CN107188986A - 一种血满草多糖及其提取方法 - Google Patents

一种血满草多糖及其提取方法 Download PDF

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王辉
刘瑜
胡啸翎
钱康
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Abstract

本申请公开了一种血满草多糖及其提取方法，该制备方法包括以下步骤：取血满草叶片粉末于圆底烧瓶中，加入石油醚，回流脱脂，挥干石油醚，再经乙醇回流脱除醇溶性杂质，挥干乙醇；取预处理过的血满草叶片粉末，以蒸馏水作为提取剂，进行浸提，得到血满草叶多糖提取液；血满草叶多糖提取液经离心，将上清液浓缩得到浓缩液，加入无水乙醇，醇沉，离心，取沉淀，冷冻干燥得到血满草叶粗多糖；用蒸馏水将血满草叶粗多糖配成质量浓度为5％的溶液，将Sevage试剂加入到血满草叶粗多糖溶液中，震荡，离心，至无游离蛋白为止，上清液透析，浓缩，冻干，得到脱蛋白血满草多糖。制备得到的血满草多糖具有良好的抗氧化活性。

Description

一种血满草多糖及其提取方法
技术领域
本申请属于中草药领域，具体地说，涉及一种血满草多糖及其提取方法。
背景技术
多糖是机体内天然大分子之一，广泛存在于许多动植物体内，不仅是生命体的营养成分，而且还参与多种生命活动。现代中药研究表明，多糖是中药的有效成分之一，具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、降血糖、降血脂、免疫调节和调控细胞分裂、分化等多种药理作用，并且其对人体正常细胞毒副作用很小。因此，中药多糖具有开发为药物资源的广阔前景和巨大潜力。
血满草(Sambucus adnata Wall.)，又名血莽草，尤古兴那波(藏语)，为我国民间常用药，也是藏药的药源植物之一，其味辛、涩、性温，具有祛风、利水、活血、通络的功效，主治急慢性肾炎、风湿疼痛、风疹瘙痒、小儿麻痹后遗症、慢性腰腿疼、扭伤瘀痛、骨折等症。血满草主要分布于我国的陕西、宁夏、甘肃、青海、四川、贵州、云南和西藏等地，其中西藏自治区的分布较广，主要集中在藏东南或藏南的海拔较低(1600-3600m)地区，资源量相对较大，但是由于血满草具有不适气味，导致这一重要药用植物资源利用率极低，绝大部分血满草处于自生自灭的状态，远未得到合理的开发利用。
目前，尚未有关于血满草多糖提取的相关研究，为了更好的利用这一重要的民族药材，本申请首次提供了血满草多糖的提取工艺。
发明内容
有鉴于此，本申请提供了一种血满草多糖及其提取方法，本发明提供了一种符合西藏自然环境条件、操作简单、提取率较高的血满草多糖提取工艺。
为了解决上述技术问题，本申请公开了一种血满草多糖的提取方法，
包括以下步骤：
1)预处理：取血满草叶片粉末于圆底烧瓶中，加入石油醚，回流脱脂，挥干石油醚，再经95％的乙醇回流脱除醇溶性杂质，挥干乙醇；
2)取预处理过的血满草叶片粉末于试管中，以蒸馏水作为提取剂，进行浸提，得到血满草叶多糖提取液；
3)血满草叶多糖提取液经离心，将上清液浓缩得到浓缩液，加入无水乙醇至终浓度为80％(v/v)，醇沉，离心，取沉淀，冷冻干燥得到血满草叶粗多糖；
4)用蒸馏水将血满草叶粗多糖配成质量浓度为5％的溶液，将Sevage试剂按血满草叶粗多糖溶液总体积的1/4加入到血满草叶粗多糖溶液中，剧烈震荡，离心，去除游离蛋白形成的凝胶状沉淀，重复多次，至无游离蛋白为止，上清液透析，浓缩，冻干，得到脱蛋白血满草多糖。
进一步地，所述步骤1)中的石油醚的用量为血满草叶片粉末体积的3-5倍；回流脱脂次数为3-5次，每次2-4h；回流脱除醇溶性杂质的次数为3-5次，每次2-4h。
进一步地，步骤2)中提取温度为70-90℃。
进一步地，步骤2)中提取时间为60-150min。
