CN102928373B - 一种石斛多糖含量的测定方法及其应用 - Google Patents
一种石斛多糖含量的测定方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种测定石斛多糖含量的方法及其应用。本发明采用热水浸提法提取石斛粗多糖、采用Sevag法和透析法脱蛋白获得石斛精多糖，通过测定一种石斛的换算因子，依据此换算因子测定其他不同来源的石斛多糖的含量，不需要重新制备粗多糖和精多糖，能有效地降低材料的使用成本，并能够批量的测定多种石斛的多糖含量，使石斛多糖的检测更为方便、简捷、科学。本发明得到的石斛精多糖纯度高、杂质少；与现有超声波提取、酸碱提取等方法相比，本发明的测定方法能够精确地检测石斛多糖的含量，给石斛品种的鉴定提供参考，也给石斛育种、生产和市场消费提供有效的指引。
Description
技术领域
本发明属于中药及其提取物的化学分析技术领域，特别涉及一种石斛多糖含量的测定方法及其应用。
背景技术
多糖（polysaccharide）由多个单糖分子缩合、失水而成，是一类分子结构复杂且庞大的糖类物质，其相对分子质量从几万到几千万不等。多糖在自然界分布极广，亦很重要，有的是构成动植物骨架结构的组成成分，如纤维素；有的是作为动植物储藏的养分，如糖原和淀粉；有的具有特殊的生物活性，像人体中的肝素有抗凝血作用，肺炎球菌细胞壁中的多糖有抗原作用。近年来多糖研究越来越深入，逐渐成为生命科学研究的前沿。
多糖的测定方法有很多种，如斐林法、蒽酮-硫酸法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、酶法和苯酚-硫酸法等，各测定方法有各自的优点和缺点，如毛细管电泳法和高效液相色谱法精密度较高但需要多糖纯品，对测定样品的要求高，成本较高；蒽酮-硫酸法和苯酚-硫酸法等测定多糖时蛋白的干扰比较明显。由于苯酚-硫酸法操作简便，精确度较好，是目前多糖测定中较常使用的一种方法。
石斛是我国名贵的中药材，最早记载于《神农本草经》，被列为上品，具有滋阴清热、生津益胃、强身等功效。石斛多糖是石斛的主要药效成分之一，有抗肿瘤、降血糖、抗衰老和增强免疫等作用。石斛精多糖的获得是一个非常复杂的过程，需要经过热水浸提、粗多糖提取以及蛋白去除等步骤，其中制备1g精多糖需要耗费500g左右鲜石斛，传统的制备及测定方法具有耗时、耗力和耗材的缺点。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种石斛多糖含量的测定方法。
本发明的另一目的在于提供所述石斛多糖含量的测定方法的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种石斛多糖含量的测定方法，包括以下步骤：
标准曲线的制备：分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、2.0ml的0.05mg·mL-1的葡萄糖标准液，各加蒸馏水补至2.0ml，然后各加6wt%重蒸苯酚1.0ml，摇匀后加入98wt%浓硫酸5.0ml，摇匀，静置5min后置沸水浴中加热20min，冷却至室温，于490nm处测定吸光度；以吸光度为纵坐标、葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程；
换算因子（f）的测定：取50μg·ml-1石斛精多糖溶液0.05～1ml，加蒸馏水补足至2.0ml，各加6wt%重蒸苯酚溶液1.0ml，摇匀后加入98wt%浓硫酸5.0ml，摇匀，静置5min后置沸水浴中加热20min，冷却至室温，于490nm处测定吸光度，根据回归方程计算石斛精多糖溶液的浓度；计算换算因子f：f＝Cs/C，其中，Cs为石斛精多糖溶液的实际浓度，C为回归方程计算石斛精多糖溶液的浓度；
