CN110141602A - 一种桑叶生物碱的提取方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种桑叶生物碱的提取方法及应用，属于桑叶生物碱应用技术领域，所述方法包括以下步骤：1)将桑叶与水混合进行超声提取1～3次，合并提取液获得桑叶生物碱粗提液；2)将所述桑叶生物碱粗提液依次经过减压浓缩、D101大孔树脂吸附、阳离子树脂吸附、AB‑8大孔树脂吸附后获得桑叶生物碱；步骤1)中所述超声提取的功率为500～700W，所述超声提取的温度为55～65℃；每一次超声提取的时间为50～70min。所述提取方法获得的桑叶生物碱中总生物碱的含量高；能显著降低肝纤维化标志物的水平，对小鼠肝纤维化具有改善作用。

Description

一种桑叶生物碱的提取方法及应用
技术领域
本发明属于桑叶生物碱应用技术领域，尤其涉及一种桑叶生物碱的提取方法及应用。
背景技术
肝纤维化是由各种刺激如病毒感染、酒精、药物毒性或其他因素诱导的慢性炎症反应的最终结果(Wu J,Zern M A.Hepatic stellate cells:a target for thetreatment of liver fibrosis[J].Journal of gastroenterology,2000,35(9):665-672.DOI:10.1007/s005350070045.；Gebhardt R.Oxidative stress,plant-derivedantioxidants and liver fibrosis[J].Planta Medica,2002,68(04):289-296.DOI:10.1055/s-2002-26761.)。肝纤维化也是肝损伤发展至肝硬化的中间环节，延缓或逆转肝纤维化的发生是治愈大多数慢性肝病的关键。
桑叶广泛分布于全国各地，作为中药的历史源远流长。我国2015版药典中记载桑叶甘、苦，寒，归肺、肝经，具有疏散风热、益肝通气、清肝明目等功效，桑叶营养丰富、无毒副作用，可作为药食两用植物。桑叶生物碱作为桑叶的一种特征活性成分，具有降糖(JiangY,Wang C,Li Y Y,et al.Mistletoe alkaloid fractions alleviates carbontetrachloride-induced liver fibrosis through inhibition of hepatic stellatecell activation via TGF-β/Smad interference[J].Journal of Ethnopharmacology,2014,158:230-238.DOI:10.1016/j.jep.2014.10.028)、降脂(陈少锋,赵湘培,余胜民,钟鸣.排钱草总生物碱对大鼠肝星状细胞相关细胞因子蛋白表达的影响[J].广西医学,2018,40(02):174-176.DOI:10.11675/j.issn.0253-4304.2018.02.17.)、抑制病毒活性(冯霞,孙鹏,易若琨,彭德光,赵欣.巴莲莲子生物碱提取物对CCl4诱导小鼠肝损伤的预防效果[J].食品科学,2017,38(17):216-222.DOI:10.7506spkx1002-6630-201717035.)、抗肿瘤细胞生长(Eissa L A,Kenawy H I,El-Karef A,et al.Antioxidant and anti-inflammatory activities of berberine attenuate hepatic fibrosis induced bythioacetamide injection in rats[J].Chemico-biological interactions,2018,294:91-100.DOI:10.1016/j.cbi.2018.08.016)、减轻肾损伤(张晨,黄进,詹菲,张进.黄芪多糖对四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化的保护作用[J].世界中医药,2015,10(06):887-890.DOI:10.3969issn.1673-7202.2015.06.022.)等作用。
