EA023912B1 - Лечение воспалительных состояний - Google Patents

Лечение воспалительных состояний Download PDF

Info

Publication number
EA023912B1
EA023912B1 EA201100452A EA201100452A EA023912B1 EA 023912 B1 EA023912 B1 EA 023912B1 EA 201100452 A EA201100452 A EA 201100452A EA 201100452 A EA201100452 A EA 201100452A EA 023912 B1 EA023912 B1 EA 023912B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
chemokine
blood
column
cells
carrier
Prior art date
Application number
EA201100452A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201100452A1 (ru
Inventor
Ола Винквист
Грэхэм Коттон
Original Assignee
АйТиЭйч ИММЬЮН ТЕРАПИ ХОЛДИНГЗ АБ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by АйТиЭйч ИММЬЮН ТЕРАПИ ХОЛДИНГЗ АБ filed Critical АйТиЭйч ИММЬЮН ТЕРАПИ ХОЛДИНГЗ АБ
Publication of EA201100452A1 publication Critical patent/EA201100452A1/ru
Publication of EA023912B1 publication Critical patent/EA023912B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M1/00—Suction or pumping devices for medical purposes; Devices for carrying-off, for treatment of, or for carrying-over, body-liquids; Drainage systems
    • A61M1/34—Filtering material out of the blood by passing it through a membrane, i.e. hemofiltration or diafiltration
    • A61M1/3472—Filtering material out of the blood by passing it through a membrane, i.e. hemofiltration or diafiltration with treatment of the filtrate
    • A61M1/3486—Biological, chemical treatment, e.g. chemical precipitation; treatment by absorbents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M1/00—Suction or pumping devices for medical purposes; Devices for carrying-off, for treatment of, or for carrying-over, body-liquids; Drainage systems
    • A61M1/36—Other treatment of blood in a by-pass of the natural circulatory system, e.g. temperature adaptation, irradiation ; Extra-corporeal blood circuits
    • A61M1/3679—Other treatment of blood in a by-pass of the natural circulatory system, e.g. temperature adaptation, irradiation ; Extra-corporeal blood circuits by absorption
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M1/00—Suction or pumping devices for medical purposes; Devices for carrying-off, for treatment of, or for carrying-over, body-liquids; Drainage systems
    • A61M1/36—Other treatment of blood in a by-pass of the natural circulatory system, e.g. temperature adaptation, irradiation ; Extra-corporeal blood circuits
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M1/00—Suction or pumping devices for medical purposes; Devices for carrying-off, for treatment of, or for carrying-over, body-liquids; Drainage systems
    • A61M1/36—Other treatment of blood in a by-pass of the natural circulatory system, e.g. temperature adaptation, irradiation ; Extra-corporeal blood circuits
    • A61M1/3618—Magnetic separation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M1/00—Suction or pumping devices for medical purposes; Devices for carrying-off, for treatment of, or for carrying-over, body-liquids; Drainage systems
    • A61M1/36—Other treatment of blood in a by-pass of the natural circulatory system, e.g. temperature adaptation, irradiation ; Extra-corporeal blood circuits
    • A61M1/362—Other treatment of blood in a by-pass of the natural circulatory system, e.g. temperature adaptation, irradiation ; Extra-corporeal blood circuits changing physical properties of target cells by binding them to added particles to facilitate their subsequent separation from other cells, e.g. immunoaffinity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M1/00—Suction or pumping devices for medical purposes; Devices for carrying-off, for treatment of, or for carrying-over, body-liquids; Drainage systems
    • A61M1/36—Other treatment of blood in a by-pass of the natural circulatory system, e.g. temperature adaptation, irradiation ; Extra-corporeal blood circuits
    • A61M1/3672—Means preventing coagulation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
    • B01J20/26—Synthetic macromolecular compounds
    • B01J20/262—Synthetic macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon to carbon unsaturated bonds, e.g. obtained by polycondensation
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
    • B01J20/26—Synthetic macromolecular compounds
    • B01J20/265—Synthetic macromolecular compounds modified or post-treated polymers
    • B01J20/267—Cross-linked polymers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
    • B01J20/28002—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties characterised by their physical properties
    • B01J20/28004—Sorbent size or size distribution, e.g. particle size
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
    • B01J20/28002—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties characterised by their physical properties
    • B01J20/28009—Magnetic properties
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
    • B01J20/28014—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties characterised by their form
    • B01J20/28016—Particle form
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/3085—Chemical treatments not covered by groups B01J20/3007 - B01J20/3078
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3202—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the carrier, support or substrate used for impregnation or coating
    • B01J20/3206—Organic carriers, supports or substrates
    • B01J20/3208—Polymeric carriers, supports or substrates
    • B01J20/3212—Polymeric carriers, supports or substrates consisting of a polymer obtained by reactions otherwise than involving only carbon to carbon unsaturated bonds
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3214—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the method for obtaining this coating or impregnating
    • B01J20/3217—Resulting in a chemical bond between the coating or impregnating layer and the carrier, support or substrate, e.g. a covalent bond
    • B01J20/3219—Resulting in a chemical bond between the coating or impregnating layer and the carrier, support or substrate, e.g. a covalent bond involving a particular spacer or linking group, e.g. for attaching an active group
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3268—Macromolecular compounds
    • B01J20/3272—Polymers obtained by reactions otherwise than involving only carbon to carbon unsaturated bonds
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3268—Macromolecular compounds
    • B01J20/3272—Polymers obtained by reactions otherwise than involving only carbon to carbon unsaturated bonds
    • B01J20/3274—Proteins, nucleic acids, polysaccharides, antibodies or antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/521—Chemokines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
    • C07K17/06—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier attached to the carrier via a bridging agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
    • C07K17/10—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier the carrier being a carbohydrate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0642—Granulocytes, e.g. basopils, eosinophils, neutrophils, mast cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0645—Macrophages, e.g. Kuepfer cells in the liver; Monocytes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2220/00—Aspects relating to sorbent materials
    • B01J2220/50—Aspects relating to the use of sorbent or filter aid materials
    • B01J2220/58—Use in a single column

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Anesthesiology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)

Abstract

В данном изобретении раскрыта колонка для афереза, наполненная твердым носителем, содержащим один или более чем один хемокин, в частности биотинилированные хемокины, иммобилизованный на носителе прямым или непрямым образом, в частности на носителе со стрептавидином. Также раскрыты применения колонки и носителя и способ уменьшения содержания клеток, в частности лейкоцитов, в периферической крови индивида, страдающего от воспалительного состояния, такого как воспалительное заболевание кишечника (IBD).

