）。其中，在大多数这些样品中几乎无法检测到峰I，例如，铁皮石斛的最常用的替代品金钗石斛中就无法检测到峰I。这些结果清晰的表明铁皮石斛中的碳水化合物具有特征性，不同于其它类似物种中的碳水化合物。

最后，检验十三批铁皮枫斗商品样品，其GPC谱图概括于图3C。可直观发现其图谱与真品样品的谱图相似，与其它石斛物种样品的谱图显著不同。然而，基于色谱图可见，虽然这些商品样品中碳水化合物的分子量范围与真品样品中的相似，但分布不一致。例如，在一些商品样品，例如CTF-07、11 和 12的色谱图中峰I极大的减小了，同时相比于真品铁皮枫斗样品的谱图，其峰III成为主峰。HPGPC分析结果可部分显示所有商品样品可能都来自铁皮石斛植物，但它们的质量未得到良好的控制。

石斛样品的分类可通过HPGPC指纹参数A=(PI-PII)/(PI+PII)轻易实现，其中PI是峰I的峰面积，PII是峰II峰的总面积。如图6所示, 那些A值大于0.3的样品被认定为铁皮枫斗，A值小于或等于0.3的被认定为其它石斛物种。

上述HPGPC分析所得的结果应该比糖组成分析所得的结果更加合理。例如，如表1所示，CTF-08和DT中碳水化合物的成分应该从定性和定量上都一致，因为通过糖组成分析得到它们有相似的单糖组成。然而，根据HPGPC色谱图，这些样品的碳水化合物成分有很明确的不同分子量分布。本领域公知，糖组成分析建立在破坏中药材中碳水化合物（特别是多糖和寡糖）的原始存在状态之上。可容易理解，组成单糖和碳水化合物成分的整体的化学性质（如分子量）无必然联系。而后者对以碳水化合物为基础的中药材质控非常重要。因此，可得出结论，糖组成分析法似乎并不合理，可能在铁皮枫斗质控中提供令人困惑的结果。与之相反，HPGPC指纹图谱不需要任何样品预处理，因此相比于糖组成分析更加方便，可直观地提供碳水化合物在分子量分布上的原始特征，并被证明可高效地用于铁皮枫斗的鉴定和质量评价。

HPGPC的定量分析：除了定性确认，十批次铁皮枫斗真品样品高度一致的GPC色谱图给出启示：作为碳水化合物成分的绝对多数的主要多糖峰（峰I）可被分离，并可作为铁皮枫斗定量定性质控的独特的化学标志物。因此，在本研究中，十批次铁皮枫斗真品样品的峰I被纯化出来（示于图4），且这些分离出来的峰的定性一致性通过它们高度相似的组成单糖（Man和glc峰面积的比为5.37~6.17）被进一步确认（示于图5）。在此之后，所得的化学标志物被用于所有被测石斛样品的定量测定。同传统小分子定量分析一样，该方法也被校验。定量分析结果概括于表1和图7中。结果显示十批次铁皮枫斗真品样品中化学标志物的含量都在300 mg/g左右；与之相对，其它石斛物种样品中的含量低于50 mg/g，甚至低到0 mg/g。上述含量在不同商品样品中不同。铁皮枫斗的质量随着化学标志物含量的下降而下降。

结论

本发明以铁皮石斛为例，发展了一种新颖的、快速的、基于HPGPC的，通过对碳水化合物成分同时进行定性和定量的表征，实现对以糖为主的中草药材的质控的方法。在此方法中，首次提出并示范了HPGPC指纹图谱和多糖标志物，同时HPGPC首次以定量为目的被使用。实验结果显示相比于现有的方法，新建立的方法更高效、稳定和方便，并减小了定性和定量评价铁皮石斛过程中的不确定性。虽然发明中使用铁皮石斛为模型，但是可以理解为本发明也应适用于其它以糖为主的中药材和产品的质控。

总而言之，本发明涉及质控标志物，以及将此标志物用于定性和定量鉴定中药材，特别是石斛属Dendrobium sp的方法。本发明也涉及一种化学标志物，以及其在快速、高效、低成本鉴定兰科石斛属铁皮石斛(即广为人知的名为铁皮石斛的名贵中药)中的应用。在本发明中，基于铁皮石斛的化学标志物可以轻易与其它石斛物种以迅速、经济的方式区分开。本发明可以广泛应用于检测实验室、药厂和研究所对铁皮石斛进行鉴定。