进一步地，步骤2)中水料比为25-40mL/g。
进一步地，步骤2)中提取次数为2-5次。
进一步地，步骤3)中离心转速为3500-4500r/min，离心时间为5-15min；浓缩液的体积与预处理过的血满草叶片粉末的体积质量比为5∶1-15∶1mL/g；醇沉温度为3-5℃，醇沉时间为12-24h；冷冻干燥温度为-45--60℃。
进一步地，步骤4)中Sevage试剂为体积比为4∶1的氯仿和正丁醇的混合物。
进一步地，步骤4)中剧烈震荡时间为1-2h，转速为280-320r/min；离心转速为3500-4500r/min，离心时间为5-15min。
本发明还公开了一种由上述提取方法制备得到的血满草多糖。
与现有技术相比，本申请可以获得包括以下技术效果：
至今为止，西藏民族药材多糖成分的研究相对较少、开发利用率较低，本发明以西藏药源植物血满草为材料，提供了一套符合西藏自然环境、操作简单、提取率较高的血满草多糖提取工艺，为血满草资源的开发利用提供基础数据，也为血满草多糖结构分析、活性研究及构效关系研究奠定基础，最终推动具有西藏自主知识产权的药用植物资源的开发利用及精深加工产品的研发。
当然，实施本申请的任一产品必不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1是本申请提取温度对SaWP提取率的影响；
图2是本申请提取时间对SaWP提取率的影响；
图3是本申请水料比对SaWP提取率的影响；
图4是本申请提取次数对SaWP提取率的影响；
图5是本申请脱蛋白血满草多糖SaWPrp清除H2O2的能力；
图6是本申请脱蛋白血满草多糖SaWPrp清除DPPH·的能力；
图7是本申请脱蛋白血满草多糖SaWPrp清除ABTS+·的能力；
图8是本申请脱蛋白血满草多糖SaWPrp清除·OH的能力。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本申请的实施方式，藉此对本申请如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
本发明提供一种血满草多糖的提取方法，包括以下步骤：
1)预处理：取血满草叶片粉末于圆底烧瓶中，加入3-5倍体积的石油醚，回流脱脂3-5次，每次2-4h，挥干石油醚，再经95％的乙醇回流脱除醇溶性杂质3-5次，每次2-4h，挥干乙醇。
2)取预处理过的血满草叶片粉末1g于试管中，以蒸馏水作为提取剂，进行浸提，得到血满草叶多糖提取液；其中，提取温度为70-90℃，提取时间为60-150min，水料比为25-40mL/g，提取次数为2-5次；
3)血满草叶多糖提取液经3500-4500r/min离心5-15min，将上清液浓缩至10mL，加入无水乙醇至终浓度为80％(v/v)，于3-5℃醇沉12-24h，3500-4500r/min离心5-15min，取沉淀，-45--60℃冷冻干燥得到血满草叶粗多糖(SaWP)；
4)用蒸馏水将SaWP配成质量浓度为5％的溶液，将Sevage试剂(氯仿∶正丁醇＝4∶1)按SaWP溶液总体积的1/4加入到样品溶液中，在转速为280-320r/min的条件下剧烈震荡1-2h，3500-4500r/min离心5-15min，去除游离蛋白形成的凝胶状沉淀，重复多次，至无游离蛋白为止，上清液经500Da透析袋透析48h，浓缩，冻干，得到脱蛋白血满草多糖SaWPrp。
其中，多糖提取率的测定采用苯酚-硫酸比色法，精密量取多糖溶液1mL，按2.2步骤于490nm处测定吸光值，根据标准曲线计算多糖含量。SaWP提取率(％)＝[(多糖含量×血满草粗多糖质量)/血满草质量]×100％。
提取温度对SaWP提取率的影响较为显著，如图1所示，在温度为70-85℃范围内，随着提取温度的升高，多糖的提取率呈现迅速增加的趋势，在提取温度为85-90℃范围内，随着提取温度的增加SaWP提取率增幅缓慢。