Description

Настоящее изобретение относится к продуктам для лечения и способам лечения воспалительных состояний, таких как воспалительное заболевание кишечника, в частности неспецифического язвенного колита (иС) и болезни Крона (СО), особенно фульминантного язвенного колита и болезни Крона, и средству для лечения.
Предшествующий уровень техники
Фульминантный язвенный колит представляет собой ухудшение неспецифического язвенного колита, отличающееся большим количеством лейкоцитов и сильной болью в животе. В настоящее время пациентов с фульминантным язвенным колитом лечат высокими дозами стероидов. В исследованиях III фазы было изучено лечение антителами против фактора некроза опухоли α (ΤΝΡα). Оба лекарственных средства в целом ингибируют воспаление. Они эффективны приблизительно в 50% случаев, но имеют серьезные нежелательные эффекты. Даже при успешном лечении фульминантный язвенный колит имеет тенденцию к рецидивированию.
У пациентов с фульминантным язвенным колитом, не отвечающих на консервативное лечение, обязательно немедленное хирургическое вмешательство. Неспецифический язвенный колит всегда ограничен толстой кишкой. В качестве крайней меры проводят резекцию толстой кишки и делают наружную илеостому. После восстановительного периода продолжительностью по меньшей мере 6 месяцев и в некоторых случаях дальнейшего консервативного лечения воспаления культи прямой кишки у большинства пациентов будут проводить либо наложение илеоректального анастомоза, либо реконструктивное хирургическое вмешательство с тазовым тонкокишечным резервуаром для восстановления непрерывности кишки. Оба способа приводят к частому жидкому стулу около шести раз в сутки и расстройствам водного и минерального баланса. Также возможны фульминантные эпизоды при болезни Крона (фульминантный колит Крона), также представляющие собой серьезные состояния, при которых необходимо немедленное консервативное и/или хирургическое вмешательство.
Несмотря на то что у пациентов с болезнью Крона возможно воспаление любой части желудочнокишечного тракта, оно обычно ограничено наиболее дистальной частью тонкой кишки и начальной частью толстой кишки (илеоцекальной областью). Консервативное лечение не способно привести к излечению заболевания, хотя противовоспалительные лекарственные средства, такие как стероиды и азатиоприн, облегчают симптомы. Приблизительно 50% пациентов показано хирургическое вмешательство с резекцией стенозированных и истонченных сегментов кишечника; приблизительно у половины из них будут рецидивы и будет необходимо последующее хирургическое лечение. Таким образом, крайне обоснован способ, позволяющий специфично устранять воспаление при воспалительном расстройстве кишечника (ΙΒΌ) и предотвращать рецидивы заболевания у пациента-индивида.
В \νϋ 2008/038785 описана колонка для адсорбции клеток для удаления клеток, в частности активированных лейкоцитов и раковых клеток, и цитокинов из крови.
Краткое изложение сущности изобретения
Воспалительное заболевание кишечника характеризуется воспалением и лейкоцитарной инфильтрацией пораженной кишки.
Хемокины представляют собой класс цитокиновых молекул, вовлеченных в рекрутинг и активацию клеток при воспалении. Хемокины вызывают хемотаксис и активацию различных субпопуляций клеток в иммунной системе. Активность хемокинов обусловлена главным образом прочным связыванием с их рецепторами на поверхности лейкоцитов. Настоящее изобретение основано на понимании того, что взаимодействие между хемокинами и клетками, экспрессирующими их рецепторы, может быть использовано для лечения воспалительных состояний, в частности хронических воспалительных состояний, характеризующихся усиленным рекрутингом клеток, экспрессирующих рецепторы хемокинов, в очаг воспаления. Таким образом, изобретение способствует уменьшению рекрутинга воспалительных лейкоцитов в очаг воспаления, обусловленного индукцией высоких уровней экспрессии воспалительных хемокинов. Этого достигают с использованием таких воспалительных хемокинов для захвата воспалительных лейкоцитов от пациента. Конкретнее, лейкоциты и, в частности, одно или более из (активированных) Τлимфоцитов, (активированных) моноцитов, (активированных) нейтрофильных гранулоцитов, (активированных) эозинофилов, обеспечивают начало и поддержание воспаления при ΙΒΌ, и, таким образом, их удаление из кровообращения может снижать и даже устранять такое воспаление. Проточной цитометрией образцов биопсии кишки от пациентов с активным ΙΒΌ авторы настоящего изобретения идентифицировали (активированные) Τ-лимфоциты, моноциты, нейтрофильные гранулоциты и эозинофилы; клетки, содержание которых велико в очаге воспаления, но которые также присутствуют в циркулирующей периферической крови.
Таким образом, в первом аспекте согласно изобретению предложен твердый носитель, содержащий один или более чем один хемокин, иммобилизованный на носителе прямым или непрямым образом, для обеспечения возможности удаления клетки, экспрессирующей когнатный рецептор хемокина или хемокинов, в частности (активированного) лейкоцита, как описано здесь (такого как моноцит или лимфоцит), из периферической крови пациента. Хемокины представляют собой воспалительные хемокины, т.е. хемокины, индуцируемые в высоких уровнях клетками или тканями в ответ на повреждение или инфекцию
- 1 023912 (и которые способствуют рекрутингу воспалительных лейкоцитов).
В контексте настоящего изобретения термин хемокин включает биотинилированные или меченные иным образом хемокины. Термин хемокин также включает модифицированные или процессированные варианты хемокина при условии, что модифицированная или процессированная форма сохраняет способность к связыванию с ее штатным рецептором (и, таким образом, остается функциональной в контексте изобретения). Модификации могут быть проведены для улучшения синтеза белка, например, однородности продукта и выхода. Модификации могут включать аминокислотные добавления, замены, делеции или другие модификации одной или более чем одной аминокислоты в хемокине. Модификации могут включать замену аминокислоты дикого типа искусственными аминокислотами, такими как норлейцин (ПБеи), и дериватизированными аминокислотами, такими как пироглутаминовая кислота (ругоС1и). Такие модификации могут быть проведены для минимизации образования побочных продуктов при хранении и применении колонок по изобретению. Модификации могут быть проведены для улучшения мечения, например, включение полиэтиленгликолевого спейсера (ПЭГ-спейсера) для облегчения биотинилирования. Биотинилирование хемокина и/или его конъюгацию с флуорохромами или другими группами для мечения проводят способом, не оказывающим существенного влияния на способность к связыванию с рецептором. Сайт-специфичное биотинилирование или другое мечение является предпочтительным, поскольку неселективное мечение хемокинов может снижать рецептор-связывающую активность. Биотинилирование или другое мечение в большинстве случаев предпочтительно при его проведении на С-конце или ближе к С-концу белка, поскольку авторы изобретения обнаружили, что модификации в этой области в большинстве случаев хорошо переносимы (исходя из минимального эффекта на способность к связыванию с рецептором). Процессинг может включать, в зависимости от обстоятельств, удаление либо Ν-концевых, либо С-концевых аминокислот, или и тех, и других. Обычно в процессированном варианте будут сохранены остатки, необходимые для правильного фолдинга хемокина, например, для сохранения структуры хемокиновой петли, согласно тому требованию, что процессированный вариант должен сохранять способность к связыванию с соответствующим рецептором (экспрессированным в лейкоците (на поверхности лейкоцита)). В определенных воплощениях процессированные варианты могут содержать примерно на 1-100 аминокислот меньше, например на 1, 2, 3, 4, 5 и так далее аминокислот меньше, чем аминокислотная последовательность дикого типа. Несомненно, процессированные варианты могут содержать другую модификацию, как подробно описано здесь. В определенных воплощениях модифицированный или процессированный вариант может иметь 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95% или большую общую идентичность аминокислотной последовательности с полноразмерным хемокином дикого типа (где делецию считают различием в аминокислотной последовательности). В определенных воплощениях в общей для молекул последовательности (т.е. аминокислотах, которые не были удалены) идентичность аминокислотной последовательности может составлять 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%. Пример хемокина по изобретению, включающего как модификации, так и процессинг, и специально приспособленного для применения в изобретении, подробно описан здесь. Процессированный тимус-экспрессируемый хемокин (ТЕСК) соответствует остаткам 1-74 полноразмерного зрелого белка (и, таким образом, лишен аминокислот 75-127 и Ν-концевого сигнального пептида из 23 аминокислот) и, таким образом, сохраняет хемокиновую петлю. В дополнение, включена замена метионина на норлейцин для предотвращения окисления остатка при сборке цепи. Ν-концевой глутаминовый остаток заменен пироглутамином для обеспечения однородности продукта во время синтеза. Биотинилирование проводят через ПЭГ -спейсер по ε-функциональности лизинового остатка, расположенного в положении 72. Аминокислотная последовательность линейной молекулы (т.е. ПЭГ-спейсер и молекула биотина при аминокислоте 72 не показаны) содержит, состоит по существу из или состоит из аминокислотной последовательности, представленной как БЕЦ ГО ΝΟ: 1. Хемокины по изобретению могут быть синтезированы любым подходящим способом. Предпочтительно, проводят химический синтез хемокинов, поскольку это облегчает модификацию, и мечение, и тому подобное. Тем не менее, по необходимости также могут быть применены способы, основанные на рекомбинантной ДНК, в комбинации с подходящими технологиями мечения и модификации. Таким образом, согласно изобретению также предложена молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая процессированный белок ССБ25. содержащий, состоящий по существу из или состоящий из аминокислот 1-74 (зрелой формы) ССБ25 (т.е. формы, лишенной сигнального пептида, содержащего первые 23 аминокислоты). Таким образом, белок лишен аминокислот 75-127 аминокислотной последовательности зрелого ССБ25. Изобретение также относится к вектору, содержащему такую молекулу нуклеиновой кислоты, и клетке-хозяину, содержащей вектор. Вектор может дополнительно включать подходящий промотор, функционально связанный с молекулой нуклеиновой кислоты, для облегчения транскрипции соответствующей молекулы матричной РНК (мРНК). Клетка-хозяин может быть способна экспрессировать белок посредством транскрипции и трансляции молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей процессированный белок ССБ25. содержащий аминокислоты 1-74 ССБ25 (и, таким образом, лишенный аминокислот 75-127 и Ν-концевого сигнального пептида из 23 аминокислот).
Рецепторы хемокинов экспрессированы на ряде мигрирующих клеток, таких как лимфоциты, гранулоциты и антиген-представляющие клетки, но также на определенных немигрирующих клетках, таких как эпителиальные клетки и фибробласты. Как упомянуто выше, хемокины по изобретению иммобили- 2 023912 зованы на твердом носителе так, чтобы обеспечить возможность удаления клетки, экспрессирующей когнатный рецептор одного или более чем одного хемокина, из периферической крови пациента. Когнатный рецептор каждого из предпочтительных хемокинов по изобретению приведен в табл. 1. В определенных примерах может быть более одного рецептора, с которым может связываться хемокин. Такие свойства хемокина могут преимущественно обеспечить возможность более эффективного лечения посредством захвата ряда клеток, экспрессирующих рецепторы, способствующие воспалительному состоянию. В определенных воплощениях носитель несет множество хемокинов с целью усиления захвата ряда провоспалительных клеток.
Воспаление, наблюдаемое у пациентов с ΙΒΌ, поддерживается постоянным проникновением антиген-представляющих клеток (АРС) и Т-клеток из циркулирующей крови в слизистую оболочку кишки. Это постоянное накопление клеток регулируют хемокины и их рецепторы. Таким образом, хемокины представляют собой молекулы, вовлеченные в рекрутинг и активацию различных субпопуляций иммунокомпетентных клеток при воспалении. Одним местным хемокином, образуемым в воспаленной слизистой оболочке кишки, является ТЕСК (тимус-экспрессируемый хемокин, также называемый ССЬ25). Моноциты и лимфоциты в циркулирующей крови распознают данный хемокин через рецептор ТЕСК; хемокиновый рецептор 9 (ССК9). Клетки связываются с ТЕСК через рецептор ССК9 и начинают мигрировать в воспалительный очаг в кишке (1). По достижении воспаленной слизистой оболочки из моноцитов развиваются АРС. Циркулирующие Т-клетки, экспрессирующие ССК9, также проникают в воспалительные очаги в кишке, где происходит их активация. Удаление ССК9 или его лиганда, ТЕСК, генетической делецией или ингибированием антителами ослабляет миграцию Т-клеток в кишечник в моделях на мышах (2). Взаимодействие ССК9-ТЕСК, по-видимому, играет центральную роль в миграции моноцитов и Т-клеток по всему кишечнику; в тонкой кишке, а также в толстой кишке. В недавнем исследовании верифицировано присутствие как ССК9, так и ТЕСК в толстой кишке здоровых людей и в кишечнике людей с ΙΒΌ. Исследование ткани толстой кишки, полученной от пациентов либо с СИ, либо с ИС выявляет присутствие Т-клеток, экспрессирующих ССК9, при иммуногистохимическом окрашивании. Кроме того, в толстой кишке также наблюдают присутствие рецепторного агониста ТЕСК (3). У пациентов с ΙΒΌ логическое обоснование состоит в удалении циркулирующих моноцитов и Т-клеток, экспрессирующих ССК9, до того, как они достигают воспалительного очага в кишке, и, посредством этого, в уменьшении воспаления. С использованием колонки с биотинилированным ТЕСК (ЬТЕСК), иммобилизованным на твердом носителе, на который происходит захват моноцитов и Т-клеток, экспрессирующих ССК9, из кровообращения, постоянное поддержание воспаления должно быть угнетено, что сделает возможным заживление слизистой оболочки. Такое же логическое обоснование применимо к ряду других хемокинов, вовлеченных в рекрутинг лейкоцитов в воспаленные области кишечника. Например, в слизистой оболочке кишечника происходит секреция интерлейкина-8 (1Ь-8) с привлечением нейтрофилов посредством взаимодействия с рецептором 1Ь-8. ССК6 регулирует миграцию Тн17-клеток в кишечник и баланс/распределение эффекторных Т-клеток в воспаленной ткани (14). Таким образом, ССЬ20, иммобилизованный на твердом носителе, также полезен в данном изобретении для лечения воспалительных состояний, таких как ΙΒΟ.
Хемокины по изобретению были выбраны на основании того факта, что обнаружено, что их экспрессии активирована при воспалительных расстройствах. Более того, было показано, что рецепторы хемокинов, присутствующие на клетках соответствующих типов, связаны с частотой таких воспалительных расстройств посредством рекрутинга клеток, экспрессирующих рецепторы, в очаг воспаления. Таким образом, хемокины по изобретению могут включать любой один или более из макрофагального воспалительного белка-1а (М1Р-1а), М1Р-1Ь, моноцитарного хемотаксического белка-1 (МСР-1), МСР-2, МСР-3, МСР-4, хемокина, регулируемого тимусом и активацией (ТАКС), хемокина макрофагального происхождения (МИС), М1Р-3, М1Р-3а, М1Р3Ь, М1Р-4, Ι-309, НСС-1, НСС-2, хемокина вторичных лимфоидных тканей (8ЬС), интерлейкина-8 (ΙΠ-8), регулируемого ростом онкогена-а (ОКОа), ОКОЬ, ОКОд, хемокина, выделяемого Т-клетками при активации (КАИТЕ8), белка-2, активирующего нейтрофилы (ΝΑΚ-2), эпителиального пептида 78, активирующего нейтрофилы (ЕЫА78), гранулоцитарного хемотаксического белка-2 (ОСР-2), ТР-10, монокина, индуцируемого интерфероном-гамма (МЮ), Ι-ТАС, фактора стромальных клеток (8ΌΡ), фракталкина, лимфотактина, эотаксина, эотаксина-2, Ι-309, хемокина Влимфоцитов (ΒΕΟ), ССЬ25. Особенно предпочтительные хемокины по изобретению включают МГР-1а, М^ПЬ, МШ-3а, М№-3Ь, МШ-4, 8ЬС, МСР-1, МСР-2, МСР-3, МСР-4, ТАКС, МИС, Ш-8, ТР-10, МЮ, ΙТАС, фракталкин, ССЬ-25, КАЛТЕ8. Наиболее предпочтительными хемокинами по изобретению являются хемокины, предпочтительно связывающиеся с активированными Т-лимфоцитами, в частности МГР1а, МСР, ГР-10, МЮ, ПАС. ССЬ25. Под предпочтительным связыванием понимают, что хемокины более склонны к связыванию с активированными Т-лимфоцитами, чем с неактивированными Тлимфоцитами и/или с другими клетками крови. В определенном воплощении хемокин представляет собой ССЬ25. ССЬ25 предпочтительно связывается с клетками, экспрессирующими ССК9, в частности (активированными) лимфоцитами (СИ4 и СЭ8 лимфоцитами) и моноцитами (такими как СЭ14положительные моноциты).
