CN104974236A - 一种蝎毒多肽b4及其分离纯化方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种蝎毒多肽B4及其分离纯化方法与应用。该蝎毒多肽B4的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，是从东亚钳蝎的蝎毒中分离得到的天然多肽。本发明得到的蝎毒多肽B4是一个小分子多肽，且纯度较高，引起过敏反应和其他不良反应的可能性很小，深入研究其对放化疗导致的骨髓造血功能和免疫功能损伤的恢复作用和机制，具有很好的临床应用前景。本发明的结果说明SVPB4对CTX所致的骨髓造血功能抑制和毒性作用具有显著的恢复和保护作用，为今后深入研究其作用和机制提供了充分的实验依据。

Description

一种蝎毒多肽B4及其分离纯化方法与应用

技术领域

本发明涉及一种蝎毒多肽B4(scorpion venom peptide B4，SVPB4)，具体涉及一种蝎毒多肽B4及其分离纯化方法与应用。

背景技术

全世界蝎目分6科，70属，约800余种，中国境内主要为东亚钳蝎，后者在历史上一直作为我国传统、名贵中药之一的“全蝎”而享誉海内外。蝎毒为蝎尾节毒囊中排泌出来的一种有毒分泌物，是全蝎治疗疾病的主要有效部位，其对肿瘤、疼痛、心血管疾病的疗效较全蝎强数倍。蝎毒以毒攻毒的药理作用是建立在全蝎及蝎尾千百年来大量临床应用的基础之上，具有鲜明的民族特色。

蝎毒是一个巨大的生物资源宝库，其中大部分是具有药理学活性的多肽类。目前，蝎毒中已分离出的蝎毒素大约有30种左右，主要是由35～70个氨基酸所组成的短肽，分子量约在4000～9000D之间，pH变化对蝎毒素的毒性影响不大，在加热至100℃并持续15～30min后，毒性依然较强。国外在蝎毒方面的研究始于十九世纪末，自上个世纪九十年代以来，蝎毒作为研究离子通道的工具及制作抗毒血清的原料而成为国际上研究的重点。从LQS蝎毒中分离出的氯毒素及charybdotoxin，对恶性神经胶质瘤细胞膜上的离子通道有特异的亲和作用，细胞的恶性度越高，氯毒素对它们的亲和作用越强。氯毒素与同位素结合后，其对胶质瘤的定向杀伤作用更为显著。此外，蝎毒素能够阻滞细胞膜的K⁺通道，同时导致Ca²⁺的内流减少，使肿瘤细胞的生长延缓。

我国在蝎毒方面的研究虽然起步晚，但在中医临床验证及理论体系(攻毒散结、通经活络、平肝熄风)的指导下，在抗肿瘤、抗痛、抗癫痫、抗凝、抗肝炎、抗风湿等领域均取得了丰硕的成果。

环磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)是一种临床常见的具有高治疗指数的烷化剂类抗肿瘤药物，广泛应用于各种癌症治疗，具有诱导肿瘤细胞凋亡和抑制细胞增殖的作用。但环磷酰胺可导致严重的副作用，如白细胞减少、骨髓抑制、免疫抑制和细胞毒作用。其中骨髓抑制可引起骨髓微环境、造血干细胞、造血细胞生长因子等的损伤，骨髓抑制引起的外周血细胞减少会导致严重感染、贫血以及严重出血，甚至导致死亡。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种蝎毒多肽B4。

本发明的另一目的在于提供上述蝎毒多肽B4的分离纯化方法。

本发明的再一目的在于提供上述蝎毒多肽B4的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种蝎毒多肽B4(scorpion venom peptide B4，SVPB4)，该蝎毒多肽B4是一种天然蝎毒多肽，该天然蝎毒多肽是从东亚钳蝎(Buthus martensii Karsch)蝎毒中分离的一种新的蛋白质。所述东亚钳蝎可以为野生或是任何一种市售的人工养殖的东亚钳蝎，如乌鲁木齐县东亚钳蝎良种繁育场、徐州新沂市浩大蝎子养殖场、金华市天道有毒生物科技开发有限公司等市售的东亚钳蝎。

