CN104945533B - 一种活性玉米须纯多糖的制备方法 - Google Patents
一种活性玉米须纯多糖的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种活性玉米须纯多糖的制备方法，属于天然植物活性多糖的提取分离技术领域。该活性玉米须纯多糖经过玉米须的预处理、脱脂、粗多糖制备及多糖纯化步骤，综合运用超滤和离子层析分离技术制备而得，所得的玉米须纯多糖是均一多糖，免疫活性研究发现，该方法制备的玉米须纯多糖具有良好的免疫调节活性。
Description
技术领域
本发明涉及一种活性玉米须纯多糖的制备方法，属于天然植物活性多糖的提取分离技术领域。
背景技术
玉米须(Stigmata madis)别名玉米麦、棒子毛，禾本科玉蜀属植物玉米(Zea mays L．)的花柱，是一种传统的中草药，在《滇南本草》、《中药大辞典》等都有记载，为《中华人民共和国卫生部药材标准》1985版(一部)收录的常用药材品种。
我国是玉米生产大国，玉米年产量居世界第2位。因此，作为玉米副产物的玉米须的资源十分丰富。
多糖类化合物是玉米须所含重要的化学成分之一，现已证明，玉米须中多糖含量较高，初步研究表明玉米须多糖具有护肝、降糖、调节免疫、抗菌、抗肿瘤、利尿和解热等作用，故玉米须多糖类是玉米须的主要有效成分。临床试验证实，多糖类还可作为肿瘤化学治疗和放射治疗的有效辅助治疗药，在医药、食品方面均有很好的应用前景和开发价值。
目前玉米须多糖的生物活性研究主要集中在多糖粗品，多糖含量较低，还没有玉米须多糖纯品。本发明综合运用超滤和离子层析分离技术，建立一种玉米须多糖纯品的制备方法。免疫活性研究发现，该方法制备的玉米须纯多糖具有良好的免疫调节活性。
发明内容
本发明提供了一种活性玉米须纯多糖的制备方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种活性玉米须纯多糖的制备方法，包括如下步骤：
1. 玉米须的预处理
玉米须除杂后，于60-70 ℃下烘干，置于干燥环境自然冷却后粉碎至60目。
2.玉米须的脱脂
玉米须粉按质量体积比1:5加入95%乙醇或无水乙醇浸泡12小时，减压过滤，滤渣同法再重复浸泡1次后于阴凉处自然干燥，并于干燥环境保存备用。
3.粗多糖制备
按1:15质量体积比加入蒸馏水，在95-100 ℃下浸提2小时。提取液5000 r/min离心10 min，分别收集上清和沉淀。沉淀同法再浸提1次。合并两次提取液。提取液经12000 r/min高速离心20 min，制备多糖浸提清液。浸提清液经截留分子量为10 KDa超滤膜超滤，去除小分子物质。最后将浓缩液继续超滤至干物质含量达15-20%，冷冻干燥，获得玉米须粗多糖粉。
4.多糖纯化
制备粗多糖溶液，10000 r/min 离心20 min。经DEAE-Sepharose Fast F1ow离子交换柱层析（2.6 mm×100 cm），先用蒸馏水洗脱，再用NaCl梯度洗脱，最大浓度2.0mol/L。上样量：14 mg/mL，共28 mL。收集18 mL/管，样品峰10-23管，浓缩后，用截留分子量为8-12kDa透析袋，蒸馏水透析2天，冷冻干燥。
本发明的有益效果是：本发明综合运用超滤和离子层析分离技术，建立一种玉米须多糖纯品的制备方法，本发明的原料玉米须资源丰富，所得的玉米须纯多糖是均一多糖，免疫活性研究发现，该方法制备的玉米须纯多糖具有良好的免疫调节活性。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明进一步说明。
图1为本发明的HPSEC图谱。
具体实施方式
实施例1
一种活性玉米须纯多糖的制备方法，包括如下步骤：
1. 玉米须的预处理
玉米须除杂后，于65 ℃下烘干，置于干燥环境自然冷却后粉碎至60目。
2.玉米须的脱脂
玉米须粉按质量体积比1:5加入95%乙醇或无水乙醇浸泡12小时，减压过滤，滤渣同法再重复浸泡1次后于阴凉处自然干燥，并于干燥环境保存备用。
3.粗多糖制备
按1:15质量体积比加入蒸馏水，在95 ℃下浸提2小时。提取液5000 r/min离心10min，分别收集上清和沉淀。沉淀同法再浸提1次。合并两次提取液。提取液经12000 r/min高速离心20 min，制备多糖浸提清液。浸提清液经截留分子量为10 KDa超滤膜超滤，去除小分子物质。最后将浓缩液继续超滤至干物质含量达20%，冷冻干燥，获得玉米须粗多糖粉。