В таблице описаны определенные хемокины, полезные в данном изобретении, включая утвержден- 3 023912 ное обозначение гена (согласно Комитету по номенклатуре генов организации Геном человека (НИОО Оепе ЫотепсШиге СоттШее)), название и информацию о последовательности. Также приведен/приведены штатный рецептор или рецепторы для каждого хемокина.
Хемокин Утввржд емкое* обозначе нмагене Утвержденное название гена Распояо женив Регистрацией ныв кдылифмкат еры. (10) яоел|адашпж явности Првдиюетв ующме обозиячеии я Другие названия Ре цеть тор
М1Р-1а ссьз Хемоки новый (мотив С-С) лиганд 3 17Д12 М23178 ΝΜ_002983 ЗСУАЗ 00819-1, Ю78А1.РНА, ΜΙΡ-1- альфа ССК5
М1Р-1Ь СС14 Хемокиновый (мотив С-С) лиганд 4 17Д21- Д23 М23502 ΝΜ_002984 САО1, 30ΥΑ4 ΜΙΡ-1-бета, Ас1-2, АТ744.1 ССК5
МСР-1 СС1.2 Хемокиновый (мотив С-С) лиганд 2 17д11.2 -Д21.1 ВС009716 ΝΜ_0029Β2 ЗСУА2 МСР1, МСР-1, МСАР, 5МС-СР, ООСР-2. НС11, МОС9434 ССК2
МСР-2 ссьа Хемокиновый (мотив С-С) лиганд в 17д11.2 Х99886 ΝΜ_005623 ЗСУА8 МСР-2, НС14 ССК1, ССК2, ССКЗ, ССК5
МСР-3 ССТ7 Хемокиновый (мотив С-С) лиганд 7 17д11.2 -Д12 ΑΡ043338 ΝΜ_006273 ЗСУА6, ЗСУА7 МСР-3, 14С28, Р1С, МАКС, МСРЗ ССН1, ССК2, ССКЗ
МСР4 ССПЗ Хемокиновый (мотив С-С) лиганд 13 17д11.2 Αΰ001634 ΝΜ_005408 ЗСУА13 МСР-4, N00-1, ЗСУИ, СКМО, МСС17134 ССК1, ССК2, ССКЗ
ТАКС ССИ7 Хемокиновый (мотив С-С) лиганд 17 16д13 043767 ΝΜ_002987 ЗСУА17 ТАКС, АВСО-2 ССК4, ССК8
мос ССХ22 Хемокиновый (мотив С-С) лиганд 22 16Д13 1183171 ΝΜ_002990 ЗСУА22 МОС, ЗТСР-1, АВСО- 1, ОС/В-СК, А- 152Е5.1, МОС34554 ССК4
ΜΙΡ-3 СС1.23 Хемокиновый (мотив С-С) лиганд 23 17д11.2 1158913 ΝΜ_005064 ΝΜ_145898 ЗСУА23 СкЬ-8, ΜΡΙΡ-1, ΜΙΡ-3, СКЬ8 ССК1
М1Р-За СС1.20 Хемокиновый (мотив С-С) лиганд 20 2дЗЗ- Д37 086955 ΝΜ_004591 ЗСУА20 САКС, М1Р-За, ΕΧΟΛΙ8-1, 5Т38, СКЬ4 ССК6
ΜΙΡ-ЗЬ ССИ9 Хемокиновый (мотив С-С) лиганд 19 9р13 ΑΒ000887 ΝΜ_006274 ЗСУА19 ЕЮ, ΜΙΡ-ЗЬ, ЕхоЬиз- 3, СКМ1 ССК7
- 4 023912
ΜΙΡ-4 ССИ8 Хемокиновый (мотив С-С) лиганд 18 (легочный и регулируемы й активацией) 17Д11.2 Υ13710 ΝΜ_Ο02988 5ΟΥΑ18 ОС-СК1, РАРС, АМАС-1, ОССК1, ΜίΡ-4, СКЬ7 Неизве стен
1-309 ССИ Хемокиновый (мотив С-С) лиганд 1 17Ц11.2 М57506 ΝΜ_002981 3ΟΥΑ1 Ι-309, ТСАЗ, Ρ500, 3Ι3θ ССР8
НСС-1 ССИ4 Хемокиновый (мотив С-С) лиганд 14 17Ц11.2 Ζ49270 ΝΜ_032962 5ΟΥΑ14 НСС-1, НСС-3, ЫСС- 2, ЗСУ12, СКЫ, МС1Р ССР1
НСС-2 ССН5 Хемокиновый (мотив С-С) лиганд 15 17д11.2 АР031587 ΝΜ_004167 3ΟΥΑ15 НСС-2, НСС-3, ЗСУ1_Э, ΜΙΡ-5, 1_кп-1, ΜΙΡ-18, ΗΜΚΡ-2Β ССК7
5Ю ССЬ21 Хемокиновый (мотив С-С) лиганд 21 9р13 ΑΒ002409 ΝΜ_002989 ЗСУА21 ЗЕС ЕхоОиз-2, ТСА4, СКЬ9, бСкюе СХСР1 СХСР2
Ιί-8 шв Интерлейкин 8 4ц13- 421 ΥΟΟ787 ЗСУВ8ХиСТ,1ЕСТ,М 0ЫСР,ТЗС-1, ΟΧΟίβ,Ιί-β, ΝΑΡ-1,3- ЮСМОМАР, АМСР-Ι, ίΥΝΑΡ, ΝΑΡ, Ь-ΕΝΑΡ, ССР-1, Κ60 СХСК2
СКОа схси Хемокиновый (мотив С-Х- С) лиганд 1 (активность, стимулирую щая рост меланомы. альфа) 4ς13.3 Л03561 МСЗА, СВО1, Ρ3Ρ 3ΟΥΒ1, СВОа, МСЗА-а, ΝΑΡ-3 СХСР2
СРОЬ СХСЬ2 Хемокиновый (мотив С-Х- С) лиганд 2 4д13.3 Μ36820 ΝΜ_002089 СНО2 ЗСУВ2, СРОЬ, ΜΙΡ- 2а, МСЗА-Ь, СШС-2а СХСР2
СРОд схсьз Хемокиновый (мотив С-Х- С) лиганд 3 4д21 Μ3Θ821 СРОЗ 3ΟΥΒ3, еРОд, ΜΙΡ- 2Ь, С1Г4С-2Ь ССК1, ССВЗ, ССН5
- 5 023912
ΒΑΝΤΕ5 ССЬ5 Хемокиновый (мотив С-С) лиганд 5 17ц11.2 -д12 АЕ043341 ΝΜ_002985 0173136 Ε. ЗСУА5 ΡΑΝΤΕ3, 5Ι5Φ ТСР228, М6С17164 СХСР2
ΝΑΡ-2 РРВР Протромбоци тарный основной белок (хемокиновы й (мотив С-Х- С) лиганд 7) 4η12- д13 М54995 ΝΜ_002704 ТНВСВ1 3ΟΥΒ7,ΤΘΒ,ΝΑΡ-2- Η,ίΑ- РЕ4,МООЕ,1_ОСЕ,бет а-ТО,СТАРЗ,СХСС7, РВР.Ь- Т61,ТОВ1,СТАРШ, ΝΑΡ-2 СХСР2
ΕΝΑ-78 СХС1.5 Хемокиновый (мотив С-Х- С) лиганд 5 4д13.3 Х78686 ΝΜ_002994 3ΟΥΒ5 ΕΝΑ-78 СХСР2
ЗСР-2 СХСЬб Хемокиновый (мотив С-Х- С) лиганд б (гранулоцита рный хемотаксичес кий белок 2) 4Д13.3 ивззоз ΝΜ_002993 3ΟΥΒ6 ОСР-2, СКА-3 СХСК2
ΙΡ-10 схсно Хемокиновый (мотав С-Х- С) лиганд 10 4д21 Х02530 ΙΝΡ10, 3ΟΥΒ10 ΙΕΙ10, ΙΡ-10, сгд-2, тоЬ-1,С7, д!Р-10 СХСРЗ
МЮ схсьэ Хемокиновый (мотив С-ХС) лиганд 9 4д21 Х72755 СМК, ΜΙΟ 5СУВ9, Нипнд, сгд-10 СХСРЗ
1-ТАС схсш Хемокиновый (мотав С-Х- С) лиганд 11 4д21 ΙΙ66096 3ΟΥΒ9Β, 30ΥΒ11 Н174. 0-Я1. 1-ТАС, ΙΡ- 9 схскз СХСР7
ЗОЕ СХСП2 Хемокиновый (мотив С-Х- С) лиганд 12 (фактор стромальных клеток 1) 10η11.1 Ι.36033 ΝΜ_000609 30Ε1Α, 30Ε1Β, 3ϋΕ1 3ΟΥΒ12, 30Е-1а, 80Р-1Ь, РВЗР, Т13Е- а, ТЬЗЕ-Ь, ТРАР1 СХСР4 СХСР7
Фрактал кин схзси Хемокиновый (мотив С-ХЗ- С) лиганд 1 16ц13 ΙΙ84487 ΝΜ_002996 30Υ01 ΝΤΝ, СЗХМле, АВСО- 3, СХСЗС, СХСЗ, фракгалкин, нейротактин СХЗСР 1
Лимфот актин ХСИ Хемокиновый (мотив С) лиганд 1 1ц24.2 043768 ΝΜ_002995 ΤΤΝ, ЗСУС1 ίΡΤΝ. АТАС, ЗСМ-1а, ЗСМ-1, лимфотакгин ХРС1
Эотакси н ССШ Хемокиновый (мотав С-С) лиганд 11 17Ц21.1 -Д21.2 ΑΒ063614 ΝΜ_002986 50ΥΑ11 Эотаксин, МОС22554 ССРЗ
Эотакси н-2 СС1-24 Хемокиновый (мотав С-С) лиганд 24 7д 11.23 1185768 ΝΜ_002991 30ΥΑ24 Скб-6, ΜΡΙΕ-2, эотаксин-2, ΜΡΙΡ2 ССРЗ
ВТС схсиз Хемокиновый (мотив С-ХС) лиганд 13 4д21 АЦ002211 3ΟΥΒ13 В1С, ВСА-1, БЕРН, ΑΝΟΙΕ, ΑΝΟΙΕ2 СХСР5
ССЬ26 СС126 Хемокиновый (мотив С-С) лиганд 25 19р13.2 υβ6358 ΝΜ_005624 ЗСУА25 ТЕСК, СкЫб ССР9
Хемокины по изобретению могут быть биотинилированы способами, известными в данной области техники, такими как описанные в \УО 00/50088 А2, включенной сюда посредством ссылки. Как указано выше, предпочтительно сайт-специфическое мечение хемокинов по изобретению, хотя может быть применена любая методика мечения, не оказывающая существенного эффекта на способность хемокина к связыванию с рецептором. Различные биотинилированные сайт-специфическим образом и нативные хемокины имеются в продаже, например, от А1тас, Стагдауои, ик. В определенных воплощениях один или
- 6 023912 более чем один хемокин биотинилирован через спейсерную группу. Спейсер может быть использован для предотвращения воздействия биотиновой группы на активность хемокина, в частности связывание хемокина с его когнатным рецептором. В изобретении может быть использован любой подходящий спейсер, способствующий сохранению рецептор-связывающих свойств хемокина. В определенных воплощениях спейсер представляет собой полиэтиленгликолевый спейсер (ПЭГ-спейсер). Здесь было показано, что ПЭГ является эффективным спейсером, позволяющим присоединить биотин к хемокину (который затем может быть иммобилизован на твердом носителе посредством взаимодействия со стрептавидином) без снижения способности к связыванию с рецептором.
Твердые вещества-носители для иммобилизации хемокинов по изобретению известны в данной области техники. Полезное вещество-носитель представляет собой вещество-носитель, не вызывающее активации клеток крови, в частности лимфоцитов, приводящей к их коагуляции или адгезии на носителе. Полезно использовать носитель, обработанный агентом для придания ему антикоагулянтных свойств, в частности гепаринизированный носитель. Альтернативно, кровь пациента может быть обработана антикоагулянтом, таким как гепарин, перед нанесением на носитель. Полезные вещества-носители включают углеводы с большой молекулярной массой, в частности углеводы, имеющие молекулярную массу 100 кДа или более, такие как агароза в форме частиц, возможно поперечно сшитая, и целлюлоза. Другие предпочтительные вещества-носители представляют собой полимеры, такие как карбоксилированный полистирол, и стекло. Носитель по изобретению предпочтительно имеет форму частиц или волокон. Частицы носителя могут иметь правильную форму, такую как сферы или гранулы, или неправильную форму. Они могут быть пористыми или непористыми. Предпочтительный средний размер частиц носителя составляет от 50 мкм до 2 мм. Способы иммобилизации хемокинов на твердом носителе известны в данной области техники. Хемокин может быть иммобилизован на носителе прямым или непрямым способом. Прямая иммобилизация может представлять собой иммобилизацию посредством подходящего линкера. Предпочтительный способ непрямой иммобилизации хемокина основан на взаимодействии молекул биотина и авидина. Таким образом, биотинилирование хемокина и использование стрептавидина, иммобилизованного на твердом носителе, позволяет надежно присоединить хемокины к твердому носителю. Конкретно, способ может включать предоставление хемокина в биотинилированной форме, предоставление твердого носителя, имеющего стрептавидин, иммобилизованный на его поверхности, контакт носителя с водным раствором биотинилированного хемокина и отмывку носителя водным растворителем. В дополнение, для непрямой иммобилизации хемокинов на носителе могут быть применены взаимодействия антитело-антиген. В таких воплощениях носитель может быть дериватизирован с использованием антитела или его фрагмента или производного, имеющим известную аффинность в отношении определенной пептидной последовательности или гаптена с небольшой молекулой. Включение пептидной последовательности или гаптена на или в хемокин способствует иммобилизации на твердом носителе, покрытом соответствующим антителом или его фрагментом или производным. Таким образом, хемокин может быть модифицирован для включения пептидной последовательности или гаптена в линейную молекулу или может быть добавлен как боковая цепь или метка. Может быть использована любая подходящая пара антитело-антиген. Фрагмент или производное антитела могут представлять собой любой фрагмент или производное, сохраняющие специфичную аффинность связывания в отношении соответствующего антигена. Примеры включают РаЬ, 8сРУ, домены Ун, нанотела, антитела из тяжелых цепей и гуманизированные варианты антител от источника, не являющегося человеком, и тому подобное. Для иммобилизации хемокинов могут быть применены другие высокоаффинные взаимодействия, если хемокин может быть дериватизирован одним из взаимодействующих партнеров и твердый носитель дериватизирован другим взаимодействующим партнером без потери связывающей активности (т.е. связывания хемокина с его когнатным рецептором).
Альтернативно, хемокины могут быть иммобилизованы на твердом носителе прямым образом с использованием методик биологической конъюгации, признанных в данной области техники. Например, прямой иммобилизации белков на твердых носителях, активированных бромцианом, через аминофункциональные группы первичной последовательности белка. Альтернативно, сульфгидрильные функциональные группы белков могут быть использованы для прямой иммобилизации белка на носителях, дериватизированных алкилгалогенидами, или носителях, содержащих свободные тиольные функциональные группы. В других воплощениях возможна прямая иммобилизация белков, содержащих αтиоэфирные функциональные группы, на носителях, содержащих 1,2-аминотиольные группировки (например, Ν-концевой цистеин), с применением природной химической реакции лигирования. Альтернативно, белки, модифицированные кетонами и альдегидами, могут быть иммобилизованы на твердых носителях, дериватизированных гидразинильными, гидразидными функциональными группами и аминооксифункциональными группами с применением реакций лигирования с образованием связи гидразон/оксим (и наоборот). Альтернативно, для иммобилизации белков на твердых носителях может быть применена клик-химия (Сйск скстМгу). в соответствии с которой белок и носитель дериватизируют подходящими взаимно реакционно-способными химическими функциональными группами (азидами и алкинами). В других воплощениях для иммобилизации соответствующим образом дериватизированных белков на соответствующим образом дериватизированных твердых носителях может быть применена
- 7 023912 химия лигирования Штаудингера.
Согласно настоящему изобретению раскрыта колонка для афереза, наполненная твердым носителем указанного выше типа, содержащим иммобилизованный на нем один или более чем один хемокин. Колонка наполнена твердым носителем, содержащим один или более чем один хемокин, иммобилизованный на носителе прямым или непрямым образом, для обеспечения возможности удаления клетки, экспрессирующей когнатный рецептор хемокина или хемокинов, в частности (активированного) лейкоцита, как описано здесь (такого как моноцит или лимфоцит), из периферической крови пациента. В предпочтительном воплощении настоящего изобретения колонка для афереза наполнена носителем, содержащим стрептавидин, иммобилизованный на носителе, и один или более чем один биотинилированный хемокин, связанный со стрептавидином на носителе. Предпочтительно, носитель представляет собой углевод с высокой молекулярной массой, возможно поперечно сшитый, такой как агароза. Наполненная означает, что колонка несет или содержит твердый носитель таким образом, что возможен ток (периферической) крови через колонку в контакте с твердым носителем. Таким образом, твердый носитель обеспечивает матрицу в колонке, через которую происходит ток крови, в определенных воплощениях непрерывным образом.
Таким образом, колонку по изобретению используют как емкость для носителя, обеспечивающего возможность удаления клеток, экспрессирующих когнатный рецептор хемокина, из образца крови. Конкретнее, колонка может быть использована для удаления одного или более чем одного (активированного) лейкоцита, в частности одного или более из (активированных) Т-лимфоцитов, (активированных) моноцитов, (активированных) нейтрофильных гранулоцитов, (активированных) эозинофилов, из периферической крови пациента (с ΙΒΌ). В зависимости от профиля клеток отдельных пациентов для изготовления носителя выбирают определенные хемокины для специфичного удаления таких Т-лимфоцитов, моноцитов, нейтрофильных гранулоцитов и эозинофилов, или активированных клеток других типов, вовлеченных в воспаление кишечника.
Таким образом, согласно изобретению также предложен способ удаления клеток, таких как лейкоциты, экспрессирующих рецептор соответствующего хемокина, как например одного или более из (активированных) Т-лимфоцитов, (активированных) моноцитов, (активированных) нейтрофильных гранулоцитов, (активированных) эозинофилов, из периферической крови пациента, в частности пациента, страдающего от воспалительного расстройства, конкретнее, воспалительного заболевания кишечника (ΙΒΌ), включающий: приведение полученной периферической крови в контакт с одним или более чем одним хемокином, иммобилизованным на твердом носителе, в течение периода времени, достаточного для адгезии указанной клетки на носителе; и отделение крови с уменьшенным содержанием указанной клетки от носителя. Данный способ может представлять собой ех νίνο или ίη νίίτο способ. Однако в некоторых воплощениях способ дополнительно включает, перед стадией приведения в контакт, получение периферической крови от пациента. В другом воплощении способ дополнительно включает, после стадии отделения, инфузию крови с уменьшенным содержанием указанной клетки пациенту. В таком случае это представляет собой полный способ лечения лейкаферезом. Таким образом, способ лейкафереза включает получение периферической крови от пациента; приведение полученной периферической крови в контакт с одним или более чем одним хемокином, иммобилизованным на твердом носителе, в течение периода времени, достаточного для адгезии указанных клеток, экспрессирующих рецептор соответствующего хемокина, таких как одно или более из лейкоцитов, в частности (активированных) Т-лимфоцитов, (активированных) моноцитов, (активированных) нейтрофильных гранулоцитов или (активированных) эозинофилов, на носителе; отделение крови с уменьшенным содержанием указанных клеток, экспрессирующих рецептор соответствующего хемокина, таких как одно или более из лейкоцитов, в частности (активированных) Т-лимфоцитов, (активированных) моноцитов, (активированных) нейтрофильных гранулоцитов или (активированных) эозинофилов, от носителя; и инфузию крови с уменьшенным содержанием указанных клеток пациенту. Возможно непрерывное получение периферической крови от пациента. Сходным образом, возможна непрерывная инфузия крови с уменьшенным содержанием указанных клеток пациенту посредством применения подходящей схемы, как описано здесь. Таким образом, носитель может быть помещен в колонку, через которую осуществляют ток крови. Например, это может быть осуществлено с использованием подходящего насоса. Ток крови через колонку делает возможным захват лейкоцитов, экспрессирующих рецептор, хемокинами, иммобилизованными на носителе, и таким образом удаление указанных лейкоцитов из крови с предотвращением их содействия воспалительному состоянию.