其中，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示：

SEQ ID NO:1：CGPCFTTDANMARKFRECCGGIGKKFFPQQLLNN；

所述的蝎毒多肽B4是从东亚钳蝎的蝎毒中所分离得到的天然多肽，该蝎毒多肽B4的分离纯化方法，包括如下步骤：

(1)东亚钳蝎蝎毒采集：利用电刺激法提取新鲜粗毒液，经真空冷冻干燥成蝎毒干粉；通常5kg活蝎可提取1.5～2.0g冻干蝎毒；

(2)东亚钳蝎蝎毒粗毒溶液的配制；取步骤(1)制备的蝎毒干粉配制成浓度为20mg/mL的蝎毒粗毒溶液，备用；

(3)SVP II分离

凝胶过滤：采用分子筛层析凝胶Sephadex G-50Medium对步骤(2)制备的蝎毒粗毒溶液进行分离；层析柱规格为50cm×5.5cm，每次上样量为400mg原毒，体积为20mL，收集峰II(SVPII)冻干，备用，收率约60％；

(4)SVPB4纯化

a.离子交换：采用CM Sepharose FF填料，通过离子凝胶柱对SVPII进行进一步纯化；层析柱规格为100cm×5.5cm，每次上样量为500mg SVPII冻干粉，体积为20mL，洗脱液为ph＝6.4的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，其中A液为0.05M磷酸盐缓冲液(Na₂HPO₄/NaH₂PO₄)，B液为含0.3MNaCl的A液，收集SVPB4，用Vivaflow 50切向超滤器脱盐，冻干，备用，收率约9％；

b.HPLC分析：流动相A液为0.1％(v/v)TFA(三氟乙酸)/H₂O，B液为70％(v/v)乙腈+0.1％(v/v)TFA；洗脱程序为0～60min，B液浓度由0～100，洗脱速度为0.5mL/min；经分析，由离子交换所得的目标峰——SVPB4的纯度可达96％以上；

(5)SVPB4分子量及其氨基酸序列测定

用质谱分析法(Bruker公司的9.4T混合型串联傅立叶质谱仪Q-FT-MS)测定SVPB4的精确分子量为3746.53Da；用蛋白质N端测序法(岛津公司的PPSQ-31A蛋白自动测序仪)测定SVPB4共有34个氨基酸残基，其始自N端的全序列为：

CGPCFTTDANMARKFRECCGGIGKKFFPQQLLNN；(SEQ ID NO:1)

经BLASTp比对的结果表明，SVPB4属于蝎毒的α毒素家族，与已知的其他成员均有一定的差异性，说明SVPB4是一种新的天然多肽。

为解决上述技术问题，本发明人经过锐意研究，在前期研究蝎毒多肽与化疗药物联合应用可协同抗癌，并能降低化疗药带来的毒副作用；蝎毒多肽II(SVPII)有类似造血生长因子作用，通过上调白细胞介素-3受体，促进辐射后小鼠骨髓造血功能的恢复损伤。蝎毒多肽B4(scorpion venom peptide B4，SVPB4)是本发明人从SVPII中分离纯化出的一种新的小分子多肽。本发明采用CTX致小鼠骨髓抑制模型，观察SVPB4对CTX所致的小鼠骨髓抑制及其毒性的恢复作用，以及该作用的量效关系，从而完成了本发明。

所述的蝎毒多肽B4在抗癌治疗辅助药物中的应用。

所述的抗癌治疗辅助药物可具有化疗所致骨髓造血功能抑制及毒副反应中的保护作用和功能恢复作用。

所述的抗癌治疗辅助药物，含有SEQ ID NO:1所示的蝎毒多肽B4。

所述的抗癌治疗辅助药物，其中，所述的蝎毒多肽B4的施用量为0.5～2.0mg·kg^-1。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

