CN104818312B - 一种核桃活性多肽提取物的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于中药提取物的制备技术领域，具体公开了一种核桃活性多肽提取物的制备方法及应用。本发明制备方法的具体步骤包括：去皮核桃仁用碱溶酸沉法提取、离心、冷冻干燥后获得核桃蛋白冻干粉，依次加入中性蛋白酶、碱性蛋白酶酶解，离心取上清液，稀释后用凝胶层析分离，收集分子量3000‑1000 D的组分，冷冻干燥即得核桃活性多肽冻干粉。本发明采用复合酶酶解和凝胶色谱方法制备核桃活性多肽，具有条件温和、工艺简单、安全性高、绿色环保等优点；所制备的核桃活性多肽具有明显的口服降糖、降脂作用，可以用于制备糖尿病、高血脂的预防和治疗药物或保健食品及食品。
Description
技术领域
本发明涉及中药提取物的制备技术领域，具体涉及一种核桃活性多肽提取物的制备方法及应用。
背景技术
生物活性肽的制备，通常有三种方式：一是从自然界的生物体中直接提取其本身固有的天然活性肽；二是通过蛋白质降解获得具有生理功能的活性肽；三是利用化学、酶合成和重组DNA法合成法制备生物活性肽。但由于直接提取法和化学合成法存在产量低、成本高、污染大等缺点，因此采用酶法水解蛋白来制备生物活性肽是一种比较合理的途径，具有条件温和、工艺简单、安全性高、对蛋白质和多肽的品种影响小、无有机溶剂污染等明显的优越性。
核桃(Juglans regia L.)又名胡桃、羌桃，《神农本草经》将其列为久服轻身益气、延年益寿的上品。《本草纲目》记述，核桃仁有“补气养血，润燥化痰，益命门，处三焦，温肺润肠，治虚寒喘咳，腰脚重疼”等功效。
目前临床常用糖尿病药物长期服用会产生耐药性、抗药性、肝肾损伤等副作用，同时伴有体重增加、低血糖等不良反应，而生物多肽类药物具有活性好、疗效高、分子量小、副作用少等独特的优势，为糖尿病的预防和治疗开辟了新的思路。核桃仁中蛋白质含量丰富，结合现代化学与药理研究成果，对核桃多肽类成分加以开发利用，发掘糖尿病防治新药，将拓展核桃资源的应用范围。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明的第一个目的是提供了一种核桃活性多肽提取物的制备方法，该方法通过碱溶酸沉获得核桃蛋白，通过复合酶酶解、凝胶层析、冷冻干燥等步骤从核桃中获得核桃活性多肽提取物。
本发明的另一个目的是提供了一种上述方法制备的核桃活性多肽提取物在制备糖尿病、高血脂的预防和治疗药物或保健食品及食品中的应用。
本发明的第一个目的通过如下技术方案来实现：
一种核桃活性多肽提取物的制备方法，步骤如下：
(1)取核桃仁，加0.4-0.8w/w％NaOH溶液浸泡20-40分钟，取出核桃仁，去皮，粉碎成核桃仁粗粉；
优选的，所述NaOH浓度为0.6w/w％，浸泡时间为30分钟；
(2)向步骤(1)所得核桃仁粗粉中加入4-8倍重量的0.4-0.8w/w％NaOH溶液浸泡过夜，冷冻离心，收集中间水层，然后用0.1mol/L HCl调节pH至4.0-4.5，冷冻离心，收集沉淀，冷冻干燥，即得核桃蛋白冻干粉。
优选的，所述0.4-0.8w/w％NaOH溶液用量为核桃仁粗粉重量的6倍，NaOH溶液浓度为0.6w/w％；
优选的，步骤(2)中所述冷冻离心条件为4℃、4000转/分钟下离心30分钟；
经测定，在步骤(1)和(2)优选的条件下，所得的核桃蛋白冻干粉中蛋白质的含量为92.6w/w％。
(3)将步骤(2)所得核桃蛋白冻干粉用蒸馏水稀释至相当于含蛋白质2g/100mL的溶液，按酶底比1:(4-11)加入中性蛋白酶，用0.1mol/L HCl调节pH至7.0，在48℃下酶解0.5-1.5小时，灭酶，冷却至室温；