Таким образом, в общих чертах согласно изобретению предложено применение колонки или носителя по изобретению в лечении воспалительного расстройства, такого как ΙΒΌ, или в лечении заболевания, характеризующегося присутствием клеток (особенно лейкоцитов), экспрессирующих рецептор соответствующего хемокина, таких как одно или более из (активированных) Т-лимфоцитов, (активированных) моноцитов, (активированных) нейтрофильных гранулоцитов, (активированных) эозинофилов, в периферической крови больного. Согласно изобретению также предложен хемокин, иммобилизованный на твердом носителе, для применения в терапии, в частности для лечения воспалительного расстройства, такого как ΙΒΌ. Изобретение также относится к применению хемокина в изготовлении лекарственного
- 8 023912 средства для лечения воспалительного расстройства, такого как ΙΒΌ, где хемокин иммобилизован на твердом носителе.
Все воплощения, описанные в отношении носителя и колонки по изобретению, применимы к этим аспектам с необходимыми поправками, и для краткости их не повторяют.
Согласно изобретению также раскрыт способ получения магнитной покрытой стрептавидином микрогранулы, связанной с биотинилированным хемокином. Способ включает предоставление магнитной покрытой стрептавидином микрогранулы, суспендированной в водном растворителе, предоставление водного раствора биотинилированного хемокина, смешивание указанных выше суспензии и раствора, инкубацию смеси, разделение, возможно, магнитным способом, магнитной покрытой стрептавидином микрогранулы, связанной с полученным биотинилированным хемокином, и отмывку магнитной покрытой стрептавидином микрогранулы, связанной с биотинилированным хемокином, водным растворителем.
Магнитная покрытая стрептавидином микрогранула, связанная с биотинилированным хемокином, по изобретению может быть использована для отделения клеток крови, имеющих (экспрессирующих) рецепторы соответствующих хемокинов, от клеток крови без таких рецепторов. Разделение предпочтительно проводить в периферической крови магнитным сепаратором. Согласно предпочтительному аспекту изобретения после разделения проводят реинфузию периферической крови индивиду, от которого она была получена.
Способы и медицинские применения по изобретению могут, таким образом, быть адаптированы к потребностям отдельных пациентов или групп пациентов. Удалением из кровообращения клеток, активированных в отношении клеток слизистой оболочки кишечника, можно контролировать важный фактор воспалительного процесса при ΙΒΌ. Способ по изобретению особенно эффективен в лечении или индукции обратного развития неспецифического язвенного колита или болезни Крона, в частности фульминантного (язвенного) колита или фульминантной болезни Крона.
Способы и медицинские применения по изобретению могут также быть применены для лечения пациентов с болезнью Крона удалением клеток и, в частности лейкоцитов, экспрессирующих рецептор соответствующего хемокина, таких как (активированные) Τ-клетки, (активированные) моноциты, (активированные) нейтрофилы, (активированные) эозинофилы, или клеток других типов, активированных в отношении антигена (антигенов), расположенного глубже в стенке кишки.
В более общем воплощении изобретения колонку по изобретению или носитель по изобретению используют в лечении заболевания, характеризующегося присутствием клеток и, в частности, лейкоцитов, экспрессирующих рецептор соответствующего хемокина, как например одного или более из (активированных) Τ-лимфоцитов, (активированных) моноцитов, (активированных) нейтрофильных гранулоцитов, (активированных) эозинофилов в периферической крови больного.
Изобретение будет теперь описано более подробно посредством ссылки на следующие неограничивающие воплощения и примеры.
Описание графических материалов
Фиг. 1а, 1б и 1в - связывание биотинилированного ΜΙΡ-1α СО4+, СЭ8+ Τ-клетками и СЭ14+ моноцитами, соответственно, полученными из периферической крови здорового донора.
Фиг. 1г, 1д и 1е - связывание биотинилированного МСР-1 СО4+, СЭ8+ Τ-клетками и СЭ14+ моноцитами, соответственно, полученными из периферической крови здорового донора.
Фиг. 2а, 2б и 2в - связывание биотинилированного ССЬ25 СЭ4+, СЭ8+ Τ-клетками и СЭ14+ моноцитами, соответственно, полученными из периферической крови здорового донора.
Фиг. 2г, 2д и 2е - связывание биотинилированного ССЬ25 СЭ4+, СЭ8+ Τ-клетками и СЭ14+ моноцитами, соответственно, полученными из периферической крови пациента с СО.
Фиг. 3а, 3б и 3в - связывание ГО-8 СО4+, СО8+ Τ-клетками и СО16+ моноцитами, соответственно, полученными из периферической крови здорового донора.
Фиг. 4 - пластиковый корпус и верхняя часть, где показан распределительный лист (2) и блоки предохранительных фильтров (3 и 4).
Фиг. 5 - общая система лейкафереза.
Фиг. 6 - насос с воздушным детектором и оптическим детектором (4).
Фиг. 7 - уменьшение содержания популяций клеток, экспрессирующих ССК9, у одного донора крови. Общие популяции клеток не меняются после прохождения через колонку.
Фиг. 8 - уменьшение содержания популяций клеток, экспрессирующих ССК9, у одного пациента с ΙΒΏ. Общие популяции клеток не меняются после прохождения через колонку.
Фиг. 9 - маркеры активации на клетках крови от одного донора крови до и после прохождения через колонку.
Фиг. 10 - секреция ΙΡΝ-γ на клетках до и после прохождения через устройство небольшого размера.
Фиг. 11 - результат на клетках, стимулированных фитогемагглютининовым (РНА) антигеном, до и после прохождения через колонку.
Фиг. 12 - результаты в отношении гибели клеток после инкубации клеток с высокими концентрациями ΕΤΕί’Κ.
- 9 023912
Фиг. 13 - высокоэффективная жидкостная хроматография (НРЬС) очищенного прошедшего фолдинг биотинилированного ТЕСК (Ы1еи).
Фиг. 14 - данные ионизации очищенного прошедшего фолдинг биотинилированного ТЕСК (Ы1еи) электрораспылением с тандемной масс-спектрометрией (Εδ/Μδ).
Описание предпочтительных воплощений
Материалы и методы.
Выделение лейкоцитов периферической крови. Гепаринизированную периферическую кровь от здоровых доноров крови или от пациентов с ΙΒΌ фиксировали 4% параформальдегидом в течение 4 мин, разрушали эритроциты в течение 15 мин 0,83% раствором хлорида аммония и отмывали два раза в буфере для сортировки клеток с возбуждением флуоресценции (ΡΑСδ) с получением суспензии лейкоцитов крови.
Хемокины. Лейкоциты инкубировали в течение 30 мин в темноте при 4°С со следующими биотинилированными и меченными А1еха647 Р1иог® хемокинами: ССЬ25 (в концентрациях 0,1 нг/мкл, 0,5 нг/мкл и 5 нг/мкл), ΜΙΡ-1α или МСР-1 (в концентрациях 10 нг/мкл и 50 нг/мкл). Клетки затем отмывали буфером для ΡАСδ и анализировали проточной цитометрией. Все хемокины, использованные в Примерах, были предоставлены А1тас δс^еηсеδ δοοίΐαηά Ыб, ЕбшЬигдЬ, δοοίΐαηά.
Анализ проточной цитометрией. Анализ проточной цитометрией проводили на цитометре ΡАСδ СаПЬиг с двумя лазерами (ΒΌ ПптипосуЮтеОу хуЧепъ. δαη 1о8е, Са, υδΑ). В каждом образце подсчитывали и анализировали десять тысяч клеток. Для анализа данных использовали программное обеспечение Се11 ОиеЧ Рго от ВесЮп Оюкиъоп.
Пример 1. Связывание моноцитов с ΜΙΡ-1α.
В эксперименте с биотинилированным ΜΙΡ-1α было обнаружено, что приблизительно 90% моноцитов, полученных из периферической крови здоровых доноров, связывались с цитокином после 30 мин инкубации (фиг. 1в), в то время как СЭ4+ и СЭ8+ лимфоциты не связывались с цитокином (фиг. 1а и 1б).
Пример 2. Связывание моноцитов с МСР-1.
В эксперименте с биотинилированным МСР-1 было обнаружено, что приблизительно 90% моноцитов, полученных из периферической крови здоровых доноров, связывались с цитокином после 30 мин инкубации (фиг. 1е), в то время как СЭ4+ и СЭ8+ лимфоциты не связывались с цитокином (фиг. 1г и 1д).
Пример 3. Аффинность клеток крови в отношении ССЬ25.
В эксперименте с биотинилированным ССЬ25 было обнаружено, что ни Т-клетки (СЭ4+ лимфоциты; СЭ8+ лимфоциты), ни моноциты (СЭ14+ моноциты) из периферической крови здорового донора (фиг. 2а, 2б и 2в) не связывались с биотинилированным хемокином. В отличие от этого, приблизительно 80% СЭ8+ лимфоцитов и приблизительно 90% СЭ4+ лимфоцитов и моноцитов от пациента с болезнью Крона связывались с ССЬ25 (фиг. 2г, 2д и 2е).
Пример 4. Аффинность клеток крови в отношении биотинилированного 1Ь-8.
На фиг. 3 показано связывание биотинилированного 1Ь-8 (СХСЬ8) СЭ4+ лимфоцитами (фиг. 3а), СЭ8+ лимфоцитами (фиг. 3б) и СЭ16+ нейтрофилами (фиг. 3в), полученными от здоровых доноров. После 30 мин инкубации все СЭ16+ нейтрофилы связывались с 1Ь-8. В отличие от этого, с СЭ4+ лимфоцитами и СЭ8+ лимфоцитами связывания не наблюдали.
Пример 5. Подготовка хемокиновой колонки для афереза клеток крови.
К стрептавидиновым гранулам из поперечно сшитой агарозы (Рго2уте, δаη Ьеапбго, СА, υ.δ.Α.) размером от 75 мкм до 300 мкм, суспендированным (200 мл, «50% об./об.) в водном растворе 25 мМ фосфата натрия (рН 7,0) и 150 мМ ЫаС1, добавляли раствор 75 мкг биотинилированного М1Р-1а (А1тас δ^ΐ'^δ) в том же буфере при 22°С и медленно перемешивали вручную в течение 3 мин. Смесь оставляли еще на 20 мин, носитель отфильтровывали, отмывали три раза нейтральным водным раствором фосфата натрия/хлорида натрия и заполняли им стеклянную колонку (внутренний диаметр 25 мм, длина 12 см).
Пример 6. Отделение моноцитов из периферической крови здорового донора хемокиновой колонкой из примера 6.
Гепаринизированную периферическую кровь от здорового донора мужского пола анализировали проточной цитометрией на СЭ4+ лимфоциты, СЭ8+ лимфоциты и СЭ14 моноциты. 100 мл крови фильтровали через колонку со скоростью приблизительно 8 мл/мин и отмывали буфером для ΡΑСδ. Профильтрованную кровь анализировали на те же клетки. Было обнаружено, что колонка задерживала приблизительно 95% моноцитов, в то время как более 90% СЭ4+ и СЭ8+ лимфоцитов проходили через нее.
Пример 7. Получение магнитных гранул, конъюгированных со стрептавидином, связанных с биотинилированным М1Р-1а.
Водную суспензию магнитных гранул, конъюгированных со стрептавидином (МадСе11ес1 δΐ^еρΐаνίάίη Реггойшф 1 мл; Κ&Ό δуδΐетδ, МптеароПх, ΜΝ, υ.δ.Α.), смешивали с 30 мкг М1Р-1а (А1тас δαепсех) в 50 мл 25 мМ фосфата натрия (рН 7,0) и 150 мМ №тС1 и медленно перемешивали в течение 1 ч. Частицы отмывали три раза порциями того же растворителя объемом 20 мл и хранили в суспензии при 4°С.
- 10 023912
Пример 8. Отделение СЭ14+ моноцитов из периферической крови здорового донора стрептавидиновыми магнитными гранулами из примера 8.
100 мл гепаринизированной крови здорового донора из примера 7 смешивали с магнитными гранулами, конъюгированными со стрептавидином, связанными с биотинилированным ΜΙΡ-1α, и медленно перемешивали в течение 40 мин. Частицы отделяли от крови магнитным сепаратором и кровь анализировали на СИ14+ моноциты и СЭ4+ и СЭ8+ лимфоциты. В то время как не было выявлено по существу ни одного СИ14+ моноцита, СЭ4+ и СЭ8+ лимфоциты присутствовали приблизительно в исходных количествах.
Пример 9. Адаптированный лейкаферез.
Устройство и свойства колонки.
Введение.
Аферез является признанным лечением, применяемым для уменьшения содержания компонентов крови, таких как антитела, липопротеины низкой плотности (ЛПНП) и клетки крови. Лейкаферез представляет собой лечение аферезом, применяемое для удаления белых клеток крови, лейкоцитов. Пациента соединяют с системой экстракорпорального кровообращения; проводят забор крови из вены на одной руке, пропускают ее через колоночное устройство и возвращают в другую руку пациента. Побочные эффекты лечения лейкаферезом варьируют от нетяжелых явлений, таких как головная боль, головокружение, гипотензия, сильное сердцебиение и прилив крови к лицу, наблюдаемых у 0,1-5% пациентов, получающих лечение.
Колонка.
Колонка предназначена для использования в качестве лечения ΙΒΌ лейкаферезом. Она обеспечит специфичное удаление лейкоцитов, экспрессирующих ССК9, проходящих хоминг в кишечнике, с помощью смолы, содержащей ЬТЕСК, с применением взаимодействия ССК9-ТЕСК. Колонка состоит из трех объединенных компонентов, пластикового корпуса, матрицы из стрептавидиновых (БА) гранул БерЬагоке™ В1§Веаб8 и ЬТЕСК, связанного с матрицей. Лечение проводят с применением таких же методик, как стандартная процедура афереза.
Пластиковый корпус (фиг. 4).
Пластиковый корпус, разработанный для поддержания непрерывного тока крови через матрицу, состоит из прозрачной основной части и красной верхней части. Верхняя часть имеет распределительный лист (2) в месте притока крови (1) для ее равномерного распределения по всей области матрицы. Лист является первым предохранительным барьером, предотвращающим прохождение крупных частиц через колонку и к пациенту. Блоки предохранительных фильтров (3 и 4) расположены в местах притока (1) и оттока (5) крови пластикового корпуса. Блок предохранительных фильтров включает три фильтра, разработанных так, чтобы быть надежным барьером и задерживать все частицы крупнее клеток крови, проходящие через колонку.
Конструкция пластикового корпуса показана на фиг. 4. Конструкция с предохранительными фильтрами (3 и 4) на обоих концах колоночного устройства минимизирует риск проникновения частиц в организм пациента, в том числе в случае неправильного расположения устройства с током крови в направлении, противоположном предполагаемому.
Стрептавидиновые гранулы БерЬагоке™ В1дВеаб8.
Вторым компонентом устройства является аффинная матрица, называемая стрептавидиновыми гранулами БерЕагоке™ В1дВеаб8 (БерЬагоке™ ОЕ НеаИЪсаге, Б^ебеп). БерЕагоке™ представляет собой гранулярную форму поперечно сшитой агарозы, являющейся полисахаридом, получаемым из морских водорослей. БерЕагоке™ и агарозу обычно используют в качестве матриц для колонок в биомедицинских аффинных методиках. Ее выбирают ввиду ее оптимальной распределительной способности, и она позволяет обеспечить обширную область, доступную для аффинного связывания.
ЬТЕСК.
С матрицей связан третий компонент устройства, ЬТЕСК. Этот пептид ЬТЕСК представляет собой синтетический сконструированный вариант человеческого хемокина ТЕСК, процессированный и биотинилированный, но сохраняющий свою связывающую активность в отношении рецептора ТЕСК, ССК9. Биотинилирование сконструированного ТЕСК делает его способным связываться с молекулами стрептавидина на матрице БерЬагоке™. Известно, что связывание биотина и стрептавидина является одним из сильнейших биологических взаимодействий с Кб порядка 4х10-14 М. Вычисленное соотношение сайтов связывания стрептавидин:биотин в колонке составляет 10:1. Таким образом, связывание матрицы и ЬТЕСК будет моментальным, минимизируя риск отсоединения ЬТЕСК от матрицы.
Система афереза.
Для проведения лейкафереза необходимы следующие компоненты: колонка, система трубок и насос 4008 АЭБ (Рге8еп1И8 Мебюа1 Саге).
Контур.
