CN103285027B - 血红铆钉菇菌丝体多糖在制备降血糖药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属食用菌资源开发领域，具体涉及血红铆钉菇菌丝体多糖在制备降血糖药物中的应用，以血红铆钉菇菌丝体为原料，按如下步骤依次实施：（1）去离子水煮提；过滤提取物，过滤所得残渣，合并提取液；离心除沉淀，向上清液中加入乙醇；收集沉淀，干燥后即得血红铆钉菇菌丝体粗多糖；（2）加入Sevag试剂；离心去除蛋白层和氯仿层，水层重复操作至不再出现蛋白层为止；（3）将脱蛋白血红铆钉菇菌丝体多糖溶于去离子水中，分离，洗脱。本发明所涉及的血红铆钉菇菌丝体多糖，可显著降低机体血糖含量，目标产物改善代谢紊乱，可制备具有降血糖作用血红铆钉菇菌丝体多糖的各种制剂。
Description
技术领域
本发明属食用菌资源开发领域，具体涉及一种血红铆钉菇菌丝体多糖的降血糖的应用。
背景技术
血红铆钉菇[(Chroogomphis rutillus (schaeff.:Fr.) O.K. Miller]是红蘑学名，东北地区俗称红蘑、松树伞、松蘑等。红蘑在真菌分类上属于担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、铆钉菇科、铆钉菇属。夏秋季在松林地上单生或群生。肉质肥嫩、鲜美可口，不但风味极佳、香味诱人，而且营养丰富，有“食用菌之王”的美称，不亚于猴头、灵芝，欧美尤视之为珍品，是东北地区重要的野生食用菌之一。血红铆钉菇在健胃、防病和抗癌方面都有着较好的辅助治疗作用，还有防止过早衰老的功效。由于目前人们对血红铆钉菇的培养条件了解有限，在人工条件下无法使其生成子实体，尚未见人工栽培。虽然如此，仍可通过液体发酵的手段获得其菌丝体，菌丝体虽然不能直接食用，但仍然可从菌丝体中提取到与野生血红铆钉菇相同的有效成分。
糖尿病是血中胰岛素绝对或相对不足，导致血糖过高，出现糖尿，进而引起脂肪和蛋白质代谢紊乱，临床上可出现多尿、烦渴、多饮、多食，消瘦等表现，重者容易发生酮症酸中毒等急性并发症或血管、神经等慢性并发症。随着社会的日益发展，人们的生活水平日益提高，我国糖尿病的发病率也在逐年上升。一项来自国际糖尿病联盟的统计数据显示，中国糖尿病患病率近10年翻了近两倍。2010年，中国成人糖尿病患病率为9.7%，患者总数已超过9000万，成为世界第一糖尿病大国；同时，糖尿病前期的糖耐量受损人群达到了1.48亿人，患病率为15.5%。数据还显示，目前全球糖尿病患者为3.66亿，预计到2030年将达到5.52亿，相当于每10秒钟增加一名糖尿病患者或每年增加1000万名患者。糖尿病作为一种重要的非传染性疾病，如不加以合理监测和治疗，糖尿病患者的长期高血糖状态可致全身多系统损害，引起各种急慢性并发症，包括心血管疾病、糖尿病肾病、糖尿病神经性病变、糖尿病足及截肢、糖尿病视网膜病变等。
糖尿病分1型糖尿病(type 1 diabetes) 和2 型糖尿病(type 2 diabetes)。其中1型糖尿病多发生于青少年，其胰岛素分泌缺乏，必须依赖胰岛素治疗维持生命。2型糖尿病多见于30岁以后中、老年人，其胰岛素的分泌量并不低甚至还偏高，病因主要是机体对胰岛素不敏感(即胰岛素抵抗)。据统计，2型糖尿病占糖尿病的80%，而有50%新诊断的2型糖尿病患者已存在一种或一种以上的慢性并发症，有些患者是因为并发症才发现患糖尿病的。
我国作为世界上主要的发展中国家，如何作好糖尿病的预防、治疗和管理工作，已经成为一个重要社会问题。长远来看，要做到彻底征服糖尿病，实现持久达标，全面改善代谢紊乱纠正糖尿病治疗的低达标率现状任重而道远。
发明内容
本发明以2型糖尿病为模型，旨在提供一种血红铆钉菇菌丝体多糖在制备降血糖药物中的应用。
为解决上述技术问题，本发明可以通过以下步骤实现。
血红铆钉菇菌丝体多糖在制备降血糖药物中的应用；所述血红铆钉菇菌丝体多糖按如下步骤依次实施。
（1）血红铆钉菇菌丝体粗多糖提取。
a1干燥血红铆钉菇菌丝体经粉碎后用去离子水煮提。
b1过滤提取物，过滤所得残渣，再重复提取，合并提取液。
c1离心除沉淀，浓缩上清液，向上清液中加入乙醇，静止沉淀。
