CN101323873B - 一种人参多糖提取工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种人参多糖的提取工艺。该方法选取生晒参，经粉碎、醇提、水提、醇沉后，离心取沉淀得粗糖提取物，再经水溶醇沉、离心取沉淀得精制糖提取物；经添加淀粉酶去淀粉，加活性炭脱色，取上清液Sevage法脱蛋白得到棕褐色粉末；再将此棕褐色粉末经柱层脱色分离，采用不同浓度的洗脱液梯度洗脱，将洗脱液浓缩，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到人参多糖。本生产工艺具有技术可靠、操作步骤简单、条件易于控制的特点，适用于大规模生产。所制得的人参多糖纯度可达96.5％以上，纯度高、安全性好，可用于制备静脉注射人参多糖注射剂。
Description
技术领域：
本发明涉及一种人参多糖的提取工艺，属于中药制剂领域。
背景技术：
人参为五加科Araliaceae植物Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根，在我国有着悠久的药用历史，主要含有人参皂苷、人参多糖、人参多肽及挥发油、多种氨基酸、脂肪酸及维生素、微量元素等有效成分，国内外对人参的活性成分的提取工艺和药效研究始终非常活跃，特别是对于人参皂苷的报道较多见，但是近年来随着分析手段的逐步提高，对于人参多糖的研究也取得了较大的进展。
人参多糖为中药人参的活性成份，为高分子葡聚糖。人参多糖具有增强机体免疫调节功能及增强化疗药物抗肿瘤作用，对肿瘤有明显的抑制作用。
实验表明，人参多糖能诱生肿瘤坏死因子和干扰素-γ，对肿瘤细胞有杀伤和抑制作用。肿瘤坏死因子是由激活的巨噬细胞/单核细胞系统产生的多功能蛋白分子，在机体内起着重要的生理作用。在体内肿瘤坏死因子可以通过三种途径发挥抗肿瘤作用：直接杀伤肿瘤细胞；作用于肿瘤血循环，导致肿瘤组织血供减少，从而影响肿瘤的生长；激活机体免疫系统的抗肿瘤作用。同时，肿瘤坏死因子还可介导炎性过程，减少网膜组织间皮细胞溶纤维蛋白活性，进而使网膜表面纤维蛋白增多，减少组织外渗。干扰素是细胞在受到刺激物作用后合成并释放出的蛋白性淋巴因子，其作用为：直接抗病毒作用；增强主要组织相容性抗原和肿瘤相关抗原的表达；增强自然杀伤细胞(NK)的细胞毒作用；增强抗体依赖性细胞的细胞毒作用；直接的抗细胞增殖作用和抗血管生成作用。同时人参多糖能增强T淋巴细胞及NK细胞活性，提高了机体的免疫调节功能，而有利于抗肿瘤作用的发挥。
其次，人参多糖具有免疫调节作用，可以用于治疗病毒性流感。
人参多糖具有显著增强单核吞噬细胞系的功能，人参多糖可明显增加巨噬细胞的吞噬指数。人参多糖能促进抗体和补体的形成，可以显著增加血清补体和血清IgG的含量。
目前国家食品药品监督管理局批准生产的人参多糖注射液只有肌肉注射给药途径。没有批准静脉注射给药途径主要原因是现有的人参多糖提取、分离、纯化技术所制得原料纯度不高，存在一定安全隐患。肌肉注射存在的主要问题是生物利用率低，患者注射部位疼痛及长期注射可能出现局部红肿、淤血、肿块、甚至肌肉坏死等不良反应。
专利ZL200410000209.4公开了一种人参多糖的制备方法，其提纯方法为：
A)取人参，加入8～15倍重量水，煎煮2～3次，每次煎煮时间为30～90分钟，合并煎液，过滤，滤液减压浓缩至原体积的0.1～0.4倍；加入95％的乙醇使浓缩液含醇量为65～85％，0～8℃冷藏静置12～48小时，将冷藏后的药液用离心机低温离心20～40分钟(离心转速为3000～4000转/分)，收集沉淀，沉淀低温干燥得人参多糖粗品；
B)人参多糖粗晶加10～15倍重量水加热煮沸10～30分钟，降温，过滤，向滤液中加入95％的乙醇使含醇量为65～85％，0～8℃冷藏静置12～48小时，将冷藏后的药液用离心机在0～8℃下离心20-40分钟(离心转速为3000～4000转/分)，收集沉淀；重复水煮醇沉、冷藏离心过程2～3次，得到人参多糖沉淀；人参多糖沉淀加10～20倍重量水溶解，药液用冷冻离心机在-10～-30℃冻实后，在0～8℃下融解离心20～30分钟(离心转速为3000～4000转/分)，取上清液，上清液重复冻融离心1～2次后，将上清减压，减压浓缩，在0～8℃下干燥得到人参多糖精品。
此提纯方法仅采用了多次水煮醇沉、过滤离心除杂，再经冻融离心、多次除杂蛋白，离心得上清液，再经减压浓缩、低温干燥的人参多糖精品。此方法不仅步骤繁琐复杂，回收率低，实施例中的回收率仅为0.45～0.5％，而且制得的人参多糖的纯度不高。
专利申请200610034728.1公开了一种注射用人参多糖冻干粉及其制备工艺，其中人参多糖提取工艺步骤为：
A)采集鲜人参的根部，洗净，粉碎，过筛，加水浸泡过夜，晾干，用乙醇浸渍提取或者回流提取至少5次；
B)将药渣挥发去尽乙醇后，加水浸泡，加热至沸腾，保持微沸提取至少5次；
