CN103588859A

CN103588859A - 蜈蚣的活性多肽及其在制药中的应用

Info

Publication number: CN103588859A
Application number: CN201310272557.6A
Authority: CN
Inventors: 李振国; 万玲; 陈艳明
Original assignee: Mudanjiang Youbo Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Mudanjiang Youbo Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2013-07-02
Filing date: 2013-07-02
Publication date: 2014-02-19

Abstract

本发明涉及一种蜈蚣活性多肽的提取、分离、纯化和鉴定及其在制药中的应用，属于生物医学领域。该发明提供了一种节肢动物门蜈蚣科动物少棘巨蜈蚣活性多肽的提取、分离、纯化和鉴定的方法，具体来说，该方法通过使用乙醇加热回流方法提取，以镇痛活性为指标，运用盐析、葡聚糖层析柱等方法分离、纯化而获得，并经过质谱确认。本发明方法提取、分离、纯化获得的蜈蚣多肽药理活性高。本发明同时公开了蜈蚣活性多肽在制备心脑血管和镇痛药物中的应用。

Description

蜈蚣的活性多肽及其在制药中的应用

技术领域

本发明属于天然高分子领域，也属于生化制药领域，涉及一种从动物中药体内获得活性物质，更具体涉及一种从蜈蚣中提取、分离、纯化和鉴定活性多肽的方法，同时还涉及一种蜈蚣活性多肽在制备镇痛、心脑血管药物中的应用。

背景技术

蜈蚣始载于《神农本草经》，为节肢动物门蜈蚣科动物少棘巨蜈蚣Scolopendra subspinipes mutilans L.Koch的干燥体，具有辛温走窜、通经逐邪、调达肝经之功效，是祛风镇痛、攻毒散结之要药。传统医学中蜈蚣常用于小儿惊风，抽搐痉挛，中风，半身不遂，毒蛇咬伤等。在近代医学中，应用蜈蚣治疗肿瘤、结核病、神经性头疼、糖尿病等疗效显著。

目前，在临床应用中，蜈蚣通常是采用干燥全虫入药，也有采用干燥全虫经水提液或醇提取后入药的，无论采取哪种方法，其所用的实际是蜈蚣所有化学成分的混合物。现代药学研究表明，蜈蚣中含有蛋白质86.25％、水不溶性物质0.24％、还原糖0.23％等多种成分，但蜈蚣中已经报导的具有活性作用的成分不多。在蜈蚣众多的化学成分中，如何筛选、分离、提取出最具有药理活性的有效成分已成为人们研究的热点和重点。曾红等人曾将蜈蚣脱脂处理后，经sephadex G-25、sephadex G-150两次柱层析，分离出8种具有抗癌活性的组分，并经药理实验表明其中的E1、E6两组抗癌活性最强。(沈阳药科大学制药工程学院.曾红.蜈蚣中抗癌活性成分的提取.湖南中医杂志，2004.20(5).57)。许鸣镝等人则采取不同的方法提取到了对人口腔上皮细胞鳞癌和人结肠癌细胞有明显抑制作用的碱性蛋白。(许鸣镝.柳雪枚.蜈蚣碱性蛋白SSmp-d的分离纯化及其部分理化性质的鉴定.生物化学杂质.1997.13(5)：586)。由此可见，采用不同的提取方法可以从蜈蚣中提取出具有不同药理活性的有效成分。

本发明采用活性跟踪的办法，从蜈蚣体内提取、分离、纯化并鉴定出两个活性多肽，以及该活性多肽在制备镇痛、心脑血管药物中应用。

发明内容

本发明公开了具有镇痛、抗凝和溶栓活性作用的蜈蚣活性多肽的提取、分离、纯化和鉴定方法，以及该活性多肽在制备镇痛、心脑血管药物中的应用。

本发明的目的是这样实现的：

本发明方法包括有一下步骤：

a、取蜈蚣细粉，加一定量一定浓度的乙醇回流提取两次，过滤，合并滤液；

b、所得滤液在水浴下挥干乙醇，适量蒸馏水溶解，离心，取上清液用石油醚萃取，待分层后，取水层浓缩至一定量，得墨绿色的蜈蚣粗提液；

c、取所述蜈蚣粗提液，加入适量海藻酸，搅拌，过滤，所得滤渣用稀盐酸少量多次洗脱海藻酸，得绿色的洗脱液；

d、向所述洗脱液中加入氯化钠至饱和，搅拌，置冰箱4℃静置过夜至完全析出并分层，收集悬浮于液面的蛋白类物质，冷冻干燥，得多肽粗品；

e、取多肽粗品用蒸馏水溶解成一定的浓度，上样，用蒸馏水做洗脱剂，sephadex凝胶柱分离，收集峰1和峰2，冷冻干燥，其核酸蛋白仪的波谱图见附图1，液相色谱图见附图2。

f、取峰1和峰2的冷冻样品，进行液相色谱分离，得到纯度更高的两个多肽样品1和2，其中活性最强的蜈蚣多肽分子量介于13000～14000，其中多肽样品峰1的液相色谱图见附图3。

