CN101744770B - 人参多糖注射剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种人参多糖注射剂及其制备方法，该注射剂包括人参多糖注射液、注射用人参多糖浓溶液或注射用人参多糖无菌粉末，均以分子量为4000-1800000道尔顿的人参多糖为活性成分；该方法选取生晒参，经粉碎、醇提、水提、醇沉后，离心取沉淀得粗糖提取物，再经水溶醇沉、离心取沉淀得精制糖提取物；经添加淀粉酶去淀粉，加活性炭脱色，取上清液Sevage法脱蛋白得到棕褐色粉末；再将此棕褐色粉末经柱层脱色分离，最后经过膜分离技术选取分子量为4000-1800000道尔顿的人参多糖，制备成注射剂。本发明的制法可靠、操作方便、条件易于控制，适用于大规模生产，由于该注射剂选取特定分子量的人参多糖为原料，纯度高达96.9％，安全性更好，生产成本低廉，疗效更佳。

Description

人参多糖注射剂及其制备方法

技术领域

本发明属于中药制剂领域，具体地说是涉及一种人参多糖注射剂及其制备方法。

背景技术

人参为五加科Araliaceae植物Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根，在我国有着悠久的药用历史，主要含有人参皂苷、人参多糖、人参多肽及挥发油、多种氨基酸、脂肪酸及维生素、微量元素等有效成分，国内外对人参的活性成分的提取工艺和药效研究始终非常活跃，特别是对于人参皂苷的报道较多见，但是近年来随着分析手段的逐步提高，对于人参多糖的研究也取得了较大的进展。

人参多糖为中药人参的活性成份，为高分子葡聚糖。人参多糖具有增强机体免疫调节功能及增强化疗药物抗肿瘤作用，对肿瘤有明显的抑制作用。

实验表明，人参多糖能诱生肿瘤坏死因子和干扰素-γ，对肿瘤细胞有杀伤和抑制作用。肿瘤坏死因子是由激活的巨噬细胞/单核细胞系统产生的多功能蛋白分子，在机体内起着重要的生理作用。在体内肿瘤坏死因子可以通过三种途径发挥抗肿瘤作用：直接杀伤肿瘤细胞；作用于肿瘤血循环，导致肿瘤组织血供减少，从而影响肿瘤的生长；激活机体免疫系统的抗肿瘤作用。同时，肿瘤坏死因子还可介导炎性过程，减少网膜组织间皮细胞溶纤维蛋白活性，进而使网膜表面纤维蛋白增多，减少组织外渗。干扰素是细胞在受到刺激物作用后合成并释放出的蛋白性淋巴因子，其作用为：直接抗病毒作用；增强主要组织相容性抗原和肿瘤相关抗原的表达；增强自然杀伤细胞(NK)的细胞毒作用；增强抗体依赖性细胞的细胞毒作用；直接的抗细胞增殖作用和抗血管生成作用。同时人参多糖能增强T淋巴细胞及NK细胞活性，提高了机体的免疫调节功能，而有利于抗肿瘤作用的发挥。

其次，人参多糖具有免疫调节作用，可以用于治疗病毒性流感。

人参多糖具有显著增强单核吞噬细胞系的功能，人参多糖可明显增加巨噬细胞的吞噬指数。人参多糖能促进抗体和补体的形成，可以显著增加血清补体和血清IgG的含量。

目前国家食品药品监督管理局批准生产的人参多糖注射液只有肌肉注射给药途径。没有批准静脉注射给药途径主要原因是现有的人参多糖提取、分离、纯化技术所制得原料纯度不高，存在一定安全隐患。肌肉注射存在的主要问题是生物利用率低，患者注射部位疼痛及长期注射可能出现局部红肿、淤血、肿块、甚至肌肉坏死等不良反应。

专利ZL200410000209.4公开了一种人参多糖的制备方法，其提纯方法为：

A)取人参，加入8～15倍重量水，煎煮2～3次，每次煎煮时间为30～90分钟，合并煎液，过滤，滤液减压浓缩至原体积的0.1～0.4倍；加入95％的乙醇使浓缩液含醇量为65～85％，0～8℃冷藏静置12～48小时，将冷藏后的药液用离心机低温离心20～40分钟(离心转速为3000～4000转/分)，收集沉淀，沉淀低温干燥得人参多糖粗品；

B)人参多糖粗晶加10～15倍重量水加热煮沸10～30分钟，降温，过滤，向滤液中加入95％的乙醇使含醇量为65～85％，0～8℃冷藏静置12～48小时，将冷藏后的药液用离心机在0～8℃下离心20—40分钟(离心转速为3000～4000转/分)，收集沉淀；重复水煮醇沉、冷藏离心过程2～3次，得到人参多糖沉淀；人参多糖沉淀加10～20倍重量水溶解，药液用冷冻离心机在-10～-30℃冻实后，在0～8℃下融解离心20～30分钟(离心转速为3000～4000转/分)，取上清液，上清液重复冻融离心1～2次后，将上清减压，减压浓缩，在0～8℃下干燥得到人参多糖精品。

专利申请200610034728.1公开了一种注射用人参多糖冻干粉及其制备工艺，其中人参多糖提取工艺步骤为：

A)采集鲜人参的根部，洗净，粉碎，过筛，加水浸泡过夜，晾干，用乙醇浸渍提取或者回流提取至少5次；

B)将药渣挥发去尽乙醇后，加水浸泡，加热至沸腾，保持微沸提取至少5次；

C)合并提取液，浓缩，加入乙醇至少提取三次，至醇浓度为80—90％，收集沉淀，用无水乙醇浸洗1—2次，得到粗人参多糖；

D)再经葡聚糖凝胶柱或者聚酰胺柱分离纯化，用水洗脱，洗脱液浓缩，再用乙醇沉淀，沉淀用无水乙醇浸洗1—2次，得到精品人参多糖。

此专利申请在醇提和水提的基础上采用了葡聚糖凝胶柱或者聚酰胺柱的分离纯化，但所含杂质仍然比较多，人参多糖的含量仅为75％，不能完全适应临床需要。

上述授权或公开的专利所采用的人参多糖提取工艺，人参多糖含量均未达到《中药、天然药物注射剂基本技术要求》(国食药监注[2007]743号)关于“有效成份制成的注射剂，主药成份含量应不少于90％。多成份制成的注射剂，所测成份应大于总固体量的80％”的质量标准。

发明内容

本发明的目的是为了克服人参多糖杂质含量高的缺陷，选择性采用分子量4000-1800000道尔顿的人参多糖为活性成分，提供一种生物利用率高、不良反应少、高纯度的人参多糖注射剂。

本发明的另一个目的在于提供一种的人参多糖注射剂的制备方法。

本发明提供了一种人参多糖注射剂，包括用于肌内注射、静脉注射和静脉滴注的人参多糖注射液、注射用人参多糖浓溶液或注射用人参多糖无菌粉末，其特征在于：所述人参多糖注射液和注射用人参多糖浓溶液包括分子量为4000-1800000道尔顿的人参多糖、附加剂及注射用水，所述人参多糖无菌粉末包括分子量为4000-1800000道尔顿的人参多糖及附加剂。

其中，按1ml计的人参多糖注射液中含有分子量为4000-1800000道尔顿的人参多糖0.1-10mg，附加剂1-150mg，其余为注射用水；

按1ml计的注射用人参多糖浓溶液中含有分子量为4000-1800000道尔顿的人参多糖5-20mg，附加剂1-150mg，其余为注射用水；

注射用人参多糖无菌粉末中含有分子量为4000-1800000道尔顿的人参多糖1％-100％w/w及附加剂0-99％w/w。

优选地，按1ml计的人参多糖注射液中含有分子量为4000-1800000道尔顿的人参多糖0.2-5mg，附加剂1-75mg，其余为注射用水；

优选地，按

计的注射用人参多糖浓溶液中含有分子量为4000-1800000道尔顿的人参多糖12-20mg，附加剂1-150mg，其余为注射用水；

优选地，注射用人参多糖无菌粉末中含有分子量为4000-1800000道尔顿的人参多糖1％-20％w/w及附加剂80-99％。

所述附加剂选自氯化钠、葡萄糖、葡聚糖、乳糖、低分子右旋糖酐、甘露醇、山梨醇、聚乙二醇、甘氨酸、精氨酸、白蛋白、明胶其中的任意一种至三种的混合物。

注射液，系指直接注射入体内用的无菌溶液型注射液。注射用浓溶液，系指临用前稀供静脉滴注用的无菌浓溶液。注射用无菌粉末，系指供临用前用适宜的无菌溶液配制成溶液的无菌粉末或无菌块状物。无菌粉末用冷冻干燥法或喷雾干燥法制得；无菌块状物用冷冻干燥法制得。本发明的人参多糖注射剂可用于肌内注射、静脉注射、静脉滴注等。

本发明还提供了一种制备人参多糖注射剂的方法，该方法包括：

(1)粉碎：选取生晒参，过10～100目筛；

(2)醇提：使用10～100％的乙醇回流反应3～10小时，乙醇与生晒参粉末的重量比为1：2～11，过滤，将固体产物自然风干；

(3)水提：向上述风干的固体产物中加入其固体产物2～8倍体积的水，于60～110℃回流反应1～5小时得水提物；

(4)醇沉：将上述水提物于35～90℃减压浓缩成密度为1.02～1.1的液体，用40～100％的乙醇醇沉，室温放置10～48小时，离心，取沉淀，得粗糖提取物，粗糖提取物经水溶后，再加入80～100％的乙醇醇沉放置10～48小时，离心，取沉淀，得精制糖提取物；

(5)酶解、脱色及除蛋白：取上述精制糖提取物水溶后按比例添加淀粉酶，置于85～95℃保温20～40分钟；加10～20％活性炭90～110℃回流30～45分钟脱色、离心；取上清液Sevage法脱蛋白，重复3～5次，取水层浓缩、离心、干燥，得到棕褐色粉末；

(6)柱层脱色分离：采用葡聚糖凝胶树脂、交联琼脂糖凝胶、快流速琼脂糖凝胶中的一种为载体，将上述棕褐色粉末水溶后和载体按1:10～100克上样，采用不同浓度的洗脱液梯度洗脱，将洗脱液浓缩，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到人参多糖；