石斛样品溶液中石斛多糖含量的测定：吸取石斛样品溶液0.05～1ml，各加蒸馏水补至2.0ml，然后各加6wt%重蒸苯酚1.0ml，摇匀后加入98wt%浓硫酸5.0ml，摇匀，静置5min后置沸水浴中加热20min，冷却至室温，于490nm处测定吸光度，由回归方程计算石斛样品溶液中石斛多糖的浓度，由下述公式计算石斛样品溶液中石斛多糖含量（X）：X=f×C’×D×100%/W；
式中：f-换算因子（即石斛多糖相当于葡萄糖的校正系数），C’--由回归方程得到的石斛样品溶液中的葡萄糖含量，D--样品（石斛干燥粉末）测定中的稀释倍数，W--石斛干燥粉末的质量；
所述的石斛样品溶液优选采用以下方法进行制备：将石斛粉末按质量体积比1g/100～150ml加入80wt%乙醇中（即1g石斛粉末加入100～150ml 80wt%乙醇），80～90℃回流提取2～3次，每次0.5～1h，抽滤后取滤渣；往滤渣中按质量体积比1g/100～150ml加入蒸馏水（即1g滤渣加入100～150ml蒸馏水），80～90℃回流提取2～3次，每次0.5～1h，抽滤后取滤液，合并滤液，用蒸馏水定容至50mL，摇匀，得到石斛样品溶液；
所述的石斛粉末优选为过60目筛的干燥石斛粉末；
所述的石斛精多糖溶液优选采用以下方法进行制备：取石斛精多糖，加蒸馏水配制成50μg·ml-1的石斛精多糖溶液；
所述的石斛精多糖优选采用以下方法进行制备：
取石斛粉末，按质量体积比1g/10～15ml加入石油醚（即1g石斛粉末加入10～15ml石油醚），80～90℃回流提取2～3次，每次0.5～1h，抽滤后取滤渣A；按质量体积比1g/10～15ml往滤渣A中加入80wt%乙醇（即1g滤渣加入10～15ml 80wt%乙醇），80～90℃回流提取2～3次，每次0.5～1h，抽滤后取滤渣B；于60℃将滤渣B烘干，得到脱脂干粉；按质量体积比1g/10～15ml往脱脂干粉加入蒸馏水（即1g脱脂干粉加入10～15ml蒸馏水），80～90℃回流提取2～3次，每次0.5～1h，抽滤后取滤液，合并滤液，60℃减压浓缩旋转蒸发，收集浓缩液；往浓缩液中加入4℃预冷无水乙醇至溶液含醇量为80wt%，静置过夜，离心，收集沉淀，干燥，得到石斛粗多糖；
取石斛粗多糖，配制成40mg·ml-1的石斛粗多糖溶液；按体积比0.4：1往40mg·ml-1石斛粗多糖溶液中加入1mg·ml-1的胰蛋白酶，得到混合液，37℃恒温处理5h后于95℃灭活5min，加入Sevag溶液，常温震荡培养5min后于10℃、3500rpm离心5min，保存上层溶液，取下层溶液，加入Sevag溶液，重复振荡培养和离心操作3次，合并上层溶液，用蒸馏水过夜透析后加入预冷无水乙醇至溶液含醇量为80wt%，静置过夜，离心，收集沉淀，干燥，得到石斛精多糖；
所述的石斛粉末优选为过60目筛的干燥石斛粉末；
所述的石油醚优选为沸点60～90℃的石油醚；
所述的浓缩优选于60℃减压旋转蒸发浓缩至20～50ml；
所述的预冷无水乙醇优选为4℃无水乙醇；
所述的静置过夜的温度优选为4℃；
所述的离心优选为于4℃、12,000rpm离心5min；
所述的干燥的条件优选为-80℃冷冻干燥72h；
所述的石斛粗多糖溶液优选采用以下方法进行配制：将石斛粗多糖加入蒸馏水中，80℃加热溶解后冷却至室温，即得；
所述的Sevag溶液优选采用以下方法进行配制：将氯仿和正丁醇按体积比为4：1混合均匀，得到Sevag溶液；
所述的Sevag溶液的体积优选为所述的混合液的体积的1/3；
所述的振荡培养的频率优选为1,000rpm；
所述的过夜透析优选采用截留分子量7500D的透析袋；过夜透析的作用在于除去无机盐、小分子杂质及色素；
所述石斛多糖含量的测定方法可应用于测定各种石斛药材如铁皮石斛和金钗石斛的石斛多糖的含量。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明采用热水浸提法提取石斛粗多糖、采用Sevag法和透析法脱蛋白获得石斛精多糖，所得的石斛精多糖纯度高、杂质少；与现有超声波、酸碱提取等方法相比，本发明通过测定一种石斛的换算因子，依据此换算因子测定其他不同来源的石斛多糖的含量，不需要重新制备粗多糖和精多糖，能有效地降低材料的使用成本，并能够批量的测定多种石斛的多糖含量，使石斛多糖的检测更为方便、简捷、科学。同时，本发明所述的石斛多糖含量的测定方法能够精确地检测石斛多糖的含量，给石斛品种的鉴定提供参考，给石斛育种、生产和市场消费提供有效的指引。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