(1)环磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)是一种免疫抑制剂，主要用于肿瘤、自身免疫性疾病以及器官移植的治疗。CTX引起的主要不良反应是造成免疫功能和造血系统功能的抑制，并且目前尚无有效的防治方法。本实验中观察到，注射CTX 3d后，小鼠表现为活动迟缓，倦卧，扎堆，毛发蓬松，一般状态较差，摄食和饮水量均减少，体重增长缓慢等，这些表现与临床肿瘤患者CTX化疗后出现的疲惫、消瘦、食欲差以及体力进行性下降等症状类似。本发明的结果显示，经过SVPB4的治疗后，小鼠一般状态改善，摄食增加，体重增长加快。本发明人早期的研究发现，蝎毒抗癌多肽能够显著抑制H22荷瘤小鼠肿瘤生长，亦能升高小鼠体内的免疫细胞，提高荷瘤小鼠的免疫功能。本实验的结果也提示SVPB4可能增强了小鼠的免疫功能，使小鼠的抵抗力增高，一般状况改善，体重增加。

(2)目前，制备化疗药物所致骨髓抑制动物模型多数采用CTX。CTX属氮芥类烷化剂，临床上用于治疗肿瘤时常常缺乏选择性，在杀死大量肿瘤细胞的同时也对正常骨髓细胞造成不同程度的损伤，尤其是对粒细胞系的影响最大，从而出现骨髓抑制，白细胞减少，甚至全血细胞减少。本实验观察到，应用CTX后小鼠外周血细胞的改变以WBC和LY细胞计数减少为主，血小板亦出现减少，而红细胞变化不大，与临床应用时出现的骨髓损伤的表现一致。高剂量SVPB4治疗后能够显著升高小鼠外周血WBC和LY数目，外周血LY计数甚至高于空白对照组，SVPB4对CTX导致骨髓造血功能抑制的治疗作用与rhG-CSF相当或优于rhG-CSF，具有很好的临床应用前景。

(3)骨髓有核细胞(bone marrow nucleated cells，BMNC)计数在一定程度上反映骨髓造血细胞的增生情况，骨髓切片的组织病理学观察能较为全面的反映骨髓组织以及骨髓腔中造血细胞和其他实质细胞的状况。本实验结果表明，CTX注射小鼠后，小鼠BMNC数显著下降，骨髓腔内造血组织面积显著减少；给予SVPB4治疗7d后，即能显著升高BMNC数，高剂量SVPB4的治疗作用与rhG-CSF类似，SVPB4治疗14d后，升高小鼠BMNC的作用优于rhG-CSF，骨髓腔内造血组织明显增多。说明SVPB4促进了骨髓造血细胞的增生，加速受损骨髓造血功能的恢复。前期研究发现，蝎毒多肽II(SVPII)有类似造血生长因子作用，通过上调白细胞介素-3受体，促进辐射后小鼠骨髓造血功能的恢复损伤。本实验的结果与之前的结果一致，说明SVPB4对CTX所致的骨髓造血功能抑制和毒性作用具有显著的恢复和保护作用，为今后深入研究其作用和机制提供了充分的实验依据。

(4)脾脏为机体的造血组织，脾脏重量的明显下降提示脾中造血集落的大幅度减少，也反映了造血干细胞数量的明显较低。当机体造血系统受到损伤时，残存的具有增殖能力的造血干细胞在脾脏中代偿性增殖，形成脾结节。每个脾结节来源于单个既有自我更新，又有多向分化能力的造血干细胞。啮齿类动物中脾结节数可以直接代表残存的具有更新和多向分化能力的造血干细胞数量。本实验结果显示，空白对照组小鼠脾脏表面光滑，鲜有脾结节形成，CTX注射后，小鼠造血功能受到损伤，骨髓造血干细胞代偿性增生，导致脾脏脾结节数增加；骨髓抑制小鼠经SVPB4治疗7d后，小鼠脾结节数显著高于模型对照组，说明SVPB4促进了骨髓造血干细胞的增殖，增加了干细胞的数量，促进小鼠造血功能的恢复。这部分结果与前述的外周血WBC和LY增多、骨髓BMNC增多以及骨髓中造血组织增多的结果一致。本实验结果初步证实，SVPB4对化疗导致的小鼠骨髓造血功能抑制以及免疫损伤具有一定的保护作用。