C)合并提取液，浓缩，加入乙醇至少提取三次，至醇浓度为80-90％，收集沉淀，用无水乙醇浸洗1-2次，得到粗人参多糖；
D)再经葡聚糖凝胶柱或者聚酰胺柱分离纯化，用水洗脱，洗脱液浓缩，再用乙醇沉淀，沉淀用无水乙醇浸洗1-2次，得到精品人参多糖。
此专利申请在醇提和水提的基础上采用了葡聚糖凝胶柱或者聚酰胺柱的分离纯化，但所含杂质仍然比较多，人参多糖的含量仅为75％，不能完全适应临床需要。
上述授权或公开的专利所采用的人参多糖提取工艺，人参多糖含量均未达到《中药、天然药物注射剂基本技术要求》(国食药监注[2007]743号)关于“有效成份制成的注射剂，主药成份含量应不少于90％。多成份制成的注射剂，所测成份应大于总固体量的80％”的质量标准。
发明内容：
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种过程简单、操作方便的人参多糖提取、分离和纯化方法，所制得的人参多糖符合国家现行中药注射剂质量标准，可用于制备静脉注射人参多糖注射剂，为临床提供一种新的给药途径，克服了肌肉注射生物利用率低，不良反应多等缺点。
本发明的人参多糖提取工艺，在已有技术基础上增加了酶解、脱色及除蛋白的工艺步骤，最大限度的去除了淀粉和色素，并且通过Sevage法去除了人参多糖经过醇沉后存在的少量蛋白质。Sevage法去蛋白的优点是条件温和，不会引起多糖的变性。人参多糖制成注射剂临床上肌肉注射或者静脉注射，若注射液中存在人参中的异体蛋白质会使人体发生过敏反应。其次，本发明采用了葡聚糖树脂、交联琼脂糖凝胶、快流速琼脂糖凝胶为载体柱层脱色分离的提纯方法，采用洗脱液梯度洗脱，使得人参多糖的纯度明显提高，产率增加。
Sevage法是利用蛋白质在三氯甲烷等有机溶剂中变性的特点，将提取液与Sevage试剂5∶1混合，振荡，离心，变性后的蛋白质介于提取液与Sevage试剂交界处。Sevage试剂为氯仿与正丁醇体积比为5∶1配制而成。
本发明所述的人参多糖的分离、纯化方法，包括以下步骤：
(1)粉碎：选取生晒参，过10～100目筛；
(2)醇提：使用10～100％的乙醇回流反应3～10小时，乙醇与生晒参粉末的重量比为1∶2～11，过滤，将固体产物自然风干；
(3)水提：向上述风干的固体产物中加入其固体产物2～8倍体积的水，于60～110℃回流反应1～5小时得水提物；
(4)醇沉：将上述水提物于35～90℃减压浓缩成密度为1.02～1.1的液体，用40～100％的乙醇醇沉，室温放置10～48小时，离心，取沉淀，得粗糖提取物，粗糖提取物经水溶后，再加入80～100％的乙醇醇沉放置10～48小时，离心，取沉淀，得精制糖提取物；
(5)酶解、脱色及除蛋白：取上述精制糖提取物按比例添加淀粉酶，置于85～95℃保温20～40分钟；加10～20％活性炭90～110℃回流30～45分钟脱色、离心；取上清液Sevage法脱蛋白，重复3～5次，取水层浓缩、离心、干燥，得到棕褐色粉末；
(6)柱层脱色分离：采用葡聚糖凝胶树脂、交联琼脂糖凝胶、快流速琼脂糖凝胶中的一种为载体，将上述棕褐色粉末和载体按1∶10～100克上样，采用不同浓度的洗脱液梯度洗脱，将洗脱液浓缩，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到人参多糖。
本发明所述的人参多糖提取工艺优选为：
(1)粉碎：选取生晒参，过10～80目筛；
(2)醇提：使用50～75％的乙醇回流反应4～8小时，乙醇与生晒参粉末的重量比为1∶7～11，过滤，将固体产物自然风干；
(3)水提：向上述风干的固体产物中加入其固体产物5～8倍的水，于80～110℃回流反应3～5小时得水提物；
(4)醇沉：将上述水提物于55～90℃减压浓缩成密度为1.02～1.1的液体，用50～100％的乙醇，沉室温放置10～40小时，离心，取沉淀，得粗糖提取物，粗糖提取物经水溶后再加入80～100％的乙醇醇沉放置10～40小时，离心，取沉淀，得精制糖提取物；
(5)酶解、脱色及除蛋白：取上述精制糖提取物按比例添加淀粉酶，置于90～95℃保温20～30分钟；加入精制糖提取物重量15～20％的活性炭95～110℃回流30～40分钟脱色，离心；上清液Sevage法脱蛋白，重复4～5次，取水层浓缩、离心、干燥，得到棕褐色粉末；
(6)柱层脱色分离：采用葡聚糖凝胶树脂、交联琼脂糖凝胶、快流速琼脂糖凝胶中的一种为载体，将上述棕褐色粉末和载体按1∶10～100克上样，采用不同浓度的洗脱液梯度洗脱，将洗脱液浓缩，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到人参多糖。
其中，选用的生晒参为4～5年龄的人参。
其中，选用的淀粉酶为α-淀粉酶，添加的比例为每克粗糖提取物添加1μl淀粉酶。
其中，步骤(6)中采用的洗脱液为Tris缓冲液，醋酸溶液，醋酸铵溶液，磷酸盐缓冲液，氯化钠溶液其中的一种。