一种铁皮石斛多糖含量的测定方法，包括以下步骤：
（1）石斛粉末的制备：选取来自云南的组培铁皮石斛（Dendrobium officinaleKimura et Migo）成熟植株，105℃杀青15min，60℃烘干至恒重，磨成粉末，过60目筛，得到铁皮石斛干燥粉末；
（2）粗多糖的制备：称取铁皮石斛干燥粉末50g，加入750ml石油醚（沸点60-90℃），80℃回流提取2次，每次1h，抽滤后得到滤渣A；往滤渣A加入750ml 80wt%乙醇溶液，80℃回流提取2次，每次1h，抽滤后得到滤渣B，将滤渣B于60℃烘干，得到脱脂干粉；往脱脂干粉加750ml蒸馏水，80℃回流提取2次，每次1h，抽滤后取滤液，合并滤液，60℃减压浓缩，收集浓缩液；往浓缩液中加入预冷无水乙醇至溶液含醇量为80wt%，4℃放置过夜，4℃、12,000rpm离心5min，收集沉淀，-80℃冷冻干燥72h，得到石斛粗多糖；
（3）精多糖的制备：称取步骤（2）的粗多糖4g溶于100ml蒸馏水中，得40mg·ml-1粗多糖溶液，80℃加热溶解后冷却至室温，加入1mg·ml-1的胰蛋白酶36ml，得到混合液，37℃恒温处理5h，95℃灭活酶5min后，向上述处理过（加入1mg·ml-1的胰蛋白酶36ml，37℃恒温处理5h；95℃灭活酶5min）的混合液中加入1/3体积的Sevag溶液（氯仿：正丁醇体积比为4：1），常温1,000rpm震荡培养5min，然后10℃、3,500rpm离心10min，保存上层溶液，取下层溶液，按体积比3：1往下层溶液中加入Sevag溶液，重复振荡培养和离心操作3次，合并上层溶液，用蒸馏水过夜透析（透析袋截留分子量7500D）后加入4℃下预冷的无水乙醇至溶液含醇量为80wt%，4℃放置过夜，4℃、12,000rpm离心5min，收集沉淀，-80℃冷冻干燥72h，得到石斛精多糖；
（4）样品溶液的制备：称取过60目筛的铁皮石斛干燥粉末0.1g，溶于15ml80wt%乙醇，80℃回流提取1h后抽滤，取滤渣，重复回流提取1次后抽滤，所得滤渣溶于15ml蒸馏水，80℃回流提取1h后抽滤，保存滤液，所得的滤渣挥干溶媒后于15ml蒸馏水重复回流提取1次，抽滤后取滤液，合并滤液，蒸馏水定容至50mL，摇匀，得到样品溶液；
（5）改良苯酚-硫酸法测定石斛多糖的含量：
标准曲线的制备：分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、2.0ml的0.05mg·mL-1的葡萄糖标准液，各加蒸馏水补至2.0ml，然后各加6wt%重蒸苯酚1.0ml，摇匀后加入浓度为98wt%浓硫酸5.0ml，摇匀，放置5min后置沸水浴中加热20min，冷却至室温，于490nm处测吸光度，以吸光度为纵坐标、葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为y=0.0586x+0.0338（R2=0.997）。
换算因子（f）的测定：称取步骤（3）的干燥至恒重的石斛精多糖50mg，溶于50ml蒸馏水，得到1mg·ml-1的石斛精多糖溶液A；取1mg·ml-1的石斛精多糖溶液A 5ml，加蒸馏水定容至100ml，摇匀，得到50μg·ml-1的石斛精多糖溶液B；取50μg·ml-1石斛精多糖溶液B 0.05ml，加蒸馏水补足至2.0ml，各加6wt%重蒸苯酚溶液1.0ml，摇匀后加入98wt%浓硫酸5.0ml，摇匀，静置5min后置沸水浴中加热20min，冷却至室温，于490nm处测定吸光度，根据回归方程计算石斛精多糖溶液B的浓度；计算换算因子f：f＝Cs/C=2.760，其中，Cs为石斛精多糖溶液B的实际浓度，C为回归方程计算石斛精多糖溶液B的浓度；
