CN115227667B - 负载硼替佐米的人单核细胞外泌体的制备方法及其在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了负载硼替佐米的人单核细胞外泌体的制备方法及其在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用,在体外获得人单核细胞外泌体,并用此外泌体负载硼替佐米。与单独使用硼替佐米相比,负载硼替佐米的外泌体对多发性骨髓瘤细胞的增殖抑制作用更强。并且小鼠原位骨髓瘤移植瘤模型证明,使用负载了硼替佐米单核细胞外泌体比使用硼替佐米具有更强的抑制肿瘤生长能力。为临床治疗多发性骨髓瘤提供了一种新的治疗方式。
Description
技术领域
本发明属于生命科学技术领域,具体涉及一种负载硼替佐米的人单核细胞外泌体的制备方法及其在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用。
背景技术
多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是以恶性浆细胞聚集在骨髓并在血液或尿液中出现单克隆蛋白(M蛋白)为特征的一种恶性疾病。临床特点包括贫血、骨痛、感染、肾功能不全和高钙血症等。目前MM占所有恶性肿瘤的1%,约占血液系统恶性肿瘤的10%,日益成为严重的公共卫生问题。
硼替佐米(Bortezomib,Btz)作为第一代蛋白酶体抑制剂,极大地延长了MM患者的生存时间。Btz的主要作用机制是可逆地抑制26S蛋白酶体,通过稳定NF-κB的调节单位IκB,抑制NF-κB的活性,干扰IL-6的分泌,有效地抑制MM细胞的增殖,同时通过减少MM细胞中血管内皮生长因子(VEGF)的分泌来发挥抗血管生成作用,诱导MM细胞的凋亡。目前以Btz为基础的联合治疗方案也逐渐成为MM患者的一线诱导方案。但是硼替佐米在临床应用中出现了以下缺陷:1.药物作用期短,体内药物蓄积时间不足,胞内蓄积量;90%的Btz在给药15分钟内就能从血浆室中清除,快速α半衰期为0.22-0.46小时,分布体积为500L;2.给药方式复杂,需要反复给药:硼替佐米常规使用剂量为1.3mg/m2,第1、4、8、11天静脉注射,休息10天,21天为一个周期。3.在细胞内的生物利用度低,残留药物对正常组织及细胞毒副作用比较大;最常见的不良反应包括血液学毒性、消化道反应、各种感染、带状疱疹、周围神经病变以及乏力。靶向性低,免疫原性高,耐药明显,是目前多发性骨髓瘤治疗效果不佳的重要原因。
外泌体是近年来比较新颖的药物载体,是指一种能被机体内大多数细胞分泌的直径大约为30-150nm的微小膜泡,具有脂质双层膜,透射电子显微镜下呈双凹碟形或杯状。几乎所有的哺乳动物细胞都可以分泌外泌体,并且在组织细胞生理和病理情况下皆可持续分泌。外泌体也几乎存在于所有体液中,在血液、尿液、唾液、滑液、脑脊髓液、乳汁、羊水、精液、阴道分泌物、腹水、癌症病人的血清和血浆、细胞培养基等液体中都能发现外泌体。
经研究发现,外泌体中富含核酸(microRNA、lncRNA、circRNA、mRNA、tRNA等)、蛋白、胆固醇等。外泌体不含有内质网内的蛋白质,但高表达与主要组织相容性复合体以及整合素等多种蛋白质相互作用的四分子交联体超蛋白家族,如CD9,CD81,CD63。外泌体的表面标志蛋白主要有CD63、CD81、CD9、TSG101、HSP27。外泌体被细胞摄取通常分为一下三个步骤:识别并结合靶向受体细胞,通过巨胞饮或微胞饮进入受体细胞内,将内含物送至受体细胞。