其中，步骤(6)中采用的载体为纤维素DEAE-52、琼脂糖凝胶Sephadex G-25、Sephadex G-75、Sephadex G-100中的一种，交联琼脂糖凝胶载体为SepharoseCL-4B、Sepharose CL-6B中的一种，快流速琼脂糖凝胶载体为Sepharose 4FF、Sepharose 6FF、Q-Sepharose FF的一种。
本工艺采用酶解、脱色及除蛋白，柱层脱色分离，梯度洗脱，克服了已有技术中参多糖提取工艺的不足，人参多糖的纯度(苯酚硫酸法)可以达到96.5％以上，符合国家现行标准可用于静脉注射。而且产率高，成本低，反应条件易于控制。
本发明所具有的技术优势为：
1.人参多糖分离、纯化技术可靠，操作步骤简单，条件易于控制，适用于大规模生产。
2.所制得的人参多糖纯度高、安全性好，含量达96.5％以上，符合《中药、天然药物注射剂基本技术要求》(国食药监注[2007]743号)关于“有效成份制成的注射剂，主药成份含量应不少于90％。多成份制成的注射剂，所测成份应大于总固体量的80％”的质量标准。
3.所制得的人参多糖用于制备静脉注射人参多糖注射剂，具有生物利用度高，临床使用方便、安全有效、不良反应少等优点。
具体实施方式：
实施例1：
(1)选取生晒参，粉碎，过80目筛
(2)醇提：使用50％的乙醇回流反应4小时，乙醇与生晒参粉末的重量比为1∶7，过滤，将固体产物自然风干，其中的醇提物可用于回收皂苷；
(3)水提：将上述固体产物溶解于其5倍体积的水中，于80℃回流反应3小时得水提物，其固体废渣可用做饲料等；
(4)醇沉：将上述水提物于55℃减压浓缩成密度为1.02-1.1的液体，用70％的乙醇室温放置10小时，2000转/分离心，取沉淀，得粗糖提取物，粗糖提取物经水溶，再用90％的乙醇醇沉放置10小时，2000转/分离心，取沉淀，得精制糖提取物；
(5)酶解、脱色及除蛋白：按每克精制糖提取物添加1μlα-淀粉酶，置于90℃保温30分钟；加精制糖提取物重量15％的活性炭110℃回流40分钟脱色，离心；上清液Sevage法脱蛋白，重复4次，取水层浓缩，离心，干燥，得到棕褐色粉末；
(6)柱层脱色分离：采用纤维素DEAE-52为载体，将上述棕褐色粉末和载体按重量比1∶100上样，先以0.02mol/L醋酸铵洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到100流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第一部分多糖，为黄白色至棕黄色粉末；继续以0.3mol/L醋酸铵洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到80流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第二部分多糖，黄白色至棕黄色粉末；最后以0.5mol/L醋酸铵洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到70流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第三部分多糖，黄白色至棕黄色粉末；
将三个部分人参多糖合并得到人参多糖成品，经苯酚硫酸法测定，人参多糖的纯度为95.3％。
实施例2
(1)粉碎：选取生晒参，过10目筛；
(2)醇提：使用10％的乙醇回流反应3小时，乙醇与生晒参粉末的重量比为1∶2，过滤，将固体产物自然风干；
(3)水提：将上述固体产物溶解于其2倍体积的水中，于60℃回流反应3小时得水提物，其固体废渣可用做饲料等；
(4)醇沉：将上述水提物于35℃减压浓缩成密度为1.02～1.1的液体，用40％的乙醇室温放置10小时，3000转/分离心，取沉淀，得粗糖提取物，粗糖提取物经水溶，再用80％的乙醇醇沉放置10小时，3000转/分离心，取沉淀，得精制糖提取物；
(5)酶解、脱色及除蛋白：按每克精制糖提取物添加1μlα-淀粉酶，置于95℃保温30分钟；加精制糖提取物重量15％的活性炭95℃回流30分钟脱色，离心；上清液Sevage法脱蛋白，重复5次，取水层浓缩，离心，干燥，得到棕褐色粉末；
(6)柱层脱色分离：采用葡聚糖凝胶树脂Sephadex G-25为载体，将上述棕褐色粉末和载体按重量比1∶90上样，先以0.02mol/L醋酸铵洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到100流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第一部分多糖，黄白色至棕黄色粉末；继续以0.3mol/L醋酸铵洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到80流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第二部分多糖，黄白色至棕黄色粉末；最后以0.5mol/L醋酸铵洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到70流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第三部分多糖，黄白色至棕黄色粉末。