样品溶液中石斛多糖含量的测定：吸取步骤（4）的样品溶液0.08ml，各加蒸馏水补至2.0ml，然后各加6wt%重蒸苯酚1.0ml，摇匀后加入98wt%浓硫酸5.0ml，摇匀，静置5min后置沸水浴中加热20min，冷却至室温，于490nm处测定吸光度，由回归方程y=0.0586x+0.0338计算石斛样品溶液中石斛多糖的浓度，由下述公式计算石斛样品溶液中石斛多糖含量（X）：X=f×C’×D×100%/W=（2.760×5.618×10-6×2500）×100%/0.1=38.8%；
式中：f--铁皮石斛多糖相当于葡萄糖的校正系数（即换算因子），C’--由回归方程得到的石斛样品溶液中的葡萄糖含量，D--样品（石斛干燥粉末）测定中的稀释倍数，W--石斛干燥粉末质量。
实施例2
一种测定杂交春石斛多糖含量的方法，包括以下步骤：
（1）石斛粉末的制备：选取经驯化两年的云南野生金钗石斛（Dendrobiumnobile Lindl）2年生成熟茎段，105℃杀青15min，60℃烘干至恒重，磨成粉末，过60目筛，得到野生金钗石斛干燥粉末；
分别取从日本引进的36种杂交春石斛（Nobile-type Dendrobium）成熟茎段和组培金钗成熟茎段（均为2年生），105℃杀青15min，60℃烘干至恒重，磨成粉末，过60目筛得杂交春石斛干燥粉末；
（2）粗多糖的制备：同实施例1步骤（2），其区别仅在于所用粉末为野生金钗石斛干燥粉末；
（3）精多糖的制备：操作同实施例1步骤（3）；
（4）样品溶液的制备：分别称取上述野生金钗石斛干燥粉末和杂交春石斛干燥粉末0.1g，溶于15ml 80wt%的乙醇，80℃回流提取1h后抽滤，取滤渣，重复回流提取1次后抽滤，所得滤渣溶于15ml蒸馏水，80℃回流提取1h后抽滤，保存滤液，所得的滤渣挥干溶媒后于15ml蒸馏水重复回流提取1次，抽滤后取滤液，合并滤液，蒸馏水定容至50mL，摇匀，得到样品溶液；
（5）改良苯酚-硫酸法测定石斛多糖的含量：
标准曲线的制备：分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、2.0ml的0.05mg·mL-1的葡萄糖标准液，各加蒸馏水补至2.0ml，然后各加6wt%重蒸苯酚1.0ml，摇匀后加入98wt%浓硫酸5.0ml，摇匀，放置5min后置沸水浴中加热20min，冷却至室温，于490nm处测吸光度，以吸光度为纵坐标、葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为y=0.0586x+0.0338（R2=0.997）。
换算因子（f）的测定：称取步骤（3）的干燥至恒重的石斛精多糖50mg，溶于50ml蒸馏水，得到1mg·ml-1的石斛精多糖溶液A；取1mg·ml-1的石斛精多糖溶液A 5ml，加蒸馏水定容至100ml，摇匀，得到50μg·ml-1的石斛精多糖溶液B；取50μg·ml-1石斛精多糖溶液B 0.5ml，加蒸馏水补足至2.0ml，各加6wt%重蒸苯酚溶液1.0ml，摇匀后加入98wt%浓硫酸5.0ml，摇匀，静置5min后置沸水浴中加热20min，冷却至室温，于490nm处测定吸光度，根据回归方程计算石斛精多糖溶液B的浓度；计算换算因子f：f＝Cs/C=2.445，其中，Cs为石斛精多糖溶液B的实际浓度，C为回归方程计算石斛精多糖溶液B的浓度；
样品中多糖含量的测定：吸取步骤（4）的样品溶液0.5ml，各加蒸馏水补至2.0ml，然后各加6wt%重蒸苯酚1.0ml，摇匀后加入98wt%浓硫酸5.0ml，摇匀，静置5min后置沸水浴中加热20min，冷却至室温，于490nm处测定吸光度，由回归方程y=0.0586x+0.0338计算石斛样品溶液中石斛多糖的浓度，由下述公式计算野生金钗石斛样品溶液中石斛多糖含量（X）：X=f×C’×D×100%/W=（2.445×5.942×10-6×800）×100%/0.1=11.62%；
