CN104818311B

CN104818311B - 一种洋葱活性多肽提取物的制备方法及应用

Info

Publication number: CN104818311B
Application number: CN201510242493.4A
Authority: CN
Inventors: 刘阳; 阮金兰; 周涵黎; 李丽; 马明兰; 谭珺隽; 张琳
Original assignee: Wuchang University of Technology
Current assignee: Wuchang University of Technology
Priority date: 2015-05-13
Filing date: 2015-05-13
Publication date: 2017-12-01
Anticipated expiration: 2035-05-13
Also published as: CN104818311A

Abstract

本发明属于中药提取物的制备技术领域，具体公开了一种洋葱活性多肽提取物的制备方法及应用。本发明制备方法的具体步骤包括：紫皮洋葱用酸溶醇沉法分离提取、冷冻干燥后获得洋葱蛋白冻干粉，依次加入酸性蛋白酶、胃蛋白酶酶解，离心取上清液，稀释后用凝胶层析分离，收集分子量3000‑1000 D的组分，冷冻干燥即得洋葱活性多肽冻干粉。本发明采用复合酶酶解和凝胶色谱方法制备洋葱活性多肽，具有条件温和、安全性高、成本低廉、产物易分离、绿色环保等优点；所制备的洋葱活性多肽具有明显的口服降糖、降脂作用，可以用于制备预防或治疗糖尿病、高血脂的药物或保健食品及食品。

Description

一种洋葱活性多肽提取物的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及中药提取物的制备技术领域，具体涉及一种洋葱活性多肽提取物的制备方法及应用。

背景技术

活性肽的制备方法主要有：天然活性肽的分离提取、食品蛋白质水解(包括酸水解、碱水解、酶水解)、化学合成法、基因重组法等。研究表明，在营养蛋白的多肽链内部可能普遍存在着功能区，选择适当的蛋白酶水解这些蛋白，可将活性多肽释放出来。与酸水解和碱水解相比，酶法水解蛋白具有条件温和、反应时间短、不产生消旋作用、不破坏氨基酸、产物纯度高、易分离、无污染等特点。而化学合成法和基因工程生产活性肽需要相当大的投入，其安全性也要进行研究。因此，酶法水解蛋白是目前制备生物活性肽的主要方法。

洋葱(Allium cepa L.)别名葱头、圆葱等，百合科、葱属二年生草本植物，被誉为“菜中皇后”，食用和药用价值较高。目前临床常用糖尿病药物长期服用会产生耐药性、抗药性、肝肾损伤等副作用，同时伴有体重增加、低血糖等不良反应，而生物多肽类药物具有活性好、疗效高、分子量小、副作用少等独特的优势，为糖尿病的预防和治疗开辟了新的思路。结合现代化学与药理研究成果，对洋葱多肽类成分加以开发利用，发掘新药，将拓宽洋葱物质资源的应用范围。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明的第一个目的是提供了一种洋葱活性多肽提取物的制备方法，该方法采用酸溶碱沉获得洋葱蛋白，然后通过复合酶酶解、凝胶层析、冷冻干燥等步骤从洋葱中获得活性多肽提取物。

本发明的另一个目的是提供了一种上述方法制备的洋葱活性多肽提取物在制备预防或治疗糖尿病、高血脂的药物、保健食品及食品中的应用。

本发明的第一个目的通过如下技术方案来实现：

一种洋葱活性多肽提取物的制备方法，步骤如下：

(1)取洋葱，切丁、匀浆，加入洋葱重量1-3倍的0.2mol/L pH 5.0-7.0的磷酸盐缓冲液浸泡，置于4℃冰箱12小时后，冷冻离心，上层即为洋葱蛋白粗提液；

优选的，所述洋葱为紫皮洋葱；

优选的，所述磷酸盐缓冲液pH为6.0，磷酸盐缓冲液用量为洋葱重量的2倍；

优选的，步骤(1)中所述冷冻离心条件为4℃、10000转/分钟下离心20分钟；

(2)向步骤(1)所得洋葱蛋白粗提液中缓慢加入其1/3-1倍体积的95v/v％乙醇，然后用0.6w/w％NaOH溶液调节pH至8.0，冰浴中静置过夜后，冷冻离心，收集沉淀，冷冻干燥即得洋葱蛋白冻干粉；