骨髓造血受到众多特异的造血生长因子调控，重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)的应用减少了化疗导致的持续而严重的中性粒细胞减少症和相关感染的发生，给肿瘤患者的化、放疗提供了有力的支持，因此本发明选择其作为阳性对照药物。rhG-CSF的不良反应有轻、中度发热，注射部位疼痛，骨、肌肉疼痛，乏力。少数病人可能出现皮疹、寒战、流涕、胸闷、心悸，一般可以耐受。

但是由于rhG-CSF的半衰期短，造价昂贵，无法满足临床上广大病患的应用。SVPB4是本发明人从东亚钳蝎蝎毒组分II(SVPII)中分离纯化得到的纯度达96％的多肽。本发明人前期的研究表明，SVPII能够促进辐射损伤导致的骨髓造血功能抑制的恢复，SVPB4是一个分子量为3746.53Da的小分子多肽，且纯度较高(>96％)，引起过敏反应和其他不良反应的可能性很小，深入研究其对放化疗导致的骨髓造血功能和免疫功能损伤的恢复作用和机制，具有很好的临床应用前景。

附图说明

图1是实施例1中东亚钳蝎粗毒溶液进行凝胶过滤层析分离后的洗脱蛋白的280nm下的吸光度值结果图。

图2是实施例1中对峰II(SVPII)进行离子柱交换层析分离后的洗脱蛋白的280nm下的吸光度值结果图；其中，Ⅰ：A液平衡；II：含0～0.3mol/L NaCl的A液梯度洗脱。

图3是实施例1中对B3、B4、B5、B6四个组分进行RP-HPLC鉴定的结果图。

图4是实施例1中SVPB4的质谱图。

图5是实施例2中SVPB4对骨髓抑制小鼠体重的影响的结果图。

图6是实施例2中SVPB4对骨髓抑制小鼠股骨骨髓组织形态学改变的影响的结果图；其中，A、空白对照组；B、模型对照组；C、SVPB4低浓度组(0.5mg·kg^-1)；D、SVPB4高浓度组(2.0mg·kg^-1)；E、阳性对照组(rhG-CSF 125μg·kg^-1)。

图7是实施例2中SVPB4对正常小鼠骨髓细胞液体培养7d时形态的影响。

图8是实施例2中SVPB4对正常小鼠骨髓细胞液体培养14d时形态的影响。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

本发明所述蝎毒多肽B4的分离纯化方法，包括如下步骤：

(一)蝎毒多肽SVPB4的分离纯化

1、东亚钳蝎蝎毒采集

本实施方式中成年东亚钳蝎取自东莞中科生物制药有限公司下属的有毒生物种养殖基地，利用电刺激法提取新鲜粗毒液，经真空冷冻干燥成蝎毒干粉。采毒仪器：采用JL-D药理生理实验多用仪(上海益联科教设备有限公司生产)；仪器参数：连续脉冲25～30Hz，波宽0.5～0.7ms，电压6～8伏；操作方法：用一电极夹住蝎的一个触肢，再用一个金属夹夹在蝎子后腹部第5节处，用另一个电极轻触金属夹，待尾节毒针尖端有毒液排出后即停止电刺激。用5mL试管收集尾刺所排出的毒液，经真空冷冻干燥成干毒。通常5kg活蝎可提取1.5～2.0g冻干蝎毒。

2、东亚钳蝎粗毒溶液配制：天平称取400mg的东亚钳蝎粗毒干粉小心溶解于20mL双蒸水中(按20mg/mL的比例配制)，玻璃棒搅拌使其溶解均匀后分装入50mL离心管中，4℃高速离心(20000rpm×60mins)去沉淀，取上清分装入无菌离心管中，配制成浓度为20mg/mL的蝎毒粗毒溶液，-80℃储存备用。

3、凝胶过滤层析(Sphadex G-50)：称取80g Sephadex G-50葡聚糖凝胶(美国GE公司)干粉，缓慢均匀撒入装有3000mL双蒸水的烧杯(规格为5000mL)中，室温下过夜使其充分溶胀，将溶胀好的葡聚糖凝胶脱气，静置30min，将已脱气凝胶经漏斗缓慢装入已用双蒸水预先润洗玻璃柱(规格为55mm×500mm)(上海华美实验仪器厂)，装柱后凝胶高度为450mm，取20mg/mL的蝎毒粗毒溶液20mL上样，用双蒸水洗脱，流速1.3mL/min；用紫外蛋白检测仪监测洗脱液280nm的吸光度值，灵敏度为0.5A。台式记录仪记录吸光度值峰型图，10min/管收集洗脱液。根据台式记录仪记录的蛋白洗脱峰形，将各试管蛋白峰洗脱液合并，-20℃冷冻，用真空冷冻干燥机将液体变为冻干粉，置于4℃密闭保存备用，收率约60％。