(7)膜分离：采用中空纤维膜滤掉小于4000道尔顿的滤液，得到分子量为4000-1800000道尔顿的人参多糖；

(8)依照本领域技术人员所熟知的注射剂成型工艺将分子量为4000-1800000道尔顿的人参多糖制成注射剂。

优选的人参多糖注射剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)粉碎：选取生晒参，过10～80目筛；

(2)醇提：使用50～75％的乙醇回流反应4～8小时，乙醇与生晒参粉末的重量比为1：7～11，过滤，将醇提后得到的固体产物自然风干；

(3)水提：向上述风干的固体产物中加入其固体产物5～8倍的水，于80～110℃回流反应3～5小时得水提物；

(4)醇沉：将上述水提物于55～90℃减压浓缩成密度为1.02～1.1的液体，用50～100％的乙醇，沉室温放置10～40小时，离心，取沉淀，得粗糖提取物，粗糖提取物经水溶后再加入80～100％的乙醇醇沉放置10～40小时，离心，取沉淀，得精制糖提取物；

(5)酶解、脱色及除蛋白：取上述精制糖提取物水溶后按比例添加淀粉酶，置于90～95℃保温20～30分钟；加入精制糖提取物重量15～20％的活性炭95～110℃回流30～40分钟脱色，离心；上清液Sevage法脱蛋白，重复4～5次，取水层浓缩、离心、干燥，得到棕褐色粉末；

(6)柱层脱色分离：步骤5所得棕褐色粉末经水溶后和载体一起上样，所述棕褐色粉末按重量比1：10～1：100采用洗脱液进行梯度洗脱，将洗脱液浓缩，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到人参多糖；

(7)膜分离：采用中空纤维膜滤掉小于4000道尔顿的滤液，得到分子量为4000-1800000道尔顿的人参多糖；

(8)依照本领域技术人员所熟知注射剂成型工艺将分子量为4000-1800000道尔顿的人参多糖制成注射剂。

所述生晒参为4～5年龄人工种植的人参。

所述淀粉酶为α-淀粉酶，添加的比例为每克精制糖提取物添加1～1.2μl淀粉酶，以添加1μlα-淀粉酶为佳，所述α-淀粉酶购买于诺维信(中国)生物技术有限公司。

步骤(6)中采用的洗脱液为Tris缓冲液，醋酸溶液，醋酸铵溶液，磷酸盐缓冲液，氯化钠溶液其中的一种，其中：

Tris缓冲液作为洗脱液各梯度的浓度分别为0.002mol/L(洗脱速度为0.2ml/分)，0.01mol/L(洗脱速度为0.5ml/分)，0.1mol/L(洗脱速度为1ml/分)；

醋酸溶液作为洗脱液的浓度分别为0.01mol/L(洗脱速度为0.5ml/分)，0.1mol/L(洗脱速度为1ml/分)，0.8mol/L(洗脱速度为2ml/分)；

醋酸铵溶液作为洗脱液的浓度分别为0.01mol/L(洗脱速度为0.5ml/分)，0.2mol/L(洗脱速度为1ml/分)，0.5mol/L(洗脱速度为2ml/分)；

磷酸盐缓冲液作为洗脱液的浓度分别为0.002mol/L(洗脱速度为1ml/分)，0.02mol/L(洗脱速度为1.25ml/分)，0.1mol/L(洗脱速度为2ml/分)；

氯化钠溶液作为洗脱液的浓度分别为0.02mol/L(洗脱速度为1ml/分)，0.1mol/L(洗脱速度为1.25ml/分)，0.5mol/L(洗脱速度为2ml/分)。

步骤(6)中所述载体为葡聚糖凝胶树脂、交联琼脂糖凝胶或快流速琼脂糖凝胶中的一种，葡聚糖凝胶树脂载体选自DEAE-52、Sephadex G-25、Sephadex G-75或Sephadex G-100中的一种，交联琼脂糖凝胶载体选自Sepharose CL-4B或Sepharose CL-6B，快流速琼脂糖凝胶载体选自Sepharose 4FF、Sepharose 6FF、Q-Sepharose FF中的一种。

步骤(4)中粗糖提取物经水溶过程中粗糖提取物与水的重量比为1：5；步骤(5)中精制糖提取物经水溶过程中精制糖提取物与水的重量比为1：5；步骤(6)中棕褐色粉末经水溶过程中棕褐色粉末与水的比例1：3。

首先，本发明的人参多糖在提取时，增加了酶解、脱色及除蛋白的工艺步骤，最大限度的去除了淀粉和色素，并且通过Sevage法去除了人参多糖经过醇沉后存在的少量蛋白质，Sevage法去蛋白的优点是条件温和、不会引起多糖的变性，人参多糖制成注射剂临床上肌肉注射或者静脉注射，若注射液中存在人参中的异体蛋白质会使人体发生过敏反应；其次，本发明采用了葡聚糖树脂、交联琼脂糖凝胶、快流速琼脂糖凝胶为载体柱层脱色分离的提纯方法，采用洗脱液梯度洗脱，使得人参多糖的纯度明显提高，产率增加；最后，通过膜分离工艺滤掉小于4000道尔顿的滤液，得到分子量为4000-1800000道尔顿的人参多糖作为本发明的活性成分。

Sevage法是利用蛋白质在三氯甲烷等有机溶剂中变性的特点，将提取液与Sevage试剂5：1混合，振荡，离心，变性后的蛋白质介于提取液与Sevage试剂交界处。Sevage试剂为氯仿与正丁醇体积比为5：1配制而成。

本发明的人参多糖注射剂可以制备以下为代表剂型和规格的制剂，根据临床治疗需要，可用于肌内注射、静脉注射、静脉滴注等给药途径。

1、人参多糖注射液：本品为人参多糖的灭菌水溶液或人参多糖0.9％的氯化钠灭菌水溶液。优选规格为2ml和4ml，以2ml含人参多糖6mg；4ml含人参多糖12mg为佳。

2、注射用人参多糖浓溶液：本品为人参多糖的灭菌水溶液。优选规格为2ml和4ml，以2ml含人参多糖12mg；4ml含人参多糖24mg为最佳。

3.人参多糖氯化钠注射液：本品为人参多糖和氯化钠的灭菌水溶液。优选规格为50ml和100ml，以50ml含人参多糖12mg，氯化钠0.45g；100ml含人参多糖24mg，氯化钠0.9g为最佳。

4、人参多糖葡萄糖注射液：本品为人参多糖和葡萄糖的灭菌水溶液。优选规格为50ml和100ml，以50ml含人参多糖12mg，葡萄糖2.5g；100ml含人参多糖24mg，葡萄糖5.0g为最佳。

5、注射用人参多糖无菌粉末：本品为人参多糖和药用辅料的无菌粉末或无菌块状物。优选每1西林瓶含人参多糖1-100mg，优选规格为含人参多糖6mg、12mg和24mg。

本发明所带来的有益效果为：

1.本发明采用分子量为4000-1800000道尔顿的人参多糖为活性成分，符合国家现行标准中对中药主药的规定，所得注射剂生物利用度高，疗效佳，临床使用方便、安全有效，不良反应少。

2.本发明的人参多糖注射剂具有提高免疫力、抗癌、抗肿瘤之功效，较特定分子量之外的人参多糖效果更明显。

3.本发明的人参多糖分离、纯化技术可靠，操作步骤简单，条件易于控制，适用于大规模生产；本发明通过采用膜分离工艺使所提取的人参多糖中的总糖含量高达为96.9％；通过本发明的制备工艺制得的注射剂更进一步提高了有效成分的利用率、增加产率、降低生产成本。

附图说明

图1为右旋糖苷标准品约200万左右的色谱图；

图2为右旋糖苷标准品约133800左右的色谱图；

图3为右旋糖苷标准品约80000左右的色谱图；

图4为右旋糖苷标准品约10000左右的色谱图；

图5为右旋糖苷标准品约2500左右的色谱图；

图6为人参多糖样品的色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的注射剂及制备方法进行详细说明。

实施例1 人参多糖注射液

              组份                 量

分子量为4000-1800000道尔顿人参多糖     3g

葡萄糖                                 50g

加注射用水至                           1000ml

制备方法为：

(1)选取生晒参，粉碎，过80目筛；

(2)醇提：使用50％的乙醇回流反应4小时，乙醇与生晒参粉末的重量比为1：7，过滤，将固体产物自然风干，其中的醇提物可用于回收皂苷；

(3)水提：将上述固体产物溶解于其5倍体积的水中，于80℃回流反应3小时得水提物，其固体废渣可用做饲料等；

(4)醇沉：将上述水提物于55℃减压浓缩成密度为1.02-1.1的液体，用70％的乙醇室温放置10小时，2000转/分离心，取沉淀，得粗糖提取物，加入粗糖提取物5倍重量的水进行水溶，再用90％的乙醇醇沉放置10小时，2000转/分离心，取沉淀，得精制糖提取物；

(5)酶解、脱色及除蛋白：向精制糖提取物中加入其5倍重量的水进行水溶后，加入α-淀粉酶，比例为每克精制糖提取物添加1μlα-淀粉酶，置于90℃保温20分钟；加精制糖提取物重量15％的活性炭110℃回流40分钟脱色，离心；上清液Sevage法脱蛋白，重复4次，取水层浓缩，离心，干燥，得到棕褐色粉末；

(6)柱层脱色分离：向棕褐色粉末中加入其3倍重量的水进行水溶，以纤维素DEAE-52为载体，按上述棕褐色粉末和载体的重量比1:100上样，先以0.01mol/L醋酸铵、流速为0.5ml/分进行洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到100流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第一部分多糖——为黄白色至棕黄色粉末；继续以0.2mol/L醋酸铵、流速为1ml/分进行洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到80流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第二部分多糖——黄白色至棕黄色粉末；最后以0.5mol/L醋酸铵、流速为2ml/分进行洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到70流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第三部分多糖——黄白色至棕黄色粉末；将三个部分人参多糖合并得到人参多糖样品I，经苯酚硫酸法测定，人参多糖的纯度为95.3％；