将三个部分人参多糖合并得到人参多糖成品，经苯酚硫酸法测定，人参多糖的纯度为95.7％。
实施例3
(1)选取生晒参，粉碎，过100目筛；
(2)醇提：使用100％的乙醇回流反应10小时，乙醇与生晒参粉末的重量比为1∶11，过滤，将固体产物自然风干，其中的醇提物可用于回收皂苷；
(3)水提：将上述固体产物溶解于其8倍体积的水中，于110℃回流反应5小时得水提物，其固体废渣可用做饲料等；
(4)醇沉：将上述水提物于90℃减压浓缩成密度为1.02～1.1的液体，用70％的乙醇室温放置48小时，5000转/分离心，取沉淀，得粗糖提取物，粗糖提取物经水溶，再用80％的乙醇醇沉放置48小时，5000转/分离心，取沉淀，得精制糖提取物；
(5)酶解、脱色及除蛋白：按每克精制糖提取物添加1μlα-淀粉酶，置于90～95℃保温20～30分钟；加精制糖提取物重量15％的活性炭95～110℃回流30～40分钟脱色，离心；上清液Sevage法脱蛋白，重复4～5次，取水层浓缩，离心，干燥，得到棕褐色粉末；
(6)柱层脱色分离：采用交联琼脂糖凝胶Sepharose CL-4B为载体，将上述棕褐色粉末和载体按重量比1∶10上样，先以0.002mol/L Tris缓冲液洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到100流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第一部分多糖，黄白色至棕黄色粉末；继续以0.02mol/L Tris缓冲液洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到80流分，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第二部分多糖，黄白色至棕黄色粉末；最后以0.1mol/LTris缓冲液洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到70流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第三部分多糖，黄白色至棕黄色粉末。
将三个部分人参多糖合并得到人参多糖成品，经苯酚硫酸法测定，人参多糖的纯度为96.2％。
实施例4
(1)选取生晒参，粉碎，过80目筛；
(2)醇提：使用75％的乙醇回流反应8小时，乙醇与生晒参粉末的重量比为1∶7，过滤，将固体产物自然风干，其中的醇提物可用于回收皂苷；
(3)水提：将上述固体产物溶解于其8倍体积的水中，于110℃回流反应3小时得水提物，其固体废渣可用做饲料等；
(4)醇沉：将上述水提物于90℃减压浓缩成密度为1.02～1.1的液体，用80％的乙醇室温放置45小时，5000转/分离心，取沉淀，得粗糖提取物，粗糖提取物经水溶，再用80％的乙醇醇沉放置45小时，5000转/分离心，取沉淀，得精制糖提取物；
(5)酶解、脱色及除蛋白：按每克精制糖提取物添加1μlα-淀粉酶，置于95℃保温30分钟；加精制糖提取物重量20％的活性炭110℃回流40分钟脱色，离心；上清液Sevage法脱蛋白，重复5次，取水层浓缩，离心，干燥，得到棕褐色粉末；
(6)柱层脱色分离：采用快流速琼脂糖凝胶Sepharose 4FF为载体，将上述棕褐色粉末和载体按重量比1∶75上样，先以0.002mol/L磷酸盐缓冲液洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到100流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第一部分多糖，黄白色至棕黄色粉末；继续以0.02mol/L磷酸盐缓冲液洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到80流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第二部分多糖，黄白色至棕黄色粉末；最后以0.1mol/L磷酸盐缓冲液洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到70流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第三部分多糖，黄白色至棕黄色粉末。
将三个部分人参多糖合并得到人参多糖成品，经苯酚硫酸法测定，人参多糖的纯度为96.5％。
实施例5
(1)选取生晒参，粉碎，过80目筛；