目前尚没有桑叶生物碱对于肝纤维化的影响的研究。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种桑叶生物碱的提取方法及应用；所述提取方法获得的桑叶生物碱中总生物碱的含量高；能降低肝纤维化标志物的水平，对小鼠肝纤维化具有改善作用。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
一种桑叶生物碱的提取方法，包括以下步骤：
1)将桑叶与水混合进行超声提取1～3次，合并提取液获得桑叶生物碱粗提液；
2)将所述桑叶生物碱粗提液依次经过减压浓缩、D101大孔树脂吸附、阳离子树脂吸附、AB-8大孔树脂吸附后获得桑叶生物碱；
步骤1)中所述超声提取的功率为500～700W，所述超声提取的温度为55～65℃；每一次超声提取的时间为50～70min。
优选的，所述桑叶与水的质量比1：(25～35)。
优选的，所述桑叶为桑叶粉；所述桑叶粉的粒径≤0.2cm。
优选的，所述D101大孔树脂吸附的上样流速为2.0～2.2BV/h。
优选的，所述阳离子树脂吸附的上样流速为2.4～2.6BV/h。
优选的，所述AB-8大孔树脂吸附的上样流速为2.0～2.2BV/h。
本发明提供了所述的提取方法提取获得的桑叶生物碱，所述桑叶生物碱中总生物碱的质量百分含量为87～99.9％。
本发明提供了所述的桑叶生物碱在制备改善肝纤维化的食品、保健品或药品中的应用。
本发明提供了所述的桑叶生物碱在制备降低血浆中肝纤维化标志物含量的食品、保健品和药品中的应用。
优选的，所述肝纤维化标志物包括HA、LN、PC-Ⅲ和IV-C。
本发明的有益效果：本发明提供了一种桑叶生物碱的提取方法，所述方法通过将超声提取与热水浸提结合，获得桑叶生物碱粗提液，然后将所述桑叶生物碱粗提液依次经过减压浓缩、D101大孔树脂吸附、阳离子树脂吸附、AB-8大孔树脂吸附后获得桑叶生物碱；本发明所述桑叶生物碱的提取方法提取获得的桑叶生物碱中总生物碱含量高，可达99.9％。本发明提取获得的桑叶生物碱能降低肝纤维化标志物的水平，对小鼠肝纤维化具有改善作用；所述桑叶生物碱能提高肝纤维化小鼠的TP、ALB活性，改善小鼠肝脏受损情况；能调节肝损伤小鼠血浆TBil和DBil水平，能够恢复肝脏对胆红素的处理能力；对CCl4联合高脂饮食引起的小鼠血脂异常具有改善作用。
具体实施方式
本发明提供了一种桑叶生物碱的提取方法，包括以下步骤：1)将桑叶与水混合进行超声提取1～3次合并提取液获得桑叶生物碱粗提液；2)将所述桑叶生物碱粗提液依次经过减压浓缩、D101大孔树脂吸附、阳离子树脂吸附、AB-8大孔树脂吸附后获得桑叶生物碱；步骤1)中所述超声提取的功率为500～700W，每一次超声提取的时间为50～70min；所述超声提取的温度为55～65℃。
在本发明中，将桑叶与水混合进行超声提取1～3次，合并提取液获得桑叶生物碱粗提液。在本发明中，所述桑叶与水的质量比优选为1：(25～35)，更优选为1：(28～32)，最优选为1:30。本发明中，所述桑叶优选为干桑叶粉；所述干桑叶粉的粒径优选≤0.2cm；本发明对所述桑叶粉的来源没有特殊限定，采用本领域常规桑叶粉即可。在本发明中，所述超声提取的次数优选为2次；所述超声提取的功率优选为500～700W，更优选为550～650W，最优选为600W；所述超声提取的温度优选为55～65℃，更优选为58～62℃，最优选为60℃；每一次超声提取的时间优选为50～70min，更优选为55～65min，最优选为60min。本发明在所述超声提取结束后，合并超声提取的提取液获得桑叶生物碱粗提液。