优选的，所述95v/v％乙醇用量为洋葱蛋白粗提液体积的0.5倍；

优选的，步骤(2)中所述冷冻离心条件为4℃、10000转/分钟下离心20分钟；

(3)向步骤(2)所得洋葱蛋白冻干粉中加入6-8倍重量的蒸馏水稀释，然后用0.1mol/L HCl调节pH至3.5；

优选的，所述蒸馏水用量为洋葱蛋白冻干粉重量的7倍；

(4)向步骤(3)所得溶液中按酶底比1:(8-12)加入酸性蛋白酶，在55℃下酶解1-3小时，灭酶，冷却；

步骤(4)中所述酶底比为酸性蛋白酶与步骤(2)所得洋葱蛋白冻干粉的质量比；

所述酸性蛋白酶的活力为50000u/g；

优选的，所述酶底比为1:10；

优选的，所述酶解时间为2小时；

优选的，所述灭酶条件为95℃、15分钟；

所述冷却为冷却至室温；

(5)用0.1mol/L HCl调节步骤(4)所得溶液pH至1.5，按酶底比1:(50-70)加入胃蛋白酶，在37℃下酶解1-3小时，灭酶，冷却，4℃、20000转/分钟离心30分钟，收集上清液；

步骤(5)中所述酶底比为胃蛋白酶与步骤(2)所得洋葱蛋白冻干粉的质量比；

所述胃蛋白酶的活力为3000u/mg；

优选的，所述酶底比为1:60；

优选的，所述酶解时间为2小时；

优选的，所述灭酶条件为95℃、15分钟；

所述冷却为冷却至室温；

(6)将步骤(5)收集的上清液用蒸馏水稀释至为含多肽3-7mg/mL的溶液(命名为“稀释液”)，用葡聚糖凝胶层析分离，收集分子量3000-1000D的组分，冷冻干燥，即得到洋葱活性多肽提取物冻干粉。

优选的，将步骤(5)收集的上清液用蒸馏水稀释至为含多肽5mg/mL的溶液，葡聚糖凝胶层析的分离条件为：凝胶色谱柱(Superdex Peptide 10/300GL)，流动相为0.2mol/L的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，流速0.5mL/min；

经峰面积计算，收集的分子量3000-1000D的组分占前述稀释液总质量的70.8-89.2％，得到的洋葱活性多肽提取物冻干粉中总多肽含量为36.8-50.7w/w％。

根据上述制备方法得到的洋葱活性多肽提取物，可用于制备预防或治疗糖尿病、高血脂的药物、保健食品及食品。

与现有技术相比，本发明的优点和有益效果在于：

本发明突破了洋葱药效物质基础的研究思路，直接指向多肽类成分，提高了洋葱资源的利用率，开辟了其新的药用、食用途径。

本发明所得的洋葱活性多肽提取物具有明显的口服预防和治疗糖尿病、高血脂的作用。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明的洋葱活性多肽提取物的制备方法及其应用。

以下实施例中所用洋葱均为市售紫皮洋葱。

以下实施例中所用0.2mol/L磷酸盐缓冲液配置方法如下：

称取6.72g十二水合磷酸二氢钠溶于100mL蒸馏水中，得0.2mol/L磷酸二氢钠溶液，再用0.6mol/L氢氧化钠调节pH值至5.0，即得pH 5.0的磷酸盐缓冲液。

称取十二水合磷酸二氢钠0.881g及二水合磷酸氢二钠0.242g溶于100mL蒸馏水中，即得pH 6.0的磷酸盐缓冲液；用0.6mol/L氢氧化钠调节pH至7.0，即得pH 7.0的磷酸盐缓冲液；用0.6mol/L氢氧化钠调节pH至7.4，即得pH 7.4的磷酸盐缓冲液(流动相)。