(7)将人参多糖样品I进行中空超滤：将超滤器安装小于4000道尔顿的滤膜，取500g多糖样品I溶解于50L水中，溶解完全后放入原液罐。将蠕动泵的进口管和超滤器的回流罐插入原液中，将超滤液出口管插入滤液罐中。旋转调速钮和调压阀，使其达到100L/h，压力为0.08Mpa，超滤运转。滤掉小于4000道尔顿的滤液，而原液中为所需的大分子溶液。经苯酚硫酸法测定，人参多糖的纯度为96.1％。经高效液相色谱GPC分子量测定，得分子量为多少的人参多糖为样品II；

(8)取分子量为4000-1800000道尔顿的人参多糖3g，加入葡萄糖50g，加入注射用水至全量，调节PH至5.0左右，搅匀，0.22μm微孔滤膜过滤，灌封于2ml曲颈安瓿中，于100℃灭菌30分钟，经检漏、灯检、贴标、包装即得。

实施例2 人参多糖注射液

           组份                         量

分子量为4000-1800000道尔顿人参多糖     0.1g

氯化钠                                 9.0g

加注射用水至                           1000ml

制备方法为：

(1)粉碎：选取生晒参，过10目筛；

(2)醇提：使用10％的乙醇回流反应3小时，乙醇与生晒参粉末的重量比为1：2，过滤，将固体产物自然风干；

(3)水提：将上述固体产物溶解于其2倍体积的水中，于60℃回流反应3小时得水提物，其固体废渣可用做饲料等；

(4)醇沉：将上述水提物于35℃减压浓缩成密度为1.02～1.1的液体，用40％的乙醇室温放置10小时，3000转/分离心，取沉淀，得粗糖提取物，加入粗糖提取物5倍重量的水进行水溶，再用80％的乙醇醇沉放置10小时，3000转/分离心，取沉淀，得精制糖提取物；

(5)酶解、脱色及除蛋白：向精制糖提取物中加入其5倍重量的水进行水溶后，加入α-淀粉酶，比例为每克精制糖提取物添加1μlα-淀粉酶，置于95℃保温30分钟；加精制糖提取物重量15％的活性炭95℃回流30分钟脱色，离心；上清液Sevage法脱蛋白，重复5次，取水层浓缩，离心，干燥，得到棕褐色粉末；

(6)柱层脱色分离：向棕褐色粉末中加入其3倍重量的水进行水溶，以葡聚糖凝胶树脂Sephadex G-25为载体，按上述棕褐色粉末和载体的重量比1:90上样，先以0.01mol/L醋酸铵、流速为0.5ml/分进行洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到100流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第一部分多糖，黄白色至棕黄色粉末；继续以0.2mol/L醋酸铵、流速为1ml/分进行洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到80流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第二部分多糖，黄白色至棕黄色粉末；最后以0.5mol/L醋酸铵、流速为2ml/分进行洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到70流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第三部分多糖，黄白色至棕黄色粉末。将三个部分人参多糖合并得到人参多糖样品I，经苯酚硫酸法测定，人参多糖的纯度为95.7％；

(7)将人参多糖样品I进行中空超滤：将超滤器安装小于4000道尔顿的滤膜。取500g多糖样品I溶解于50L水中，溶解完全后放入原液罐。将蠕动泵的进口管和超滤器的回流罐插入原液中，将超滤液出口管插入滤液罐中。旋转调速钮和调压阀，使其达到100L/h，压力为0.08Mpa，超滤运转。滤掉小于4000道尔顿的滤液，而原液中为所需的大分子溶液。经苯酚硫酸法测定，人参多糖的纯度为96.2％。经高效液相色谱GPC分子量测定，取分子量为多少的人参多糖为样品II；

(8)取分子量为4000-1800000道尔顿的人参多糖0.1g，加入氯化钠9.0g，加入注射用水至全量，调节PH至5.0左右，搅匀，0.22μm微孔滤膜过滤，灌封于4ml曲颈安瓿中，于100℃灭菌30分钟，经检漏、灯检、贴标、包装即得。

实施例3 注射用人参多糖浓溶液

               组份                   量

分子量为4000-1800000道尔顿人参多糖    5g

乳糖                                  100g

加注射用水至                          1000ml

制备方法为：

(1)选取生晒参，粉碎，过100目筛；

(2)醇提：使用100％的乙醇回流反应10小时，乙醇与生晒参粉末的重量比为1:11，过滤，将固体产物自然风干，其中的醇提物可用于回收皂苷；

(3)水提：将上述固体产物溶解于其8倍体积的水中，于110℃回流反应5小时得水提物，其固体废渣可用做饲料等；

(4)醇沉：将上述水提物于90℃减压浓缩成密度为1.02-1.1的液体，用40％的乙醇室温放置48小时，5000转/分离心，取沉淀，得粗糖提取物，加入粗糖提取物5倍重量的水进行水溶，再用80％的乙醇醇沉放置48小时，5000转/分离心，取沉淀，得精制糖提取物；

(5)酶解、脱色及除蛋白：向精制糖提取物中加入其5倍重量的水进行水溶后，加入α-淀粉酶，比例为每克精制糖提取物添加1μlα-淀粉酶，置于95℃保温30分钟；加精制糖提取物重量15％的活性炭95℃回流30分钟脱色，离心；上清液Sevage法脱蛋白，重复4次，取水层浓缩，离心，干燥，得到棕褐色粉末；

(6)柱层脱色分离：向棕褐色粉末中加入其3倍重量的水进行水溶，以交联琼脂糖凝胶Sepharose CL-4B为载体，按上述棕褐色粉末和载体的重量比1:10上样，先以0.002mol/L Tris缓冲液、流速为0.2ml/分进行洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到100流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第一部分多糖，黄白色至棕黄色粉末；继续以0.01mol/L Tris缓冲液、流速为0.5ml/分进行洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到80流分，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第二部分多糖，黄白色至棕黄色粉末；最后以0.1mol/L Tris缓冲液、流速为1ml/分进行洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到70流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第三部分多糖，黄白色至棕黄色粉末。将三个部分人参多糖合并得到人参多糖样品I，经苯酚硫酸法测定，人参多糖的纯度为96.2％；

(7)将人参多糖样品I进行中空超滤。将超滤器安装小于4000道尔顿的滤膜。取500g多糖样品I溶解于50L水中，溶解完全后放入原液罐。将蠕动泵的进口管和超滤器的回流罐插入原液中，将超滤液出口管插入滤液罐中。旋转调速钮和调压阀，使其达到100L/h，压力为0.08Mpa，超滤运转。滤掉小于4000道尔顿的滤液，而原液中为所需的大分子溶液。经苯酚硫酸法测定，人参多糖的纯度为96.8％。经高效液相色谱GPC分子量测定，取分子量为4000-1800000道尔顿的人参多糖为样品II；

(8)取分子量为4000-1800000道尔顿的人参多糖5g，加入乳糖100g，加入注射用水至全量，调节PH至5.0左右，搅匀，0.22μm微孔滤膜过滤，灌封于2ml曲颈安瓿中，于100℃灭菌30分钟，经检漏、灯检、贴标、包装即得。

实施例4 注射用人参多糖浓溶液

                组份                 量

分子量为4000-1800000道尔顿人参多糖   6g

氯化钠                               9g

加注射用水至                         1000ml

制备方法为：

(1)选取生晒参，粉碎，过80目筛；

(2)醇提：使用75％的乙醇回流反应8小时，乙醇与生晒参粉末的重量比为1：7，过滤，将固体产物自然风干，其中的醇提物可用于回收皂苷；

(3)水提：将上述固体产物溶解于其8倍体积的水中，于110℃回流反应3小时得水提物，其固体废渣可用做饲料等；

(4)醇沉：将上述水提物于90℃减压浓缩成密度为1.02～1.1的液体，用80％的乙醇室温放置45小时，5000转/分离心，取沉淀，得粗糖提取物，加入粗糖提取物5倍重量的水进行水溶，再用80％的乙醇醇沉放置45小时，5000转/分离心，取沉淀，得精制糖提取物；

(5)酶解、脱色及除蛋白：向精制糖提取物中加入其5倍重量的水进行水溶后，加入α-淀粉酶，比例为每克精制糖提取物添加1μl α-淀粉酶，置于95℃保温30分钟；加精制糖提取物重量20％的活性炭110℃回流40分钟脱色，离心；上清液Sevage法脱蛋白，重复5次，取水层浓缩，离心，干燥，得到棕褐色粉末；

(6)柱层脱色分离：向棕褐色粉末中加入其3倍重量的水进行水溶，以快流速琼脂糖凝胶Sepharose 4FF为载体，按上述棕褐色粉末和载体的重量比1:75上样，先以0.002mol/L磷酸盐缓冲液、流速为1ml/分进行洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到100流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第一部分多糖，黄白色至棕黄色粉末；继续以0.02mol/L磷酸盐缓冲液、流速为1.25ml/分进行洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到80流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第二部分多糖，黄白色至棕黄色粉末；最后以0.1mol/L磷酸盐缓冲液、流速为2ml/分进行洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到70流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第三部分多糖，黄白色至棕黄色粉末。将三个部分人参多糖合并得到人参多糖样品I，经苯酚硫酸法测定，人参多糖的纯度为96.5％；

(7)将人参多糖样品I进行中空超滤:将超滤器安装小于4000道尔顿的滤膜。取500g多糖样品I溶解于50L水中，溶解完全后放入原液罐。将蠕动泵的进口管和超滤器的回流罐插入原液中，将超滤液出口管插入滤液罐中。旋转调速钮和调压阀，使其达到100L/h，压力为0.08Mpa，超滤运转。滤掉小于4000道尔顿的滤液，而原液中为所需的大分子溶液。经苯酚硫酸法测定，人参多糖的纯度为96.9％。经高效液相色谱GPC分子量测定，取分子量为多少的人参多糖为样品II；