4.多糖纯化
制备粗多糖溶液，10000 r/min 离心20 min。经DEAE-Sepharose Fast F1ow离子交换柱层析（2.6 mm×100 cm），先用蒸馏水洗脱，再用NaCl梯度洗脱，最大浓度2.0 mol/L。上样量：14 mg/mL，共28 mL。收集18 mL/管，样品峰10-23管峰，浓缩后，用截留分子量为8-12 kDa透析袋，蒸馏水透析2天，冷冻干燥。
纯度鉴定：
HPSEC层析：配置测试样品1.4 mg/mL，于12000 r/min 4 ℃离心20 min，取上清液上样分析。
HPLC的具体分析测试条件如下：岛津高效液相色谱系统：泵LC-20AT，示差检测器RID-10A，柱温箱CTO-20A；柱TSK 3000 PWXL（7.8 mm×300 mm）；流速为0.5 mL/min，柱温为30±0.1 ℃，上样20 μL。流动相为pH为5.6的0.1 mol/L NaH2PO3和0.3 mol/L NaNO3。
结果见图1。样品洗脱后呈现均匀对称峰，表明该多糖是均一多糖。经测定多糖分子量为166.2 KDa。
免疫调节作用研究：
颈椎脱臼处死小鼠，无菌条件下取脾，置于100目灭菌不锈钢筛网上，用注射器内塞将脾研碎，过筛，用PBS冲洗网筛2-3遍，脾细胞的悬液转入无菌的离心管中，再加入PBS至30-40 mL，400 G离心6 min，收集细胞，在室温下加NH4Cl溶液（1.5 mL/只），不断枪打或摇晃混匀细胞10分钟，以裂解红细胞，加PBS至30-40 mL，400 G离心5 min，去上清，加入少量RPMI1640培养基细胞计数仪计数后，用RPMI1640稀释细胞悬液至2×106个/mL。取180 µL细胞悬浮液加至96孔板中，分别加入20 µL的不同的样品和阳性对照植物血凝素，阴性对照PBS。在37°C和5% CO2 的条件下培养3天后，用ELISA自动读板仪分别测定570 nm 和 600nm 的吸光度，加入20 µL Alamar Blue显色剂，培养6-8小时，再次测定570 nm 和 600 nm的吸光度，然后根据Alamer Blue Assay给的公式计算各样品对淋巴细胞的激活率。
淋巴细胞增殖率(%)=[117216×Aλ570(sample)-80586×Aλ600(sample)]
/[117216×Aλ570(control)-80586×Aλ600(control)]×100%；
实验结果显示，在低浓度（50 μg/mL）时，增值率为140%；当浓度增加到200 μg/mL增值率达到213%；继续增加浓度至500 μg/mL时，增值率达到289%（阳性对照60 μg/mL植物凝聚素增值率272%）。表明玉米须纯多糖具有较好的刺激淋巴细胞增殖作用，且呈现剂量依赖关系。
Claims (1)
1.一种活性玉米须纯多糖的制备方法，包括如下步骤：
1、玉米须的预处理
玉米须除杂后，于60-70 ℃下烘干，置于干燥环境自然冷却后粉碎至60目；
2、玉米须的脱脂
玉米须粉按质量体积比1:5加入95%乙醇或无水乙醇浸泡12小时，减压过滤，滤渣同法再重复浸泡1次后于阴凉处自然干燥，并于干燥环境保存备用；
3、粗多糖制备
按1:15质量体积比加入蒸馏水，在95-100 ℃下浸提2小时；提取液5000 r/min离心10min，分别收集上清和沉淀；沉淀同法再浸提1次，合并两次提取液；提取液经12000 r/min高速离心20 min，制备多糖浸提清液，浸提清液经截留分子量为10 kDa超滤膜超滤，去除小分子物质，最后将浓缩液继续超滤至干物质含量达15-20%，冷冻干燥，获得玉米须粗多糖粉；
4、多糖纯化
制备粗多糖溶液，10000 r/min离心20 min，经型号为2.6 mm×100 cm DEAE-Sepharose Fast F1ow离子交换柱层析，先用蒸馏水洗脱，再用NaCl梯度洗脱，最大浓度2.0mol/L，上样量：14 mg/mL，共28 mL，收集18 mL/管，样品峰10-23管，浓缩后，用截留分子量为8-12 kDa透析袋，蒸馏水透析2天，冷冻干燥得到分子量为166.2kDa的均一多糖。
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