目前使用外泌体转载药物的类型主要有三类:1.小分子化学药物,如抗肿瘤药物紫杉醇、阿霉素、姜黄素等;2.核酸类药物,如DNA、mRNA、siRNA、非编码RNA:microRNA、lncRNA、circRNA等;3.蛋白质类药物,如抗原等。外泌体作为药物载体具有免疫原性低,可穿生物屏障,亲和力高,能逃避溶酶体介导,具有高度的生物兼容性及低毒性等明显的明显的优势。
因此,有必要以外泌体为载体负载硼替佐米,研究其在多发性骨髓瘤中的治疗应用。
发明内容
本发明目的是提供一种负载硼替佐米的人单核细胞外泌体的制备方法及其在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用。
本发明的一种技术方案是:负载硼替佐米的人单核细胞外泌体的制备方法,包括:
(1)单核细胞外泌体的提取及鉴定:采用ficoll分离出人单个核细胞层,使用CD14磁珠分离获得单核细胞;在无血清培养体系培养人单核细胞,收集细胞上清液,采用旋转超滤结合低温超速离心方法收集纯化培养基中的外泌体,并鉴定;
(2)硼替佐米标准曲线的测定,做小量修改,利用高效液相色谱法测定硼替佐米的含量;
(3)将硼替佐米载入外泌体:通过共孵育法将硼替佐米载入外泌体,收取并纯化外泌体。
进一步的,在步骤(1)中,所述旋转超滤结合低温超速离心方法包括:将培养基置于4℃、400g离心5min,去除游离细胞,得到上清液,并移入另一管中,4℃、12000g离心45min,去除细胞碎片,获得上清液,并倒入millipore超滤装置中,用PBS洗脱收集滤膜上的浓缩液体,再次加入PBS,经millipore超滤装置再次超滤,得到的浓缩液在4℃、130000g的条件下离心120min,重悬底部沉淀,使用PBS转移至可截留100KD分子的超滤细心管中,4℃、130000g离心120min,PBS洗涤3次,最终按后续实验要求定容至一定体积,得到Exosomes悬液,将外泌体溶液用0.22μm滤头过滤除掉大颗粒杂质,分装保存至-80℃。
进一步的,在步骤(1)中,所述鉴定为:收集外泌体后,通过电镜、粒径分析、免疫印迹方法对外泌体的特性进行鉴定。
进一步的,步骤(2)具体为:称取适量硼替佐米,用ddH2O溶解,配成10mM/L,作为储备液,-80℃保存;吸取所述储备液适量,加入流动相,制成1,5,10,20,40,80,160μM/L的硼替佐米溶液,利用高效液相色谱法测定硼替佐米的含量。
进一步的,所述高效液相色谱法的色谱条件为:色谱柱:C18 column;流动相:水-乙腈,75∶25;流量:1mL/min;紫外检测波长:270nm;室温;进样量:20μL。
进一步的,步骤(3)所述通过共孵育法将硼替佐米载入外泌体,收取并纯化外泌体的具体方法为:100μg纯化的外泌体与50μg硼替佐米轻轻混匀,在恒温摇床上37℃轻轻摇动孵育48h,获得混合液,将所述混合液用超速离心机130000×g离心120min,初步去除未被包载进入外泌体的硼替佐米,将所述混合液加入PBS中,清洗3遍,用超速离心机130000×g离心120min,彻底去除多余的硼替佐米,获得纯化的外泌体负载硼替佐米。
本发明的另一种技术方案是:负载硼替佐米的人单核细胞外泌体在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用。
本发明提供了一种负载硼替佐米的人单核细胞外泌体的制备方法及其在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用,其优点是:负载硼替佐米的人单核细胞外泌体可以较为有效地杀伤多发性骨髓瘤,减轻肿瘤负荷,改进传统药物的有效率,有助于为临床治疗提供新的给药模式。
附图说明