(2)醇提：使用75％的乙醇回流反应8小时，乙醇与生晒参粉末的重量比为1∶10，过滤，将固体产物自然风干，其中的醇提物可用于回收皂苷；
(3)水提：将上述固体产物溶解于其8倍体积的水中，于100℃回流反应4小时得水提物，其固体废渣可用做饲料等；
(4)醇沉：将上述水提物于35℃减压浓缩成密度为1.02～1.1的液体，用75％的乙醇室温放置42小时，4000转/分离心，取沉淀，得粗糖提取物，粗糖提取物经水溶再用90％的乙醇醇沉放置42小时，4000转/分离心，取沉淀，得精制糖提取物；
(5)酶解、脱色及除蛋白：按每克精制糖提取物添加1μlα-淀粉酶，置于90℃保温25分钟；加精制糖提取物重量20％的活性炭95℃回流40分钟脱色，离心；上清液Sevage法脱蛋白，重复4次，取水层浓缩，离心，干燥，得到棕褐色粉末；
(6)柱层脱色分离：采用快流速琼脂糖凝胶Sepharose 6FF为载体，将上述棕褐色粉末和载体按重量比1∶80上样，先以0.02mol/L氯化钠溶液洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到100流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第一部分多糖，为黄白色至棕黄色粉末；继续以0.1mol/L氯化钠溶液洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到80流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第二部分多糖，为黄白色至棕黄色粉末；最后以0.5mol/L氯化钠溶液洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到70流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第三部分多糖，为黄白色至棕黄色粉末。
将三个部分人参多糖合并得到人参多糖成品，经苯酚硫酸法测定，人参多糖的纯度为96.3％。
实施例6
(1)选取生晒参，粉碎，过90目筛；
(2)醇提：使用75％的乙醇回流反应6小时，乙醇与生晒参粉末的重量比为1∶9，过滤，将固体产物自然风干，其中的醇提物可用于回收皂苷；
(3)水提：将上述固体产物溶解于其7倍体积的水中，于95℃回流反应5小时得水提物，其固体废渣可用做饲料等；
(4)醇沉：将上述水提物于55℃减压浓缩成密度为1.02～1.1的液体，用50％的乙醇室温沉淀10小时，4000转/分离心，取沉淀，得粗糖提取物，粗糖提取物经水溶再用80％的乙醇沉淀10小时，4000转/分离心，取沉淀，得精制糖提取物；
(5)酶解、脱色及除蛋白：按每克精制糖提取物添加1μlα-淀粉酶，置于90℃保温25分钟；加入精制糖提取物重量18％的活性炭100℃回流45分钟脱色，离心；上清液Sevage法脱蛋白，重复4次，取水层浓缩，离心，干燥，得到棕褐色粉末；
(6)柱层脱色分离：采用快流速琼脂糖凝胶Q-Sepharose FF为载体，将上述棕褐色粉末和载体按重量比1∶70上样，先以0.02mol/L氯化钠溶液洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到100流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第一部分多糖，为黄白色至棕黄色粉末；继续以0.1mol/L氯化钠溶液洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到80流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第二部分多糖为黄白色至棕黄色粉末；最后以0.8mol/L氯化钠溶液洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到70流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第三部分多糖，为黄白色至棕黄色粉末。
将三个部分人参多糖合并得到人参多糖成品，经苯酚硫酸法测定，人参多糖的纯度为96.5％。
实施例7
(1)选取生晒参，粉碎，过100目筛；
(2)醇提：使用100％的乙醇回流反应10小时，乙醇与生晒参粉末的重量比为1∶11，过滤，将固体产物自然风干，其中的醇提物可用于回收皂苷；
(3)水提：将上述固体产物溶解于其8倍体积的水中，于110℃回流反应5小时得水提物，其固体废渣可用做饲料等；
(4)醇沉：将上述水提物于90℃减压浓缩成密度为1.02～1.1的液体，用70％的乙醇室温放置48小时，5000转/分离心，取沉淀，得粗糖提取物，粗糖提取物经水溶再用90％的乙醇醇沉放置48小时，5000转/分离心，取沉淀，得精制糖提取物；
