CN104945533B - 一种活性玉米须纯多糖的制备方法 - Google Patents

一种活性玉米须纯多糖的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种活性玉米须纯多糖的制备方法,属于天然植物活性多糖的提取分离技术领域。该活性玉米须纯多糖经过玉米须的预处理、脱脂、粗多糖制备及多糖纯化步骤,综合运用超滤和离子层析分离技术制备而得,所得的玉米须纯多糖是均一多糖,免疫活性研究发现,该方法制备的玉米须纯多糖具有良好的免疫调节活性。

Description

一种活性玉米须纯多糖的制备方法
技术领域
本发明涉及一种活性玉米须纯多糖的制备方法,属于天然植物活性多糖的提取分离技术领域。
背景技术
玉米须(Stigmata madis)别名玉米麦、棒子毛,禾本科玉蜀属植物玉米(Zea mays L.)的花柱,是一种传统的中草药,在《滇南本草》、《中药大辞典》等都有记载,为《中华人民共和国卫生部药材标准》1985版(一部)收录的常用药材品种。
我国是玉米生产大国,玉米年产量居世界第2位。因此,作为玉米副产物的玉米须的资源十分丰富。
多糖类化合物是玉米须所含重要的化学成分之一,现已证明,玉米须中多糖含量较高,初步研究表明玉米须多糖具有护肝、降糖、调节免疫、抗菌、抗肿瘤、利尿和解热等作用,故玉米须多糖类是玉米须的主要有效成分。临床试验证实,多糖类还可作为肿瘤化学治疗和放射治疗的有效辅助治疗药,在医药、食品方面均有很好的应用前景和开发价值。
目前玉米须多糖的生物活性研究主要集中在多糖粗品,多糖含量较低,还没有玉米须多糖纯品。本发明综合运用超滤和离子层析分离技术,建立一种玉米须多糖纯品的制备方法。免疫活性研究发现,该方法制备的玉米须纯多糖具有良好的免疫调节活性。
发明内容
本发明提供了一种活性玉米须纯多糖的制备方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:一种活性玉米须纯多糖的制备方法,包括如下步骤:
1. 玉米须的预处理
玉米须除杂后,于60-70 ℃下烘干,置于干燥环境自然冷却后粉碎至60目。
2.玉米须的脱脂
玉米须粉按质量体积比1:5加入95%乙醇或无水乙醇浸泡12小时,减压过滤,滤渣同法再重复浸泡1次后于阴凉处自然干燥,并于干燥环境保存备用。
3.粗多糖制备
按1:15质量体积比加入蒸馏水,在95-100 ℃下浸提2小时。提取液5000 r/min离心10 min,分别收集上清和沉淀。沉淀同法再浸提1次。合并两次提取液。提取液经12000 r/min高速离心20 min,制备多糖浸提清液。浸提清液经截留分子量为10 KDa超滤膜超滤,去除小分子物质。最后将浓缩液继续超滤至干物质含量达15-20%,冷冻干燥,获得玉米须粗多糖粉。
4.多糖纯化
制备粗多糖溶液,10000 r/min 离心20 min。经DEAE-Sepharose Fast F1ow离子交换柱层析(2.6 mm×100 cm),先用蒸馏水洗脱,再用NaCl梯度洗脱,最大浓度2.0mol/L。上样量:14 mg/mL,共28 mL。收集18 mL/管,样品峰10-23管,浓缩后,用截留分子量为8-12kDa透析袋,蒸馏水透析2天,冷冻干燥。
本发明的有益效果是:本发明综合运用超滤和离子层析分离技术,建立一种玉米须多糖纯品的制备方法,本发明的原料玉米须资源丰富,所得的玉米须纯多糖是均一多糖,免疫活性研究发现,该方法制备的玉米须纯多糖具有良好的免疫调节活性。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明进一步说明。
图1为本发明的HPSEC图谱。
具体实施方式
实施例1
一种活性玉米须纯多糖的制备方法,包括如下步骤:
1. 玉米须的预处理
玉米须除杂后,于65 ℃下烘干,置于干燥环境自然冷却后粉碎至60目。
2.玉米须的脱脂
玉米须粉按质量体积比1:5加入95%乙醇或无水乙醇浸泡12小时,减压过滤,滤渣同法再重复浸泡1次后于阴凉处自然干燥,并于干燥环境保存备用。
3.粗多糖制备
按1:15质量体积比加入蒸馏水,在95 ℃下浸提2小时。提取液5000 r/min离心10min,分别收集上清和沉淀。沉淀同法再浸提1次。合并两次提取液。提取液经12000 r/min高速离心20 min,制备多糖浸提清液。浸提清液经截留分子量为10 KDa超滤膜超滤,去除小分子物质。最后将浓缩液继续超滤至干物质含量达20%,冷冻干燥,获得玉米须粗多糖粉。
4.多糖纯化
制备粗多糖溶液,10000 r/min 离心20 min。经DEAE-Sepharose Fast F1ow离子交换柱层析(2.6 mm×100 cm),先用蒸馏水洗脱,再用NaCl梯度洗脱,最大浓度2.0 mol/L。上样量:14 mg/mL,共28 mL。收集18 mL/管,样品峰10-23管峰,浓缩后,用截留分子量为8-12 kDa透析袋,蒸馏水透析2天,冷冻干燥。
纯度鉴定:
HPSEC层析:配置测试样品1.4 mg/mL,于12000 r/min 4 ℃离心20 min,取上清液上样分析。
HPLC的具体分析测试条件如下:岛津高效液相色谱系统:泵LC-20AT,示差检测器RID-10A,柱温箱CTO-20A;柱TSK 3000 PWXL(7.8 mm×300 mm);流速为0.5 mL/min,柱温为30±0.1 ℃,上样20 μL。流动相为pH为5.6的0.1 mol/L NaH2PO3和0.3 mol/L NaNO3
结果见图1。样品洗脱后呈现均匀对称峰,表明该多糖是均一多糖。经测定多糖分子量为166.2 KDa。
免疫调节作用研究:
颈椎脱臼处死小鼠,无菌条件下取脾,置于100目灭菌不锈钢筛网上,用注射器内塞将脾研碎,过筛,用PBS冲洗网筛2-3遍,脾细胞的悬液转入无菌的离心管中,再加入PBS至30-40 mL,400 G离心6 min,收集细胞,在室温下加NH4Cl溶液(1.5 mL/只),不断枪打或摇晃混匀细胞10分钟,以裂解红细胞,加PBS至30-40 mL,400 G离心5 min,去上清,加入少量RPMI1640培养基细胞计数仪计数后,用RPMI1640稀释细胞悬液至2×106个/mL。取180 µL细胞悬浮液加至96孔板中,分别加入20 µL的不同的样品和阳性对照植物血凝素,阴性对照PBS。在37°C和5% CO2 的条件下培养3天后,用ELISA自动读板仪分别测定570 nm 和 600nm 的吸光度,加入20 µL Alamar Blue显色剂,培养6-8小时,再次测定570 nm 和 600 nm的吸光度,然后根据Alamer Blue Assay给的公式计算各样品对淋巴细胞的激活率。
淋巴细胞增殖率(%)=[117216×Aλ570(sample)-80586×Aλ600(sample)]
/[117216×Aλ570(control)-80586×Aλ600(control)]×100%;
实验结果显示,在低浓度(50 μg/mL)时,增值率为140%;当浓度增加到200 μg/mL增值率达到213%;继续增加浓度至500 μg/mL时,增值率达到289%(阳性对照60 μg/mL植物凝聚素增值率272%)。表明玉米须纯多糖具有较好的刺激淋巴细胞增殖作用,且呈现剂量依赖关系。