式中：f-野生金钗石斛多糖相当于葡萄糖的校正系数（即换算因子），C’--由回归方程得到的石斛样品溶液中的葡萄糖含量，D--样品（石斛干燥粉末）测定中的稀释倍数，W--石斛干燥粉末的质量；
以野生金钗石斛的换算因子f作为参考值，测定其他杂交春石斛的多糖含量，结果如表1所示：
表1杂交春石斛多糖含量测定结果
备注：表中同列数据后小写英文字母不同者表示差异显著,采用SPSS17.0中文软件进行统计分析。
表1中：1为野生金钗石斛（Dendrobium nobile Lindl）、2为组培金钗石斛（Dendrobium nobile Lindl）、3为杂交春石斛（D.Fairyflake‘Carmen’）、4为杂交春石斛（D.Spot Right）、5为杂交春石斛（D.Kazuli）、6为杂交春石斛（D.Yohkou‘Peach Boy’）、7为杂交春石斛（D.Yohkou‘Cat Eyes’）、8为杂交春石斛（D.FullBloom‘Hanahime’）、9为杂交春石斛（D.Pink Beauty‘Queen’）、10为杂交春石斛（D.Utopia‘Messenger’）、11为杂交春石斛（D.Tomofleak‘Napori’）、12为杂交春石斛（D.Maloflake‘Yumedono’）、13为杂交春石斛（D.Shinonome‘Karen’）、14为杂交春石斛（D.‘Bizen Akebano’）、15为杂交春石斛（D.Casiflake）、16为杂交春石斛（D.Emur）、17为杂交春石斛（D.Tubuyaki）、18为（D.Moon Harmaid）、19为杂交春石斛（D.SpringColor‘Hohoemi’）、20为杂交春石斛（D.Yaotome）、21为杂交春石斛（D.RedArce）、22为杂交春石斛（D.Love Story）、23为杂交春石斛（D.Second Love‘Tokimeki’）、24为杂交春石斛（D.Oriental Sprit‘Rudoruph’）、25为杂交春石斛（D.Sekand Rave‘YakigiPon’）、26为杂交春石斛（D.Shirasagi）、27为杂交春石斛（D.Marchen Color）、28为杂交春石斛（D.Rainbow‘Saira’）、29为杂交春石斛（D.Snowflake’Otome’）、30为杂交春石斛（D.Himezakura‘Fujikka’）、31为杂交春石斛（D.Spring Color‘Green Sleep’）、32为杂交春石斛（D.Pink Doll‘Elegance’）、33为杂交春石斛（D.Pittero Gold‘Princess’）、34为杂交春石斛（D.Yellow Magic‘Carnival’）、35为杂交春石斛（D.Spring Zewel‘Miui’）、36为杂交春石斛（D.Yellow Song‘Rhythm’）、37为杂交春石斛（D.Spring Dream‘kumiko’）、38为杂交春石斛（D.Lady Smile）。
本方法以野生金钗石斛换算因子作为参照，初步测定组培金钗和其他杂交春石斛茎段的多糖含量，可以大大降低材料使用量，节约提取时间，明显提高了提取效率，快速科学地筛选出高多糖含量的石斛资源。
实施例3
一种鼓槌石斛多糖含量的测定方法，包括以下步骤：
（1）石斛粉末的制备：选取经驯化两年的云南野生鼓槌石斛（Dendrobiumchysotoxum Lindle）2年生成熟茎段，105℃杀青15min，60℃烘干至恒重，磨成粉末，过60目筛，得到野生鼓槌石斛干燥粉末；
（2）粗多糖的制备：同实施例1步骤（2）；其区别仅在于所用粉末为野生鼓槌石斛干燥粉末；
（3）精多糖的制备：操作同实施例1步骤（3）；
（4）样品溶液的制备：操作同实施例1步骤（4）；
（5）改良苯酚-硫酸法测定石斛多糖的含量：