(8)取分子量为4000-1800000道尔顿的人参多糖6g，氯化钠9g，加入注射用水至全量，调节PH至5.0左右，搅匀，0.22μm微孔滤膜过滤，灌封于4ml曲颈安瓿中，于100℃灭菌30分钟，经检漏、灯检、贴标、包装即得。

实施例5 人参多糖氯化钠注射液

                组份                   量

分子量为4000-1800000道尔顿人参多糖    0.24g

氯化钠                                9g

加注射用水至                          1000ml

制备方法为：

(1)粉碎：选取生晒参，过10目筛；

(2)醇提：使用10％的乙醇回流反应3小时，乙醇与生晒参粉末的重量比为1：2，过滤，将固体产物自然风干；

(3)水提：将上述固体产物溶解于其2倍体积的水中，于60℃回流反应3小时得水提物，其固体废渣可用做饲料等；

(4)醇沉：将上述水提物于35℃减压浓缩成密度为1.02～1.1的液体，用40％的乙醇室温放置10小时，3000转/分离心，取沉淀，得粗糖提取物，加入粗糖提取物5倍重量的水进行水溶，再用80％的乙醇醇沉放置10小时，3000转/分离心，取沉淀，得精制糖提取物；

(5)酶解、脱色及除蛋白：向精制糖提取物中加入其5倍重量的水进行水溶后，加入α-淀粉酶，比例为每克精制糖提取物添加1μl α-淀粉酶，置于90℃保温30分钟；加入精制糖提取物重量15％的活性炭95℃回流30分钟脱色，离心；上清液Sevage法脱蛋白，重复5次，取水层浓缩，离心，干燥，得到棕褐色粉末；

(6)柱层脱色分离：向棕褐色粉末中加入其3倍重量的水进行水溶，以葡聚糖凝胶树脂Sephadex G-100为载体，将上述棕褐色粉末和载体按重量比1:50上样，先以0.002mol/L Tris缓冲液、流速为0.2ml/分进行洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到100流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第一部分多糖，为黄白色至棕黄色粉末；继续以0.01mol/L Tris缓冲液、流速为0.5ml/分进行洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到80流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第二部分多糖，为黄白色至棕黄色粉末；最后以0.1mol/L Tris缓冲液、流速为1ml/分进行洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到70流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第三部分多糖，为黄白色至棕黄色粉末。将三个部分人参多糖合并得到人参多糖样品I，经苯酚硫酸法测定，人参多糖的纯度为96.3％；

(7)将人参多糖样品I进行中空超滤。将超滤器安装小于4000道尔顿的滤膜。取500g多糖样品I溶解于50L水中，溶解完全后放入原液罐。将蠕动泵的进口管和超滤器的回流罐插入原液中，将超滤液出口管插入滤液罐中。旋转调速钮和调压阀，使其达到100L/h，压力为0.08Mpa，超滤运转。滤掉小于4000道尔顿的滤液，而原液中为所需的大分子溶液。经苯酚硫酸法测定，人参多糖的纯度为96.9％。经高效液相色谱GPC分子量测定，取分子量为多少的人参多糖为样品II；

(8)取分子量为4000-1800000道尔顿的人参多糖0.24g，加入氯化钠9g，加注射用水至全量，搅匀，调节PH至5.0左右，半成品检验合格后，0.22μm微孔滤膜过滤，灌封于50ml输液玻瓶或输液袋中，于115℃灭菌30分钟，经冷却、灯检、贴标、包装即得。

实施例6 人参多糖葡萄糖输液

                  组份                 量

分子量为4000-1800000道尔顿人参多糖   0.24g

葡萄糖                               50g

加注射用水至                         1000ml

制备方法为：

(1)选取生晒参，粉碎，过90目筛；

(2)醇提：使用75％的乙醇回流反应6小时，乙醇与生晒参粉末的重量比为1：9，过滤，将固体产物自然风干，其中的醇提物可用于回收皂苷；

(3)水提：将上述固体产物溶解于其7倍体积的水中，于95℃回流反应5小时得水提物，其固体废渣可用做饲料等；

(4)醇沉：将上述水提物于55℃减压浓缩成密度为1.02～1.1的液体，用50％的乙醇室温沉淀10小时，4000转/分离心，取沉淀，得粗糖提取物，加入粗糖提取物5倍重量的水进行水溶，再用80％的乙醇沉淀10小时，4000转/分离心，取沉淀，得精制糖提取物；

(5)酶解、脱色及除蛋白：向精制糖提取物中加入其5倍重量的水进行水溶后，加入α-淀粉酶，比例为每克精制糖提取物添加1μl α-淀粉酶，置于90℃保温25分钟；加入精制糖提取物重量18％的活性炭100℃回流45分钟脱色，离心；上清液Sevage法脱蛋白，重复4次，取水层浓缩，离心，干燥，得到棕褐色粉末；

(6)柱层脱色分离：向棕褐色粉末中加入其3倍重量的水进行水溶，以快流速琼脂糖凝胶Q-Sepharose FF为载体，将上述棕褐色粉末和载体按重量比1：70上样，先以0.02mol/L氯化钠溶液、流速为1ml/分进行洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到100流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第一部分多糖，为黄白色至棕黄色粉末；继续以0.1mol/L氯化钠溶液、流速为1.25ml/分进行洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到80流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第二部分多糖为黄白色至棕黄色粉末；最后以0.5mol/L氯化钠溶液、流速为2ml/分进行洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到70流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第三部分多糖，为黄白色至棕黄色粉末。将三个部分人参多糖合并得到人参多糖样品I，经苯酚硫酸法测定，人参多糖的纯度为96.5％；

(7)将人参多糖样品I进行中空超滤：将超滤器安装小于4000道尔顿的滤膜。取500g多糖样品I溶解于50L水中，溶解完全后放入原液罐。将蠕动泵的进口管和超滤器的回流罐插入原液中，将超滤液出口管插入滤液罐中。旋转调速钮和调压阀，使其达到100L/h，压力为0.08Mpa，超滤运转。滤掉小于4000道尔顿的滤液，而原液中为所需的大分子溶液。经苯酚硫酸法测定，人参多糖的纯度为97.3％。经高效液相色谱GPC分子量测定，取分子量为多少的人参多糖为样品II；

(8)取分子量为4000-1800000道尔顿的人参多糖0.24g，加入葡萄糖50g，加注射用水至全量，搅匀，调节PH至5.0左右，半成品检验合格后，0.22μm微孔滤膜过滤，灌封于100ml输液玻瓶中或输液袋中，于115℃灭菌30分钟，经冷却、灯检、贴标、包装即得。

实施例7 注射用人参多糖无菌粉末(冻干粉)

             组份                     量

分子量为4000-1800000道尔顿人参多糖   6mg

甘露醇                               2.5mg

山梨醇                               1.5mg

制备方法为：

(1)选取生晒参，粉碎，过80目筛；

(2)醇提：使用75％的乙醇回流反应8小时，乙醇与生晒参粉末的重量比为1：10，过滤，将固体产物自然风干，其中的醇提物可用于回收皂苷；

(3)水提：将上述固体产物溶解于其8倍体积的水中，于100℃回流反应4小时得水提物，其固体废渣可用做饲料等；

(4)醇沉：将上述水提物于35℃减压浓缩成密度为1.02～1.1的液体，用75％的乙醇室温放置42小时，4000转/分离心，取沉淀，得粗糖提取物，加入粗糖提取物5倍重量的水进行水溶，再用90％的乙醇醇沉放置42小时，4000转/分离心，取沉淀，得精制糖提取物；

(5)酶解、脱色及除蛋白：向精制糖提取物中加入其5倍重量的水进行水溶后，加入α-淀粉酶，比例为每克精制糖提取物添加1μl α-淀粉酶，置于90℃保温25分钟；加精制糖提取物重量20％的活性炭95℃回流40分钟脱色，离心；上清液Sevage法脱蛋白，重复4次，取水层浓缩，离心，干燥，得到棕褐色粉末；

(6)柱层脱色分离：向棕褐色粉末中加入其3倍重量的水进行水溶，以快流速琼脂糖凝胶Sepharose6FF为载体，按上述棕褐色粉末和载体的重量比1:80上样，先以0.02mol/L氯化钠溶液、流速为1ml/分进行洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到100流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第一部分多糖，为黄白色至棕黄色粉末；继续以0.1mol/L氯化钠溶液、流速为1.25ml/分进行洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到80流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第二部分多糖，为黄白色至棕黄色粉末；最后以0.5mol/L氯化钠溶液、流速为2ml/分进行洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到70流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第三部分多糖，为黄白色至棕黄色粉末。将三个部分人参多糖合并得到人参多糖样品I，经苯酚硫酸法测定，人参多糖的纯度为96.2％；

(7)将人参多糖样品I进行中空超滤：将超滤器安装小于4000道尔顿的滤膜。取500g多糖样品I溶解于50L水中，溶解完全后放入原液罐。将蠕动泵的进口管和超滤器的回流罐插入原液中，将超滤液出口管插入滤液罐中。旋转调速钮和调压阀，使其达到100L/h，压力为0.08Mpa，超滤运转。滤掉小于4000道尔顿的滤液，而原液中为所需的大分子溶液。经苯酚硫酸法测定，人参多糖的纯度为96.8％。经高效液相色谱GPC分子量测定，取分子量为多少的人参多糖为样品II；

(8)取分子量为4000-1800000道尔顿的人参多糖6mg，加入甘露醇2.5mg及山梨醇1.5mg，再加注射用水至溶解完全，0.22μm微孔滤膜过滤，放入西林瓶中；将西林瓶置于冻干箱中，-45℃预冻10h，真空干燥，抽真空至-600mmHg，程序升温干燥，最后升温至30℃，干燥24小时，取出封口即得。

实施例8 注射用人参多糖无菌粉末(冻干粉)