如图2所示，在30-90min内，随着提取时间的延长，SaWP提取率快速增加，当提取时间达到90min以上时，SaWP提取率趋于平缓。考虑到加热时问过长，能耗增加，而且多糖可能发生水解，因而综合各方面考虑，提取时间在60-150min为宜。
如图3所示，随着水料比的增大，SaWP提取率逐渐增加，在水料比为40mL/g时提取率最高，随后随着水料比的增大，SaWP提取率缓慢降低。这可能是因为水料比太大，浓缩时间延长，导致多糖部分降解，提取率降低。因此，选择料液比为25-40mL/g。
如图4所示，随着提取次数的增加，SaWP提取率逐渐增加，在提取次数达到4次以上时，SaWP提取率增幅减慢，为节约能源，简化操作，确定提取次数为2-5次。
实施例1
一种血满草多糖的提取方法，包括以下步骤：
1)预处理：取血满草叶片粉末于圆底烧瓶中，加入3倍体积的石油醚，回流脱脂3次，每次3h，挥干石油醚，再经95％的乙醇回流脱除醇溶性杂质3次，每次3h，挥干乙醇。
2)取预处理过的血满草叶片粉末1g于试管中，以蒸馏水作为提取剂，按一定的提取温度、提取时间、水料比和提取次数条件下常规热水浸提血满草叶多糖，其中，提取温度89℃，提取时间114min，水料比26mL/g，提取次数4次。
3)提取液经4000r/min离心10min，将上清液浓缩至10mL，加入无水乙醇至终浓度为80％(v/v)，于4℃醇沉24h，4000r/min离心10min，取沉淀，-60℃冷冻干燥得到血满草叶粗多糖(SaWP)。
4)用蒸馏水将SaWP配成质量浓度为5％的溶液，将Sevage试剂(氯仿∶正丁醇＝4∶1)按SaWP溶液总体积的1/4加入到样品溶液中，在转速为300r/min的条件下剧烈震荡1.5h，4000r/min离心10min，去除游离蛋白形成的凝胶状沉淀，重复多次，至无游离蛋白为止，上清液经500Da透析袋透析48h，浓缩，冻干，得到脱蛋白血满草多糖SaWPrp。
本实施例制备得到的血满草叶粗多糖的提取率为2.6885％。
实施例2
一种血满草多糖的提取方法，包括以下步骤：
1)预处理：取血满草叶片粉末于圆底烧瓶中，加入5倍体积的石油醚，回流脱脂5次，每次2h，挥干石油醚，再经95％的乙醇回流脱除醇溶性杂质5次，每次2h，挥干乙醇。
2)取预处理过的血满草叶片粉末1g于试管中，以蒸馏水作为提取剂，进行浸提，得到血满草叶多糖提取液；其中，提取温度为70℃，提取时间为150min，水料比为25mL/g，提取次数为5次；
3)血满草叶多糖提取液经3500r/min离心15min，将上清液浓缩至5mL，加入无水乙醇至终浓度为80％(v/v)，于3℃醇沉24h，3500r/min离心15min，取沉淀，-45℃冷冻干燥得到血满草叶粗多糖(SaWP)；
4)用蒸馏水将SaWP配成质量浓度为5％的溶液，将Sevage试剂(氯仿∶正丁醇＝4∶1)按SaWP溶液总体积的1/4加入到样品溶液中，在转速为280r/min的条件下剧烈震荡2h，3500r/min离心15min，去除游离蛋白形成的凝胶状沉淀，重复多次，至无游离蛋白为止，上清液经500Da透析袋透析48h，浓缩，冻干，得到脱蛋白血满草多糖(SaWPrp)。
本实施例制备得到的血满草叶粗多糖的提取率为2.1326。
实施例3
一种血满草多糖的提取方法，包括以下步骤：
1)预处理：取血满草叶片粉末于圆底烧瓶中，加入4倍体积的石油醚，回流脱脂4次，每次3h，挥干石油醚，再经95％的乙醇回流脱除醇溶性杂质4次，每次3h，挥干乙醇。
2)取预处理过的血满草叶片粉末1g于试管中，以蒸馏水作为提取剂，进行浸提，得到血满草叶多糖提取液；其中，提取温度为90℃，提取时间为60min，水料比为40mL/g，提取次数为2次；
3)血满草叶多糖提取液经4500r/min离心5min，将上清液浓缩至15mL，加入无水乙醇至终浓度为80％(v/v)，于5℃醇沉12h，4500r/min离心5min，取沉淀，-60℃冷冻干燥得到血满草叶粗多糖(SaWP)；