以下实施例中所用酸性蛋白酶的活力均为50000u/g(250g/瓶，上海金穗生物科技有限公司)。

以下实施例中所用胃蛋白酶的活力均为3000u/mg，5g/瓶，进口分装。

以下实施例中所用葡聚糖凝胶层析柱均为：Superdex Peptide 10/300GL(GE公司)。

实施例1：

一种洋葱活性多肽提取物的制备方法，步骤如下：

(1)取紫皮洋葱，切丁、匀浆，加入洋葱重量2倍的0.2mol/L pH 5.0的磷酸盐缓冲液浸泡，置于4℃冰箱12小时后，4℃下，10000转/分钟下离心20分钟，上层即为洋葱蛋白粗提液；

(2)向步骤(1)所得洋葱蛋白粗提液中缓慢加入与其等体积的95v/v％乙醇，然后用0.6w/w％NaOH溶液调节pH至8.0，冰浴中静置过夜后，4℃下，10000转/分钟下离心20分钟，收集沉淀，冷冻干燥即得洋葱蛋白冻干粉；

(3)向洋葱蛋白冻干粉中加入其6倍重量的蒸馏水稀释，然后用0.1mol/LHCl调节pH至3.5；

(4)向步骤(3)所得溶液中按酶底比1:8加入酸性蛋白酶，于55℃酶解2小时后，95℃、15分钟灭酶，冷却至室温；

(5)用0.1mol/L HCl调节步骤(4)所得溶液pH至1.5，按酶底比1:50加入胃蛋白酶，于37℃酶解1小时后，95℃、15分钟灭酶，冷却至室温，4℃下、20000转/分钟离心30分钟，收集上清液；

(6)将步骤(5)收集的上清液用蒸馏水稀释成含多肽3mg/mL的溶液，用葡聚糖凝胶层析(Superdex Peptide 10/300GL柱，流动相为0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，流速0.5mL/min，进样量0.5mL，检测波长280nm)分离，收集分子量3000-1000D的组分。经峰面积计算，所收集的组分占总面积的72.3％，将收集的分子量3000-1000D的组分冷冻干燥，即得到洋葱活性多肽提取物冻干粉，总多肽含量为42.1w/w％。

实施例2：

一种洋葱活性多肽提取物的制备方法，步骤如下：

(1)取紫皮洋葱，切丁、匀浆，加入洋葱重量2倍的0.2mol/L pH 6.0的磷酸盐缓冲液浸泡，置于4℃冰箱12小时后，4℃下，10000转/分钟下离心20分钟，上层即为洋葱蛋白粗提液；

(2)向步骤(1)所得洋葱蛋白粗提液中缓慢加入其体积0.5倍的95v/v％乙醇，然后用0.6w/w％NaOH溶液调节pH至8.0，冰浴中静置过夜后，4℃下，10000转/分钟下离心20分钟，收集沉淀，冷冻干燥即得洋葱蛋白冻干粉；

(3)向洋葱蛋白冻干粉中加入其8倍重量的蒸馏水稀释，然后用0.1mol/LHCl调节pH至3.5；

(4)向步骤(3)所得溶液中按酶底比1:10加入酸性蛋白酶，于55℃酶解 2小时后，95℃、15分钟灭酶，冷却至室温；

(5)用0.1mol/L HCl调节步骤(4)所得溶液pH至1.5，按酶底比1:70加入胃蛋白酶，于37℃酶解1小时后，95℃、15分钟灭酶，冷却至室温，4℃下、20000转/分钟离心30分钟，收集上清液；

(6)将步骤(5)收集的上清液用蒸馏水稀释成含多肽5mg/mL的溶液，用葡聚糖凝胶层析(Superdex Peptide 10/300GL柱，流动相为0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，流速0.5mL/min，进样量0.5mL，检测波长280nm)分离，收集分子量3000-1000D的组分。经峰面积计算，所收集的组分占总面积的80.1％，将收集的分子量3000-1000D的组分冷冻干燥，即得到洋葱活性多肽提取物冻干粉，总多肽含量为36.8w/w％。