d1离心收集沉淀，干燥后即得血红铆钉菇菌丝体粗多糖。
（2）Sevag法脱蛋白。
a2向血红铆钉菇菌丝体多糖水溶液中加入Sevag试剂。
b2离心去除蛋白层和氯仿层，水层重复操作至不再出现蛋白层为止，所得水溶液经透析和冷冻干燥得到脱蛋白血红铆钉菇菌丝体多糖。
（3）血红铆钉菇菌丝体多糖的分级。
将脱蛋白血红铆钉菇菌丝体多糖溶于去离子水中，分离，洗脱；收集中性血红铆钉菇菌丝体多糖和血红铆钉菇菌丝体酸性多糖级分。
作为一种优选方案，本发明所述步骤（1）中，3500～4500转/分离心10～25分钟除沉淀，浓缩上清液温度70～85℃；3500～4500转/分离心10～25分钟收集沉淀。
作为另一种优选方案，本发明所述步骤（2）中，Sevag试剂包括正丁醇及氯仿；其中：正丁醇与氯仿的体积比为：1：4；3500～4500转/分离心10～25分钟，去除蛋白层和氯仿层。
进一步地，本发明所述步骤 （1）中，干燥血红铆钉菇菌丝体经粉碎后用去离子水100℃煮提3小时；过滤提取物，过滤所得残渣，再重复提取2次，合并两次提取液；离心除沉淀，浓缩上清液，向浓缩上清液中加入3倍体积95%乙醇，沉淀过夜；离心收集沉淀。
更进一步地，本发明所述步骤 （2）中，向10%血红铆钉菇菌丝体多糖水溶液中加入Sevag试剂充分振荡2小时。
更近一步地，本发明所述步骤 （3）中，将5%脱蛋白血红铆钉菇菌丝体多糖经DEAE-纤维素离子交换层析柱分级；3倍柱体积的去离子水洗脱，收集洗脱液经去离子水透析、冷冻干燥得到中性多糖级分，3倍柱体积的0.4M氯化钠水溶液洗脱，收集洗脱液经去离子水透析、冷冻干燥得到酸性多糖级分。
本发明方法制得的血红铆钉菇菌丝体中性多糖和血红铆钉菇菌丝体酸性多糖分别经Sepharose CL-6B 凝胶洗脱均鉴定为单一组分。其中中性多糖单糖组成为Glc：Xyl = 0.46：1，分子量为2.9×104~4.5×104左右；中性多糖单糖组成为Glc：Xyl：GlcUA= 0.63：1：0.05，分子量为2.6×104~4.2×104左右。血红铆钉菇菌丝体中性多糖和酸性多糖可用混合或分别单独制成口服制剂、针剂、粘膜吸收、透皮吸收等剂型。
本发明所涉及的血红铆钉菇菌丝体多糖，可显著降低机体血糖含量，目标产物改善代谢紊乱，可制备具有降血糖作用血红铆钉菇菌丝体多糖的各种制剂，本发明保留了血红铆钉菇菌丝体多糖的活性，并提高了血红铆钉菇菌丝体多糖降血糖活性成分的纯度。
血红铆钉菇菌丝体多糖降糖实验。
1、血红铆钉菇菌丝体多糖降糖实验。
从100只ICR小鼠中随机取10只作为空白对照组，其余小鼠禁食12小时后，按180mg/kg 剂量腹腔注射链脲佐菌素溶液。72小时后，尾静脉采血，测定禁食12小时后小鼠血糖值，取血糖值大于15.0mmol/L的小鼠为成型的糖尿病小鼠。将糖尿病模型小鼠分为8组，每组10 只，模型对照组灌胃给去离子水，阳性对照组灌胃给格列本脲，其余6组为多糖实验组。给别给予血红铆钉菇菌丝体多糖剂量12.5、25、50、100、200和400mg/kg。每天灌胃给药1次，连续10天，第10次给药后所有小鼠禁食12小时后，测定血糖含量。实验结果见表1。
表1 血红铆钉菇菌丝体多糖对糖尿病小鼠血糖的影响。
注：与模型组比较：*，p＜0.05；**，p＜0.01。
由表1可知，糖尿病小鼠经灌胃给药10 天后，血红铆钉菇菌丝体多糖和阳性对照组均能显著降低小鼠血糖值，其中多糖200mg/kg 实验组能够极显著降低小鼠血糖并达到正常值，说明血红铆钉菇菌丝体多糖在口服的情况下即可以实现其降血糖功能。
2、血红铆钉菇菌丝体酸性多糖与中性多糖的降糖实验。
按照200mg血红铆钉菇菌丝体多糖经DEAE纤维素离子交换层析的分离比例，将血红铆钉菇菌丝体中性多糖和血红铆钉菇菌丝体酸性多糖做降糖分析。从100只ICR小鼠中随机取10只作为空白对照组，其余小鼠禁食12小时后，按180mg/kg 剂量腹腔注射链脲佐菌素溶液。72小时后，尾静脉采血，测定禁食12小时后小鼠血糖值，取血糖值大于15.0mmol/L的小鼠为成型糖尿病小鼠。将糖尿病模型小鼠分为4组，每组10 只，模型对照组灌胃给去离子水，阳性对照组灌胃给格列本脲，多糖组分别设中性多糖组(70mg/kg)组和酸性多糖组(100mg/kg)实验组。每天灌胃给药1次，连续10天，第10次给药后所有小鼠禁食12小时后，测定血糖含量。实验结果见表2。