              组份                    量

分子量为4000-1800000道尔顿人参多糖   12mg

甘露醇                               5mg

山梨醇                               3mg

制备方法为：

(1)粉碎：选取生晒参，过10目筛；

(2)醇提：使用10％的乙醇回流反应3小时，乙醇与生晒参粉末的重量比为1：2，过滤，将固体产物自然风干；

(3)水提：将上述固体产物溶解于其2倍体积的水中，于60℃回流反应3小时得水提物，其固体废渣可用做饲料等；

(4)醇沉：将上述水提物于35℃减压浓缩成密度为1.02～1.1液体，用40％的乙醇室温放置10小时，3000转/分离心，取沉淀，得粗糖提取物，加入粗糖提取物5倍重量的水进行水溶，再用80％的乙醇醇沉放置10小时，3000转/分离心，取沉淀，得精制糖提取物；

(5)酶解、脱色及除蛋白：向精制糖提取物中加入其5倍重量的水进行水溶后，加入α-淀粉酶，比例为每克精制糖提取物添加1μlα-淀粉酶，置于90℃保温30分钟；加入精制糖提取物重量15％的活性炭95℃回流30分钟脱色，离心；上清液Sevage法脱蛋白，重复5次，取水层浓缩，离心，干燥，得到棕褐色粉末；

(6)柱层脱色分离：向棕褐色粉末中加入其3倍重量的水进行水溶，以葡聚糖凝胶树脂Sephadex G-75为载体，将上述棕褐色粉末和载体按重量比1:50上样，先以0.01mol/L醋酸铵溶液、流速为0.5ml/分进行洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到100流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第一部分多糖，为为黄白色至棕黄色粉末；继续以0.2mol/L醋酸铵溶液、流速为1ml/分进行洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到80流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第二部分多糖，为黄白色至棕黄色粉末；最后以0.5mol/L醋酸铵溶液、流速为2ml/分进行洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到70流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第三部分多糖，为黄白色至棕黄色粉末；将三个部分人参多糖合并得到人参多糖样品I，经苯酚硫酸法测定，人参多糖的纯度为95.8％；

(7)将人参多糖样品I进行中空超滤。将超滤器安装小于4000道尔顿的滤膜。取500g多糖样品I溶解于50L水中，溶解完全后放入原液罐。将蠕动泵的进口管和超滤器的回流罐插入原液中，将超滤液出口管插入滤液罐中。旋转调速钮和调压阀，使其达到100L/h，压力为0.08Mpa，超滤运转。滤掉小于4000道尔顿的滤液，而原液中为所需的大分子溶液。经苯酚硫酸法测定，人参多糖的纯度为96.6％。经高效液相色谱GPC分子量测定，取分子量为多少的人参多糖为样品II；

(8)取分子量为4000-1800000道尔顿的人参多糖12mg，加入甘露醇5mg及山梨醇3mg，再加注射用水至溶解完全，0.22μm微孔滤膜过滤，放入西林瓶中；将西林瓶置于冻干箱中，-45℃预冻10h，真空干燥，抽真空至-600mmHg，程序升温干燥，最后升温至30℃，干燥24小时，取出封口即得。

实施例9 注射用人参多糖无菌粉末(冻干粉)

                 组份                  量

分子量为4000-1800000道尔顿人参多糖    24mg

甘露醇                                10mg

山梨醇                                6mg

低分子右旋糖苷                        1mg

制备方法为：

(1)选取生晒参，粉碎，过100目筛；

(2)醇提：使用100％的乙醇回流反应10小时，乙醇与生晒参粉末的重量比为1:11，过滤，将固体产物自然风干，其中的醇提物可用于回收皂苷；

(3)水提：将上述固体产物溶解于其8倍体积的水中，于110℃回流反应5小时得水提物，其固体废渣可用做饲料等；

(4)醇沉：将上述水提物于90℃减压浓缩成密度为1.02～1.1的液体，用70％的乙醇室温放置48小时，5000转/分离心，取沉淀，得粗糖提取物，加入粗糖提取物5倍重量的水进行水溶，再用90％的乙醇沉放置48小时，5000转/分离心，取沉淀，得精制糖提取物；

(5)酶解、脱色及除蛋白：向精制糖提取物中加入其5倍重量的水进行水溶后，加入α-淀粉酶，比例为每克精制糖提取物添加1μl α-淀粉酶，置于95℃保温20～30分钟；加入精制糖提取物重量20％的活性炭110℃回流30～40分钟脱色，离心；上清液Sevage法脱蛋白，重复4～5次，取水层浓缩，离心，干燥，得到棕褐色粉末；

(6)柱层脱色分离：向棕褐色粉末中加入其3倍重量的水进行水溶，以交联琼脂糖凝胶Sepharose CL-6B为载体，将上述棕褐色粉末和载体按1:50克上样，先以0.01mol/L醋酸溶液、流速为0.5ml/分进行洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到100流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第一部分多糖，为黄白色至棕黄色粉末；继续以0.1mol/L醋酸溶液、流速为1ml/分进行洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到80流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第二部分多糖，为黄白色至棕黄色粉末；最后以0.8mol/L醋酸溶液、流速为2ml/分进行洗脱，每20ml为一个流份接收洗脱液，纸层析色谱检测，收集第10到70流份，合并，浓缩，浓缩液加乙醇调至80％浓度，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到第三部分多糖，为黄白色至棕黄色粉末；将三个部分人参多糖合并得到人参多糖样品I，经苯酚硫酸法测定，人参多糖的纯度为96.3％；

(7)将人参多糖样品I进行中空超滤。将超滤器安装小于4000道尔顿的滤膜。取500g多糖样品I溶解于50L水中，溶解完全后放入原液罐。将蠕动泵的进口管和超滤器的回流罐插入原液中，将超滤液出口管插入滤液罐中。旋转调速钮和调压阀，使其达到100L/h，压力为0.08Mpa，超滤运转。滤掉小于4000道尔顿的滤液，而原液中为所需的大分子溶液。经苯酚硫酸法测定，人参多糖的纯度为96.8％。经高效液相色谱GPC分子量测定，取分子量为多少的人参多糖为样品II；

(8)取分子量为4000-1800000道尔顿的人参多糖24mg，加入甘露醇10mg、山梨醇6mg及低分子右旋糖苷1mg，再加注射用水至溶解完全，0.22μm微孔滤膜过滤，放入西林瓶中；将西林瓶置于冻干箱中，-45℃预冻10h，真空干燥，抽真空至-600mmHg，程序升温干燥，最后升温至30℃，干燥24小时，取出封口即得。

实施例10 人参多糖注射液

本例中所述组分及制备方法基本同实施例1，唯有不同的是：

               组份                  量

分子量为4000-1800000道尔顿人参多糖   10g

葡萄糖                               50g

氯化钠                               9g

加注射用水至                         1000ml

实施例11 人参多糖注射液

本例中所述组分及制备方法基本同实施例1，唯有不同的是：

              组份                    量

分子量为4000-1800000道尔顿人参多糖   0.2g

葡萄糖                               50g

加注射用水至                         1000ml

实施例12 人参多糖注射液

本例中所述组分及制备方法基本同实施例1，唯有不同的是：

               组份                    量

分子量为4000-1800000道尔顿人参多糖   5g

氯化钠                               9g

加注射用水至                         1000ml

实施例13 注射用人参多糖浓溶液

本例中所述组分及制备方法基本同实施例3，唯有不同的是：

              组份                   量

分子量为4000-1800000道尔顿人参多糖   20g

乳糖                                 90g

氯化钠                               9g

加注射用水至                         1000ml

实施例14 注射用人参多糖浓溶液

本例中所述组分及制备方法基本同实施例3，唯有不同的是：

              组份                   量

分子量为4000-1800000道尔顿人参多糖   12g

乳糖                                 20g

氯化钠                               8g

加注射用水至                         1000ml

实施例15 人参多糖氯化钠注射液

本例中所述组分及制备方法基本同实施例5，唯有不同的是：

              组份                   量

分子量为4000-1800000道尔顿人参多糖   0.1g

氯化钠                               9g

加注射用水至                         1000ml

实施例16 人参多糖氯化钠注射液

本例中所述组分及制备方法基本同实施例5，唯有不同的是：

              组份                   量

分子量为4000-1800000道尔顿人参多糖   10g

氯化钠                               9g

加注射用水至                         1000ml

实施例17 人参多糖葡萄糖注射液

本例中所述组分及制备方法基本同实施例6，唯有不同的是：

               组份                  量

分子量为4000-1800000道尔顿人参多糖   2g

葡萄糖                               50g

加注射用水至                         1000ml

实施例18 人参多糖葡萄糖注射液

本例中所述组分及制备方法基本同实施例6，唯有不同的是：

               组份                  量

分子量为4000-1800000道尔顿人参多糖   10g

葡萄糖                               50g

加注射用水至                         1000ml

实施例19 苯酚硫酸法测定人参多糖中总糖含量

实验方法：精密称取标准单糖或单糖混合物100mg，配制成浓度为0.1mg/ml的溶液，分别取0.2ml，0.4ml，0.6ml，0.8mi，1.0mi，依次补加蒸馏水至1ml。以蒸馏水为对照，分别向其中加入6％的苯酚0.5ml，浓硫酸2.5ml，充分振荡摇匀后，冷至室温，490nm处测吸光值。准确称取适当多糖样品配成浓度为0.1mg／ml的溶液，按同法处理后，根据多糖样品的吸光值，对照标准曲线计算出人参多糖样品的总糖含量(见表1)。

实验结果：以标准葡萄糖为对照品

表1

 

样品	样品I(重量百分比)	样品II(重量百分比)
			实施例1所得样品	95.3％	96.1％
实施例2所得样品	95.7％	96.2％
			实施例3所得样品	96.2％	96.8％
实施例4所得样品	96.5％	96.9％
			实施例5所得样品	96.3％	96.9％
实施例6所得样品	96.5％	97.3％
			实施例7所得样品	96.2％	96.8％
实施例8所得样品	95.8％	96.6％
			实施例9所得样品	96.3％	96.8％