4)用蒸馏水将SaWP配成质量浓度为5％的溶液，将Sevage试剂(氯仿∶正丁醇＝4∶1)按SaWP溶液总体积的1/4加入到样品溶液中，在转速为320r/min的条件下剧烈震荡1h，4500r/min离心5min，去除游离蛋白形成的凝胶状沉淀，重复多次，至无游离蛋白为止，上清液经500Da透析袋透析48h，浓缩，冻干，得到脱蛋白血满草多糖(SaWPrp)。
本实施例制备得到的血满草叶粗多糖的提取率为1.4263％。
下面结合具体的实验数据进行说明本发明的技术效果：
一、脱蛋白血满草多糖SaWPrp对H2O2清除能力的测定
取不同浓度的SaWPrp水溶液1.0mL于试管中，分别加入0.15mol/L pH7.5的PBS2.4mL和50mmol/L的H2O2 0.6mL，混匀，反应10min，于230nm处测定吸光度A，Vc作为阳性对照，重复3次，然后按下式计算清除率：H2O2清除率(％)＝[A0-(A1-A2)]/A0×100％，其中，A0为对照实验(水代替样品溶液)的吸光值；A1为样品实验的吸光值；A2为样品干扰实验(蒸馏水代替H2O2)的吸光值。
H2O2是活性氧的一种，属中等活性，是许多活性较强的自由基产生过程的中间体，因此，清除H2O2就阻止了自由基产生的链式反应。从图5可以看出，SaWPrp对自由基具有一定的清除能力，但清除能力较弱。随着多糖浓度的增加，清除率逐渐升高，总体上呈现出一定的浓度依赖性。
二、脱蛋白血满草多糖SaWPrp对DPPH·清除能力的测定
取不同浓度的SaWPrp水溶1.0mL于试管中，加入0.4mmol/L的DPPH·乙醇溶液4.0mL，混匀，暗处反应30min，于517nm处测定吸光度A，Vc作为阳性对照，重复3次，然后按下式计算清除率：DPPH·清除率(％)＝[A0-(A1-A2)]/A0×100％，其中，A0为对照实验(水代替样品溶液)的吸光值；A1为样品实验的吸光值；A2为样品干扰实验(无水乙醇代替DPPH·乙醇溶液)的吸光值。
SaWPrp对DPPH·的清除作用见图6。结果显示，在实验浓度范围内，SaWPrp对DPPH·有较强的清除作用，随着浓度的升高，清除作用也逐渐加强，当SaWPrp浓度为3.2mg/mL时，对DPPH·的清除率为92.41％，基本达到Vc的清除水平。
三、脱蛋白血满草多糖SaWPrp对ABTS+·清除能力的测定
1、将5.0mL的7mmo1/L ABTS和88.0μL的140mmo1/L过硫酸钾混合，在室温、避光的条件下静置12-24h，形成ABTS+·自由基储备液。该储备液在室温、避光的条件下稳定。使用前用无水乙醇稀释成工作液，要求其30℃、734nm波长下的吸光度为0.7±0.02。
取不同浓度的SaWPrp水溶0.1mL于试管中，加入2.0mL ABTS+·乙醇溶液，震荡30s，在20℃下测定反应液在734nm处6min内的吸光值变化，Vc作为阳性对照，重复3次，然后按下式计算清除率：ABTS+·清除率(％)＝[A0-(A1-A2)]/A0×100％，其中，A0为对照实验(水代替样品溶液)的吸光值；A1为样品实验的吸光值；A2为样品干扰实验(无水乙醇代替ABTS+·乙醇溶液)的吸光值。
以Vc作为阳性对照，SaWPrp对ABTS+·的清除作用见图7。SaWPrp对ABTS+·表现出较强的清除作用，清除能力与其浓度呈正相关，当SaWPrp浓度为1.6mg/mL时，对ABTS+·的清除率为58.27％。
2、SaWPrp对·OH清除能力的测定