(5)酶解、脱色及除蛋白：按每克精制糖提取物添加1μlα-淀粉酶，置于95℃保温20～30分钟；加入精制糖提取物重量20％的活性炭110℃回流30～40分钟脱色，离心；上清液Sevage法脱蛋白，重复4～5次，取水层浓缩，离心，干燥，得到棕褐色粉末；
(6)柱层脱色分离：采用交联琼脂糖凝胶Sepharose CL-6B为载体，将上述棕褐色粉末和载体按1∶50克上样，先以0.01mol/L醋酸溶液洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到100流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第一部分多糖，为黄白色至棕黄色粉末；继续以0.1mol/L醋酸溶液洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到80流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第二部分多糖，为黄白色至棕黄色粉末；最后以0.8mol/L醋酸溶液洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到70流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第三部分多糖，为黄白色至棕黄色粉末；
将三个部分人参多糖合并得到人参多糖成品，经苯酚硫酸法测定，人参多糖的纯度为96.2％。
实施例8
(1)粉碎：选取生晒参，过10目筛；
(2)醇提：使用10％的乙醇回流反应3小时，乙醇与生晒参粉末的重量比为1∶2，过滤，将固体产物自然风干；
(3)水提：将上述固体产物溶解于其2倍体积的水中，于60℃回流反应3小时得水提物，其固体废渣可用做饲料等；
(4)醇沉：将上述水提物于35℃减压浓缩成密度为1.02～1.1液体，用40％的乙醇室温放置10小时，3000转/分离心，取沉淀，得粗糖提取物，粗糖提取物经水溶再用80％的乙醇醇沉放置10小时，3000转/分离心，取沉淀，得精制糖提取物；
(5)酶解、脱色及除蛋白：按每克精制糖提取物添加1μlα-淀粉酶，置于90℃保温30分钟；加入精制糖提取物重量15％的活性炭95℃回流30分钟脱色，离心；上清液Sevage法脱蛋白，重复5次，取水层浓缩，离心，干燥，得到棕褐色粉末；
(6)柱层脱色分离：采用葡聚糖凝胶树脂Sephadex G-75为载体，将上述棕褐色粉末和载体按重量比1∶50上样，先以0.01mol/L醋酸铵溶液洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到100流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第一部分多糖，为为黄白色至棕黄色粉末；继续以0.02mol/L醋酸铵溶液洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到80流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第二部分多糖，为黄白色至棕黄色粉末；最后以0.1mol/L醋酸铵溶液洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到70流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第三部分多糖，为黄白色至棕黄色粉末；
将三个部分人参多糖合并得到人参多糖成品，经苯酚硫酸法测定，人参多糖的纯度为95.8％。
实施例9
(1)粉碎：选取生晒参，过10目筛；
(2)醇提：使用10％的乙醇回流反应3小时，乙醇与生晒参粉末的重量比为1∶2，过滤，将固体产物自然风干；
(3)水提：将上述固体产物溶解于其2倍体积的水中，于60℃回流反应3小时得水提物，其固体废渣可用做饲料等；
(4)醇沉：将上述水提物于35℃减压浓缩成密度为1.02～1.1的液体，用40％的乙醇室温放置10小时，3000转/分离心，取沉淀，得粗糖提取物，粗糖提取物经水溶再用80％的乙醇醇沉放置10小时，3000转/分离心，取沉淀，得精制糖提取物；
(5)酶解、脱色及除蛋白：按每克精制糖提取物添加1.1μl淀粉酶，置于90℃保温30分钟；加入精制糖提取物重量15％的活性炭95℃回流30分钟脱色，离心；上清液Sevage法脱蛋白，重复5次，取水层浓缩，离心，干燥，得到棕褐色粉末；