实施例20 人参多糖分子量分布测定

根据2000年药典二部附录要求，应进行人参多糖分子量测定。

1我们选用测量多糖专用凝胶柱色谱柱，由广州菲罗门科学仪器有限公司提供。凝胶柱PolysepS000 GPC处理软件，检测器为示差折光检测器。

2系统适用性试验

根据要求进行了适用性试验，色谱柱的最小理论板数(n)和供试品在该分析状态下的分配系数(Kd)达到规定的要求。

$\mathrm{Kd}=\frac{R-\mathrm{to}}{\mathrm{tT}-\mathrm{to}}$

式中tR为供试品的保留时间

    to为完全被填料颗粒网孔排阻的大分子的保留时间，一般指蓝色葡聚糖的保留时间。

    tT为能自由进出填料颗粒网孔的小分子的保留时间，一般指葡聚糖的保留时间。

3测定法：

(1)系统校正根据供试品分子量大小，选用5个葡聚糖标准品(2000000、133800、80000、10000、4000)分别用流动相制成lml约含10mg的标准溶液，分别取上述标准溶液25ul注入液相色谱仪，记录色谱图，见附图1-图6。由GPC专用软件绘制标准曲线，得线性回归方程。

lgMw=a+btR

式中Mw为标样的已知重均分子量

    tR为标样的保留时间

(2)样品测量 取人参多糖供试品溶液25ul注入液相色谱仪，按下式计算分子量：

Mn=∑RIi/∑(RIi/Mi)

Mw=∑(RIi/Mi)/∑RIi

D=Mw／Mn

式中Mn为数均分子量

RIi为样品级分的物质量，即供试品在保留时间i的峰高

Mi为样品级分的分子量，即供试品在保留时间i的峰高

4结果处理

采用GPC专用软件，获得供试品归一化色谱图，微分、积分分子量分布图，各时间点的分子量(片断数据)和各种平均分子量，测定结果见表2-1至表2-6。

表2-1 依据色谱图1绘制的数据表

DetectorA(示差检测器)

表2-2 依据色谱图1绘制的数据表

DetectorA(示差检测器)

表2-3 依据色谱图1绘制的数据表

DetectorA(示差检测器)

表2-4 右旋糖苷标准品约10000左右的数据

DetectorA(示差检测器)

表2-5 右旋糖苷标准品约2500左右的数据

DetectorA(示差检测器)

采用GPC处理软件结果如下：

2000000左右     5.817min

133800左右      8.979min

80000左右       9.198min

10000左右       9.910min

2500左右        10.187min

见附图

曲线方程：

logM＝-0.1111875X³+2.54445622X²-19.49509731X+55.48784769

Dispersion：0.0237625

表2-6 依据色谱图6统计的人参多糖样品的数据

DetectorA(示差检测器)

分子量分布在1875810，328284，219508，145677，4127左右，平均总分子量约为328284。

实施例21 特定分子量人参多糖提取物对免疫功能低下模型小鼠及荷瘤小鼠免疫功能影响的药效学预试验研究

摘要 目的：观察人参多糖提取物对环磷酰胺所致免疫功能低下小鼠及荷瘤小鼠白细胞的影响，及对胸腺、脾脏等免疫器官重量的影响。方法：用腹腔注射环磷酰胺80mg/kg的方法造成免疫功能低下小鼠模型；腋下种植瘤细胞造成荷瘤小鼠，分别尾静脉连续给药7天，眼内眦取血测白细胞数量，称取胸腺、肝脏、脾脏重量并计算脏器指数。结果：人参多糖注射液12mg/kg可升高免疫低下小鼠白细胞数量；人参多糖提取物12、24、48mg/kg可升高荷瘤小鼠白细胞数量，其中48mg/kg亦有增加荷瘤小鼠脾脏重量的作用。结论：人参多糖提取物具有升高免疫功能低下小鼠及荷瘤小鼠白细胞及增加脾脏等免疫器官重量的作用。但升高白细胞的同时可见伴有红细胞、血红蛋白减少现象。分别将人参多糖提取物及人参多糖注射液进行家兔体外溶血试验，均无溶血发生。人参多糖提取物的药理作用、量效关系及安全性有待进一步研究。

1 试验材料

1.1 实验动物：KM小鼠，雄性，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2007-0001，体重18～20g。

1.1.1 实验动物饲养管理

每天为小鼠提供普通全价颗粒饲料II号，由北京科澳协力饲料有限公司生产，京动许字(2000)第015号。动物饮用纯净水。

标准化实验室，实验动物使用许可证号SYXK(津)2007-0001。

1.2 试验药物

1.2.1 人参多糖提取物样品，浅棕色粉末，由天津市医药科学研究所制剂室提供。

1.2.2 人参多糖注射液(对照药)，山西普德药业有限公司产品，4ml：12mg，批号20080103。

1.2.3 注射用环磷酰胺，规格0.2g，江苏恒瑞医药股份有限公司，产品批号07012621，有效期至20090125。：

1.3 仪器与设备：日本光电全自动血象分析仪；T-500电子天平(常熟双杰测试仪器厂，编号：265)；PL203精密电子天平(梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司制造)。

2 试验方法

2.1 对环磷酰胺致免疫功能低下小鼠升高白细胞作用

将小鼠按体重分层随机分为4组，分别为正常对照组、模型对照组、人参多糖注射液对照组(12mg/kg)、人参多糖提取物组(12mg/kg)。正常与模型对照组尾静脉注射无菌生理盐水(10ml/kg)、各给药组注射相应药物，每日给药1次，连续7天。给药同时，自第3天开始，除正常对照组外，其余各组均经腹腔注射环磷酰胺溶液80mg/kg，连续注射3天，每日1次，以制备小鼠免疫功能低下模型。末次给药后将小鼠禁食12小时，第8天眼内眦取血，血细胞自动分析仪计数白细胞(WBC(×10⁹/L))、血小板(PLT(×10¹⁰/L))、红细胞(RBC(×10¹²/L))、血红蛋白(HGB(g/L))、单核细胞百分比(MO％)、粒细胞百分比(GR％)、淋巴细胞百分比(LY％)等血象指标。

2.2 对荷瘤小鼠升高白细胞及对免疫器官作用

将小鼠接种S180瘤细胞，按照体重分层随机分为6组，分别为模型对照组、人参多糖注射液对照组(12mg/kg)、环磷酰胺治疗组(20mg/kg)、人参多糖提取物48、24、12mg/kg组。模型对照组尾静脉注射无菌生理盐水、各给药组注射相应药物，均为10ml/kg，每日给药1次，连续7天。末次给药后将小鼠禁食12小时，第8天眼内眦取血，血细胞自动分析仪测定WBC数，称得小鼠体重、胸腺、脾脏、肝脏重量，计算脏器指数。

2.3 统计方法

所得数据均经SPSS11.5统计软件进行方差分析及t检验处理，以均数±标准差(x±s)表不。

3 试验结果

3.1 对环磷酰胺致免疫功能低下小鼠升高白细胞作用

经环磷酰胺腹腔注射3天后，小鼠WBC数量，LY％显著下降。经人参多糖提取物12mg/kg连续静脉注射7天后，小鼠WBC和LY％显著升高。但RBC、HGB含量、PLT数量减少。数据见表3-1，3-2。

3.2 对荷瘤小鼠升高白细胞作用

将小鼠接种S180瘤细胞，经人参多糖提取物48、24、12mg/kg连续静脉注射7天后，3个剂量组小鼠WBC数量均可见升高，尤以48mg/kg、12mg/kg升高明显，与模型对照组比较有显著差异(P<0.001)。但升高WBC同时，亦可见减少RBC和HGB作用。数据见表4-1，4-2。

3.3 对荷瘤小鼠免疫器官重量的影响

将小鼠接种S180瘤细胞，经人参多糖提取物48、24、12mg/kg连续静脉注射7天后，可见人参多糖48mg/kg组脾脏重量及脾脏指数明显高于模型对照组。数据见表5-1，5-2。

3.4 体外溶血试验

为探讨人参多糖提取物减少RBC、HGB含量、PLT数量的原因，分别将人参多糖提取物4.8、2.4、1.2、0.6mg/ml应用液及人参多糖注射液进行家兔全血体外溶血试验，均无溶血发生。

表3-1 人参多糖对环磷酰胺致免疫功能低下小鼠血象影响(x±s)

注：与正常对照组t检验：

与模型对照组方差分析：^***P<0.001，^▲P<0.05。

表3-2 人参多糖对环磷酰胺致免疫功能低下小鼠血象影响(x±s)

注：与正常对照组t检验：与模型对照组方差分析：^***P<0.001，^▲▲P<0.01，^▲▲▲P<0.001。

表4-1 人参多糖对荷瘤小鼠血象影响(x±s)

注：与模型对照组方差分析：^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001。

表4-2 人参多糖对荷瘤小鼠血象的影响(x±s)

注：与模型对照组方差分析：^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001。

表5-1 人参多糖对荷瘤小鼠免疫器官重量的影响(x±s)

注：与模型对照组方差分析：^*P<0.05。

表5-2 人参多糖对荷瘤小鼠免疫器官指数的影响(x±s)

注：与模型对照组方差分析：^*P<0.05。

4 试验结论

人参多糖提取物具有升高白细胞及增加脾脏等免疫器官的作用。但升高白细胞的同时可见伴有红细胞、血红蛋白减少。同浓度人参多糖提取物应用液无体外溶血作用。人参多糖提取物的药理作用、量效关系及安全性有待进一步研究。

实施例22 特定分子量人参多糖提取物对小鼠免疫功能的影响

摘要 目的：观察特定分子量人参多糖提取物对小鼠免疫功能的影响。方法：小鼠尾静脉注射预防性给药2天后，腹腔注射环磷酰胺60mg/kg，连续3天，造成免疫功能低下小鼠模型，继续给药5天，眼内眦取血测定外周白细胞数量；末次给药24h后，尾静脉注射印度墨汁，计算吞噬指数K及校正吞噬指数α；8～12g幼鼠连续尾静脉给药7天后，称取胸腺、脾脏重量，计算胸腺、脾脏指数。结果：特定分子量人参多糖提取物24mg/kg组小鼠白细胞较模型组比较明显升高(P<0.05)，但对淋巴细胞及粒细胞百分比的恢复无明显作用，对单核细胞有明显升高作用(P<0.001)，升高白细胞同时可降低血红蛋白及血小板含量。特定分子量人参多糖提取物24、12、6mg/kg可降低免疫低下小鼠体重，且存在一定量效关系。小鼠尾静脉注入印度墨汁后，特定分子量人参多糖提取物24mg/kg 1min及7min吸光度均较模型组明显降低，计算得出吞噬指数K有升高趋势，说明特定分子量人参多糖提取物24mg/kg能提高免疫低下小鼠炭粒廓清能力。特定分子量人参多糖提取物24、12、6mg/kg对KM幼鼠连续注射7天后，与模型对照组比较均能显著增加脾脏指数，但对胸腺指数未见明显影响。结论：特定分子量人参多糖提取物可改善免疫功能低下小鼠白细胞减少症状，并能提高小鼠对惰性炭粒的廓清能力，能明显增加脾脏免疫器官的重量；但同时亦可减轻免疫功能低下小鼠体重，并降低血红蛋白及血小板含量。如何使特定分子量人参多糖提取物在增强免疫低下小鼠免疫功能的同时减少破坏红细胞及血小板的副作用，值得进一步探索。