在试管中分别加入0.8mmol/L的邻二氮菲乙醇溶液1.0mL，0.15mol/LpH7.5的PBS1.0mL，0.8mmol/L的FeSO4 1.0mL，混匀，再加入不同浓度的SaWPrp水溶1.0mL，混匀，最后加入1.0mmol/L的H2O2 1.0mL，混匀，于536nm处测定吸光度A，Vc作为阳性对照，重复3次，然后按下式计算清除率：·OH清除率(％)＝[(A2-A1)/(A0-A1)]×100％，其中：A0为正常管(蒸馏水代替样品溶液和H2O2)的吸光值，A1为阴性对照管(蒸馏水代替样品溶液)吸光值，A2为样品管吸光值。
以Vc作为阳性对照，SaWPrp对·OH的清除作用见图8。SaWPrp具有一定的·OH清除能力，随着浓度的增加，其清除·OH的能力增强，在试验浓度范围内呈现良好的量效关系。
如在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定成分或方法。本领域技术人员应可理解，不同地区可能会用不同名词来称呼同一个成分。本说明书及权利要求并不以名称的差异来作为区分成分的方式。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。“大致”是指在可接收的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明本申请的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系统中还存在另外的相同要素。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种血满草多糖的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)预处理：取血满草叶片粉末于圆底烧瓶中，加入石油醚，回流脱脂，挥干石油醚，再经95％的乙醇回流脱除醇溶性杂质，挥干乙醇；
2)取预处理过的血满草叶片粉末于试管中，以蒸馏水作为提取剂，进行浸提，得到血满草叶多糖提取液；
3)血满草叶多糖提取液经离心，将上清液浓缩得到浓缩液，加入无水乙醇至终浓度为80％(v/v)，醇沉，离心，取沉淀，冷冻干燥得到血满草叶粗多糖；
4)用蒸馏水将血满草叶粗多糖配成质量浓度为5％的溶液，将Sevage试剂按血满草叶粗多糖溶液总体积的1/4加入到血满草叶粗多糖溶液中，剧烈震荡，离心，去除游离蛋白形成的凝胶状沉淀，重复多次，至无游离蛋白为止，上清液透析，浓缩，冻干，得到脱蛋白血满草多糖。
2.根据权利要求1所述的血满草多糖的提取方法，其特征在于，所述步骤1)中的石油醚的用量为血满草叶片粉末体积的3-5倍；回流脱脂次数为3-5次，每次2-4h；回流脱除醇溶性杂质的次数为3-5次，每次2-4h。
3.根据权利要求1所述的血满草多糖的提取方法，其特征在于，步骤2)中提取温度为70-90℃。
4.根据权利要求1所述的血满草多糖的提取方法，其特征在于，步骤2)中提取时间为60-150min。
5.根据权利要求1所述的血满草多糖的提取方法，其特征在于，步骤2)中水料比为25-40mL/g。
6.根据权利要求1所述的血满草多糖的提取方法，其特征在于，步骤2)中提取次数为2-5次。
7.根据权利要求1所述的血满草多糖的提取方法，其特征在于，步骤3)中离心转速为3500-4500r/min，离心时间为5-15min；浓缩液的体积与预处理过的血满草叶片粉末的体积质量比为5∶1-15∶1mL/g；醇沉温度为3-5℃，醇沉时间为12-24h；冷冻干燥温度为-45--60℃。
8.根据权利要求1所述的血满草多糖的提取方法，其特征在于，步骤4)中Sevage试剂为体积比为4∶1的氯仿和正丁醇的混合物。
9.根据权利要求1所述的血满草多糖的提取方法，其特征在于，步骤4)中剧烈震荡时间为1-2h，转速为280-320r/min；离心转速为3500-4500r/min，离心时间为5-15min。
10.一种由权利要求1-9中任一权利要求所述的提取方法制备得到的血满草多糖。
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