实施例3：

一种洋葱活性多肽提取物的制备方法，步骤如下：

(1)取紫皮洋葱，切丁、匀浆，加入洋葱重量3倍的0.2mol/L pH 6.0的磷酸盐缓冲液浸泡，置于4℃冰箱12小时后，4℃下，10000转/分钟下离心20分钟，上层即为洋葱蛋白粗提液；

(2)向步骤(1)所得洋葱蛋白粗提液中缓慢加入其体积0.3倍的95v/v％乙醇，然后用0.6w/w％NaOH溶液调节pH至8.0，冰浴中静置过夜后，4℃下，10000转/分钟下离心20分钟，收集沉淀，冷冻干燥即得洋葱蛋白冻干粉；

(3)向洋葱蛋白冻干粉中加入其7倍重量的蒸馏水稀释，然后用0.1mol/LHCl调节pH至3.5；

(4)向步骤(3)所得溶液中按酶底比1:12加入酸性蛋白酶，于55℃酶解2小时后，95℃、15分钟灭酶，冷却至室温；

(6)将步骤(5)收集的上清液用蒸馏水稀释成含多肽7mg/mL的溶液，用葡聚糖凝胶层析(Superdex Peptide 10/300GL柱，流动相为0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，流速0.5mL/min，进样量0.5mL，检测波长280nm)分离，收集分子量3000-1000D的组分。经峰面积计算，所收集的组分占总面积的85.6％，将收集的分子量3000-1000D的组分冷冻干燥，即得到洋葱活性多肽提取物冻干粉，总多肽含量为48.5w/w％。

实施例4：

一种洋葱活性多肽提取物的制备方法，步骤如下：

(1)取紫皮洋葱，切丁、匀浆，加入与洋葱相等重量的0.2mol/L pH 7.0的磷酸盐缓冲液浸泡，置于4℃冰箱12小时后，4℃下，10000转/分钟下离心20分钟，上层即为洋葱蛋白粗提液；

(3)向洋葱蛋白冻干粉中加入其6倍重量的蒸馏水稀释，然后用0.1mol/L HCl调节pH至3.5；

(6)将步骤(5)收集的上清液用蒸馏水稀释成含多肽3mg/mL的溶液，用葡聚糖凝胶层析(Superdex Peptide 10/300GL柱，流动相为0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，流速0.5mL/min，进样量0.5mL，检测波长280nm)分离，收集分子量3000-1000D的组分。经峰面积计算，所收集的组分占总面积的70.8％，将收集的分子量3000-1000D的组分冷冻干燥，即得到洋葱活性多肽提取物冻干粉，总多肽含量为40.4w/w％。

实施例5：

一种洋葱活性多肽提取物的制备方法，步骤如下：

(4)向步骤(3)所得溶液中按酶底比1:10加入酸性蛋白酶，于55℃酶解2小时后，95℃、15分钟灭酶，冷却至室温；

(5)用0.1mol/L HCl调节步骤(4)所得溶液pH至1.5，按酶底比1:60加入胃蛋白酶，于37℃酶解1小时后，95℃、15分钟灭酶，冷却至室温，4℃下、20000转/分钟离心30分钟，收集上清液；

(6)将步骤(5)收集的上清液用蒸馏水稀释成含多肽5mg/mL的溶液，用葡聚糖凝胶层析(Superdex Peptide 10/300GL柱，流动相为0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，流速0.5mL/min，进样量0.5mL，检测波长280nm)分离，收集分子量3000-1000D的组分。经峰面积计算，所收集的组分占总面积的89.2％，将收集的分子量3000-1000D的组分冷冻干燥，即得到洋葱活性多肽提取物冻干粉，总多肽含量为50.7w/w％。

实施例6：

用上述实施例5制备得到的洋葱活性多肽提取物进行药理实验、药理结果与分析，以证明本发明方法制得的洋葱活性多肽提取物具有血糖升高的干预作用和高血糖、高血脂的治疗作用，可以应用于制备预防或治疗糖尿病、高血脂的药物或保健食品及食品。