4、离子柱交换层析(CM-Sepharose Fast Flow)：将凝胶层析分离得到的冻干粉500mg，溶于20mLpH6.40.05M磷酸盐缓冲液，4℃高速离心(20000rpm×60min)，去沉淀取上清，做为峰II(SVPII)上样液，-80℃储存备用。取800mL CM-Sepharose Fast Flow凝胶(美国GE公司)，用双蒸水将胶中乙醇洗净，最后一次用磷酸盐缓冲液(A液：PH6.40.05M Na₂HPO₄-NaH₂PO₄)清洗，将凝胶脱气后装入已用A液预先润洗玻璃柱(规格为55mm×1000mm)(上海华美实验仪器厂)，装柱后凝胶高度为750mm，取SVPII上样液20mL上样，用pH6.4的磷酸盐缓冲液(A液：PH6.40.05M Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，B液：含0.3MNaCl的A液)进行线性梯度洗脱，流速1.9mL/min，紫外蛋白检测仪监测洗脱液的280nm的吸光度值，灵敏度为0.1A，自动收样器6min/管部分收集，根据台式记录仪记录的洗脱蛋白峰型图，将各组分洗脱液合并，收集SVPB4，4℃保存备用。

5、样品制备：用Vivaflow 50切向流滤器，将离子层析分离纯化的样品溶液进行浓缩脱盐，溶液置换体积达5～10倍除盐率可达90％，最后用电导率仪测试样品电导率，确定脱盐效果。将脱盐后的样品-80℃冷冻，用真空冷冻干燥机将液体变为冻干粉，置于4℃密闭保存备用，收率约9％。

(二)蝎毒多肽SVPB4及其他组分纯度分析

RP-HPLC分析各组分样品的纯度，采用C18色谱柱(Hypersil ODS25μm，4.6mm×250mm)(日本岛津公司)，色谱条件为：流动相A：0.1％(v/v)三氟乙酸TFA水溶液，流动相B：70％(v/v)的乙腈(含0.1％(v/v)TFA)溶液，流速0.5mL/min，上样后经60min流动相B复合梯度从0到100％浓度变化洗脱。检测波长：280nm，分别检测B3，B4，B5，B6，组分的纯度，每次进样量20μL，每个样品重复3次。

(三)氨基酸序列测定

1.利用质谱分析法(Bruker公司的9.4T混合型串联傅立叶质谱仪Q-FT-MS)，检测纯度最高的B4组分的相对分子量；

2.利用埃德曼降解法(Edman degradation)(岛津公司的PPSQ-31A蛋白自动测序仪)测定B4组分N端前34个氨基酸序列。

(四)结果分析

(1)经凝胶过滤层析(Sphadex G-50)分离，得到3个蛋白峰群，主峰分别为Ⅰ峰、II峰、Ⅲ峰(见图1)；进一步通过离子交换层析分离，得到8个峰，见图2。

(2)RP-HPLC对蝎毒各组分纯度鉴定

用RT-HPLC对B3、B4、B5、B6四个组分进行鉴定，结果如图3。结果显示，B4、B5组分较纯，B3、B6有多种组分组成。

(3)SVPB4的相对分子量测定和氨基酸序列测定

如图4所示，B4组分的分子量大小为3746.53Da，且纯度较高(>96％)。

埃德曼降解法测得B4组分N端前34氨基酸序列为：CGPCFTTDANMARKFRECCGGIGKKFFPQQLLNN(SEQ ID NO:1)；B4为一种新的多肽。