Система показана на фиг. 5. Пациента (1) соединяют с экстракорпоральным контуром стерильными иглами Уепйоп через вены правой и левой рук. Также подсоединяют емкость с физиологическим раство- 11 023912 ром (3) и физиологический раствор подают с использованием насоса АС.'Э (2). Забор крови производят из одной руки пациента через систему стерильных трубок кровяным насосом (4), и пропускают ее через колонку (6), и вводят обратно пациенту. Систему трубок соединяют с колонкой стандартными диализными соединениями с наконечниками Люэра. Соединения на колонке имеют цветовой код для правильной сборки; красные трубки для притока крови к красной верхней части колонки и синие трубки для оттока крови обратно пациенту. Присутствует воздушный детектор (8). Сенсоры давления на входе (5) и венозного давления (Руеп) (7) используют для мониторинга давления в контуре.
Насос 4008 ΆΌ8.
Насос для афереза от Ргекетик МеФса1 Саге позволяет мониторировать забор и введение крови пациенту, давление в системе экстракорпорального кровообращения и различать воздух посредством улавливателя пузырьков и воздушного детектора. Внутри улавливателя пузырьков расположен фильтрулавливатель сгустков. Насос также имеет оптический детектор для различения света, например физиологического раствора или воздуха, присутствующего в системе трубок, и темноты, например крови, присутствующей в системе трубок.
Схематическое изображение насоса, на котором показан воздушный детектор и оптический фильтр, показано на фиг. 6. При выявлении насосной системой пузырьков воздуха и оптических флуктуации или при значениях давления в системе экстракорпорального кровообращения, выходящих за пределы установленного диапазона, насос немедленно останавливается и издает визуальный/звуковой сигнал тревоги.
Обозначения на фиг. 6:
- монитор;
- держатель емкости для отходов;
- модули (слева направо: кровяной насос, насос Λί'Ό. воздушный детектор);
- резервные места для других модулей;
- держатель поглотителя;
- детектор конденсата;
- штатив для внутривенных инъекций.
Подготовка пациента.
Пациенту будут вводить антикоагулянты перед каждым лечебным сеансом. Стерильный физиологический раствор с 5000 ΙΕ гепарина будут использовать для прокачки системы экстракорпорального кровообращения, затем в контур будут вводить болюсную инъекцию 4000 ΙΕ гепарина в начале каждого лечебного сеанса.
Время лейкафереза и скорость потока.
Систему для афереза следует использовать при скорости потока 30-60 мл/мин. Лечение заканчивают после прохождения 1800 мл крови.
Условия хранения.
Колоночные устройства следует хранить при 1-25°С, избегая замораживания и более высоких температур. Данные по стабильности в течение более 3 месяцев указывают на отсутствие различий функционирования с течением времени или при изменении температуры (комнатная температура и охлаждение). Колонки будут хранить в охлажденном состоянии до использования. Следует избегать механических повреждений, как например в результате сильных вибраций и повреждения. Колонку, которую хранили с нарушением этих рекомендаций, не следует использовать.
Условия транспортировки.
Колоночные устройства будут транспортировать в охлажденном состоянии, избегая замораживания и более высоких температур. Следует избегать механических повреждений, как например в результате сильных вибраций и повреждения.
Пример 10. Неклинические исследования.
Введение.
Еще в 1970-е гг. наблюдали накопление лимфоцитов, полученных из мезентериальных лимфатических узлов овец-доноров, в кишечнике после их переноса животным-реципиентам (4, 5). Эти начальные исследования на животных позволяли предположить способность к специфичному хомингу циркулирующих лимфоцитов, направляющихся в различные компартменты организма. Дальнейшие исследования в моделях на мышах продемонстрировали, что органоспецифичность различных подгрупп Т-клеток обеспечивают несколько сигнальных метаболических путей. Было показано, что Ь-селектин (также известный как СЭ62Ь) является клеточным поверхностным белком, обеспечивающим миграцию лимфоцитов в мезентериальные лимфатические узлы (6). Было обнаружено, что в эндотелиальной выстилке кровеносных сосудов кишечника Μαύί'ΆΜΙ и ТЕСК вовлечены в адгезию и миграцию связанных со слизистой оболочкой лимфоцитов и моноцитов. Исследования привлекли внимание к соответствующим рецепторам иммунокомпетентных клеток, альфа4бета7 и ССК9, соответственно (2). В данном контексте одна из моделей болезни Крона на мышах, ТМЕЭекаАКЕ, позволила предположить, что метаболический путь альфа4бета7 функционировал независимо от ТЕСК-ССК9-зависимого транзита и, по-видимому, являлся основным механизмом хоминга в кишечнике (7, 8). Тем не менее, в других моделях на мышах было установлено, что взаимодействие ТЕСК-ССК9 является в равной степени важным в отношении
- 12 023912 хоминга в кишечнике в воспаленной слизистой оболочке. В моделях на мышах ТЕСК-/- и ССК9-/-, а также антитело-опосредованным ингибированием связывания ТЕСК-ССК9 было продемонстрировано ослабленное воспаление слизистой оболочки (9-12). Таким образом, влияние различных механизмов хоминга, по-видимому, зависит от выбранной модели на животных. В нескольких исследованиях в моделях на мышах было показано, что Т-клетки, экспрессирующие ССК9, предпочтительно мигрируют в тонкую кишку. Тем не менее, воспаление слизистой оболочки, ограниченное толстой кишкой, как наблюдают в модели неспецифического язвенного колита на мышах МЭКТа-/-, демонстрирует зависимость от лимфоцитов, экспрессирующих ССК9. После введения белка ССХ282-В, блокирующего ССК9, происходит очевидное разрешение воспалительных поражений слизистой оболочки толстой кишки, позволяя предположить важную роль ТЕСК-ССК9-взаимодействия также в слизистой оболочке толстой кишки (3). Результатом терапевтического значения ТЕСК-ССК9-механизма хоминга стали несколько исследований у людей, и, как наблюдали на мышах, было обнаружено накопление Т-клеток, экспрессирующих ССК9, в тонкой кишке человека (2, 3, 13). У пациентов с СО существует значительное повышение лимфоцитов, экспрессирующих ССК9, в мезентериальных лимфатических узлах по сравнению со здоровыми контролями (13). В дополнительных исследованиях был описан ТЕСК и присутствие Т-клеток, экспрессирующих ССК9, в воспаленной слизистой оболочке толстой кишки у пациентов, страдающих от СО и ИС. Было показано, что в слизистой оболочки толстой кишки здоровых контролей также присутствуют иммунокомпетентные клетки, экспрессирующие ССК9, что говорит о важной роли данного рецептора в нормальном функционировании связанной с кишечником иммунной системы (3). Что касается воспалительного заболевания кишечника, то имеющиеся модели на животных не полностью соответствуют воспалению в кишечнике человека. Таким образом, для поиска неклинических доказательств при тестировании концепции основное внимание было уделено применению экспериментов ίη νίΐΓΟ на образцах крови от пациентов с ΙΒΌ. В дополнение, белок ЬТЕСК, используемый в колонке для лейкафереза, специфичен в отношении человеческого поверхностного белка ССК9, что ограничивает осуществимость исследований эффективности на животных ίη νίνο.
Уменьшение популяций клеток-мишеней ίη νίίτο.
Для исследования способности элиминировать клетки, экспрессирующие ССК9, проводили исследования ίη νίίτο на матрице, связанной с ЬТЕСК. Кровь получали от доноров крови и пациентов с ΙΒΌ и пропускали через колоночное устройство, содержащее матрицу, связанную с ЬТЕСК. Образцы крови отбирали до и после прохождения через колонку и анализировали проточной цитометрией (РЛС8) на предмет уменьшения содержания клеток, экспрессирующих ССК9.
Результаты демонстрируют значительное уменьшение популяции СИ14-положительных клетокмишеней, экспрессирующих ССК9, после перфузии через матрицу; в то время как общее количество СИ14-положительных клеток не изменяется. Исследования с уменьшением содержания клеток проводили на крови от здоровых доноров и пациентов с ΙΒΌ, что подтвердило сходные эффекты. Результаты показаны на фиг. 7 и 8 соответственно.
В заключение, результаты, полученные ίη νίίτο, демонстрируют, что колонка специфично уменьшает количество клеток, экспрессирующих ССК9, на 50-75%. Влияние на клетки, не экспрессирующие ССК9, отсутствует.
Пример 11. Токсикологическая оценка и исследование безопасности.
Воздействие.
Возможны два разных пути воздействия колоночного устройства на пациента. Во-первых, местно на кровь и ее клетки химическими веществами, включая ЬТЕСК, в устройстве, и, во-вторых, системно химическими веществами, включая ЬТЕСК, высвобождаемыми из устройства и вводимыми в организм пациента через возвращаемую кровь. В обоих случаях возможности оценки общего воздействия ограничены, но исследования стабильности матрицы выявят системное воздействие сефарозы, стрептавидина и ЬТЕСК, см. ниже. Тем не менее, поскольку пластик и фильтрующие материалы соответствуют стандарту Управления по контролю за продуктами и лекарственными средствами (РИЛ)/Международной организации по стандартизации (Ι8Θ) 10993 и У классу требований биологической оценки Фармакопеи США (И8Р), даже после лучевой стерилизации, можно сделать вывод, что воздействие токсичного вещества из этих частей устройства пренебрежимо мало. Кроме того, отсутствуют данные, которые позволили бы предположить какое-либо взаимодействие между различными компонентами колонки.
Стабильность матрицы.
Свойства стабильности матрицы изучали для оценки того, происходит ли какая-либо утечка вещества при активном тестировании колонки. Колонку, заполненную матрицей, промывали в насосной системе 2 л РВ§ (забуференного фосфатом физиологического раствора) со скоростью 30-100 мл/мин для отмывки остаточных частиц со стадии изготовления. Получали образцы жидкости до и после прохождения через колонку и анализировали микроскопией и твердофазным иммуноферментным анализом (ЕЬ18Л) на предмет утечки продуктов.
После промывки колонки 2 л РВ§ не наблюдали видимой утечки вещества матрицы.
Стабильность связывания анализировали посредством ЕЬТЗЛ. Для выявления отсоединившегося ЬТЕСК лунки инкубировали с антителом против стрептавидина в течение 1 ч при 4°С. Для выявления
- 13 023912 отсоединившегося стрептавидина лунки инкубировали с биотинилированной пероксидазой в течение 1 ч при комнатной температуре. Результаты исследований продемонстрировали отсутствие утечки частиц сефарозы, стрептавидина или ЬТЕСК из матрицы.
Биологические (токсикологические) данные.
Желаемый биологический эффект, специфичное удаление активированных лейкоцитов, направляющихся в желудочно-кишечный тракт (клеток, проходящих хоминг в кишечнике), обусловлен аттрактантным действием ЬТЕСК и связыванием с его специфичным рецептором ССК9 на клетках с большой рецептор-лигандной аффинностью. Клетки крови, не экспрессирующие рецептор, проходят через колонку и возвращаются пациенту. Воздействие при предполагаемом применении колонки может также вызывать различные нежелательные биологические (токсические) эффекты, которые следует оценивать согласно Ι8Ο 10993-1 данной категории медицинского устройства. На основании предполагаемого местного воздействия при равномерном распределении крови по поверхности колонки возможны неблагоприятные эффекты на кровь, в частности ее клетки. Хемокин ЬТЕСК или любое химическое вещество в устройстве может оказывать местные эффекты, такие как цитотоксичность и гематологические несовместимости. Кроме того, крайне важно исследовать любую активацию иммунокомпетентных клеток. ЬТЕСК или любое химическое вещество, высвобождаемое из колоночного устройства или пластиковых трубок при перфузии, будет также оказывать системное воздействие на пациента, что может приводить к биологическим (токсикологическим) эффектам. Эти вещества могут вызывать различные системные эффекты, из которых цитотоксичность, сенсибилизацию, раздражение и внутрикожную реактивность, системную токсичность (острую), подострую и субхроническую токсичность и гематологические несовместимости следует оценивать согласно Ι8Ο 10993-1. Проводили различные исследования для установления биологического эффекта ЬТЕСК, синтезированного в форме процессированного и биотинилированного варианта массой 9 кДа.
Специфичное уменьшение содержания клеток и анализ посредством РАС8 (сортировки клеток с возбуждением флуоресценции) ίη νίΐΓΟ.
Для исследований уменьшения количества клеток с использованием матрицы и ЬТЕСК в крови пациента с ΙΒΌ использовали устройство небольшого размера для имитации способа в полноразмерном колоночном устройстве. Имитацию проводили с использованием набора нейлоновых фильтров в верхней части пластиковой трубки. Кровь аккуратно смешивали с матрицей и пропускали через фильтр в собирательную пробирку. Образцы нефильтрованной крови и фильтрованной крови лизировали перед окрашиванием антителами и дальнейшим анализом посредством РАС8.
Получали образцы крови от доноров крови и исследования уменьшения содержания клеток проводили с использованием колонки-прототипа, содержащей матрицу, связанную с ЬТЕСК. Образцы отбирали до и после прохождения через колонку и лизировали перед окрашиванием антителами и дальнейшим анализом посредством РАС8.
Специфичное уменьшение содержания клеток, экспрессирующих рецептор ЬТЕСК, было успешным с использованием как устройства небольшого размера, так и прототипа колоночного устройства. Также можно показать, что уменьшение содержания клеток было специфичным в отношении популяций клеток, экспрессирующих ССК9. Например, на фиг. 8 и 7 ССК9-положительные СЭ14-клетки и лимфоциты (СЭ4 и СЭ8) сильно снижены, менее 1/5 прошло через колонку, в то время как общее количество популяций СЭ14-клеток и лимфоцитов не изменялось после прохождения через колонку.
Активация, пролиферация и гибель клеток.
Цель состояла в изучении активации и функциональных свойств клеток, прошедших через колоночное устройство.
Маркеры активации.
Лизированные клетки инубировали в течение 15 мин при комнатной температуре в 10% НИ8 (сыворотке с человеческими антителами) для предотвращения неспецифического связывания с клетками через Рс-рецепторы на их клеточной поверхности. Клетки окрашивали на маркеры активации; СЭ69 (лимфоциты), СЭббЬ (гранулоциты) и НЬА-ЭК (моноциты). Клетки собирали на РАС8Апа и анализировали посредством программного обеспечения РАС8ОАа. Число клеток, исследованных на предмет маркеров активации, после прохождения через колонку было таким же, как до прохождения через колонку (см. фиг. 9).
Высвобождение цитокинов.
Исследование для оценки высвобождения воспалительных цитокинов, набор для анализа секреции интерферона гамма (ΙΡΝ-γ) (Ιηΐβτίετοη датта (ΙΡΝ-γ) 8есгейоп Аккау кД), использовали для изучения активации клеток до и после контакта с матрицей. Исследование секреции покажет количество клеток и то, какой фенотип клеток продуцирует ΙΡΝ-γ после стимуляции. Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) от 4 доноров крови разделяли посредством Р1со11. Клетки ресуспендировали в среде для культивирования клеток (КРМI с 1% Рек! + 1% Ь-О1и1 + 5% НИ8) в концентрации 1 х 106 клеток/мл. Матрицу отмывали РΒ8 и смешивали с 0,1 мкг/мл ЬТЕСК. Половину суспензии клеток пропускали через устройство небольшого размера с матрицей. Нефильтрованные и отфильтрованные клетки добавляли в
- 14 023912 концентрации 500000 на лунку в 48-луночный планшет и инкубировали в течение 16 ч при 37°С. Форболмиристатацетат (РМА) (50 нг/мл) + иономицин (1 мкг/мл) добавляли к клеткам в качестве положительного контроля. Через 16 ч клетки анализировали на количество связанного с поверхностью и секретированного ΙΡΝ-γ. Другие моноклональные антитела для РАС8-анализа представляли собой антитела против СЭ3, СЭ14 и 4,6-диамидино-2-фенилиндола (ΌΑΡΙ). Значительного изменения секреции ΙΡΝ-γ не было (см. фиг. 10).
Анализ пролиферации с включением трития ([3Н]).