图1为单核细胞分泌的外泌体粒径分布图;
图2为单核细胞分泌的外泌体包载Btz后粒径分布图;
图3为外泌体标志物的鉴定图;
图4为单核细胞外泌体包载Btz前后标志物的鉴定图;
图5为单核细胞外泌体的电镜图;
图6为单核细胞外泌体包载Btz后的电镜图;
图7为Btz的高效液相标准定量曲线图;
图8为Btz-Exo释放Btz的HPLC检测结果图;
图9为单核细胞外泌体抑制多发性骨髓瘤的细胞增殖图,其中,左为骨髓瘤细胞株U266,右为骨髓瘤细胞株LP-1;
图10为负载硼替佐米的单核细胞外泌体对多发性骨髓瘤原位小鼠模型肿瘤负荷影响示意图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂,下面结合实施例进一步说明本发明的技术方案。但是本发明不限于所列出的实施例,还应包括在本发明所要求的权利范围内其他任何公知的改变。
此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例,也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1
1.单核细胞外泌体的提取及鉴定。采用ficoll分离出人单个核细胞层,使用CD14磁珠分离获得单核细胞。在无血清培养体系培养人单核细胞,收集细胞上清液,采用旋转超滤结合低温超速离心方法收集纯化培养基中的外泌体。旋转超滤结合低温超速离心方法主要步骤是:将一定容积的培养基于4℃400g离心5min,去除游离细胞,得到的上清液移入另一管中,4℃12000g45min,去除细胞碎片,获得的上清液倒入millipore超滤装置中,用PBS洗脱收集滤膜(100KD)上的浓缩液体,即再次加入PBS,经millipore超滤装置再次超滤,得到的浓缩液4℃130000g离心120min,重悬底部沉淀,使用PBS转移至可截留100KD分子的超滤细心管中,4℃130000g离心120分钟;PBS洗涤3次,最终按后续实验要求定容至一定体积,得到Exosomes悬液,将外泌体溶液用0.22μm滤头过滤除掉大颗粒杂质,分装保存至-80℃。在收集外泌体后,通过电镜、粒径分析、免疫印迹等方法对外泌体的特性进行鉴定,结果符合外泌体特征:直径范围50-150nm,透射电子显微镜下呈双层膜囊状结构,其膜结构表面含有CD81,CD63等标志物。
2.硼替佐米标准曲线的测定,做小量修改,利用高效液相色谱法测定硼替佐米的含量。精密称取适量硼替佐米,用ddH2O溶解,配成10mM/L,作为储备液,-80℃保存。精密吸取硼替佐米储备溶液适量,加入流动相,制成1,5,10,20,40,80,160μM/L的硼替佐米溶液。色谱条件:色谱柱:C18 column(Extend-C18,250×4.6mm,5μm,AgilentTechnologies);流动相:水-乙腈(75∶25);流量:1mL/min;紫外检测波长:270nm;室温;进样量:20μL。按照上述色谱条件测定,以峰面积(A)为纵坐标,样品浓度(C)为横坐标进行线性回归。结果表明,本品浓度在1μM/L~160μM/L内线性良好,回归方程为A=5.287C+24.11,r=0.999(n=3)。
3.将硼替佐米载入外泌体:通过共孵育法将硼替佐米载入外泌体。使用差速离心、过滤、吸附、洗涤等步骤进行收取并纯化外泌体。具体方法为:100μg纯化的外泌体与50μg硼替佐米轻轻混匀,在恒温摇床上37℃轻轻摇动孵育48h。之后,混合液用超速离心机离心(130,000×g,120min),初步去除未被包载进入外泌体的硼替佐米。最后将上述混合液加入PBS中,清洗3遍,上超速离心机130000×g,离心120min,彻底去除多余的硼替佐米,获得纯化的ExoBtz。外泌体负载硼替佐米(ExoBtz)的含量通过高效液相色谱法测定。