进一步的，a步骤中所说乙醇的浓度优选30％～85％，更进一步优选65％；优选乙醇用量为药材的2～6倍量，更进一步优选第一次提取用量为4倍量，第二次提取用量为3倍量；提取时间优选为0.5小时～4小时，更进一步优选第一次提取时间为1.0小时，第二次提取时间为0.5小时。

进一步的，b步骤中所说的水浴温度优选40～90℃，更进一步优选75℃；离心机转速优选4000转/分钟；离心时间，优选5～30分钟，更进一步优选15分钟。

进一步的，c步骤中以苦味酸作为检查多肽指示剂，搅拌时间优选0.5～3小时；洗脱海藻酸所用的稀盐酸，优选浓度为0.05～0.5mol/L，更进一步有选为0.2mol/L。

进一步的，e步骤中所说核酸蛋白检测仪的检测波长优选280nm。

进一步的，f步骤中所说液相色谱分离纯化，优选反相液相色谱，流动相优选乙腈、水和三氟醋酸的组成，镇痛活性最强多肽分子量为13616.796。

本发明方法可有效提取、分离和纯化蜈蚣中所含的镇痛、降低血粘、促进微循环等的活性多肽，且用该方法所得的蜈蚣活性多肽杂质少、纯度高。

本发明方法提取的蜈蚣活性多肽，可用于制备各种剂型的镇痛、心脑血管药物。

附图说明：

图1为盐析后样品经过sephadex凝胶柱分离后的波峰图

图2为粗品多肽样品2的高效液相色谱图

图3为粗品多肽样品1的高效液相色谱图

图4为纯化后多肽样品1的基质辅助激光飞行质谱图

具体实施例：

下列实施例说明本发明的优选实施例，但并非用以限制本发明。

实施例1

准确称取蜈蚣粉末100g，乙醇溶解，加热回流提取两次，合并两次的滤液。75℃水浴挥干滤液中，得残渣，蒸馏水溶解残渣，离心(转速4000转/分钟)15min，石油醚萃取上清液，分层后，取水层浓缩，得到墨绿色的蜈蚣粗提液；量取500ml上述蜈蚣粗提液，加入海藻酸，搅拌0.5小时，待吸附完全后过滤，得滤渣，以0.2mol/L的弱盐酸少量多次洗脱海藻酸，收集得到绿色的洗脱液。向洗脱液中加入氯化钠至饱和，搅匀，4℃静置过夜，收集悬浮于液面的蛋白类物质，冷冻干燥得粗多肽样品。将上述粗多肽样品配成1g/ml，sephadex G-25凝胶柱(2.6cm×60cm)分离，得到峰1和峰2两个冷冻干燥品。峰1样品经过sephadex G-50凝胶色谱柱分离为2个峰即峰1-1和峰1-2。峰1-1和峰1-2样品经RP-HPLC分离，色谱条件为：安捷伦C18反相柱(4.6mm×150mm，5μ)，柱温20℃，流速1.0ml/min，检测波长250～280nm，进样量20μl，流动相A为超蒸水，B为100％乙腈含0.1％三氟醋酸，30min内从5％～50％，根据色谱峰收集流分。得到两个纯度较高的活性多肽样品1和2。

实施例2

昆明种小鼠每种8只，雌雄各半，体重18-22g，随机分为5组：阴性对照组(蒸馏水，2g/10g小鼠体重)、阳性对照组(阿司匹林，1.5mg/10g小鼠体重)、样品1组(蜈蚣活性多肽2，0.05mg/10g小鼠体重)、样品2组(蜈蚣活性多肽1+活性多肽2，0.05mg/10g小鼠体重)、样品3组(蜈蚣活性多肽1，0.015mg/10g小鼠体重)，皮下注射受试药物。于5min后对每只小鼠腹腔注射新鲜配制的0.6％的醋酸溶液0.2ml，5min后观察小鼠的扭体反应(即腹部内凹、躯干与后肢伸张、臀部高起)，记录20min内扭体次数，以扭体抑制率作为活性指标。