Claims (1)

1.一种活性玉米须纯多糖的制备方法,包括如下步骤:
1、玉米须的预处理
玉米须除杂后,于60-70 ℃下烘干,置于干燥环境自然冷却后粉碎至60目;
2、玉米须的脱脂
玉米须粉按质量体积比1:5加入95%乙醇或无水乙醇浸泡12小时,减压过滤,滤渣同法再重复浸泡1次后于阴凉处自然干燥,并于干燥环境保存备用;
3、粗多糖制备
按1:15质量体积比加入蒸馏水,在95-100 ℃下浸提2小时;提取液5000 r/min离心10min,分别收集上清和沉淀;沉淀同法再浸提1次,合并两次提取液;提取液经12000 r/min高速离心20 min,制备多糖浸提清液,浸提清液经截留分子量为10 kDa超滤膜超滤,去除小分子物质,最后将浓缩液继续超滤至干物质含量达15-20%,冷冻干燥,获得玉米须粗多糖粉;
4、多糖纯化
制备粗多糖溶液,10000 r/min离心20 min,经型号为2.6 mm×100 cm DEAE-Sepharose Fast F1ow离子交换柱层析,先用蒸馏水洗脱,再用NaCl梯度洗脱,最大浓度2.0mol/L,上样量:14 mg/mL,共28 mL,收集18 mL/管,样品峰10-23管,浓缩后,用截留分子量为8-12 kDa透析袋,蒸馏水透析2天,冷冻干燥得到分子量为166.2kDa的均一多糖。
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