步骤(3)中所述酶底比为中性蛋白酶与核桃蛋白冻干粉中所含蛋白质的质量比；
所述中性蛋白酶的活力为60000u/g；
优选的，步骤(3)中所述酶底比为1:7.5；
优选的，步骤(3)中所述酶解时间为1小时；
优选的，步骤(3)中所述灭酶条件为95℃、15分钟；
(4)向步骤(3)所得溶液中按酶底比1:(4-8)加入碱性蛋白酶，用0.1mol/L NaOH调节pH至9.0，在55℃下酶解1-3小时，灭酶，冷却至室温，冷冻离心，收集上清液；
所述酶底比为碱性蛋白酶与步骤(2)所得核桃蛋白冻干粉中所含蛋白质的质量比；
所述碱性蛋白酶的活力为60000u/g；
优选的，步骤(4)中所述酶底比为1:6；
优选的，步骤(4)中所述酶解时间为2小时；
优选的，步骤(4)中所述灭酶条件为95℃、15分钟；
优选的，步骤(4)中所述冷冻离心条件为4℃、4000转/分钟下离心30分钟；
(5)将步骤(4)收集的上清液用蒸馏水稀释至为含多肽3-7mg/mL的溶液(命名为“稀释液”)，用葡聚糖凝胶层析分离，收集分子量3000-1000D的组分，冷冻干燥，即得到核桃活性多肽提取物冻干粉。
优选的，将步骤(4)收集的上清液用蒸馏水稀释至为含多肽5mg/mL的溶液，用葡聚糖凝胶层析分离的条件为：凝胶色谱柱(Superdex Peptide 10/300GL)，流动相为0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4，含0.15mol/L NaCl)，流速0.5mL/min；经峰面积计算，收集的分子量3000-1000D的组分占前述稀释液总质量的82.7-94.7％，得到的核桃活性多肽提取物冻干粉中总多肽含量为43.4-53.6w/w％。
根据上述制备方法得到的核桃活性多肽提取物，可用于制备预防或治疗糖尿病、高血脂的药物或保健食品及食品。
与现有技术相比，本发明的优点和有益效果在于：
本发明提高了核桃资源的利用率，开辟了其新的药用、食用途径。本发明所得的核桃活性多肽提取物具有明显的口服预防和治疗糖尿病、高血脂的作用。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明的核桃活性多肽提取物的制备方法及其应用。
以下实施例中所用核桃仁均为常规市售中药材及干果食品。
以下实施例中所用中性蛋白酶的活力为60000u/g(100g/瓶，武汉市华顺生物技术有限公司)。
以下实施例中所用碱性蛋白酶的活力为60000u/g(100g/瓶，武汉市华顺生物技术有限公司)。
以下实施例中所用葡聚糖凝胶层析柱均为：Superdex Peptide 10/300GL(GE公司)。
实施例1：
一种核桃活性多肽提取物的制备方法，步骤如下：
(1)取核桃仁，加入0.6w/w％NaOH溶液浸泡30min，取出核桃仁，去皮，粉碎成核桃仁粗粉；
(2)向核桃仁粗粉中加入其4倍重量的0.6w/w％NaOH溶液浸泡过夜，4℃、4000转/分钟下离心30分钟，收集中间水层，然后用0.1mol/L HCl调节pH至4.0-4.5，在4℃、4000转/分钟下离心30分钟，收集沉淀，冷冻干燥，即得核桃蛋白冻干粉。经测定，所得核桃蛋白冻干粉中蛋白质含量为88.7w/w％。
(3)将核桃蛋白冻干粉用蒸馏水稀释至相当于含蛋白质2g/100mL，按酶底比1:7.5加入中性蛋白酶，用0.1mol/L HCl调节pH至7.0，在48℃下酶解0.5小时，95℃、15分钟灭酶，冷却至室温；
(4)向步骤(3)所得溶液中按酶底比1:6加入碱性蛋白酶，用0.1mol/L NaOH调节pH至9.0，在55℃下酶解1小时，95℃、15分钟灭酶，冷却至室温，然后在4℃、4000转/分钟下离心30分钟，收集上清液；