表2 血红铆钉菇菌丝体酸性多糖和中性多糖对糖尿病小鼠血糖的影响。
注：与模型组比较：*，p＜0.05；**，p＜0.01。
从表2 可知，灌胃10 天后，多糖和阳性对照组均能显著降低糖尿病小鼠的血糖值，其中中性多糖70mg/kg 组能够极显著降低小鼠的血糖，并可能够达到正常值，说明血红铆钉菇菌丝体多糖在口服的情况下具有降血糖的作用的主要组分为中性多糖部分。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。本发明的保护范围不仅局限于下列内容的表述。
图1为血红铆钉菇菌丝体多糖的离子交换层析图。
图2为血红铆钉菇菌丝体中性多糖的Sepharose CL-6B 凝胶层析图。
图3为血红铆钉菇菌丝体酸性多糖的Sepharose CL-6B 凝胶层析图。
具体实施方式
按如下步骤依次实施制备。
（1）称取干燥血红铆钉菇菌丝体500 克，用10 升去离子水100℃提取3 小时，提取物经尼龙布过滤；过滤得到的残渣在相同操作条件下重复提取2次。合并3次提取液，4000转/分离心15分钟除沉淀，上清液80℃浓缩至1.2升。向上清液中加入3倍体积的95%乙醇，静止沉淀过夜。4000转/分离心15分钟离心收集沉淀，95％乙醇、无水乙醇、乙醚依次充分搅拌后离心，沉淀50℃干燥后得到92.5 克血红铆钉菇菌丝体粗多糖。
（2）称取血红铆钉菇菌丝体粗多糖90克，溶解于1800毫升去离子水中，加入450毫升Sevag 试剂(正丁醇：氯仿＝1：4，v/v)，充分震荡2小时，4000转/分离心10分钟，去除蛋白层和氯仿层。水层重复操作至不再出现蛋白层为止，所得水溶液经透析和冷冻干燥得到脱蛋白血红铆钉菇菌丝体多糖(73.6克)。
（3）将脱蛋白血红铆钉菇菌丝体多糖(10克)溶于去离子水(100毫升)中，用DEAE-纤维素离子交换柱(2.0×20cm)分离。依次用800毫升去离子水和800毫升0.4M 氯化钠洗脱，洗脱液流速为10毫升/分钟，每20 毫升洗脱液收集一管，经由苯酚硫酸法检测，分别收集收集中性多糖和酸性多糖级分，中性多糖直接冷冻干燥得到血红铆钉菇菌丝体中性多糖(4.1克)，酸性多糖级分经去离子水透析24小时后，冷冻干燥得到血红铆钉菇菌丝体酸性多糖(4.7克)。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.血红铆钉菇菌丝体多糖在制备降血糖药物中的应用，其特征在于，所述血红铆钉菇菌丝体多糖按如下步骤依次实施：
（1）称取干燥血红铆钉菇菌丝体500 克，用10 升去离子水100℃提取3 小时，提取物经尼龙布过滤；过滤得到的残渣在相同操作条件下重复提取2次；合并3次提取液，4000转/分离心15分钟除沉淀，上清液80℃浓缩至1.2升；向上清液中加入3倍体积的95%乙醇，静止沉淀过夜；4000转/分离心15分钟离心收集沉淀，95％乙醇、无水乙醇、乙醚依次充分搅拌后离心，沉淀50℃干燥后得到92.5 克血红铆钉菇菌丝体粗多糖；
（2）称取血红铆钉菇菌丝体粗多糖90克，溶解于1800毫升去离子水中，加入450毫升Sevag 试剂；正丁醇：氯仿＝1：4，v/v；充分震荡2小时，4000转/分离心10分钟，去除蛋白层和氯仿层；水层重复操作至不再出现蛋白层为止，所得水溶液经透析和冷冻干燥得到73.6克脱蛋白血红铆钉菇菌丝体多糖；
（3）将10克脱蛋白血红铆钉菇菌丝体多糖溶于100毫升去离子水中，用2.0×20cm DEAE-纤维素离子交换柱分离；依次用800毫升去离子水和800毫升0.4M 氯化钠洗脱，洗脱液流速为10毫升/分钟，每20 毫升洗脱液收集一管，经由苯酚硫酸法检测，分别收集中性多糖和酸性多糖级分，中性多糖直接冷冻干燥得到4.1克血红铆钉菇菌丝体中性多糖，酸性多糖级分经去离子水透析24小时后，冷冻干燥得到4.7克血红铆钉菇菌丝体酸性多糖。
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