РВМС из гепаринизированной цельной крови от одного донора крови выделяли и приготавливали разделением посредством Ρίοοίΐ. Клетки считали разводили в концентрации 2х106 клеток/мл в среде для культивирования клеток (ΚΡΜΙ + 10% питательной бычьей сыворотки (ΒΟ8) + 1% рек! и 1% Ь-§1и!). Половину суспензии клеток пропускали через устройство небольшого размера с матрицей (концентрация стрептавидина 4 мг/мл), связанной с 200 нМ (0,2 мкг/мл) ΕΤΕί'Κ. 50 мкл на лунку из суспензии клеток с концентрацией 2х106 клеток/мл (100000 клеток) в трех экземплярах добавляли в 96-луночный планшет, следуя протоколу. 50 мкл среды для культивирования клеток на лунку использовали в качестве отрицательного контроля и 50 мкл фитогемагглютининового (РНА) антигена (5 мкг/мл) на лунку - в качестве положительного контроля. Клетки инкубировали при 37°С до суток 2, 3 и 4.
Перед сбором клеток в лунки добавляли 25 мкл [3Н]-тимидина и затем инкубировали при 37°С в течение 18 ч. Через 18 ч клетки собирали и проводят подсчет включенного [3Н] в сцинтилляторе. Включение [3Н] как признак пролиферации в клетках после прохождения через колонку было таким же, как до прохождения через колонку (см. фиг. 11).
Анализ гибели клеток апоптозом с использованием Аииехш V.
РВМС выделяли от 3 доноров крови разделением посредством Ρίοοίΐ. Клетки дважды отмывали в ΡΒ8 и ресуспендировали в культуральной среде (ΚΡΜΙ с 1% Ь-д1и!, 1% рек! и 10% ΒΟ8) в концентрации 1х106/мл. Клетки стимулировали 5 мкг/мл или 10 мкг/мл ΕΤΕί'Κ. Клетки инкубировали в течение 16 ч в 24-луночном планшете. В качестве положительного контроля использовали дексаметазон (1 мкМ). Клетки отмывали два раза в ΡΒ8 и окрашивали с использованием Аииехш V, следуя протоколу набора ΒΌ Аииехш V. Перед РАС8-анализом к клеткам добавляли 100 мкл ΩΛΡΙ. Образцы анализировали на РАС8 Апа с программным обеспечением РАС8 Ωίνα. Апоптотические клетки определяли как Аииехш Vположительные и ^ΛΡI-отрицательные. Значительного увеличения Аииехш V-положительных клеток после воздействия 5 или 10 мкг/мл ΕΤΕί'Ί< не было (см. фиг. 12).
Заключение.
Исследования проводили на клетках до и после их прохождения через колоночное устройство или после непосредственного контакта со стрептавидиновой сефарозной матрицей, связанной с ΕΤΕί'Κ. Результаты показали незначительные эффекты на клетки, которые были в контакте с матрицей и ΗΤΕΟΚ, или отсутствие таких эффектов. Число СЭ69-клеток (лимфоцитов), СЭ66Ь-клеток (гранулоцитов) и НЬА-ЭК-клеток (моноцитов) с маркерами активации было одинаковым до и после прохождения через колонку. Влияния на способность РВМС к пролиферации не было, и количество клеток, высвобождающих цитокины, было мало. Для большого количества ΗΤΕΟΚ, в 5-10 раз большего, чем количество, которое будут использовать в колоночном устройстве для начального клинического исследования, был показан незначительный эффект на гибель клеток.
Токсикологические исследования.
Анализ цитотоксичности ίη νίίτο.
Матрицу колонки исследовали на предмет цитотоксичности ίη νίίτο в культивированных клетках млекопитающих (мышиных фибробластах Ь 929). Исследование проводили в соответствии с руководством Ι8Ο 10993-5 Е1и!юи Τекί дшйеНие. Исследуемый образец поставляли в форме суспензии агарозных гранул с покрытием в 20% этаноле. Перед исследованием агарозные гранулы отмывали и затем ресуспендировали в равном объеме стерильного изотонического физиологического раствора (0,9% ЖС1) для удаления этанола, поскольку матрицу колонки будут отмывать перед предполагаемым применением. Экстракт колонки получали инкубацией отмытого исследуемого образца в полной среде для культивирования клеток (среде НАМ Р12 с 10% фетальной бычьей сыворотки и 50 мкг/мл гентамицина) в течение 24 ч при 37°С с аккуратным перемешиванием. Для экстракции использовали соотношение 0,2 мл исследуемого образца на мл среды (приблизительно 0,2 г/мл). Экстракт исследовали неразведенным, а также разведенным в соотношении 1 + 3 в свежей культуральной среде. Были включены отрицательные контроли (полипропиленовый экстракт, 6 см2/мл), положительные контроли (стабилизированный оловом поливинилхлоридный экстракт, 0,3 см2/мл) и необработанные контрольные культуры, обработанные полной средой для культивирования клеток. Клеточные культуры в трех экземплярах обрабатывали в каждой исследуемой точке в течение 48 ч. Контрольные обработки приводили к должным ответам, демонстрируя правильное функционирование и чувствительность системы исследования. Как для неразведенного экстракта, так и для разведенного экстракта колонки было показано отсутствие токсичности (степень цитотоксичности 0).
- 15 023912
Тест на гемолиз.
Матрицу колонки исследовали на предмет гемолитической активности (лизиса эритроцитов) ίη νίίτο. Тест на гемолиз проводили в соответствии с требованиями руководства Ιδ0 10993-4. Тест был разработан согласно рекомендациям Института материаловедения (Ма1спа1 §е1епее ΙηδίίΙυΙο (ΜδΙ), Тсппс55сс. И8Л (1979)), при этом исследуемый образец непосредственно контактировал с разведенной смесью кроличьей крови в стерильном физиологическом растворе. Исследуемый образец поставляли в форме суспензии агарозных гранул с покрытием в 20% этаноле. Перед исследованием агарозные гранулы отмывали и затем ресуспендировали в равном объеме стерильного изотонического физиологического раствора (0,9% ЫаС1) для удаления этанола, поскольку матрицу колонки будут отмывать перед предполагаемым применением. Исследуемый образец помещали в стерильный изотонический физиологический раствор с использованием соотношения 0,2 мл исследуемого образца на мл физиологического раствора (приблизительно 0,2 г/мл). После инкубации в течение 39 мин при 37°С добавляли кроличью кровь (20 мкл крови на мл физиологического раствора) и инкубацию продолжали в течение еще 60 мин. Были включены отрицательные контроли (изотонический физиологический раствор) и положительные контроли (дистиллированная вода). Все обработки проводили трижды. В конце периода инкубации смеси центрифугировали в течение 5 мин при 500 д. Затем измеряли оптическую плотность надосадочных жидкостей при 545 нм. Вычисляли процент гемолиза. Наблюдаемая средняя степень гемолиза в образцах крови, обработанных матрицей колонки в условиях, использованных в данном исследовании, составляла -0,3%. Сделан вывод о том, что матрица колонки соответствует требованиям теста ΜδΙ на гемолиз (гемолиз < 5%).
Тест на свертывание человеческой крови.
Матрицу колонки исследовали на ее способность влиять на скорость свертывания образцов человеческой крови ίη νίίτο. Исследуемый образец поставляли в форме суспензии агарозных гранул с покрытием в 20% этаноле. Перед исследованием агарозные гранулы отмывали и затем ресуспендировали в равном объеме стерильного изотонического физиологического раствора (0,9% ЫаС1) для удаления этанола, поскольку матрицу колонки будут отмывать перед предполагаемым применением. Образец отмытого исследуемого образца (0,2 мл) помещали в пробирку. Также приготавливали пробирки отрицательного контроля (без обработки) и положительного контроля (флоридин). К каждой пробирке добавляли свежую человеческую кровь (1 мл). Соотношение для исследуемого образца составляло приблизительно 0,2 мл исследуемого образца на мл крови (приблизительно 0,2 г/мл). Пробирки помещали на водяную баню при приблизительно 37°С и регулярно встряхивали. Записывали время, необходимое для полного свертывания крови. Исследуемый образец и каждый контроль исследовали один раз с кровью от каждого из четырех людей. Результаты, полученные при контрольных обработках, продемонстрировали эффективность и чувствительность тест-системы.
Для среднего времени свертывания крови, обработанной матрицей, было показано незначительное снижение до 91% среднего значения отрицательного контроля. Тем не менее, данное снижение не рассматривают как значимое ввиду больших различий в исследовании между четырьмя донорами. Сделан вывод о том, что матрица колонки не влияла на время свертывания человеческой крови в данном эксперименте.
Заключение.
На основании результатов проведенных исследований и оценки колонки можно сделать вывод о том, что она имеет очень низкую токсичность, токсичность специфического типа в отношении органовмишеней не была установлена.
Пример 12. Описание синтеза ТЕСК, биотинилированного через ПЭГ-спейсер.
Молекула-мишень.
ТЕСК (замена Ме1 на Мси), дериватизированный по ε-аминофункциональности боковой цепи Ьу§72 с использованием ПЭГ-биотина (соль трифторуксусной кислоты (ТРА)).
Модификации.
Процессированная форма человеческого ТЕСК, соответствующая остаткам 1-74 зрелого белка, включающая последовательность, соответствующую хемокиновой петле. Полноразмерный зрелый белок имеет 127 аминокислот (сигнальный пептид имеет 23 аминокислоты в незрелом белке из 150 аминокислот). Один метионин в последовательности был изменен на норлейцин для предотвращения окисления этого остатка при сборке цепи, что наблюдали при синтезе производного природной последовательности. Глутамин на Ν-конце белков является субстратом для образования рутоС1и в физиологических условиях. Таким образом, С1п1 последовательности был заменен пироглутамином для предотвращения образования смешанных разновидностей Ν-концевых Οίη и рутоС1и. Это улучшает выход синтеза и обеспечивает получение гомогенного хемокина при изготовлении и применении колонки. Встречающийся в природе лизин в положении 72 был модифицирован биотинилированием на смоле. Между εаминофункциональностью и биотином был включен ПЭГ-спейсер.
Показана линейная аминокислотная последовательность (δΕΟ ΙΌ N0:1) до присоединения молекул ПЭГ-спейсера и биотина к аминокислоте 72 (К):
- 16 023912
Сборку конструированной последовательности ТЕСК проводили на твердом носителе с применением протоколов с флуоренилметилоксикарбонилом (Ртос) для твердофазного пептидного синтеза:
Н-РугСУгеРСС1АУНУР16ИАУЬВЙА^1¥1ЦОЕУ503СМЬР№1ГУЪРК«НаКУС6Нра5КЕУОВ«ИеК1ЬП»ШК (ВДе) ντΚΕ2ΙΝ
РтосЬу8(Пке)-ОН был включен как остаток 72 для облегчения сайт-специфического мечения в данном положении белка.
Замена Ме! на №1е.
Замена Ν-концевого Ο1η на пироглутаминовую кислоту.
Удаление защитной группы Оке.
Защитную группу Оке удаляли обработкой всей смолы (2,5 г) раствором 2% гидразина в диметилформамиде (ΌΜΕ) (100 мл) в течение периода продолжительностью 1 ч с получением 2,0 г смолы.
Стадии мечения.
1. Сочетание с Ртос-8-амино-3,6-диоктановой кислотой.
Смолу (1,5 г) выдерживали в ΌΜΡ (2 мл) и затем добавляли раствор Ртос-8-амино-3,6-диоктановой кислоты (0,38 г, 1 ммоль), раствор ΌΙΕ (2 мл, 0,2 М в ΌΜΡ) и раствор НОС! (2 мл, 0,2 М в ΌΜΡ). Смесь обрабатывали ультразвуком в течение 2 ч и затем отмывали в ΌΜΡ.
2. Кэппинг.
Проводили кэппинг смолы с использованием 0,5 М уксусного ангидрида/раствора ΌΜΡ (20 мл) в течение 5 мин и затем отмывали в ΌΜΕ.
3. Удаление защитной группы Ртос.
Удаление защитной группы Ртос проводили обработкой 20% пиперидином в растворе ΌΜΡ (2x50 мл) в течение 15 мин каждый раз. Смолу отмывали ΌΜΡ.
4. Сочетание биотин-О8и.
Раствор эфира биотин-ΝΗδ (341 мг, 1 ммоль) и диизопропилэтиламина (ΌΙΡΕΑ) (348 мкл) в ΌΜΡ (10 мл) добавляли к смоле и смесь обрабатывали ультразвуком в течение 3 ч. Смолу тщательно отмывали ΌΜΡ и дихлорметаном (Ό’Μ), затем сушили в вакууме. Полученная сухая смола = 1,5 г.
Расщепление.
Сухую пептидную смолу (1,5 г) и смесь расщепляли ТРА (30 мл), содержащей очистительную смесь, состоящую из Ήδ, тиоанизола, воды, ЕЭТ и фенола и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 6 часов. Раствор фильтровали в холодный эфир и смолу промывали ТРА. Пептид центрифугировали, отмывали эфиром, центрифугировали и лиофилизировали с получением 1,0 г неочищенного пептида.
Протокол фолдинга.
Неочищенный пептид (100 мг) растворяли в 6 М ОпНС1 (233 мл) и затем быстро разбавляли до концентрации ОпНС1 2 М добавлением 50 мМ гидроксиметиламинометана (Трис), рН 8 (467 мл), содержащего 0,5 мМ окисленного глутатиона (ΟδδΟ) и 5 мМ восстановленного глутатиона (ΟδΗ). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2,5 суток и затем анализировали посредством НРЬС ОирПег С18, колонка 250x4,6 мм, 10-60% В в течение 30 мин). НРЬС-анализ подтвердил образование желаемого продукта, а также побочных продуктов с неправильным фолдингом.
Очистка.
Белок, прошедший фолдинг, очищали посредством НРЬС с обращенной фазой с использованием .ТирКег С18, колонка 250x21 мм, 9 мл/мин, 10-60% В в течение 50 мин. Было получено 11,1 мг чистого прошедшего фолдинг биотинилированного ТЕСК (Меи).
На фиг. 13 показана НРЬС очищенного прошедшего фолдинг биотинилированного ТЕСК (Меи). Белок элюировали с одним пиком на 21,6 мин.
На фиг. 14 показаны данные ионизации очищенного прошедшего фолдинг биотинилированного ТЕСК (Меи) электрораспылением с тандемной масс-спектрометрией (ЕЗ/Μδ). Предполагаемая масса составила 8959,4 Да.
Данные функционального анализа.
Биотинилированный ТЕСК (Меи) исследовали на активность агониста в анализе Аесрюпп против НССР9 (Еигоксгееп), и было сообщено значение средней эффективной концентрации (ЕС50) 63,6 нМ; ср. ЕС50 для нативного ТЕСК составляет 67,87 нМ.
- 17 023912
Ссылки
1. НидегаИ КА, ΟηβίΙΙ 1_АЛ, Сеаппд АбН, СаНагб ВЕ. ТЬе Су1окюе (ас1з Ьоок; 2001.
2. боЬапззоп-ипбЪот В, Адасе νΜΙ. Сепегайоп οί диТЬоттд Т сеНз апб ΙΙιβίΓ 1осаНгайоп (о (Ье зтаП 1п1езйпа1 тисоза. 1ттипо1 Ββν 2007;215:226-42.
3. \Л/аКегз Мб, ВегаЬоуюЬ, В., 1Л/апд, Υ., ν\ίβΐ, Ζ., 1_1пдазЬе, 5., Щ Ν., Егй, Ь,
Ваитдаг!, Т., Нои/агб, М., ЗсЬаН, Т. 3. Ргезепсе οί ССВ9 апб йз Идапб СС125/ТЕСК ίη №ιβ οοίοη: βοίβηίίίίο гайопа1е /ог 1Ье изе οί ССВ9 зта11 то1еси1е ап(адоп1$1 ССХ282-В ίη οοΙοηϊο сйзогйегв. Ιη: ПЕОА 2008; 2008; 2008.
4. СаЫН ΒΝ, РозкЩ ОС, Ргоз1 ОС, Тгпка Ζ. Τννο сИзИпсй роо1з οί геагси1айпд Т 1утрЬосу1ез: т(дга1огу сЬагас1епзйсз οί поба1 апб т1езйпа1 Т 1утрЬосу1ез. 3 Ехр Меб 1977:145(2):420-8.
5. НаП 60, Норктз б, Обапз Е. 31иб1ез оп 1Ье |утрЬосу1ез οί зЬеер. III.
Оезйпайоп οί 1утрЬ-Ьоте 1ттипоЫаз15 ίη ге1айоп ίο (Ьеи йззие οί οπρίπ. Еиг 3 1ттипо1 977;7(1);30-7,
6. 3(гее(ег РВ, Воизе ВТ, Ви(сЬег ЕС. 1ттипоЬ13(о1од1С апб !ипсйопа1 сЬагас(епгайоп οί а уазси1аг аббгеззт ίηνοίνβά ίη 1утрЬосу(е Ьоттд ίηίο репрЬега! 1утрЬ побез. б Се11 Βίοί 1988;107(5):1853-62.
7. Ароз1о1ак| М, Мапо1оикоз М, ВоиНз М, е1 а1. Во1е οί Ье(а7 ίηίβρπη апб (Не сЬетокте/сЬетокте гесер1ог рай СС1-25/ССВ9 ϊη тобе1еб ΤΝΡ-берепбеп!
СгоЬп'з б!зеазе. Саз(гоеп(его1оду 2008;134(7):2025-35.
8. 51а(оп ТЬ, НаЫеаоп А, ΙΛ/ιηβΙονν ММ, За1о Τ, ίονβ РЕ, Ви(сЬег ЕС. СО8+ гесеп! й1утю еггндгап(з Ноте (о апб ейоепйу герори1а(е (Ье зта11 ίηίββίίηβ ерНЬеПит. Ыа(1ттипо12006;7(5):482-8,
9. АигЬе) МА, МаНззеп М, Оиу-Огапб ϋ, МаНззеп В, СатрЬеН бб. 1трапеб ассити1айоп οί апйдеп-зресЙгс СО8 1утрЬосу(ез ίη сЬетокте СС125-бейаеп1 1п1езйпа1 ерНЬеНит апб 1аггнпа ргорпа. б 1ттипо12007,178(12):7598-606.
10. \Л/игЬе1 МА, МаНззеп М, Оиу-Огапб ϋ, е1 а1. Мюе 1асктд (Ье ССВ9 ССсЬетокте гесер(ог зЬо« а тНб ίιτιρθίιπιβηΐ οί еабу Т- апб В-се11 бече1ортеп( апб а гебисЙоп ίη Т-се11 гесер1ог даттабеЙа(+) ди1 1п(гаерКЬеНа1 1утрНосу1ез. В1ооб 2001;98(9):2626-32.
11. боЬапззоп-ипбЬот В, Зуепззоп М, (Л/игЬе! МА, МаНззеп В, Магдиег β,
Адасе V)/. Зе1ес№е депегайоп οί ди! (Γορίο Т сеНз ίη ди1-аззос1а1еб 1утрЬо)б Йззие (ОАЬТ); гедийетеп( !ог ОАЬТ бепбпйс сеНз апб аб)иуап1. б Ехр Меб 2003;198(6):963-9.
12. ΒίνθΓθ-Νΐβνβε б, Но б, ВапНаз О, е1 а(. АпЙЬобу Ыоскабе οί СС1.25/ССВ9 атеНога(ез еаг1у Ьи1 по! 1а(е сЬгопю типпе Не№з. Оаз(гоеп(его1оду 2006;131(5):1518-29.
13. 5аги1а М, Уи ОТ, Ауапезуап А, ПезЬпег РВ, Тагдап ЗВ, РарабаИз КА.
РЬепо(уре апб еЯес(ог (ипсйоп οί СС сЬетокте гесер(ог 9-ехргезз1пд 1утрЬосу1ез ίη зтаН т(езйпа1 СгоЬп'з б1зеазе. б 1ттипо12007;178(5):3293-300.
14. УУапд С. е( а!., Мисоза/ 1ттипо1. 2009 МагсЬ; 2(2): 173-183.
Настоящее изобретение не следует ограничивать в объеме конкретными воплощениями, описанными здесь. Несомненно, различные модификации изобретения, в дополнение к описанным здесь, станут ясны специалистам в данной области техники из предшествующего описания и последующих графических материалов. Подразумевают, что такие модификации входят в объем приложенной формулы изобретения. Более того, все воплощения, описанные здесь, рассматривают как широко применимые, и их можно комбинировать с любыми другими совместимыми воплощениями, при необходимости.
Здесь приведены различные публикации, описания которых полностью включены посредством ссылки.