本发明在获得所述桑叶生物碱粗提液后，将所述桑叶生物碱粗提液依次经过减压浓缩、D101大孔树脂吸附、阳离子树脂吸附、AB-8大孔树脂吸附后获得桑叶生物碱。本发明对所述减压浓缩没有特殊要求，采用本领域常规的减压浓缩即可；本发明中，所述减压浓缩浓缩的体积倍数优选为12～17倍，更优选为15倍。本发明在所述减压浓缩后获得浓缩液；然后将所述浓缩液过D101大孔树脂吸附。在本发明中，以所述浓缩液进行上样；所述D101大孔树脂吸附的上样流速优选为2.0～2.2BV/h，更优选为2.1BV/h。本发明中对所述D101大孔树脂没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。本发明在所述浓缩液过D101大孔树脂吸附后获得第一纯化液。
下面结合实施例对本发本发明将所述第一纯化液过阳离子树脂吸附获得第二纯化液。在本发明中，所述阳离子树脂优选为732型阳离子树脂；所述阳离子树脂吸附的上样流速优选为2.4～2.6BV/h，更优选为2.5BV/h。本发明中，所述阳离子树脂吸附后，优选的先用蒸馏水洗至中性，再用氨水洗以2倍柱体积洗脱，获得的氨水洗脱液即为第二纯化液；所述氨水的浓度优选为0.4～0.6mol/L，更优选为0.5mol/L。
本发明在获得第二纯化液后，将获得的第二纯化液过AB-8大孔树脂吸附。在本发明中，所述AB-8大孔树脂为本领域市售产品；所述AB-8大孔树脂吸附的上样流速优选为2.0～2.2BV/h，更优选为2.1BV/h。本发明在所述AB-8大孔树脂吸附后优选的还包括将所述AB-8大孔树脂吸附后的洗脱液进行干燥获得桑叶生物碱；所述干燥优选为冷冻干燥，本发明对所述冷冻干燥的参数没有特殊限定，采用本领域常规的冷冻参数即可。
本发明还提供了上述提取方法提取获得的桑叶生物碱，所述桑叶生物碱中的总生物碱含量高达87～99.9％。
本发明提供了所述的桑叶生物碱在制备改善小鼠肝纤维化的食品、保健品或药品中的应用。本发明对所述食品、保健品或药品的辅料、剂型以及制备方法等没有特殊限定，采用本领域常规的食品、保健品或药品的辅料、剂型以及制备方法即可。
本发明还提供了所述的桑叶生物碱在制备降低血浆中肝纤维化标志物含量的食品、保健品和药品中的应用。在本发明中，所述肝纤维化标志物优选的包括HA、LN、PC-Ⅲ和IV-C。本发明中所述桑叶生物碱能降低肝纤维化标志物的水平，对小鼠肝纤维化具有改善作用；所述桑叶生物碱能提高肝纤维化小鼠的TP、ALB活性，改善小鼠肝脏受损情况；能调节肝损伤小鼠血浆TBil和DBil水平，能够恢复肝脏对胆红素的处理能力；对CCl4联合高脂饮食引起的小鼠血脂异常具有改善作用。
下面结合实施例对本明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
桑叶粉末，粒径≤0.2cm；由重庆畜牧科学院蚕研所提供。
桑叶生物碱制备：称取桑叶粉，按料液质量比1:30的比例奖桑叶粉与纯水混合，60℃，功率600W，超声处理60min，进行超声提取；重复提取2次，合并滤液，用上海亚荣RE-5298A型旋转蒸发器80℃水浴加热(转速为100rpm)减压浓缩滤液获得15倍浓缩液。
将浓缩液以2.1BV/h流速过D101大孔树脂；再将过D101的纯化液以2.5BV/h流速过732型阳离子树脂吸附，先用蒸馏水洗至中性，再用0.5mol/L氨水洗以2倍柱体积洗脱的氨水洗脱液；再将氨水洗脱液以2.1BV/h流速过AB-8大孔树脂，冷冻干燥得样品。本实验所制得的桑叶生物碱中总生物碱含量为93.57％。
实验动物及饲料
SPF级雄性昆明小鼠60只(4周龄)，体重(20±2)g，由重庆医科大学实验动物中心提供，许可证号SCXK(渝)2018-0003；