(5)将步骤(4)收集的上清液用蒸馏水稀释成含多肽3mg/mL的溶液，用葡聚糖凝胶层析(Superdex Peptide 10/300GL柱，流动相为0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4，含0.15mol/L NaCl)，流速0.5mL/min，进样量0.5mL，检测波长280nm)分离，收集分子量3000-1000D的组分。经峰面积计算，所收集的组分占总面积的85.3％，将收集的分子量3000-1000D的组分冷冻干燥，即得到核桃活性多肽提取物冻干粉，总多肽含量为48.6w/w％。
实施例2：
一种核桃活性多肽提取物的制备方法，步骤如下：
(1)取核桃仁，加入0.8w/w％NaOH溶液浸泡20min，取出核桃仁，去皮，粉碎成核桃仁粗粉；
(2)向核桃仁粗粉中加入其6倍重量的0.6w/w％NaOH溶液浸泡过夜，4℃、4000转/分钟下离心30分钟，收集中间水层，然后用0.1mol/L HCl调节pH至4.0-4.5，在4℃、4000转/分钟下离心30分钟，收集沉淀，冷冻干燥，即得核桃蛋白冻干粉。经测定，所得核桃蛋白冻干粉中蛋白质含量为90.1w/w％；
(3)将核桃蛋白冻干粉用蒸馏水稀释至相当于含蛋白质2g/100mL的溶液，按酶底比1:7.5加入中性蛋白酶，用0.1mol/L HCl调节pH至7.0，在48℃下酶解1小时，95℃、15分钟灭酶，冷却至室温；
(4)向步骤(3)所得溶液中按酶底比1:11加入碱性蛋白酶，用0.1mol/L NaOH调节pH至9.0，在55℃下酶解2小时，95℃、15分钟灭酶，冷却至室温，然后在4℃、4000转/分钟下离心30分钟，收集上清液；
(5)将步骤(4)收集的上清液用蒸馏水稀释成含多肽5mg/mL的溶液，用葡聚糖凝胶层析(Superdex Peptide 10/300GL柱，流动相为0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4，含0.15mol/L NaCl)，流速0.5mL/min，进样量0.5mL，检测波长280nm)分离，收集分子量3000-1000D的组分。经峰面积计算，所收集的组分占总面积的89.1％，将收集的分子量3000-1000D的组分冷冻干燥，即得到核桃活性多肽提取物冻干粉，总多肽含量为46.5w/w％。
实施例3：
一种核桃活性多肽提取物的制备方法，步骤如下：
(1)取核桃仁，加入0.8w/w％NaOH溶液浸泡40min，取出核桃仁，去皮，粉碎成核桃仁粗粉；
(2)向核桃仁粗粉中加入其8倍重量的0.6w/w％NaOH溶液浸泡过夜，4℃、4000转/分钟下离心30分钟，收集中间水层，然后用0.1mol/L HCl调节pH至4.0-4.5，在4℃、4000转/分钟下离心30分钟，收集沉淀，冷冻干燥，即得核桃蛋白冻干粉。经测定，所得核桃蛋白冻干粉中蛋白质含量为91.3w/w％；
(3)将核桃蛋白冻干粉用蒸馏水稀释至相当于含蛋白质2g/100mL的溶液，按酶底比1:11加入中性蛋白酶，用0.1mol/L HCl调节pH至7.0，在48℃下酶解1.5小时，95℃、15分钟灭酶，冷却至室温；
(4)向步骤(3)所得溶液中按酶底比1:8加入碱性蛋白酶，用0.1mol/L NaOH调节pH至9.0，在55℃下酶解3小时，95℃、15分钟灭酶，冷却至室温，然后在4℃、4000转/分钟下离心30分钟，收集上清液；