标准曲线的制备：分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、2.0ml的0.05mg·mL-1的葡萄糖标准液，各加蒸馏水补至2.0ml，然后各加6wt%重蒸苯酚1.0ml，摇匀后加入98wt%浓硫酸5.0ml，摇匀，放置5min后置沸水浴中加热20min，冷却至室温，于490nm处测吸光度，以吸光度为纵坐标、葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为y=0.2724x+0.0126（R2=0.9918）。
换算因子（f）的测定：称取步骤（3）的干燥至恒重的石斛精多糖50mg，溶于50ml蒸馏水，得到1mg·ml-1的石斛精多糖溶液A；取1mg·ml-1的石斛精多糖溶液A 5ml，加蒸馏水定容至100ml，摇匀，得到50μg·ml-1的石斛精多糖溶液B；取50μg·ml-1石斛精多糖溶液B 1ml，加蒸馏水补足至2.0ml，各加6wt%重蒸苯酚溶液1.0ml，摇匀后加入98wt%浓硫酸5.0ml，摇匀，静置5min后置沸水浴中加热20min，冷却至室温，于490nm处测定吸光度，根据回归方程计算石斛精多糖溶液B的浓度；计算换算因子f：f＝Cs/C=2.319，其中，Cs为石斛精多糖溶液B的实际浓度，C为回归方程计算石斛精多糖溶液B的浓度；
样品中多糖含量的测定：吸取步骤（4）的样品溶液0.3ml，各加蒸馏水补至2.0ml，然后各加6wt%重蒸苯酚1.0ml，摇匀后加入98wt%浓硫酸5.0ml，摇匀，静置5min后置沸水浴中加热20min，冷却至室温，于490nm处测定吸光度，由回归方程y=0.2724x+0.0126计算石斛样品溶液中石斛多糖的浓度，由下述公式计算野生金钗石斛样品溶液中石斛多糖含量（X）：X=f×C’×D×100%/W=（2.319×7.334×10-6×1111.111）×100%/0.1=18.9%；
式中：f--石斛多糖相当于葡萄糖的校正系数（即换算因子），C’--由回归方程得到的石斛样品溶液中的葡萄糖含量，D--样品（石斛干燥粉末）测定中的稀释倍数，W--石斛干燥粉末的质量。
对比实施例
（1）石斛粉末的制备：同实施例3步骤（1）；
（2）粗多糖的制备：称取鼓槌石斛干燥粉末50g，加入750ml石油醚（沸程60-90℃），80℃回流提取2次，每次1h，抽滤后得到滤渣A；往滤渣A加入750ml 80wt%乙醇溶液，80℃回流提取2次，每次1h，抽滤后得到滤渣B；将滤渣B于60℃烘干，得到脱脂干粉；往脱脂干粉加750ml蒸馏水，40℃超声波提取45min，抽滤，得滤液，60℃减压浓缩至50ml，收集浓缩液；往浓缩液中加入预冷无水乙醇至溶液含醇量为80wt%，4℃静置过夜，4℃、12,000rpm离心5min，收集沉淀，-80℃冷冻干燥72h，得到石斛粗多糖；
（3）精多糖的制备：称取步骤（2）的粗多糖4g溶于100ml蒸馏水中，得40mg·ml-1粗多糖溶液，80℃加热溶解后冷却至室温，加入1mg·ml-1的胰蛋白酶36ml，得到混合液，37℃恒温处理5h，95℃灭活酶5min后，加入相应处理过（加入1mg·ml-1的胰蛋白酶36ml，37℃恒温处理5h；95℃灭活酶5min）的混合液1/3体积的Sevag溶液（氯仿：正丁醇体积比为4：1），常温1,000rpm震荡培养5min，然后10℃、3,500rpm离心10min，保存上层溶液，取下层溶液，按体积比3：1往下层溶液中加入Sevag溶液，重复振荡培养和离心操作3次，合并上层溶液，用蒸馏水过夜透析（透析袋截留分子量7500D）后加入预冷（4℃）无水乙醇至溶液含醇量为80wt%，4℃放置过夜，4℃、12,000rpm离心5min，收集沉淀，-80℃冷冻干燥72h，得到石斛精多糖；
（4）样品溶液的制备：称取过60目筛的石斛干燥粉末0.1g，溶于15ml80wt%乙醇，80℃回流提取1h后过滤，取滤渣，重复回流提取1次后抽滤，所得滤渣溶于15ml蒸馏水，40℃超声波提取45min，抽滤，保存滤液，蒸馏水定容至50mL，摇匀，得到样品溶液；