Claims (24)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Колонка для афереза, наполненная твердым носителем, содержащим один или более чем один хемокин, иммобилизованный на носителе прямым или непрямым образом, для обеспечения возможности удаления клетки, экспрессирующей когнатный рецептор одного или более чем одного хемокина, из периферической крови пациента.
  2. 2. Колонка по п.1, где указанный один или более чем один хемокин биотинилирован, где носитель содержит иммобилизованный на нем стрептавидин и где один или более чем один биотинилированный хемокин связан со стрептавидином на носителе.
  3. 3. Колонка по п.1 или 2, где указанный один или более чем один хемокин биотинилирован через спейсерную группу.
  4. 4. Колонка по любому из пп.1-3, где носитель содержит или состоит из углевода, имеющего молекулярную массу более 100 кДа.
  5. 5. Колонка по п.4, где углевод представляет собой поперечно сшитую агарозу.
  6. 6. Колонка по любому из пп.1-5, где указанный один или более чем один хемокин выбран из ССЬ25, макрофагального воспалительного белка-1а (М1Р-1а), М1Р-1Ь, моноцитарного хемотаксического белка-1 (МСР-1), МСР-2, МСР-3, МСР-4, хемокина, регулируемого тимусом и активацией (ТАКС), хемокина макрофагального происхождения (МЭС), М1Р-3, М1Р-3а, М1Р3Ь, М1Р-4, Ι-309, НСС-1, НСС-2, хемокина вторичных лимфоидных тканей (δΕΟ), интерлейкина-8 (ΙΓ-8), регулируемого ростом онкогена-а (СКОа), СКОЬ, СКОд, хемокина, выделяемого Т-клетками при активации (ΚΑΝΕΕδ), белка-2, активирующего нейтрофилы ^АР-2), эпителиального пептида 78, активирующего нейтрофилы (ΕΝΑ78), гранулоцитарного хемотаксического белка-2 (ССР-2), ГР-10, монокина, индуцируемого интерферономгамма (МЮ), Ι-ТАС, фактора стромальных клеток (δΌΡ), фракталкина, лимфотактина, эотаксина, эотаксина-2, Ι-309, хемокина Β-лимфоцитов (ВЬС).
  7. 7. Колонка по п.6, где указанный один или более чем один хемокин представляет собой процессированный хемокин ССЬ25, содержащий аминокислотную последовательность, определенную как δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 1.
  8. 8. Колонка по п.7, где указанный процессированный хемокин ССЬ25 биотинилирован в положении 72 (лизин) для обеспечения возможности иммобилизации указанного хемокина на твердом носителе.
  9. 9. Колонка по п.8, где указанный процессированный хемокин ССЬ25 дополнительно содержит полиэтиленгликолевый спейсер (ПЭГ -спейсер) между биотином и лизиновым остатком.
  10. 10. Колонка по любому из пп.1-9, где носитель имеет форму сфер, гранул или частиц неправильной формы, имеющих средний размер от 50 мкм до 2 мм.
  11. 11. Колонка по любому из пп.1-10, где носитель обработан агентом для придания ему антикоагулянтных свойств, как, например, у гепаринизированного носителя.
  12. 12. Способ удаления клетки, экспрессирующей штатный рецептор одного или более чем одного хемокина, из периферической крови пациента, включающий:
    а) приведение полученной периферической крови в контакт с одним или более чем одним хемокином, иммобилизованным на твердом носителе, в течение периода времени, достаточного для адгезии указанной клетки на носителе; и
    б) отделение крови с уменьшенным содержанием указанной клетки от носителя.
  13. 13. Способ по п.12, дополнительно включающий, перед стадией (а), получение периферической крови от пациента.
  14. 14. Способ по п.12 или 13, дополнительно включающий, после стадии (б), инфузию крови с уменьшенным содержанием указанной клетки пациенту.
  15. 15. Способ по любому из пп.12-14, где клетка представляет собой лейкоцит.
  16. 16. Способ по любому из пп.12-15, который используют в процессе лечения воспалительного состояния.
  17. 17. Способ по п.16, где воспалительное состояние представляет собой воспалительное расстройство кишечника (ΙΒΌ).
  18. 18. Способ по любому из пп.12-17, где твердый носитель является таким, как определено в любом из пп. 2-11.
  19. 19. Способ по любому из пп.12-18, где периферическую кровь непрерывно получают от пациента и непрерывно проводят инфузию крови с уменьшенным содержанием указанной клетки пациенту.
  20. 20. Способ по любому из пп.12-19, где носитель расположен в колонке, через которую осуществляют ток крови.
  21. 21. Способ по любому из пп.12-20, где периферическая кровь обработана антикоагулянтом.
  22. 22. Применение колонки по любому из пп.1-11 в процессе лечения воспалительного состояния.
  23. 23. Применение колонки по любому из пп.1-11 в процессе лечения заболевания, характеризующегося присутствием повышенного уровня клетки, экспрессирующей когнатный рецептор одного или более чем одного хемокина.
    - 19 023912
  24. 24. Применение по п.23, где клетка представляет собой лейкоцит, в частности один или более из Тлимфоцита, моноцита, нейтрофильных гранулоцитов или эозинофила, в периферической крови больного.
EA201100452A 2008-09-10 2009-09-10 Лечение воспалительных состояний EA023912B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE0801938 2008-09-10
PCT/GB2009/002196 WO2010029317A2 (en) 2008-09-10 2009-09-10 Treating inflammatory conditions