(6)柱层脱色分离：采用葡聚糖凝胶树脂Sephadex G-100为载体，将上述棕褐色粉末和载体按重量比1∶50上样，先以0.01mol/L Tris缓冲液洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到100流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第一部分多糖，为黄白色至棕黄色粉末；继续以0.02mol/L Tris缓冲液洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到80流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第二部分多糖，为黄白色至棕黄色粉末；最后以0.1mol/L Tris缓冲液洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到70流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第三部分多糖，为黄白色至棕黄色粉末。
将三个部分人参多糖合并得到人参多糖成品，经苯酚硫酸法测定，人参多糖的纯度为96.3％。
实施例10苯酚硫酸法测定人参多糖中总糖含量
实验方法：精密称取标准单糖或单糖混合物100mg，配制成浓度为0.1mg/ml的溶液，分别取0.2ml，0.4ml，0.6ml，0.8ml，1.0ml，依次补加蒸馏水至1ml。以蒸馏水为对照，分别向其中加入6％的苯酚0.5ml，浓硫酸2.5ml，充分振荡摇匀后，冷至室温，490nm处测吸光值。准确称取适当多糖样品配成浓度为0.1mg/ml的溶液，按同法处理后，根据多糖样品的吸光值，对照标准曲线计算出人参多糖样品的总糖含量。
实验结果：
以标准葡萄糖为对照品
| 样品 | 人参多糖含量(重量百分比) |
| 实施例1所得样品 | 95.3％ |
| 实施例2所得样品 | 95.7％ |
| 实施例3所得样品 | 96.2％ |
| 实施例4所得样品 | 96.5％ |
| 实施例5所得样品 | 96.3％ |
| 实施例6所得样品 | 96.5％ |
| 实施例7所得样品 | 96.2％ |
| 实施例8所得样品 | 95.8％ |
| 实施例9所得样品 | 96.3％ |
实施例11碘显色法测定人参多糖中淀粉含量
实验方法：精密称取标准可溶性淀粉100mg，置于100ml容量瓶中，加1ml无水乙醇，10ml蒸馏水使其润湿，再加2ml 10％的NaOH溶液，混匀置于80℃水浴中热分散15min，冷至室温后，补水至刻度。分别取上述分散液0.2ml，0.4ml，0.6ml，0.8ml，1.0ml置于100ml容量瓶中，加水50ml，6M盐酸一滴使其微酸化，加2.5ml配制好的碘试液(碘0.20g，碘化钾2.00g，加水定容到100ml)，以水稀释至刻度于620nm处测吸光值。准确称取100mg多糖样品，按同法处理后，根据样品的吸光值，对照标准曲线计算出样品的淀粉含量。
实验结果：
| 样品 | 淀粉含量(重量百分比) |
| 实施例1样品 | 0.65％ |
| 实施例2样品 | 0.56％ |
| 实施例3样品 | 0.73％ |
| 实施例4样品 | 0.58％ |
| 实施例5样品 | 0.67％ |
| 实施例6样品 | 0.54％ |
| 实施例7样品 | 0.58％ |
| 实施例8样品 | 0.64％ |
| 实施例9样品 | 0.72％ |
实施例12考马斯亮蓝法测定人参多糖中蛋白含量
实验方法：精密配置0.1mg/ml的牛血清蛋白溶液合物100mg，分别取0.2ml，0.4ml，0.6ml，0.8ml，1.0ml，依次补加蒸馏水至1ml。然后分别考马斯亮蓝试液4ml，立即混匀，5min后在595nm处测吸光值。准确称取适量多糖样品，按同法处理后，根据实施例1-9样品的吸光值，对照标准曲线计算出样品的蛋白含量。
考马斯亮蓝试液的配制：10mg考马斯亮蓝溶于95％的乙醇5ml，再加入85％的磷酸10ml，加蒸馏水稀释至100ml，过滤备用。
实验结果：
| 样品 | 蛋白质含量(重量百分比) |
| 实施例1样品 | 0.55％ |
| 实施例2样品 | 0.45％ |
| 实施例3样品 | 0.63％ |
| 实施例4样品 | 0.35％ |
| 实施例5样品 | 0.46％ |
| 实施例6样品 | 0.47％ |
| 实施例7样品 | 0.53％ |
| 实施例8样品 | 0.57％ |
| 实施例9样品 | 0.53％ |
实施例13半乳糖醛法测定人参多糖含量
实验方法：
1.半乳糖醛酸溶液的制备：精密称取60℃真空干燥至恒重的半乳糖醛酸100mg，置100ml量瓶中，加水至刻度，摇匀。精密量取10ml，置100ml量瓶中，加水至刻度，摇匀。
2.样品溶液的制备：精密称取实施例样品1-9各50mg，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。
3.测定法：精密量取半乳糖醛酸溶液、实施例样品1-9溶液及水各1ml。分别加入0.25mol/L硼砂硫酸溶液6ml，置水浴中加热30分钟，放冷，再分别加入0.125％咔唑无水乙醇溶液0.4ml，置水浴中加热10分钟，放冷至室温，照分光光度法(中国药典2000年版一部附录VB)试验，在530nm冷至室温，测定吸收度，计算。