实施例2

1、材料

1.1动物SPF级Balb/C种小鼠，6～8周，18～22g，雄性，购自广东省实验动物中心(许可证号：SYXK(粤)2010-0104)。实验环境：广州医科大学动物中心SPF级，分笼饲养，环境温度(20±2)℃，湿度55％～65％，12h光照，啮齿类动物饲料喂养，自由饮水。

1.2试剂与仪器注射用CTX(通化茂祥制药有限公司)；注射用rhG-CSF(购自厦门特宝生物工程股份有限公司)；全自动生化分析仪(美国Beckman公司)；显微镜(德国Leica)；组织包埋机、自动组织脱水机和生物组织染色机(浙江金华科迪仪器设备有限公司)；组织切片机(Thermo公司)。

2方法

2.1骨髓抑制模型制备小鼠腹腔注射CTX100mg·kg^-1，每天1次，连续3d。

2.2分组和给药50只Balb/c小鼠随机分为空白对照组、模型对照组、阳性对照组(rhG-CSF 125μg·kg^-1)、SVPB4低浓度组(0.5mg·kg^-1组)、SVPB4高浓度组(2.0mg·kg^-1组)。骨髓抑制模型制备成功后，SVPB4处理组按照不同的剂量每日腹腔注射SVPB4，连续注射13d；阳性对照组腹腔注射rhG-CSF 125μg·kg^-1，连续6d。空白对照组和模型对照组腹腔注射等体积生理盐水。

2.3观察指标

2.3.1动物一般情况：每天称量小鼠体重，观察各组小鼠体重变化影响以及精神状态、饮食、活动、毛发、大便等。

2.3.2外周血检测：分别于给药后第7d、14d从每组中随机抽取小鼠4只，采用眼眶后静脉丛取血，置于含用EDTA-K2抗凝剂(市售)的管中，用全自动血细胞分析仪进行白细胞(WBC)、淋巴细胞(LY)、血小板(PLT)和红细胞(RBC)测定。

2.3.3骨髓有核细胞(bone marrow nucleated cells，BMNC)计数：于给药后第7d、14d，每组随机选取5只小鼠，颈椎脱臼处死，取股骨并剔净软组织后，用2mL无血清培养基DMEM(Gibeco)将全部骨髓冲出，通过4号针头分散，制成单骨髓细胞悬液，1000rpm×5min离心后用2mL DMEM培养基(gibeco)重悬红细胞，混匀后取50μL单骨髓细胞悬液加150μL红细胞裂解液(购自汉康为环保科技有限公司)(按体积比1:3的比例)混匀后，冰上孵育15min，期间轻轻涡旋混匀两次。4℃，450×g离心10min，小心吸弃上清液后加入500μL DMEM培养基重悬细胞，制成BMNCs悬液，调整细胞浓度，按白细胞计数法进行BMNC计数，计数3次，求平均值。

2.3.4骨髓切片组织病理观察：于给药后第14d，每组随机选取5只小鼠，颈椎脱臼处死，取一侧完整股骨浸泡10％中性福尔马林溶液中，4℃固定24h。流水冲洗2小时，浸于已配制好的脱钙液(甲酸:水＝1:1，体积比)24小时，常规石蜡包埋、切片、HE染色，光镜下观察骨髓组织病理结构。

2.3.5脾脏指数及脾结节数观察：于给药后第7d、14d，每组随机选取5只小鼠，颈椎脱臼处死，取脾脏，用滤纸吸干血迹、称重，计算脾脏指数。脾脏指数＝脾脏重量(mg)/体重(g)。将称重后的脾脏放入新鲜配制的Bouin氏液。Bouin氏液容积与脾脏的体积总和的比例大于5:1，放置24小时后，肉眼计数脾结节。

2.3.6统计学处理：所有数据均采用SPSS 17.0统计软件处理，计量资料用均数±标准差()表示，采用One–Way ANOVA进行检验。P<0.05有统计学意义。