如需要，本文讨论的不同功能可以不同顺序和/或彼此同步开展。此外，如需要，一种或多种上述功能可任选或组合。

虽本发明以不同的实施方案和实施例进行了介绍，但应理解到表达于本文权利要求和其等同物中的其它技术方案也在本发明的范围内。此外，上述特定的实施例只可被理解示例性的，而不对本公开内容具备任何方式的限制性。相信本领域技术人员在无需更详尽的描述的指导下，亦可根据本说明书最大程度的实现此发明。本文中所有记载的出版物以全文引用的方式并入本文。

本领域技术人员应理解，除去特别说明的地方，本文介绍的发明可进行变化和修改。

本发明包括所有这些变化和修改。本发明还包括所有在说明书中单独或整体涉及的或指明的步骤和特征，以及任何和所有的步骤或特征组合，或任何两个，或更多的步骤或特征。

在本说明书中，除非上下文另有要求，词语“包括”或其变体如“包含”或“含有”应被理解为暗示其包括所述的整体或整体组，但不排除任何其他整体或整体组。还应该注意到，在本公开中，特别是在权利要求和/或段落中，术语例如“包含”等可具有它在中国专利法中的含义; 例如，它们可以意指“包含”、“包括”、“含有”等; 并且术语例如“基本上由......组成”已经赋予它们在中国专利法中的含义，例如，它们允许包含未明确列举的内容，但不包括可在现有技术中发现或可影响本发明的基础的或新颖的特征的内容。

此外，在整个说明书和权利要求书中，除非上下文另有要求，词语“包括”或变体如“包含”，应被理解为暗示包括所述的整体或整体组，但不排除任何其它整体或整体组。

对于其它本文中使用的所选术语的定义可在本发明的详细描述中和应用中找到。除非另有定义，本文使用的所有其它技术术语的含义与本发明所属领域的普通技术人的通常理解一致。

本发明其它方面和优点可被本领域技术人员通过阅读说明书一目了然。

Claims

1.一种鉴定含碳水化合物的铁皮石斛物种样品的方法，包括:

a.基于分子量分布，提供铁皮石斛物种的水提物样品中碳水化合物的化学指纹图谱，并通过包含尺寸排阻色谱的方法进行，其中色谱条件为：色谱柱为两个串联的TSK GMPWXL柱，其规格为300mm×7.8mm，内径为10um，流动相为20mM的醋酸氨水溶液；

b.鉴定铁皮石斛物种样品中碳水化合物的一种或多种主要的多糖成分，进而鉴定铁皮石斛。

2.权利要求1的方法，其中尺寸排阻色谱是高效凝胶渗透色谱。

3.权利要求1或2的方法，其中上述指纹图谱中，具有MW>15.92kDa的峰I、MW为0.65-15.92的峰II和MW<0.65Da的峰III。

4.权利要求3的方法，其中分离所述峰I作为铁皮石斛的化学标志物。

5.权利要求4的方法，其中所述化学标志物的含量在300mg/g左右。

6.一种制备化学标志物用于定性和定量鉴定含碳水化合物的铁皮石斛物种样品的方法，包括：

b.鉴定铁皮石斛物种样品中碳水化合物的一种或多种主要的多糖成分，进而用于以鉴定铁皮石斛；

c.分离该一种或多种主要的多糖成分以形成一种或多种分离的主要多糖成分；和

d.分析分离的主要多糖成分。

7.权利要求6的方法，其中尺寸排阻色谱是高效凝胶渗透色谱。

8.权利要求6的方法，其中分离步骤通过包含过滤或沉淀的方法进行。

9.权利要求8的方法，其中过滤为离心超滤。

10.权利要求8的方法，其中沉淀通过采用10-90％v/v的乙醇进行。

11.权利要求6-10中任一项的方法，其中上述指纹图谱中，具有MW>15.92kDa的峰I、MW为0.65-15.92的峰II和MW<0.65Da的峰III。

12.权利要求11的方法，其中分离所述峰I作为铁皮石斛的化学标志物。

13.权利要求12的方法，其中所述化学标志物的含量在300mg/g左右。