（5）改良苯酚-硫酸法测定石斛多糖的含量：
标准曲线的制备：分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、2.0ml的0.05mg·mL-1的葡萄糖标准液，各加蒸馏水补至2.0ml，然后各加6wt%重蒸苯酚1.0ml，摇匀后加入98wt%浓硫酸5.0ml，摇匀，放置5min后置沸水浴中加热20min，冷却至室温，于490nm处测吸光度，以吸光度为纵坐标、葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为y=0.0586x+0.0338（R2=0.997）。
换算因子（f）的测定：称取步骤（3）的干燥至恒重的石斛精多糖50mg，溶于50ml蒸馏水，得到1mg·ml-1的石斛精多糖溶液A；取1mg·ml-1的石斛精多糖溶液A 5ml，加蒸馏水定容至100ml，摇匀，得到50μg·ml-1的石斛精多糖溶液B；取50μg·ml-1石斛精多糖溶液B 0.8ml，加蒸馏水补足至2.0ml，各加6wt%重蒸苯酚溶液1.0ml，摇匀后加入98wt%浓硫酸5.0ml，摇匀，静置5min后置沸水浴中加热20min，冷却至室温，于490nm处测定吸光度，根据回归方程计算石斛精多糖溶液B的浓度；计算换算因子f：f＝Cs/C=2.159，其中，Cs为石斛精多糖溶液B的实际浓度，C为回归方程计算石斛精多糖溶液B的浓度；
样品中多糖含量的测定：吸取步骤（4）的样品溶液0.3ml，各加蒸馏水补至2.0ml，然后各加6wt%重蒸苯酚1.0ml，摇匀后加入98wt%浓硫酸5.0ml，摇匀，静置5min后置沸水浴中加热20min，冷却至室温，于490nm处测定吸光度，由回归方程y=0.0586x+0.0338计算石斛样品溶液中石斛多糖的浓度，由下述公式计算野生鼓槌石斛样品溶液中石斛多糖含量（X）：X=f×C’×D×100%/W=2.159×5.837×10-6×833.333×100%/0.1=10.5%；
式中：f--石斛多糖相当于葡萄糖的校正系数（即换算因子），C’--由回归方程得到的石斛样品溶液中的葡萄糖含量，D--样品（石斛干燥粉末）测定中的稀释倍数，W--石斛干燥粉末的质量。
表2不同提取方法对鼓槌石斛多糖含量的影响
备注：表中同列数据后小写英文字母不同者表示差异显著,采用SPSS17.0中文软件进行统计分析。
与超声提取法相比，本方法采用改良的热水浸提法，尽管热水提取时间稍长，但校正系数较高，多糖损失较小，其测定的多糖含量明显高于超声法测定的结果。此外，超声提取法材料使用量受限，主要用于实验室，而热水浸提法可应用于工业化生产。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种石斛多糖含量的测定方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)标准曲线的制备：分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、2.0ml的0.05mg·mL-1的葡萄糖标准液，各加蒸馏水补至2.0ml，然后各加6wt％重蒸苯酚1.0ml，摇匀后加入98wt％浓硫酸5.0ml，摇匀，静置5min后置沸水浴中加热20min，冷却至室温，于490nm处测定吸光度；以吸光度为纵坐标、葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程；
(2)换算因子的测定：取50μg·ml-1石斛精多糖溶液0.05～1ml，加蒸馏水补足至2.0ml，加6wt％重蒸苯酚溶液1.0ml，摇匀后加入98wt％浓硫酸5.0ml，摇匀，静置5min后置沸水浴中加热20min，冷却至室温，于490nm处测定吸光度，根据回归方程计算石斛精多糖溶液中葡萄糖的浓度；计算换算因子f：f＝Cs/C，其中，Cs为石斛精多糖溶液的实际浓度，C为回归方程计算石斛精多糖溶液中葡萄糖的浓度；