2.4SVPB4对正常小鼠骨髓细胞长期体外液体培养：将C₅₇BL/6小鼠(购自广东省实验动物中心)颈椎脱臼处死后于无菌条件下取出小鼠股骨放入装有约2mL DMEM培养基(gibeco)的6×6cm培养皿中备用，待股骨均取出后用眼科剪和镊子将骨垢端慢慢暴露，并将其转入装有新DMEM培养基的培养皿中，用1mL注射器吸取DMEM培养基冲洗骨髓腔，冲出骨髓细胞，重复3～5次，将冲出的细胞悬液收集离心，去上清，用DMEM重悬细胞，按3:1的体积比例加入红细胞裂解液，冰上孵育15min，期间轻轻涡旋混匀两次。4℃，450×g离心10min，小心吸弃上清液；向以上沉淀中加入两倍体积的红细胞裂解液，轻轻涡旋充分重悬。4℃，450×g离心10min，小心吸弃上清液。加2mL DMEM培养基悬浮单个核细胞(Mononuclear cells，MNC)，1500rpm/min，4℃离心10min。去上清后再用2mL含20％的FBS(胎牛血清)的DMEM培养基重悬细胞，细胞计数3次，求平均值后，调整细胞密度(10倍以内稀释)至5×10⁵/mL，24孔板每孔需加入1mL，分为Control组(加生理盐水)，IL-3组(10ng/mL)，GM-CSF(粒-巨噬细胞集落刺激因子)组(50ng/mL)，SVPB4组(2μg/mL)，每周半量换液，连续观察4周。

3结果

3.1 SVPB4对小鼠一般状况的影响

空白对照组小鼠体重随生长加重，摄食和活动均无异常；模型对照组小鼠活动迟缓、倦卧、毛色无光泽、精神萎靡、摄食量明显减少，体重下降，生长缓慢，10d后逐渐恢复；与模型对照组小鼠比较，经过药物治疗后，SVPB4处理组和阳性对照组小鼠摄食量增多，活动增加，无明显精神萎靡等表现，小鼠的体重能够在短时间内恢复。各实验组小鼠体重变化如图5所示。

3.2 SVPB4对骨髓抑制小鼠外周血WBC和LY的影响

与空白对照组相比，CTX导致外周血WBC和LY显著下降；给予SVPB4治疗后第7d，小鼠外周血LY高于模型对照组，阳性对照药物rhG-CSF亦能升高WBC和LY；于给药第14d，高浓度的SVPB4和rhG-CSF治疗后，小鼠外周血WBC、LY计数显著高于模型对照组(P<0.05)，高浓度的SVPB4治疗后14d，外周血LY计数甚至高于空白对照组(P<0.05)，结果见表1。

表1 SVPB4对骨髓抑制小鼠外周血白细胞、淋巴细胞计数的影响(n＝5，)

^a P<0.05VS空白对照组；^b P<0.05VS模型对照组。

3.3 SVPB4对骨髓抑制小鼠外周血PLT和RBC的影响

如表2所示，与空白对照组相比，CTX导致外周血PLT显著下降，而RBC的变化不明显；SVPB4治疗后和阳性对照药物处理后第14d，小鼠外周血PLT计数均比模型对照组有所恢复，SVPB4高浓度组的PLT计数亦高于空白对照组，但均无显著统计学差异。CTX以及SVPB4和阳性对照药物处理对RBC计数未见明显影响。

表2 SVPB4对骨髓抑制小鼠外周血血小板和红细胞计数的影响(n＝5，)

^aP<0.05VS空白对照组。

3.4 SVPB4对骨髓抑制小鼠BMNC的影响

与空白对照组相比，CTX导致小鼠骨髓BMNC显著下降(P<0.05)；经治疗后7d，SVPB4高浓度组和阳性对照组小鼠BMNC计数明显高于模型对照组(P<0.05)；给药第14d，SVPB4处理组和阳性对照组BMNC数均高于模型对照组，SVPB4高浓度组显著高于模型对照组(P<0.05)。结果见表3。

表3 SVPB4对骨髓抑制小鼠骨髓有核细胞计数的影响(n＝5，)