(5)将步骤(4)收集的上清液用蒸馏水稀释成含多肽7mg/mL的溶液，用葡聚糖凝胶层析(Superdex Peptide 10/300GL柱，流动相为0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4，含0.15mol/L NaCl)，流速0.5mL/min，进样量0.5mL，检测波长280nm)分离，收集分子量3000-1000D的组分。经峰面积计算，所收集的组分占总面积的82.7％，将收集的分子量3000-1000D的组分冷冻干燥，即得到核桃活性多肽提取物冻干粉，总多肽含量为43.4w/w％。
实施例4：
一种核桃活性多肽提取物的制备方法，步骤如下：
(1)取核桃仁，加入0.6w/w％NaOH溶液浸泡40min，取出核桃仁，去皮，粉碎成核桃仁粗粉；
(2)向核桃仁粗粉中加入其4倍重量的0.6w/w％NaOH溶液浸泡过夜，4℃、4000转/分钟下离心30分钟，收集中间水层，然后用0.1mol/L HCl调节pH至4.0-4.5，在4℃、4000转/分钟下离心30分钟，收集沉淀，冷冻干燥，即得核桃蛋白冻干粉。经测定，所得核桃蛋白冻干粉中蛋白质含量为90.5w/w％；
(3)将核桃蛋白冻干粉用蒸馏水稀释至相当于含蛋白质2g/100mL的溶液，按酶底比1:7.5加入中性蛋白酶，用0.1mol/L HCl调节pH至7.0，在48℃下酶解1小时，95℃、15分钟灭酶，冷却至室温；
(4)向步骤(3)所得溶液中按酶底比1:8加入碱性蛋白酶，用0.1mol/L NaOH调节pH至9.0，在55℃条件下酶解2小时，95℃、15分钟灭酶，冷却至室温，然后在4℃、4000转/分钟下离心30分钟，收集上清液；
(5)将步骤(4)收集的上清液用蒸馏水稀释成含多肽3mg/mL的溶液，用葡聚糖凝胶层析(Superdex Peptide 10/300GL柱，流动相为0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4，含0.15mol/L NaCl)，流速0.5mL/min，进样量0.5mL，检测波长280nm)分离，收集分子量3000-1000D的组分。经峰面积计算，所收集的组分占总面积的88.5％，将收集的分子量3000-1000D的组分冷冻干燥，即得到核桃活性多肽提取物冻干粉，总多肽含量为50.8w/w％。
实施例5：
一种核桃活性多肽提取物的制备方法，步骤如下：
(1)取核桃仁，加入0.6w/w％NaOH溶液浸泡30min，取出核桃仁，去皮，粉碎成核桃仁粗粉；
(2)向核桃仁粗粉中加入其6倍重量的0.6w/w％NaOH溶液浸泡过夜，4℃、4000转/分钟下离心30分钟，收集中间水层，然后用0.1mol/L HCl调节pH至4.0-4.5，在4℃、4000转/分钟下离心30分钟，收集沉淀，冷冻干燥，即得核桃蛋白冻干粉。经测定，所得核桃蛋白冻干粉中蛋白质含量为92.6w/w％；
(3)将核桃蛋白冻干粉用蒸馏水稀释至相当于含蛋白质2g/100mL的溶液，按酶底比1:7.5加入中性蛋白酶，用0.1mol/L HCl调节pH至7.0，在48℃下酶解1小时，95℃、15分钟灭酶，冷却至室温；
(4)向步骤(3)所得溶液中按酶底比1:6加入碱性蛋白酶，用0.1mol/L NaOH调节pH至9.0，在55℃条件下酶解2小时，95℃、15分钟灭酶，冷却至室温，然后在4℃、4000转/分钟下离心30分钟，收集上清液；
(5)将步骤(4)收集的上清液用蒸馏水稀释成含多肽5mg/mL的溶液，用葡聚糖凝胶层析(Superdex Peptide 10/300GL柱，流动相为0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4，含0.15mol/L NaCl)，流速0.5mL/min，进样量0.5mL，检测波长280nm)分离，收集分子量3000-1000D的组分。经峰面积计算，所收集的组分占总面积的94.7％，将收集的分子量3000-1000D的组分冷冻干燥，即得到核桃活性多肽提取物冻干粉，总多肽含量为53.6w/w％。