蜈蚣活性多肽对小鼠醋酸扭体反应的影响

P＜0.05，均为与阴性组(水)比较

结果表明：经t检验，以蒸馏水作为阴性对照，阿司匹林作为阳性对照，蜈蚣活性多肽1+活性多肽2混合样品、蜈蚣活性多肽1样品和蜈蚣活性多肽2样品均能抑制冰醋酸诱发的小鼠扭体次数，具有明显的镇痛作用，其中蜈蚣活性多肽1的活性较强，其浓度较阿司匹林稀释100倍时，其镇痛活性与阿司匹林相当。

实施例3

雄性SD大鼠50只，体重365±14(339～388)g，按体重随机分为5组，每组10只：对照组尾静脉注射生理盐水，样品1组(蜈蚣活性多肽1，0.05mg/10g大鼠体重)、样品2组(蜈蚣活性多肽1+活性多肽2，0.05mg/10g大鼠体重)、样品3组(蜈蚣活性多肽2，0.05mg/10g大鼠体重)，尾静脉注射。给药后15min乙醚麻醉，腹主动脉取血，3.8％枸橼酸钠抗凝剂体积之比9：1。500rpm离心10min制备富血小板血浆(PRP)，3000rpm离心10min制备贫血小板血浆(PPP)。以PPP调PRP，使其血小板计数保持在3.5～4.0×10⁸个/mL。

按比浊法测定血小板聚集性。取250μL PRP加入比色杯中，置血小板聚集仪内37℃温孵10min，然后以PPP调100％，PRP调零，在连续搅拌下加入诱导剂二磷酸腺苷(ADP)、花生四烯酸(AA)、胶原(CG)，使其终浓度分别约为5μM、0.4mM、10mg/mL。以t检验比较给药组与对照组均数差异的显著性，结果见表。

表蜈蚣活性多肽对大鼠血小板聚集功能的影响(±s，n＝10)

注：与对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01。

试验结果表明：大鼠注射蜈蚣活性多肽对ADP、AA、CG诱导的血小板聚集具有明显的抑制作用，样品1、2和3对ADP话导的聚集抑制率分别为13.7％(P＜0.05)、19.2％(P＜0.01)、22.0％(P＜0.01)；对AA诱导的聚集抑制率分别为5.3％(P＞0.05)、7.7％(P＞0.05)、9.1％(P＜0.05)；对CG诱导的聚集抑制率分别为10.6％(P＞0.05)、13.4％(P＜0.05)、19.5％(P＜0.05)。

实施例4

Wistar大鼠50只，体重229±13(204～248)g，雌雄各半。大鼠腹腔注射35％水合氯醛350mg/kg麻醉，分离颈总动脉，将BT87-3型实验性体内血栓形成测定仪的刺激电极和温度探头钩上，温度探头在远心端，刺激电极近心端。按体重随机分为5组，每组10只。对照组给予生理盐水；样品1组(蜈蚣活性多肽1，0.05mg/10g大鼠体重)、样品2组(蜈蚣活性多肽1+活性多肽2，0.05mg/10g大鼠体重)、样品3组(蜈蚣活性多肽2，0.05mg/10g大鼠体重)，动物经左侧股静脉注射给药，5min后开始刺激，温控电流强度80μA，刺激电流2mA；刺激5min后，再等待3min，将温控电流强度调零。记录从刺激开始到动脉温度骤降所需的时间(s)，作为动脉血栓形成时间。以t检验比较给药组与对照组均数差异的显著性。结果见表。

表蜈蚣活性多肽对大鼠实验性血栓形成时间的影响(±s，n＝10)

注：与对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01。

试验结果表明：大鼠注射蜈蚣活性多肽能延长电刺激引起的动脉血栓形成时间，样品1、2和3分别延长了17.4％(P＜0.05)、32.9％(P＜0.05)、49.7％(P＜0.01)。