^a P<0.05VS空白对照组；^b P<0.05VS模型对照组。

3.5 SVPB4对骨髓抑制小鼠股骨骨髓组织形态学改变的影响

HE染色观察发现，空白对照组小鼠骨髓的骨组织颜色均匀，骨髓、骨小梁、骨髓腔结构清晰，形态结构正常(图6-A)；与空白组比较，模型对照组骨髓腔内的造血组织显著减少(图6-B)；与模型对照组比较，给予SVPB4治疗14d后，明显改善骨髓腔组织的形态学变化，促进骨髓腔内造血组织的增生，骨髓腔内的造血组织明显增多(见图6-C、图6-D)。阳性对照药物亦能明显改善骨髓腔组织的形态学变化(图6-E)。

3.6 SVPB4对骨髓抑制小鼠脾脏指数、脾结节数的影响

CTX造模后的第7d，小鼠脾脏指数低于空白对照组(P<0.05)，阳性对照药物处理后，小鼠脾脏指数有所恢复，显著高于模型对照组(P<0.05)；经治疗后14d，SVPB4组和阳性对照组的脾脏指数均显著高于空白对照，SVPB4高浓度组亦显著高于模型对照组(P<0.05)；而SVPB4处理7d后，小鼠脾结节数显著高于模型对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，SVPB4增加小鼠脾结节的作用与阳性对照药物rhG-CSF的作用相当(见表4)。

表4 SVPB4对骨髓抑制小鼠脾脏指数、脾结节数的影响(n＝5，)

^a VS空白对照组，P<0.05；^b VS模型对照组，P<0.05。

3.7 SVPB4对正常小鼠骨髓细胞液体培养的影响

细胞培养第3d，SVPB4组于倒置显微镜下可见较多圆形细胞，少量梭形细胞贴壁生长，7d时可见圆形透亮细胞和长梭形基质细胞均增多。7d时，GM-CSF组梭形基质细胞明显增多(图7)。14d时，IL-3组、GM-CSF组和SVPB4组细胞密度明显大于Control组，圆形细胞较7d时明显增多(图8)。第28d时，基质细胞生长状态变差，胞内可见小颗粒，培养体系中可见大量细胞碎片。因此，SVPB4对正常骨髓细胞具有促生长和促增值作用，且没有引起过敏反应和其他不良反应，深入研究其对放化疗导致的骨髓造血功能和免疫功能损伤的恢复作用和机制，具有很好的临床应用前景。

SVPB4是本发明从东亚钳蝎蝎毒多肽II(SVPII)中分离纯化得到的纯度达96％的多肽。本实验室前期的研究表明，SVPII能够促进辐射损伤导致的骨髓造血功能抑制的恢复，SVPB4是一个分子量为3746.53Da的小分子多肽，引起过敏反应和其他不良反应的可能性很小，因此先前研究的基础上，本发明取得了预料不到的效果。同时，说明SVPB4对CTX所致的骨髓造血功能抑制和毒性作用具有显著的恢复和保护作用，为今后深入研究其作用和机制提供了充分的实验依据。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种蝎毒多肽B4，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的蝎毒多肽B4，其特征在于：所述的蝎毒多肽B4是从东亚钳蝎(Buthus martensii Karsch)的蝎毒中分离得到的天然多肽。

3.权利要求1或2所述的蝎毒多肽B4的分离纯化方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)东亚钳蝎蝎毒采集：利用电刺激法提取新鲜粗毒液，经真空冷冻干燥成蝎毒干粉；

(2)东亚钳蝎蝎毒粗毒溶液的配制；取步骤(1)制备的蝎毒干粉配制成蝎毒粗毒溶液，备用；

(3)SVPII分离

凝胶过滤：采用分子筛层析凝胶对步骤(2)制备的蝎毒粗毒溶液进行分离；收集SVPII，冻干，备用；

(4)SVPB4纯化

离子交换：通过离子凝胶柱对SVPII进行进一步纯化；用磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，收集SVPB4，脱盐，冻干，得到固体的蝎毒多肽B4。

4.权利要求1或2所述的蝎毒多肽B4在抗癌治疗辅助药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的抗癌治疗辅助药物具有化疗所致骨髓造血功能抑制及毒副反应中的保护作用和功能恢复作用。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述的抗癌治疗辅助药物含有权利要求1或2所述的蝎毒多肽B4。

7.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述的抗癌治疗辅助药物中蝎毒多肽B4的施用量为0.5～2.0mg·kg^-1。