实施例6：
用上述实施例5制备得到的核桃活性多肽提取物进行药理实验、药理结果与分析，以证明本发明方法制得的核桃活性多肽提取物具有血糖升高的干预作用和高血糖及高血脂的治疗作用，可以应用于制备预防或治疗糖尿病、高血脂的药物或保健食品及食品。
核桃活性多肽提取物预防和治疗糖尿病的实验研究：
造模方法：选用SPF级健康昆明种小鼠(18-22g)，尾静脉注射四氧嘧啶(ALX)120mg/kg，第三天按相同方法再注射ALX 80mg/kg，72小时后测定小鼠空腹血糖。以血糖值>10.0mmol/L为造模成功。
实验方法：昆明小鼠雌雄各半。禁食12小时后，造模，取血糖值>10.0mmol/L的小鼠为糖尿病鼠。实验组1和2小鼠灌胃核桃蛋白(300mg/kg)(核桃蛋白为实施例5步骤(2)所得核桃蛋白冻干粉)，实验组3和4小鼠灌胃核桃活性多肽提取物(100mg/kg)，模型组以等量蒸馏水代替。各组1次/天，连续给药7天，测空腹血糖值，结果见表1。
表1核桃蛋白及核桃活性多肽提取物对血糖升高的干预和治疗作用(mmol/L,n＝10,)
注：*与实验前比较p<0.05，△与灌胃前比较p<0.05，#与对照组造模后比较p<0.05
由表1可知，实验组1和3的结果表明，横向对比ALX直接造模(对照组，差值8.9±3.4)和先灌胃核桃蛋白或核桃活性多肽提取物再造模，显示核桃蛋白及核桃活性多肽提取物对造模有干预，可显著降低造模血糖(p<0.05)；对比造模成功后(实验组2和4)连续7天灌胃核桃蛋白或核桃活性多肽提取物前后血糖，分析可知核桃蛋白及核桃活性多肽提取物均可降低造模后血糖(p<0.05)，对高血糖小鼠有显著治疗作用；纵向分析可知，核桃活性多肽提取物与核桃蛋白比较，降糖活性显著增强，干预作用分别为：40.5％和27.2％；治疗作用分别为：40.6％和18.9％。
实施例7：
用上述实施例5制备得到的核桃活性多肽提取物进行药理实验、药理结果与分析，以证明本发明方法制得的核桃活性多肽提取物具有明显的口服降糖、降脂作用，可以应用于制备预防和治疗糖尿病、高血脂的药物或保健食品及食品。
核桃活性多肽提取物对糖尿病小鼠糖脂代谢的实验研究：
造模方法同实施例6。实验分为：正常对照组，模型对照组，阳性对照组(罗格列酮RSG，4mg/kg)，核桃活性多肽提取物组(50、100、200mg/kg)。各治疗组灌胃不同剂量的核桃活性多肽提取物，阳性对照组灌胃RSG，其它各对照组小鼠给药方式和剂量同实施例6，1次/天，连续给药14天。于末次给药2小时后测定小鼠餐后血糖水平，并于当晚禁食不禁水12小时，与次日早上摘眼球取血，分离血清，测定空腹血糖、丙二醛MDA、超氧化物歧化酶SOD和甘油三脂TG、总胆固醇TC的含量，结果见表2和3。
表2核桃活性多肽提取物对糖尿病小鼠血糖的影响()
注：与模型组比较，***p<0.001，**p<0.01
表3核桃活性多肽提取物对糖尿病小鼠血清MDA、SOD和TG、TC水平的影响()
注：与模型组比较，**p<0.01，*p<0.05
由表2可知，治疗14天后，核桃活性多肽提取物各剂量组与模型组相比空腹血糖值均有显著性下降(p<0.01)，表明本发明制备的核桃活性多肽提取物具有较好的降低糖尿病小鼠空腹血糖的作用，并存在剂量依赖性。另外，中、高剂量的核桃活性多肽提取物餐后2小时血糖基本都能恢复到餐前血糖水平，且比RSG效果好。以上结果表明，核桃活性多肽提取物高剂量组降糖作用优于其他各组，且无明显的毒副作用。