实施例5

Wistar大鼠60只，雌雄各半，体重428±27(372～485)g，按体重随机分为6组，每组10只。大鼠12％水合氯醛360mg/kg腹腔麻醉，正常对照组经舌下静脉给予生理盐水，其余各组大鼠经舌下静脉给予15％高分子右旋糖酐(分子量为50万)。15min后大鼠左侧股静脉注射给予相应药物，正常对照、模型对照组给予生理盐水，样品1组(蜈蚣活性多肽1，0.05mg/10g大鼠体重)、样品2组(蜈蚣活性多肽1+活性多肽2，0.05mg/10g大鼠体重)、样品3组(蜈蚣活性多肽2，0.05mg/10g大鼠体重)。30min后腹主动脉取血8mL，其中5mL置肝素化试管抗凝，进行全血粘度测定，2000rpm、25℃离心10min后所得血浆的粘度测定及红细胞沉降率和压积的测定，剩余3mL室温静置30min后，进行3000rpm、25℃离心10min后所得血清的粘度测定。以t检验比较给药组与对照组均数差异的显著性。结果见下表。

表蜈蚣活性多肽对高粘血症大鼠全血粘度(mPa·s)的影响(±S，n＝10)

注：与正常对照组比较：△△△P＜0.001；与模型对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01。

表蜈蚣活性多肽对高粘血症大鼠血浆、血清粘度(mPa·s)的影响(±S，n＝10)

注：与正常对照组比较：△△△P＜0.001；与模型对照组比较：*P＜0.05。

试验结果表明：大鼠注射蜈蚣活性多肽能抑制高分子右旋糖苷引起的全血粘度增加，在切变率为200s^-1时，三个样品组对增高的全血粘度分别抑制了35.3％(P＜0.05)、40.9％(P＜0.01)、52.0％(P＜0.01)；在切变率为30s^-1时分别抑制了30.6％(P＜0.05)、36.5％(P＜0.05)、50.3％(P＜0.001)；在切变率为5s^-1时分别抑制了42.7％(P＜0.05)、39.6％(P＜0.05)、55.7％(P＜0.01)；在切变率为1s^-1时分别抑制了36.3％(P＜0.05)、38.0％(P＜0.05)、47.2％(P＜0.01)；大鼠注射蜈蚣活性多肽还抑制高分子右旋糖苷引起的血浆粘度和血清粘度的增加，三个样品组对增高的血浆粘度分别抑制了22.3％(P＞0.05)、30.3％(P＜0.05)、32.6％(P＜0.05)；对增高的血清粘度稍有抑制，但无统计学差异。

实施例6

按照本领域已知的方法制备冻干粉针剂，每支含有下述成分：

Claims

1.一种蜈蚣活性多肽，其特征在于所述提取、分离、纯化和鉴定的方法包括以下步骤：

e、取多肽粗品用蒸馏水溶解成一定的浓度，上样，用蒸馏水做洗脱剂，sephadex凝胶柱分离，收集峰1和峰2，冷冻干燥。

f、取峰1和峰2的冷冻样品，进行液相色谱分离，得到纯度更高的两个多肽样品1和2，经质谱鉴定，蜈蚣活性多肽分子量介于13000～14000。

2.根据权利要求1所述活性多肽提取，其特征在于a步骤中所说乙醇的浓度优选30％～85％，更进一步优选65％；优选乙醇用量为药材的2～6倍量，更进一步优选第一次提取用量为4倍量，第二次提取用量为3倍量；提取时间优选为0.5小时～4小时，更进一步优选第一次提取时间为1.0小时，第二次提取时间为0.5小时。

3.根据权利要求1所述活性多肽分离，其特征在于b步骤中所说的水浴温度优选40～90℃，更进一步优选75℃；离心机转速优选4000转/分钟；离心时间，优选5～30分钟，更进一步优选15分钟。

4.根据权利要求1所述活性多肽分离，其特征在于c步骤中以苦味酸作为检查多肽指示剂，搅拌时间优选0.5～3小时；洗脱海藻酸所用的稀盐酸，优选浓度为0.05～0.5mol/L，更进一步有选为0.2mol/L。

5.根据权利要求1所述活性多肽，其特征在于e步骤中所说核酸蛋白检测仪的检测波长优选280nm。

6.根据权利要求1所述活性多肽，其特征在于f步骤中所说液相色谱分离纯化，优选反相液相色谱，流动相优选乙腈、水和三氟醋酸的组成。

7.具有活性作用的蜈蚣多肽，其特征在于多肽分子量介于13000-14000之间，其镇痛活性最强的多肽分子量在质谱图中更明确标示为13616.796道尔顿。

8.根据权利要求1所述活性多肽，在镇痛和心脑血管药物中的应用。

9.根据权利要求7和8所述的应用，其特征在于其中所述的药物剂型为胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、注射剂、口服液或丸剂。