(3)石斛多糖含量的测定：吸取石斛样品溶液0.05～1ml，加蒸馏水补至2.0ml，然后加6wt％重蒸苯酚1.0ml，摇匀后加入98wt％浓硫酸5.0ml，摇匀，静置5min后置沸水浴中加热20min，冷却至室温，于490nm处测定吸光度，由回归方程计算石斛样品溶液中葡萄糖的浓度，由下述公式计算石斛多糖含量X：X＝f×C’×D×100％/W；
式中：f--换算因子，C’--由回归方程得到的石斛样品溶液中的葡萄糖含量，D--石斛干燥粉末测定中的稀释倍数，W--石斛干燥粉末的质量；
步骤(3)中所述的石斛样品溶液采用以下方法进行制备：将石斛粉末按质量体积比1g/100～150ml加入80wt％乙醇中，80～90℃回流提取2～3次，每次0.5～1h，抽滤后取滤渣；往滤渣中按质量体积比1g/100～150ml加入蒸馏水，80～90℃回流提取2～3次，每次0.5～1h，抽滤后取滤液，合并滤液，用蒸馏水定容至50mL，摇匀，得到石斛样品溶液；
步骤(2)中所述的石斛精多糖采用以下方法进行制备：
取石斛粉末，按质量体积比1g/10～15ml加入石油醚，80～90℃回流提取2～3次，每次0.5～1h，抽滤后取滤渣A；按质量体积比1g/10～15ml往滤渣A中加入80wt％乙醇，80～90℃回流提取2～3次，每次0.5～1h，抽滤后取滤渣B；于60℃将滤渣B烘干，得到脱脂干粉；按质量体积比1g/10～15ml往脱脂干粉加入蒸馏水，80～90℃回流提取2～3次，每次0.5～1h，抽滤后取滤液，合并滤液，浓缩，收集浓缩液；往浓缩液中加入预冷无水乙醇至溶液含醇量为80wt％，静置过夜，离心，收集沉淀，干燥，得到石斛粗多糖；
取石斛粗多糖，配制成40mg·ml-1的石斛粗多糖溶液；往40mg·ml-1石斛粗多糖溶液中加入1mg·ml-1的胰蛋白酶，得到混合液，所述的混合液中，胰蛋白酶和粗多糖溶液体积比为0.4：1；37℃恒温处理5h后于95℃灭活5min，加入Sevag溶液，常温振荡培养5min后于10℃、3500rpm离心5min，保存上层溶液，取下层溶液，加入Sevag溶液，重复振荡培养和离心操作3次，合并上层溶液，用蒸馏水过夜透析后加入4℃预冷无水乙醇至溶液含醇量为80wt％，静置过夜，离心，收集沉淀、干燥，得到石斛精多糖。
2.根据权利要求1所述的石斛多糖含量的测定方法，其特征在于：
石斛精多糖的制备方法中，所述的浓缩于60℃减压浓缩至20～50ml。
3.根据权利要求1所述的石斛多糖含量的测定方法，其特征在于：
石斛精多糖的制备方法中，所述的Sevag溶液采用以下方法进行配制：将氯仿和正丁醇按体积比为4：1混合均匀，得到Sevag溶液。
4.根据权利要求1所述的石斛多糖含量的测定方法，其特征在于：
石斛精多糖的制备方法中，所述的Sevag溶液的体积为所述的混合液的体积的1/3。
5.根据权利要求1所述的石斛多糖含量的测定方法，其特征在于：
石斛精多糖的制备方法中，所述的石斛粉末为过60目筛的干燥石斛粉末；所述的收集沉淀、干燥的条件为收集沉淀，然后-80℃冷冻干燥72h；所述的振荡培养的频率为1000rpm；
石斛精多糖的制备方法中，所述的石斛粗多糖溶液采用以下方法进行配制：将石斛粗多糖加入蒸馏水中，80℃加热溶解后冷却至室温，得到石斛粗多糖溶液。
6.根据权利要求1所述的石斛多糖含量的测定方法，其特征在于：石斛样品溶液的制备方法中，所述的石斛粉末为过60目筛的干燥石斛粉末。
7.根据权利要求1所述的石斛多糖含量的测定方法，其特征在于：步骤(2)中所述的石斛精多糖溶液采用以下方法进行制备：取石斛精多糖，加蒸馏水配制成50μg·ml-1的石斛精多糖溶液。
8.权利要求1～7任一项所述的石斛多糖含量的测定方法的应用，其特征在于：所述的石斛多糖含量的测定方法应用于测定各种石斛药材中石斛多糖的含量。
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