洋葱活性多肽提取物预防和治疗糖尿病的实验研究：

造模方法：选用SPF级健康昆明种小鼠(18-22g)，尾静脉注射四氧嘧啶(ALX)120mg/kg，第三天按相同方法再注射ALX 80mg/kg，72小时后测定小鼠空腹血糖。以血糖值>10.0mmol/L为造模成功。

实验方法：昆明小鼠雌雄各半。禁食12小时后，造模，取血糖值>10.0mmol/L的小鼠为糖尿病鼠。实验组1和2小鼠灌胃洋葱蛋白(300mg/kg)，实验组3和4小鼠灌胃洋葱活性多肽提取物(200mg/kg)，模型组以等量蒸馏水代替。各组1次/天，连续给药7天，测空腹血糖值，比较洋葱蛋白及活性多肽的降糖活性，结果见表1。

表1洋葱蛋白及活性多肽提取物对血糖升高的干预和治疗作用(mmol/L,n＝10，)

注：*与实验前比较p<0.05，^△与灌胃前比较p<0.05，^#与对照组造模后比较p<0.05

由表1横向比较可知，先灌胃洋葱蛋白和活性多肽再造模(实验组1和3)与ALX直接造模(对照组)小鼠血糖值有显著性降低(p<0.05)，提示洋葱蛋白和活性多肽对造模有干预；对比连续7天灌胃洋葱蛋白或活性多肽(实验组2和4)前后血糖，可知洋葱蛋白和活性多肽均能降低造模后血糖(p<0.05)；纵向分析可知，洋葱活性多肽与洋葱蛋白比较，降糖活性明显增强，干预作用分别为：29.8％和20.7％；治疗作用分别为：35.2％和18.2％。

表1结果表明，洋葱活性多肽提取物对高血糖有预防作用，对实验性小鼠血糖升高有抑制作用，对糖尿病小鼠有治疗作用，口服降糖活性显著，与蛋白比较作用明显增强，且安全、无毒副作用。

实施例7：

用上述实施例5制备得到的洋葱活性多肽提取物进行药理实验、药理结果与分析，以证明本发明方法制得的洋葱活性多肽提取物具有明显的口服降糖、降脂作用，可以应用于预防和治疗糖尿病、高血脂的药物或保健食品及食品。

洋葱活性多肽提取物对糖尿病小鼠糖脂代谢的实验研究：

造模方法同实施例6。实验分为：正常对照组，模型对照组，阳性对照组(罗格列酮RSG，4mg/kg)，洋葱活性多肽提取物组(100、200、400mg/kg)。各治疗组灌胃不同剂量的洋葱活性多肽，阳性对照组灌胃RSG，其它各对照组小鼠给药方式和剂量同实施例6，1次/天，连续给药14天。于末次给药2小时后测定小鼠餐后血糖水平，并于当晚禁食不禁水12小时，与次日早上摘眼球取血，分离血清，测定空腹血糖、丙二醛MDA、超氧化物歧化酶SOD和甘油三脂TG、总胆固醇TC的含量，结果见表2和3。

表2洋葱活性多肽提取物对糖尿病小鼠血糖的影响

注：与模型组比较，***p<0.001，**p<0.01

由表2可知，治疗14天后，洋葱活性多肽提取物各剂量组与模型组相比空腹血糖值均有显著性下降(p<0.01)，表明洋葱活性多肽提取物具有较好的降低糖尿病小鼠空腹血糖的作用，并存在剂量依赖性。另外，中、高剂量的洋葱活性多肽餐后2小时血糖基本都能恢复到餐前血糖水平，且比RSG效果好。以上结果表明，洋葱活性多肽提取物高剂量组降糖作用优于其他各组，且无明显的毒副作用。