测定结果：
以D-半乳糖醛酸(C6H10O7)为对照品：
| 样品 | 人参多糖含量(重量百分比) |
| 实施例1样品 | 55.3％ |
| 实施例2样品 | 55.7％ |
| 实施例3样品 | 56.2％ |
| 实施例4样品 | 55.5％ |
| 实施例5样品 | 55.8％ |
| 实施例6样品 | 56.2％ |
| 实施例7样品 | 55.7％ |
| 实施例8样品 | 55.4％ |
| 实施例9样品 | 56.0％ |
本实验人参多糖以D-半乳糖醛酸(C6H10O7)计，重量百分含量达到55％以上。
Claims (3)
1.一种人参多糖的制备方法，其特征在于采用以下方式制备：
(1)粉碎：选取生晒参，过10～100目筛；
(2)醇提：使用10～100％的乙醇回流反应3～10小时，乙醇与生晒参粉末的重量比为1∶2～11，过滤，将固体产物自然风干；
(3)水提：向上述风干的固体产物中加入其固体产物2～8倍体积的水，于60～110℃回流反应1～5小时得水提物；
(4)醇沉：将上述水提物于35～90℃减压浓缩成密度为1.02～1.1的液体，用40～100％的乙醇室温放置10～48小时，离心，沉淀，得粗糖提取物，粗糖提取物经水溶后再加入80～100％的乙醇放置10～48小时，离心，取沉淀，得精制糖提取物；
(5)酶解、脱色及除蛋白：取上述精制糖提取物按比例添加淀粉酶，置于85～95℃保温20～40分钟；按精制糖重量10～20％添加活性炭，于90～110℃回流30～45分钟脱色、离心；取上清液Sevage法脱蛋白，重复3～5次
(6)取水层浓缩、离心、干燥，得到棕褐色粉末；
(7)柱层脱色分离：采用葡聚糖凝胶树脂、交联琼脂糖凝胶、快流速琼脂糖凝胶中的一种为载体，将上述棕褐色粉末和载体按重量比1∶10～100上样，采用不同浓度的洗脱液梯度洗脱，将洗脱液浓缩，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到人参多糖；
所述步骤(5)中的淀粉酶为α-淀粉酶，添加的比例为每克精制糖提取物添加1～1.2μl淀粉酶；
所述步骤(7)中采用的洗脱液为Tris缓冲液，醋酸溶液，醋酸铵溶液，磷酸盐缓冲液，氯化钠溶液其中的一种，其中Tris缓冲液作为洗脱液的浓度分别为0.002mol/L，0.01mol/L，0.1
mol/L；醋酸溶液作为洗脱液的浓度分别为0.01mol/L，0.1mol/L，0.8mol/L；醋酸铵溶液作为洗脱液的浓度分别为0.01mol/L，0.2mol/L，0.5mol/L；磷酸盐缓冲液作为洗脱液的浓度分别为0.002mol/L，0.02mol/L，0.1mol/L；氯化钠溶液作为洗脱液的浓度分别为0.02mol/L，0.1mol/L，0.5mol/L；
所述步骤(7)中采用的葡聚糖凝胶树脂载体为DEAE-52、Sephadex G-25、Sephadex G-75、Sephadex G-100中的一种，交联琼脂糖凝胶载体为Sepharose CL-4B、Sepharose CL-6B中的一种，快流速琼脂糖凝胶载体为Sepharose 4FF、Sepharose 6FF、Q-Sepharose FF的一种。
2.一种如权利要求1所述的人参多糖的制备方法，其特征在于：
(1)粉碎：选取生晒参，过10～80目筛；
(2)醇提：使用50～75％的乙醇回流反应4～8小时，乙醇与生晒参粉末的重量比为1∶7～11，过滤，将固体产物自然风干；
(3)水提：向上述风干的固体产物中加入其固体产物5～8倍的水，于80～110℃回流反应3-5小时得水提物；
(4)醇沉：将上述水提物于55～90℃减压浓缩成密度为1.02～1.1的液体，用50～100％的乙醇室温放置10～40小时，离心，取沉淀，得粗糖提取物，粗糖提取物经水溶后再加入80～100％的乙醇醇沉放置10～40小时，离心，取沉淀，得精制糖提取物；
(5)酶解、脱色及除蛋白：取上述精制糖提取物按比例添加淀粉酶，置于90～95℃保温20～30分钟；加入精制糖提取物重量15～20％的活性炭95～110℃回流30～40分钟脱色，离心；上清液Sevage法脱蛋白，重复4～5次，取水层浓缩、离心、干燥，得到棕褐色粉末；
(6)柱层脱色分离：采用葡聚糖凝胶树脂、交联琼脂糖凝胶、快流速琼脂糖凝胶中的一种为载体，将上述棕褐色粉末和载体按重量比1∶10～100上样，采用不同浓度的洗脱液梯度洗脱，将洗脱液浓缩，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到人参多糖。
3.一种如权利要求1所述的人参多糖的制备方法，其特征在于：采用的生晒参为4～5年龄的人造参。
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