1 试验材料

1.1 实验动物：KM小鼠，雄性，体重18～20g；KM幼鼠，雄性，体重8～12g，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2007-0001。

1.1.1 实验动物饲养管理

每天为小鼠提供普通全价颗粒饲料II号，由北京科澳协力饲料有限公司生产，京动许字(2000)第015号。动物饮用纯净水。

标准化实验室，实验动物使用许可证号SYXK(津)2007-0001。

1.2 试验药物

1.2.1 特定分子量人参多糖提取物：浅棕色粉末，由天津市医药科学研究所制剂室提供。

1.2.2 人参多糖提取物：棕色粉末，由天津市医药科学研究所制剂室提供。

1.2.3 人参多糖注射液：山西普德药业有限公司，批号：20070301

1.2.4 胸腺肽注射液：吉林华康药业股份有限公司，批号：080102

1.2.5 环磷酰胺：AlfaAesar，Lot：K06R045

1.2.6 印度墨汁：Solarbio，Cat：No.18060

1.2.7 0.1％Na2CO3

1.3 仪器与设备：日本MEK-6318K型自动血球计数仪，T-500电子天平(常熟双杰测试仪器厂，编号：265)，PL203精密电子天平(梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司制造)，紫外分光光度计(岛津UV-260)，0.45μm无菌过滤器。

2 试验方法

2.1 对环磷酰胺致免疫功能低下小鼠升高白细胞作用：将小鼠按照体重分层随机分为8组，分别为正常对照组、模型对照组、人参多糖注射液对照组(12mg/kg)、人参多糖提取物组(12mg/kg)、胸腺肽注射液对照组、特定分子量人参多糖提取物24mg/kg、12mg/kg、6mg/kg组。正常与模型对照组尾静脉注射无菌生理盐水、各给药组注射相应药物(受试药制成水溶液后经直径为0.45μm无菌漏斗过滤后供静脉注射使用)，预防性给药2d后，除正常对照组外，其余各组均经腹腔注射环磷酰胺溶液60mg/kg，连续注射3天，每日1次，制备小鼠免疫功能低下模型，同时继续给药共7天。末次给药后给小鼠禁食12小时，第8天目内眦取血，血细胞自动分析仪计数白细胞(WBC(×10⁹/L))、血小板(PLT(×10¹⁰/L))、红细胞(RBC(×10¹²/L))、血红蛋白(HGB(g/L))、单核细胞百分比(MO％)、粒细胞百分比(GR％)、淋巴细胞百分比(LY％)等血象指标。

2.2 小鼠网状内皮系统对血流中惰性炭粒的吞噬廓清能力的影响：取雄性小鼠随机分组，分别为正常对照组、模型对照组、人参多糖注射液对照组(12mg/kg)、人参多糖提取物组(12mg/kg)、胸腺肽注射液对照组、特定分子量人参多糖提取物24mg/kg、12mg/kg、6mg/kg组，共8组，每组14只。给药与模型制备方法同2.1。末次给药后24小时，于鼠尾静脉注入稀释的印度墨汁(反复振摇至均匀，用0.9％氯化钠注射液按4倍稀释后使用。)注射体积为0.1ml/10g。于注入墨汁后1分种及7分钟用特制取血吸管从小鼠眼眶后静脉丛取血0.025ml，立刻吹入0.1％Na2CO3液2ml中，吸管于该液中吸入、吹出数次，以充分洗出吸管壁附着之血液，取血完毕，以0.025ml正常小鼠血溶于2ml Na2CO3液校零，于分光光度计上675nm处比色，按下式计算吞噬指数K及吞噬系数(校正吞噬指数)α，公式如下：

吞噬指数K＝(logOD1-logOD2)/(t2-t1)

(上式中OD1、OD2为不同时间所取血样的光密度，t2～t1为取两血样的时间差)

吞噬活性α＝K1/3*体重/(肝重量+脾重量)

2.3 对幼鼠胸腺、脾脏等免疫器官的影响：将小鼠按照体重分层随机分为正常对照组、人参多糖注射液对照组24mg/kg、人参多糖提取物组(24mg/kg)、胸腺肽组10mg/kg、特定分子量人参多糖提取物24、12、6mg/kg，共6组，每组14只。尾静脉给药，每日1次，连续7日。第8日，各组小鼠称体重，摘眼球放血后，脱臼处死小鼠，取胸腺、脾脏称重量，并求得脏器指数：

脏器指数＝器官重量/体重。

2.4 统计方法：所得数据均经SPSS11.5统计软件方差分析及t检验处理，以均数±标准差(x±s)表示。

3 试验结果

3.1 对环磷酰胺致免疫功能低下小鼠升高白细胞作用：小鼠腹腔注射环磷酰胺60mg/kg，3天后，模型对照组小鼠白细胞数量与正常对照组比较明显减少，淋巴细胞百分比明显降低，粒细胞百分比明显增多(P<0.001)。经连续7天注射特定分子量人参多糖提取物24mg/kg后，小鼠白细胞较模型组比较明显升高(P<0.05)，但对淋巴细胞及粒细胞百分比的恢复无明显作用，对单核细胞能够明显升高作用(P<0.001)。数据见表6。

3.2 小鼠网状内皮系统对血流中惰性炭粒的吞噬廓清能力的影响：小鼠静脉注入印度墨汁后，特定分子量人参多糖提取物24mg/kg1min及7min吸光度均较模型组明显降低，计算得出吞噬指数K有升高趋势，说明特定分子量人参多糖提取物24mg/kg能提高免疫低下小鼠异物廓清能力。但特定分子量人参多糖提取物3个剂量组小鼠体重均较模型对照组明显减轻，数据见表7。

3.3 对幼鼠胸腺、脾脏等免疫器官的影响：KM幼鼠经静脉给药7天后，人参多糖注射液组胸腺、脾脏重量及指数均，有升高趋势，特定分子量人参多糖提取物3个剂量组脾脏指数与模型对照组比较均明显增大(P<0.001，P<0.001，P<0.05)，胸腺指数未见增大趋势。数据见表8。

4 试验结论

特定分子量人参多糖提取物可改善免疫功能低下小鼠白细胞减少症状，并能提高小鼠对惰性炭粒的廓清能力，能明显增加脾脏免疫器官的重量；但同时亦可减轻免疫功能低下小鼠体重，并降低血红蛋白及血小板数量。如何使特定分子量人参多糖提取物在提高小鼠免疫功能的同时减少破坏红细胞及血小板的副作用，值得进一步探索。

表6 特定分子量人参多糖提取物对环磷酰胺致免疫功能低下小鼠血象的影响(x±s)

注：与正常对照组t检验：

与模型对照组方差分析：^***P<0.001，^▲P<0.05，^▲▲P<0.01

表7 特定分子量人参多糖提取物对对血流中惰性炭粒的吞噬廓清能力的影响(x±s)

注：与正常对照组t检验：

，与模型对照组方差分析：^▲P<0.05，^▲▲P<0.01，^*P<0.05，^**P<0.01。

表8 特定分子量人参多糖提取物对幼鼠胸腺、脾脏等免疫器官的影响(x±s)

注：与模型对照组方差分析：^*P<0.05，^***P<0.05。

实施例23 人参多糖注射液和特定分子量人参多糖提取物的体外抗癌活性研究

1 试验目的

观察样品人参多糖注射液和特定分子量人参多糖提取物对体外培养的A549、MCF-7、BGC-823和LOVO细胞株的抑制作用。

2 试验材料

2.1 试验药物

2.1.1 人参多糖注射液，山西普德药业有限公司。规格：4mg：12ml批号：20070301。

配制使用方法：取0.64ml注射液加入4.16ml营养液，得400ug/ml，后面依次倍比稀释。

2.1.2 特定分子量人参多糖提取物，由天津市医药科学研究所药物制剂开发中心提供。样品为浅咖啡色粉末。

配制使用方法：称取药物6mg，加入2ml营养液，超声，制备成混悬液，3mg/ml，取0.64ml加入4.16ml营养液，得400ug/ml，后面依次倍比稀释。

2.1.3 顺铂，批号：20070408南京制药厂有限公司。

2.2 细胞株

细胞株MCF-7乳腺癌、A549肺腺癌、BGC-823胃癌和LOVO结肠癌细胞株均由本科室瘤源室提供。

2.3 试剂

RPMI1640培养基批号：1279327GIBCO公司

MTT批号：T15051/15181 北京欣经科生物技术有限公司

胎牛血清批号：348555 GIBCO公司

二甲基亚砜批号：0080821 天津市威晨化学试剂科贸有限公司

2.4 实验仪器

CO2孵育箱REVCO美国产

酶标仪Labsystems Dragon芬兰产

倒置显微镜OLYMPUS日本产

96孔板Greinerbio-one德国产

3 试验方法

本试验采用常规MTT检测方法。(1)接种细胞：取对数生长期细胞，经0.25％的胰酶消化后加入含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养液，将细胞稀释成单细胞悬液，调整细胞数，接种于96孔板，每孔100μL。将接种后的细胞置37℃、5％二氧化碳培养箱内培养24小时。(2)加药：将受试药物从终浓度为200μg/ml开始用RPMI-1640培养液进行倍比稀释，共配制10个浓度。于96孔板中加入不同浓度待测样品液，100μL/孔，每个样品浓度设4个复孔，对照组设5个复孔。对照组用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液补足剩余体积，使反应体积为200μL/孔。加样后将细胞置37℃、5％二氧化碳培养箱内继续培养48～68小时。(3)加MTT：弃上清，加MTT 5mg/ml以PBS溶解，每孔加200μl。置37℃继续培养4小时后取出。(4)测OD值：弃除96孔板内的上清液，每孔加入DMSO 150μl。在酶标仪570nm测定OD值。