基础饲料，购于重庆医科大学实验动物中心；
高脂饲料，实验室自制。配方参照文献(杨忠敏,王祖文,杨敏,黄先智,丁晓雯.桑叶生物碱对高脂饮食诱导小鼠肝损伤的改善作用及机理[J/OL].食品科学:1-10[2019-01-19].http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.2206.TS.20181214.1348.012.html.)进行适当修改：基础饲料69.5％、猪油12％、蔗糖10％、蛋黄粉4％、胆固醇4％、胆酸钠0.5％。
主要试剂和仪器
实验试剂
橄榄油，四氯化碳(CCl4)购于成都市科龙化工试剂厂；水飞蓟宾(98％)，购于南京道斯夫生物科技有限公司；AST、ALT、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、总蛋白(total protein，TP)、白蛋白(albumin，ALB)、总胆红素(total bilirubin，TBil)、直接胆红素(directbilirubin，DBil)、胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglycerides，TG)测定试剂盒，购于南京建成生物工程研究所；透明质酸(hyaluronicacid，HA)、层粘连蛋白(laminin，LN)、Ⅲ型前胶原(typeⅢprecollagen，PCⅢ)、IV型胶原(type IV collagen，IV-C)酶联免疫试剂盒购于上海优选生物科技有限公司。
实验仪器
ALPAAI-4LSC型高速离心机，德国Christ公司；DW-HL438型超低温冰箱，合肥美菱股份有限公司；XW-80A型微型漩涡旋混仪，上海精科实业有限公司；Synergy H1型酶标仪，美国Gene Company Limited基因有限公司；DHP-9082型恒温培养箱，上海齐欣科学仪器有限公司；5880型冷冻离心机，德国Eppendorf公司。
实验方法
实验动物分组及处理
本发明获得西南大学实验动物保护协会许可，小鼠按照实验动物保护和使用规则饲养，室温22～25℃，相对湿度40％～60％，12h明暗交替(AM 9:00-PM 21:00)，自由进食饮水。60只昆明种小鼠适应性喂养7d后，随机分为6组，分别为正常对照组、模型组、阳性药物组、桑叶生物碱低、中、高剂量组，每组10只。采用腹腔注射10％CCl4联合高脂饮食建立小鼠肝纤维化模型。除正常对照组，其余各组均腹腔注射体积分数10％CCl4橄榄油溶液(5mL/kg·bw)，隔天注射1次，持续8周，并在此期间给予高脂饲料喂养；正常对照组小鼠腹腔注射等量橄榄油，并给予基础饲料喂养。造模成功判定：正常对照组和参与造模小鼠之间，血清ALT、AST、肝纤四项指标差异显著，肝纤维化小鼠肝脏组织病变明显，胶原沉积。待造模成功后，低、中、高剂量组分别灌胃50、100、200mg/kg的桑叶生物碱溶液，阳性药物组灌胃100mg/kg水飞蓟宾溶液，正常对照组和模型组给予等量蒸馏水，10mL/kg·bw，每日1次，连续灌胃45d，同时喂饲基础饲料。
实验样品收集
末次灌胃后，小鼠禁食不禁水16h，眼球取血于含有肝素钠的真空采血管中，4℃、3000r/min离心15min，收集上清液，于-80℃保存备用。采血完毕后，颈椎脱臼处死小鼠，快速取出肝脏，用冷生理盐水漂洗除去表面血液，滤纸拭干称重，计算肝脏系数。
小鼠肝脏系数的计算公式日下
指标测定
血浆AST、ALT、ALP、TP、ALB、TBil、DBil、TC、TG、HA、LN、IV-C、PC-Ⅲ的测定按照试剂盒说明书标示的步骤进行。