表3显示，与正常组相比，ALX模型组小鼠MDA含量显著升高(p<0.01)、SOD活力显著下降(p<0.01)。与模型组相比，洋葱活性多肽提取物各剂量组均能降低糖尿病小鼠血清MDA含量，呈剂量依赖性，且活性多肽中、高剂量均具有显著性差异(p<0.05和p<0.01)，其效果优于阳性对照组；洋葱活性多肽提取物的各剂量组均能升高糖尿病小鼠血清SOD活力，表现出明显的剂量依赖性，且活性多肽提取物中、高剂量均具有显著性差异(p<0.05和p<0.01)，并优于阳性对照组。模型组小鼠血清TG、TC均显著高于正常组(p<0.01)，中、高剂量洋葱活性多肽提取物可显著降低糖尿病小鼠血清TG和TC水平(p<0.05和p<0.01)，并具有一定的剂量依赖性，而阳性对照药物RSG几乎无降血脂作用。

表3洋葱活性多肽提取物对糖尿病小鼠血清MDA、SOD和TG、TC水平的影响

注：与模型组比较，**p<0.01，*p<0.05 。

Claims

1.一种洋葱活性多肽提取物的制备方法，步骤如下：

（1）取洋葱，切丁、匀浆，加入洋葱重量1-3倍的0.2 mol/L pH 5.0-7.0的磷酸盐缓冲液浸泡，置于4℃冰箱12小时后，冷冻离心，上层即为洋葱蛋白粗提液；

（2）向步骤（1）所得洋葱蛋白粗提液中缓慢加入其1/3-1倍体积的95 v/v %乙醇，然后用0.6 w/w %NaOH溶液调节pH 至8.0，冰浴中静置过夜后，冷冻离心，收集沉淀，冷冻干燥即得洋葱蛋白冻干粉；

（3）向步骤（2）所得洋葱蛋白冻干粉中加入6-8倍重量的蒸馏水稀释，然后用0.1 mol/LHCl调节pH至3.5；

（4）向步骤（3）所得溶液中按酶底比1:（8-12）加入酸性蛋白酶，在55℃下酶解1-3小时，灭酶，冷却至室温；

步骤（4）中所述酶底比为酸性蛋白酶与步骤（2）所得洋葱蛋白冻干粉的质量比；

所述酸性蛋白酶的活力为50000 u/g；

（5）用0.1 mol/L HCl调节步骤（4）所得溶液pH至1.5，按酶底比1:（50-70）加入胃蛋白酶，在37℃下酶解1-3小时，灭酶，冷却至室温，4℃、20000转/分钟离心30 分钟，收集上清液；

步骤（5）中所述酶底比为胃蛋白酶与步骤（2）所得洋葱蛋白冻干粉的质量比；

所述胃蛋白酶的活力为3000 u/mg；

（6）将步骤（5）收集的上清液用蒸馏水稀释至为含多肽3-7 mg/mL的溶液，用葡聚糖凝胶层析分离，收集分子量1000-3000 D的组分，冷冻干燥，即得到洋葱活性多肽提取物冻干粉。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述洋葱为紫皮洋葱；所述磷酸盐缓冲液pH为6.0；所述磷酸盐缓冲液用量为洋葱重量的2倍。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述95 v/v %乙醇用量为洋葱蛋白粗提液体积的0.5倍。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，所述蒸馏水用量为洋葱蛋白冻干粉重量的7倍。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（4）中，所述酶底比为1:10；所述酶解时间为2小时；所述灭酶条件为95℃、15分钟。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（5）中，所述酶底比为1:60；所述酶解时间为2小时；所述灭酶条件为95℃、15分钟。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（6）中，将步骤（5）收集的上清液用蒸馏水稀释至为含多肽5 mg/mL的溶液，葡聚糖凝胶层析的分离条件为：凝胶色谱柱为Superdex Peptide 10/300GL，流动相为0.2 mol/L的pH 7.4磷酸盐缓冲液，流速0.5 mL/min。

8.根据权利要求1-7中任一所述的制备方法制得的洋葱活性多肽提取物在制备具有口服降糖和/或降脂作用的药物中的应用。

9.根据权利要求1-7中任一所述的制备方法制得的洋葱活性多肽提取物在制备具有口服降糖和/或降脂作用的食品中的应用。

10.根据权利要求1-7中任一所述的制备方法制得的洋葱活性多肽提取物在制备具有口服降糖和/或降脂作用的保健食品中的应用。