评价指标：

细胞生长抑制率

抑制率＝(1—实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100％。以直线回归方法计算IC₅₀。

4 试验结果

试验样品特定分子量人参多糖提取物和人参多糖注射液对体外培养的MCF-7和BGC-823均未显示细胞毒活性。特定分子量人参多糖提取物对A549细胞株未检测出抗癌活性，但人参多糖注射液从6.25～100μg/ml表现出一定的抗癌活性，统计学处理P<0.001。特定分子量人参多糖提取物浓度为3.13～100μg/ml时，对LOVO细胞株的生长具有一定程度的抑制作用，与对照组比较，6.25μg/ml剂量组和12.5～50μg/ml剂量组具有统计学意义(P<0.05、P<0.01)，但不具量效关系。人参多糖注射液对LOVO细胞株在6.25～50μg/ml虽表现出一定的抗癌活性，但无统计学意义。统计数据见表9-1至表9-8。

表9-1 特定分子量人参多糖提取物对MCF-细胞的影响(x±s)

表9-2 人参多糖注射液对MCF-7细胞的影响(x±s)

表9-3 特定分子量人参多糖提取物对BGC-823细胞的影响(x±s)

表9-4 人参多糖注射液对BGC-823细胞的影响(x±s)

表9-5 特定分子量人参多糖提取物对A549细胞的影响(x±s)

表9-6 人参多糖注射液对A549细胞的影响(x±s)

与对照组比较^*P<0.05，^***P<0.001

表9-7 特定分子量人参多糖提取物对LOVO细胞的影响(x±s)

与对照组比较^*P<0.05、^**P<0.01

表9-8 人参多糖注射液对LOVO细胞的影响(x±s)

实施例24 特定分子量人参多糖提取物对肝癌荷瘤小鼠肿瘤生长及免疫器官的影响

试验目的：观察特定分子量人参多糖提取物样品对肝癌荷瘤小鼠肿瘤生长及免疫器官的影响。

1 试验材料

1.1 试验药物

1.1.1 特定分子量人参多糖提取物样品：浅棕色粉末，由天津市医药科学研究所制剂室提供。

1.1.2 人参多糖注射液(对照药)：山西普德药业有限公司产品，4ml:12mg，批号20080103。

1.1.3 注射用环磷酰胺，规格0.2g，江苏恒瑞医药股份有限公司，产品批号07012621，有效期至20090125。

1.2 实验动物

昆明种小鼠，体重19-23g，♀，购自北京大学医学部，2008年9月16日购入，合格证号SCXK(京)2006-0008。

1.3 瘤源：小鼠肝癌腹水型，由本室瘤源室提供。

2 试验方法

①取瘤源肝癌小鼠2只，腹部消毒，用无菌消毒注射器抽取肝癌腹水，用生理盐水按1：4稀释后备用。

②昆明种小鼠60只，逐一腋下碘酒、酒精消毒，腋下皮下接种上述制备的肝癌瘤液0.2ml/只。

③接种后，小鼠称体重，按体重随机分组，本实验共分为6组，分别为模型对照组(生理盐水1ml/kg)、环磷酰胺(20mg/kg，iv×1)阳性药对照组、人参多糖注射液(12mg/kg)对照组、特定分子量人参多糖提取物24mg/kg、12mg/kg、6mg/kg组，每组10只。

④接种后次日开始iv给药，1次/日，各组均给药7天。

⑤给药第8天处死动物，称取体重，解剖，称取瘤重及胸腺、肝、脾重量，计算抑瘤率及对免疫器官重量的影响。

3 试验结果

与模型组比较，人参多糖注射液及提取物均有不同程度的减轻肝癌荷瘤小鼠瘤重作用，其中特定分子量人参多糖提取物6、12、24mg/kg组均统计学差异显著(p<0.05)。

环磷酰胺组p<0.01。各给药组均未见增加肝癌荷瘤小鼠胸腺重量作用。人参多糖注射液及提取物对肝癌荷瘤小鼠肝脏、脾脏重量未见明显影响。统计数据见表10-1至表10-4。

表10-1 特定分子量人参多糖提取物等对肝癌荷瘤小鼠瘤重的影响(x±s)

注：与模型组比较，^*p<0.05，^**p<0.01

表10-2 特定分子量人参多糖提取物等对肝癌荷瘤小鼠胸腺重量的影响(x±s)

注：与模型组比较，^*p<0.05

表10-3 特定分子量人参多糖提取物等对肝癌荷瘤小鼠肝脏重量的影响(x±s)

表10-4 特定分子量人参多糖提取物等对肝癌荷瘤小鼠脾脏重量的影响(x±s)

注：与模型组比较，^*p<0.05

参考文献：

[1]徐叔云.药理实验方法学(第三版).北京：人民卫生出版社出版。

[2]李仪奎.中药药理实验方法学.上海科学技术出版社。

Claims (7)

1.一种人参多糖注射剂，选自人参多糖注射液或注射用人参多糖无菌粉末，其特征在于：所述人参多糖注射液由分子量为4000-1800000道尔顿的人参多糖、附加剂及注射用水组成，所述人参多糖无菌粉末由分子量为4000-1800000道尔顿的人参多糖及附加剂组成；

该人参多糖注射剂的制备方法包括下述步骤：

(1)粉碎：选取生晒参，过10～100目筛；

(2)醇提：使用10～100％的乙醇回流反应3～10小时，乙醇与生晒参粉末的重量比为1∶2～11，过滤，将醇提后得到的固体产物自然风干；

(3)水提：向上述风干的固体产物中加入其固体产物2～8倍体积的水，于60～110℃回流反应1～5小时得水提物；

(4)醇沉：将上述水提物于35～90℃减压浓缩成密度为1.02～1.1的液体，用40～100％的乙醇室温放置10～48小时，离心，沉淀，得粗糖提取物，粗糖提取物经水溶后再加入80～100％的乙醇放置10～48小时，离心，取沉淀，得精制糖提取物；

(5)酶解、脱色及除蛋白：取上述精制糖提取物经水溶后按每克精制糖提取物添加1～1.2μl的α-淀粉酶，置于85～95℃保温20～40分钟；按精制糖重量10～20％添加活性炭，于90～110℃回流30～45分钟脱色、离心；取上清液Sevage法脱蛋白，重复3～5次，取水层浓缩、离心、干燥，得到棕褐色粉末；

(6)柱层脱色分离：将步骤5所得棕褐色粉末水溶后与载体一起进行上样，所述棕褐色粉末按重量比1∶10～1∶100采用洗脱液进行梯度洗脱，将洗脱液浓缩，醇沉，过夜，离心，取沉淀干燥，得到人参多糖；

(7)膜分离：采用中空纤维膜滤掉小于4000道尔顿的滤液，得到分子量为4000-1800000道尔顿的人参多糖；

(8)将分子量为4000-1800000道尔顿的人参多糖制得注射剂。

2.如权利要求1所述的人参多糖注射剂，其特征在于：按1ml计的人参多糖注射液中含有分子量为4000-1800000道尔顿的人参多糖0.1-10mg，附加剂1-150mg，其余为注射用水。

3.如权利要求1所述的人参多糖注射剂，其特征在于：所述注射用人参多糖无菌粉末中含有分子量为4000-1800000道尔顿的人参多糖1％-100％w/w及附加剂0-99％。

4.如权利要求1-3任一所述的人参多糖注射剂，其特征在于，所述附加剂选自氯化钠、葡萄糖、葡聚糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、聚乙二醇、甘氨酸、精氨酸、白蛋白、明胶其中的任意一种至三种的混合物。

5.如权利要求1所述的人参多糖注射剂，其特征在于：所述生晒参为4～5年龄人工种植的人参。

6.如权利要求1所述的人参多糖注射剂，其特征在于：步骤(6)中采用的洗脱液为Tris缓冲液、醋酸溶液、醋酸铵溶液、磷酸盐缓冲液或氯化钠溶液其中的一种，其中：

Tris缓冲液作为各梯度洗脱液的浓度分别为0.002mol/L、0.01mol/L、0.1mol/L，各梯度洗脱液的洗脱速度为0.2ml/分、0.5ml/分、1ml/分；

醋酸溶液作为各梯度洗脱液的浓度分别为0.01mol/L、0.1mol/L、0.8mol/L，各梯度洗脱液的洗脱速度为0.5ml/分、1ml/分、2ml/分；

醋酸铵溶液作为各梯度洗脱液的浓度分别为0.01mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L，各梯度洗脱液的洗脱速度为0.5ml/分、1ml/分、2ml/分；

磷酸盐缓冲液作为各梯度洗脱液的浓度分别为0.002mol/L、0.02mol/L、0.1mol/L，各梯度洗脱液的洗脱速度为1ml/分、1.25ml/分、2ml/分；

氯化钠溶液作为各梯度洗脱液的浓度分别为0.02mol/L、0.1mol/L、0.5mol/L，各梯度洗脱液的洗脱速度为1ml/分、1.25ml/分、2ml/分。

7.如权利要求1所述的人参多糖注射剂，其特征在于：步骤(6)中所述载体为葡聚糖凝胶树脂、交联琼脂糖凝胶或快流速琼脂糖凝胶中的一种，葡聚糖凝胶树脂载体选自DEAE-52、Sephadex G-25、Sephadex G-75、Sephadex G-100中的一种，交联琼脂糖凝胶载体选自Sepharose CL-4B或Sepharose CL-6B，快流速琼脂糖凝胶载体选自Sepharose4FF、Sepharose6FF或Q-Sepharose FF中的一种。

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