AST、ALT、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、总蛋白(total protein，TP)、白蛋白(albumin，ALB)、总胆红素(total bilirubin，TBil)、直接胆红素(directbilirubin，DBil)、胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglycerides，TG)测定试剂盒，购于南京建成生物工程研究所；
透明质酸(hyaluronic acid，HA)、层粘连蛋白(laminin，LN)、Ⅲ型前胶原(typeⅢprecollagen，PCⅢ)、IV型胶原(type IV collagen，IV-C)酶联免疫试剂盒，购于上海优选生物科技有限公司。
统计学分析
实验结果均以平均值±标准差表示，采用SPSS 20.0对结果进行one-wayANOVA方差分析，采用origin 8.6作图。P<0.05为差异显著。
结果如下：
桑叶生物碱对小鼠肝纤维化程度四项指标的影响
CCl4会引起肝脏细胞外基质过度增生与异常沉积，引起肝脏纤维化。HA、LN、PC-Ⅲ、IV-C是反应肝纤维化程度的重要指标，其中HA能较为灵敏的反应肝纤维量；LN水平反映了肝脏的损伤程度，判断有无活动性肝纤维的指标之一；PC-Ⅲ与肝纤维形成的活动密度相关，反应肝纤维合成状况和炎症活动性；IV-C是最早增生的纤维，以肝纤维化增幅最大，能敏感地反应肝炎向肝纤维化发展的过程和程度，是肝纤维化早期诊断的良好指标。桑叶生物碱对小鼠肝纤维化四项指标的影响见表1。
表1桑叶生物碱对小鼠血浆HA、LN、PC-Ⅲ、IV-C含量的影响
与正常对照组比较，模型组小鼠血浆肝纤维化标志物HA、LN、PC-Ⅲ、IV-C水平均显著升高(P<0.05)，表明CCl4联合高脂饮食诱导小鼠肝纤维化造模成功。与模型组比较，阳性药物组与桑叶生物碱各剂量组小鼠血浆HA、LN、PC-Ⅲ、IV-C水平均显著下降(P<0.05)；灌胃阳性药物水飞蓟宾45d后，小鼠血浆HA、LN、PC-Ⅲ、IV-C水平分别下降了18.06％、17.50％、20.82％、18.44％；桑叶生物碱高剂量组小鼠血浆HA、LN、PC-Ⅲ、IV-C分别下降了12.01％、15.77％、17.55％、17.42％，其中LN、PC-Ⅲ、IV-C指标水平与阳性药物组无显著差异(P>0.05)，但与正常对照组比较差异显著(P<0.05)。表明桑叶生物碱能降低肝纤维化标志物的水平，对小鼠肝纤维化具有改善作用。
桑叶生物碱对小鼠血浆TP和ALB活性的影响
TP包含ALB和球蛋白(GLB)，主要来自肝脏的合成。当肝细胞受损，蛋白质在机体内的合成、运输和释放受到影响，血液中蛋白质含量会下降。桑叶生物碱对小鼠血浆TP和ALB活性的影响见表2。
表2桑叶生物碱对小鼠血浆TP、ALB活性的影响(单位：gprot/L)
与正常对照组比较，模型组小鼠血浆TP、ALB水平均显著降低(P<0.05)，说明造模过程中CCl4和高脂饮食的联合作用造成了小鼠肝损伤，影响了蛋白质的合成、运输和释放。与模型组相比，阳性药物组与桑叶生物碱各剂量组小鼠血浆TP、ALB水平均有所升高，且存在显著差异(P<0.05)。阳性药物组小鼠血浆TP、ALB分别升高了26.36％、31.85％；桑叶生物碱高剂量组小鼠血浆TP、ALB分别升高了26.50％、27.75％，与阳性药物组之间无显著差异(P>0.05)，与正常对照组之间差异显著(P<0.05)。结果表明，桑叶生物碱能提高肝纤维化小鼠的TP、ALB活性，改善小鼠肝脏受损情况。
桑叶生物碱对小鼠血浆TBil和DBil含量的影响
血液中胆红素水平反映了肝细胞通过肝脏网状内皮系统对胆红素进行摄取、结合和排泄的能力。当肝细胞受损时，肝脏对胆红素的处理能力下降，血胆红素水平升高。桑叶生物碱对小鼠血浆TBil和DBil含量的影响见表3。
表3桑叶生物碱对小鼠血浆TBil、DBil含量的影响(单位：μmol/L)