4.外泌体负载硼替佐米(ExoBtz)在骨髓瘤中的蓄积和释放:用ExoBtz处理MM细胞,通过流式及共聚焦显微镜观察MM细胞对ExoBtz的吸收情况,通过高效液相检测硼替佐米包载前后在MM细胞中蓄积程度,同时比较硼替佐米包载前后在MM细胞体内作用时间;并模拟体内pH值,探索硼替佐米包载后的释放规律,进一步研究ExoBtz相对于MM细胞的作用优势。
5.ExoBtz对多发性骨髓的体外抗肿瘤应用:分别将硼替佐米,EXO及ExoBtz与MM细胞共培养,在不同质量浓度下共培养相同的时间,分别采用CCK-8法检测其对骨髓瘤细胞的抑制作用,深入探索ExoBtz体外抗肿瘤作用。
6.ExoBtz对多发性骨髓的体内抗肿瘤应用:建立人源多发性骨髓瘤原位小鼠模型,分别将硼替佐米,单核细胞来源EXO、EXO及ExoBtz输注小鼠体内,成立不同实验组,对比溶剂组PBS,观察各组多发性骨髓瘤原位小鼠移植模型肿瘤负荷及生存期变化。通过荧光定位技术,进一步探索ExoBtz的靶向作用。通过microCT扫描小鼠相关骨质,利用骨三维重建构建出骨质破坏模型,比较各组骨破坏程度,进一步评估ExoBtz体内抗肿瘤作用。
请参阅图1和图2,图1为单核细胞分泌的外泌体粒径分布图;图2为单核细胞分泌的外泌体包载Btz后粒径分布图。如图1所示,单核细胞外泌体的平均粒子直径49.68±1.52nm,得出所提取的单核细胞外泌体的直径符合制备要求的结论。如图2所示,负载硼替佐米的单核细胞外泌体的平均粒子直径89.21±4.32nm,得出负载硼替佐米后单核细胞外泌体的直径比之前增大的结论。
请参阅图3和图4,图3为外泌体标志物的鉴定图;图4为单核细胞外泌体包载Btz前后标志物的鉴定图;如图3所示,所提取的单核细胞外泌体表达外泌体特异性蛋白CD63和CD81,得出制备单核细胞外泌体成功的结论。如图4所示,所提取的单核细胞外泌体及负载硼替佐米后的单核细胞外泌体均表达外泌体特异性蛋白CD63和CD81,得出单核细胞外泌体负载硼替佐米制备成功的结论。
请参阅图5和图6,图5为单核细胞外泌体的电镜图;图6为单核细胞外泌体包载Btz后的电镜图;如图5所示,基于透射电子显微镜分析,所制备的单核细胞外泌体分布比较均匀,表现出特征性的“碟状”或是“圆形”形态,直径主要分布于30纳米到约150纳米,100纳米以下的外泌体较为多见。得出电镜下的单核细胞外泌体与之前所测粒子直径相互吻合的结论。如图6所示,基于透射电子显微镜分析,可以看出负载膨体佐米的单核细胞外泌体呈现出“圆形”形态,直径主要分布约200纳米左右。得出负载硼替佐米后的单核细胞外泌体形态未发生改变,直径较前增大的结论。
请参阅图7,图7为Btz的高效液相标准定量曲线图;如图7所示,通过高效液相检查,所提取的单核细胞外泌体的回归方程为A=5.287C+24.11,r=1(n=3),得出我们提取的单核细胞外泌体的浓度线性良好的结论。
请参阅图8,图8为ExoBtz释放Btz的HPLC检测结果图;如图8所示,负载硼替佐米的单核细胞外泌体会随着时间缓慢释放硼替佐米,模拟人体体液的酸碱变化对硼替佐米的释放影响不大,得出负载硼替佐米的单核细胞外泌体会在人体体液的酸碱变化范围内缓慢释放硼替佐米的结论。
请参阅图9,图9为单核细胞外泌体抑制多发性骨髓瘤的细胞增殖图,其中,左为骨髓瘤细胞株U266,右为骨髓瘤细胞株LP-1。如图9所示,单核细胞外泌体、硼替佐米及负载硼替佐米的单核细胞外泌体均对于多发性骨髓瘤细胞株U266及LP-1具有杀伤作用,负载硼替佐米的单核细胞外泌体的杀伤作用最强,得出在体外实验中,负载硼替佐米的单核细胞外泌体抑制多发性骨髓瘤增殖的作用最强。