表3显示，与正常组相比，模型组小鼠MDA含量显著升高(p<0.01)、SOD活力显著下降(p<0.01)。与模型组相比，核桃活性多肽提取物各剂量组均能降低糖尿病小鼠血清MDA含量，呈剂量依赖性，且中、高剂量均具有显著性差异(p<0.05和p<0.01)，其效果优于阳性对照组；核桃活性多肽提取物各剂量组均能升高糖尿病小鼠血清SOD活力，表现出明显的剂量依赖性，且中、高剂量均具有显著性差异(p<0.05和p<0.01)，并优于阳性对照组。模型组小鼠血清TG、TC均显著高于正常组(p<0.01)，中、高剂量核桃活性多肽提取物可显著降低糖尿病小鼠血清TG和TC水平(p<0.05和p<0.01)，并具有一定的剂量依赖性，而阳性对照药物RSG几乎无降血脂作用。
Claims (6)
1.一种核桃活性多肽提取物在制备具有降糖和/或降脂作用的药物中的应用，所述核桃活性多肽提取物的制备方法步骤如下：
（1）取核桃仁，加0.4-0.8w/w% NaOH溶液浸泡20-40分钟，取出核桃仁，去皮，粉碎成核桃仁粗粉；
（2）向步骤（1）所得核桃仁粗粉中加入4-8倍重量的0.4-0.8w/w% NaOH溶液浸泡过夜，冷冻离心，收集中间水层，然后用0.1 mol/L HCl调节pH至4.0-4.5，冷冻离心，收集沉淀，冷冻干燥，即得核桃蛋白冻干粉；
（3）将步骤（2）所得核桃蛋白冻干粉用蒸馏水稀释至相当于含蛋白质2 g/100 mL的溶液，按酶底比1:（4-11）加入中性蛋白酶，用0.1 mol/L HCl调节pH至7.0，在48℃下酶解0.5-1.5小时，灭酶，冷却至室温；
步骤（3）中所述酶底比为中性蛋白酶与核桃蛋白冻干粉中所含蛋白质的质量比；
所述中性蛋白酶的活力为60000 u/g；
（4）向步骤（3）所得溶液中按酶底比1:（4-8）加入碱性蛋白酶，用0.1 mol/L NaOH调节pH至9.0，在55℃下酶解1-3小时，灭酶，冷却至室温，冷冻离心，收集上清液；
步骤（4）所述酶底比为碱性蛋白酶与步骤（2）所得核桃蛋白冻干粉中所含蛋白质的质量比；
所述碱性蛋白酶的活力为60000 u/g；
（5）将步骤（4）收集的上清液用蒸馏水稀释至为含多肽3-7 mg/mL的溶液，用葡聚糖凝胶层析分离，收集分子量3000-1000 D的组分，冷冻干燥，即得到核桃活性多肽提取物冻干粉。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤（1）中，所述NaOH浓度为0.6 w/w %，浸泡时间为30分钟。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤（2）中，所述0.4-0.8w/w% NaOH溶液用量为核桃仁粗粉重量的6倍，NaOH 溶液浓度为0.6w/w%。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤（3）中，所述酶底比为1:7.5；所述酶解时间为1小时；所述灭酶条件为95℃、15分钟。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤（4）中，所述酶底比为1:6；所述酶解时间为2小时；所述灭酶条件为95℃、15分钟。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述步骤（5）为将步骤（4）收集的上清液用蒸馏水稀释至为含多肽5 mg/mL的溶液，用葡聚糖凝胶层析分离的条件为：凝胶色谱柱为Superdex Peptide 10/300GL，流动相为0.2 mol/L的pH 7.4磷酸盐缓冲液，流速0.5 mL/min；所述0.2 mol/L的pH 7.4磷酸盐缓冲液中含有浓度为0.15 mol/L的 NaCl。
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