与正常对照组比，模型组小鼠血浆TBil、DBil水平均显著升高(P<0.05)，说明造模过程中CCl4和高脂饮食的联合作用造成了小鼠肝损伤，影响了肝细胞对胆红素处理能力。与模型组比较，阳性药物组与桑叶生物碱各剂量组小鼠血浆TBil、DBil水平均显著下降(P<0.05)。阳性药物组小鼠血浆TBil、DBil水平分别下降了45.46％、74.91％；桑叶生物碱高剂量组小鼠血浆TBil、DBil水平分别下降了35.56％、74.50％，与阳性药物组之间无显著差异(P>0.05)，与正常对照组之间差异显著(P<0.05)。表明桑叶生物碱能调节肝损伤小鼠血浆TBil和DBil水平，肝脏对胆红素的处理能力有所恢复。
桑叶生物碱对小鼠血浆TC和TG含量的影响
CCl4和长期高脂饮食均会引起机体脂质代谢紊乱，引起TC、TG含量的升高。桑叶生物碱对小鼠血浆TC和TG含量的影响见表4。
表4桑叶生物碱对小鼠血浆TC、TG水平的影响(单位：mmol/gprot)
与正常对照组比较，模型组小鼠血浆TC、TG水平均显著升高(P<0.05)，表明小鼠脂代谢出现问题。与模型组比较，阳性药物组与桑叶生物碱各剂量组小鼠血浆TC、TG水平均显著下降(P<0.05)。阳性药物组TC、TG含量分别下降了32.44％、20.44％；桑叶生物碱高剂量组TC、TG含量分别下降了28.67％、23.76％，与阳性药物组无显著差异(P>0.05)，但高于正常对照组(P<0.05)。表明桑叶生物碱对CCl4联合高脂饮食引起的小鼠血脂异常具有改善作用。
由以上实施例可知，本发明提供的桑叶生物碱的提取方法，提取获得的桑叶生物碱中总生物碱含量高，可达99.9％。本发明提取获得的桑叶生物碱能降低肝纤维化标志物的水平，对小鼠肝纤维化具有改善作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种桑叶生物碱的提取方法，包括以下步骤：
1)将桑叶与水混合进行超声提取1～3次，合并提取液获得桑叶生物碱粗提液；
2)将所述桑叶生物碱粗提液依次经过减压浓缩、D101大孔树脂吸附、阳离子树脂吸附、AB-8大孔树脂吸附后获得桑叶生物碱；
步骤1)中所述超声提取的功率为500～700W，所述超声提取的温度为55～65℃；每一次超声提取的时间为50～70min。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述桑叶与水的质量比1：(25～35)。
3.根据权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于，所述桑叶为干桑叶粉；所述干桑叶粉的粒径≤0.2cm。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述D101大孔树脂吸附的上样流速为2.0～2.0BV/h。
5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述阳离子树脂吸附的上样流速为2.4～2.6BV/h。
6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述AB-8大孔树脂吸附的上样流速为2.0～2.2BV/h。
7.权利要求1～6任意一项所述的提取方法提取获得的桑叶生物碱，其特征在于，所述桑叶生物碱中总生物碱的质量百分含量为87～99.9％。
8.权利要求7所述的桑叶生物碱在制备改善肝纤维化的食品、保健品或药品中的应用。
9.权利要求7所述的桑叶生物碱在制备降低血浆中肝纤维化标志物含量的食品、保健品和药品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肝纤维化标志物包括HA、LN、PC-Ⅲ和IV-C。
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