请参阅图10,图10为负载硼替佐米的单核细胞外泌体对多发性骨髓瘤原位小鼠模型肿瘤负荷影响示意图。如图10所示,活体成像可以看出单核细胞外泌体、硼替佐米及负载硼替佐米的单核细胞外泌体均可减低多发性骨髓瘤小鼠的肿瘤负荷,其中负载硼替佐米的单核细胞外泌体组抑制肿瘤生长的作用最强。生存曲线显示,负载硼替佐米的单核细胞外泌体组的小鼠生存时间明显延长。得出在体内实验中,负载硼替佐米的单核细胞外泌体抑制多发性骨髓瘤增殖的作用最强。
综上所述,本发明提供的一种负载硼替佐米的人单核细胞外泌体制备方法及其在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用,在体外获得人单核细胞外泌体,并用此外泌体负载硼替佐米。与单独使用硼替佐米相比,负载硼替佐米的外泌体对多发性骨髓瘤细胞的增殖抑制作用更强。并且小鼠原位骨髓瘤移植瘤模型证明,用负载了硼替佐米单核细胞外泌体比硼替佐米具有更强的抑制肿瘤生长能力。为临床治疗多发性骨髓瘤提供一种新的治疗方式。
应说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围,其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (2)
1.负载硼替佐米的人单核细胞外泌体的制备方法,包括:
(1)单核细胞外泌体的提取及鉴定:采用ficoll分离出人单个核细胞层,使用CD14磁珠分离获得单核细胞;在无血清培养体系培养人单核细胞,收集细胞上清液,采用旋转超滤结合低温超速离心方法收集纯化培养基中的外泌体,并收集外泌体后,通过电镜、粒径分析、免疫印迹方法对外泌体的特性进行鉴定,其中,所述旋转超滤结合低温超速离心方法包括:将培养基置于4℃、400g离心5min,去除游离细胞,得到上清液,并移入另一管中,4℃、12000g离心45min,去除细胞碎片,获得上清液,并倒入millipore超滤装置中,用PBS洗脱收集滤膜上的浓缩液体,再次加入PBS,经millipore超滤装置再次超滤,得到的浓缩液在4℃、130000g的条件下离心120min,重悬底部沉淀,使用PBS转移至可截留100KD分子的超滤细心管中,4℃、130000g离心120min,PBS洗涤3次,最终按后续实验要求定容至一定体积,得到外泌体溶液,将外泌体溶液用0.22 μm滤头过滤除掉大颗粒杂质,分装保存至-80℃;
(2)硼替佐米标准曲线的测定:称取适量硼替佐米,用ddH2O溶解,配成10 mM/L,作为储备液,-80°C保存;吸取所述储备液适量,加入流动相,制成 1,5,10,20,40,80,160 μM/L 的硼替佐米溶液,利用高效液相色谱法测定硼替佐米的含量;
(3)将硼替佐米载入外泌体:100μg纯化的外泌体溶液与50 μg 硼替佐米轻轻混匀,在恒温摇床上37°C 轻轻摇动孵育48h,获得混合液,将所述混合液用超速离心机130000× g离心120 min,初步去除未被包载进入外泌体的硼替佐米,将所述混合液加入PBS中,清洗3遍,用超速离心机 130000× g离心120 min,彻底去除多余的硼替佐米,获得纯化的外泌体负载硼替佐米。
2.一种根据权利要求1所述的负载硼替佐米的人单核细胞外泌体的制备方法所制备的负载硼替佐米的人单核细胞外泌体在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用。
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