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201100452A1 EA201100452A1 (ru) 2011-12-30
EA023912B1 true EA023912B1 (ru) 2016-07-29

Family

ID=41666623

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201100452A EA023912B1 (ru) 2008-09-10 2009-09-10 Лечение воспалительных состояний

Country Status (11)

Country Link
US (1) US8877177B2 (ru)
EP (1) EP2331568B1 (ru)
JP (1) JP5611209B2 (ru)
KR (1) KR101703785B1 (ru)
CN (2) CN106823033A (ru)
AU (1) AU2009290694B2 (ru)
CA (1) CA2736632C (ru)
EA (1) EA023912B1 (ru)
IL (1) IL211587A0 (ru)
WO (1) WO2010029317A2 (ru)
ZA (1) ZA201101823B (ru)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX344592B (es) 2005-12-13 2016-12-20 Exthera Medical Corp Metodo para eliminar extracorporalmente de la sangre un microbio patogeno, una celula inflamatoria o una proteina inflamatoria.
WO2008155683A1 (en) 2007-06-18 2008-12-24 Firmenich Sa Malodor counteracting compositions and method for their use
US10099227B2 (en) 2009-08-25 2018-10-16 Nanoshell Company, Llc Method and apparatus for continuous removal of sub-micron sized particles in a closed loop liquid flow system
EP2470282A4 (en) 2009-08-25 2015-07-29 Agnes Ostafin METHOD AND APPARATUS FOR CONTINUOUS REMOVAL OF SUBMICRONIC PARTICLES PRESENT IN A CLOSED-CIRCUIT FLUID FLOW SYSTEM
US10751464B2 (en) 2009-08-25 2020-08-25 Nanoshell Company, Llc Therapeutic retrieval of targets in biological fluids
US11285494B2 (en) 2009-08-25 2022-03-29 Nanoshell Company, Llc Method and apparatus for continuous removal of sub-micron sized particles in a closed loop liquid flow system
AU2010326028B2 (en) 2009-12-01 2014-10-02 Exthera Medical Corporation Method for removing cytokines from blood with surface immobilized polysaccharides
US20130288370A1 (en) 2010-10-15 2013-10-31 Cytopherx, Inc. Cytopheresis cartridges and use thereof
WO2012112724A1 (en) * 2011-02-15 2012-08-23 Exthera Medical, Llc Device and method for removal of blood-borne pathogens, toxins and inflammatory cytokines
US20120219633A1 (en) * 2011-02-28 2012-08-30 Pall Corporation Removal of immunoglobulins and leukocytes from biological fluids
EP2497828A1 (en) * 2011-03-07 2012-09-12 Charité - Universitätsmedizin Berlin Use of aptamers in therapy and/or diagnosis of autoimmune diseases
EP2696961B1 (en) 2011-04-13 2019-02-13 Fenwal, Inc. Systems for use and control of an automated separator with adsorption columns
EP3693041A1 (en) 2011-06-13 2020-08-12 TLA Targeted Immunotherapies AB Treating cancer
WO2012172344A2 (en) 2011-06-13 2012-12-20 Ith Immune Therapy Holdings Treating conditions associated with sepsis
WO2013041833A1 (en) 2011-06-13 2013-03-28 Ith Immune Therapy Holdings Ab Treating conditions associated with metabolic syndrome
US9726666B2 (en) 2011-06-13 2017-08-08 Tla Targeted Immunotherapies Ab Diagnosing and treating inflammatory diseases
WO2012172343A2 (en) 2011-06-13 2012-12-20 Ith Immune Therapy Holdings Treating primary sclerosing cholangitis
WO2012172339A2 (en) 2011-06-13 2012-12-20 Ith Immune Therapy Holdings Treating inflammatory arthritis
EP2718310B1 (en) 2011-06-13 2017-08-23 TLA Targeted Immunotherapies AB Treating mental disorders
EP2718313B1 (en) * 2011-06-13 2017-05-17 TLA Targeted Immunotherapies AB Treating respiratory conditions
WO2012172347A1 (en) 2011-06-13 2012-12-20 Ith Immune Therapy Holdings Ab Diagnosing and treating inflammatory bowel disease and irritable bowel syndrome
WO2012172337A2 (en) 2011-06-13 2012-12-20 Ith Immune Therapy Holdings Treating cardiovascular disease
WO2012172342A2 (en) 2011-06-13 2012-12-20 Ith Immune Therapy Holdings Treating multiple sclerosis
WO2012172345A2 (en) 2011-06-13 2012-12-20 Ith Immune Therapy Holdings Treating conditions associated with allergy
WO2012172336A2 (en) 2011-06-13 2012-12-20 Ith Immune Therapy Holdings Treating inflammatory skin diseases
CA2860831A1 (en) * 2012-01-09 2013-07-18 H. David Humes Cartridge and method for increasing myocardial function
US9427512B2 (en) * 2012-06-08 2016-08-30 Pall Corporation Filter device
US9421317B2 (en) 2012-06-08 2016-08-23 Pall Corporation Cell harvesting device and system
WO2013188073A1 (en) 2012-06-13 2013-12-19 Exthera Medical, Llc Use of heparin and carbohydrates to treat cancer
HUE052481T2 (hu) * 2012-06-15 2021-04-28 Immunomic Therapeutics Inc Nukleinsavak, allergiák kezelésére
WO2014008490A1 (en) * 2012-07-05 2014-01-09 Nanoshell Company, Llc Therapeutic retrieval of targets in biological fluids
WO2014209782A1 (en) 2013-06-24 2014-12-31 Exthera Medical Corporation Blood filtration system containing mannose coated substrate
BR112016009827B1 (pt) 2013-11-08 2021-10-26 Exthera Medical Corporation Método in vitro para concentrar patógenos infecciosos presentes em uma amostra biológica obtida a partir de um indivíduo sob suspeita de estar infectado com os ditos patógenos, concentrador e kit
JP2017513636A (ja) 2014-04-24 2017-06-01 エクスセラ メディカル コーポレイション 高流量を用いて血液から細菌を除去するための方法
MX2017003723A (es) 2014-09-22 2017-06-30 Exthera Medical Corp Dispositivo de hemoperfusion portatil.
WO2017151797A1 (en) 2016-03-02 2017-09-08 Exthera Medical Corporation Method for treating drug intoxication
US11911551B2 (en) 2016-03-02 2024-02-27 Exthera Medical Corporation Method for treating drug intoxication
KR101698447B1 (ko) 2016-08-10 2017-01-20 테고사이언스 (주) 케모카인을 유효성분으로 포함하는 피부개선용 조성물

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102005036505A1 (de) * 2004-07-30 2006-06-01 Adexter Gmbh Vorrichtung und Verfahren zum Isolieren von Zellen, Biopartikeln und/oder Molekülen aus Flüssigkeiten mit dem Ziel einer Anwendung zur Behandlung von Krankheiten des Menschen
WO2006125201A2 (en) * 2005-05-19 2006-11-23 Centocor, Inc. Anti-biotin-pegylated-mcp-1 mutein antibodies, compositions, methods and uses
WO2007133147A1 (en) * 2006-05-12 2007-11-22 Ibd Column Therapies International Ab Method and means for treating inflammatory bowel disease
WO2008038785A1 (fr) * 2006-09-29 2008-04-03 Toray Industries, Inc. Colonne adsorbeuse de cellules

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5277701A (en) * 1991-11-15 1994-01-11 Regents Of The University Of Minnesota Treatment of aluimmunization and refractoriness to platelet transfusion by protein A column therapy
DE19538641C2 (de) 1995-10-05 2000-09-21 Privates Inst Bioserv Gmbh Patientenspezifische Immunadsorber für die extrakorporale Apherese und Verfahren für deren Herstellung
JP4197545B2 (ja) 1997-12-01 2008-12-17 旭化成クラレメディカル株式会社 特異的細胞除去材料
HUP0103563A3 (en) 1998-08-31 2004-04-28 Biogen Idec Ma Inc Cambridge Method of modulating memory effector t-cells and compositions
EP1154799A2 (en) 1999-02-22 2001-11-21 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Biotinylated-chemokine antibody complexes
GB0022748D0 (en) 2000-09-15 2000-11-01 Allied Therapeutics Ltd Reducing the content of cells in a biological sample
US20040077835A1 (en) * 2001-07-12 2004-04-22 Robin Offord Chemokine receptor modulators, production and use
AU2003287949A1 (en) * 2002-09-23 2004-04-08 Rmf Dictagene S.A. Synthetic chemokines labeled at selected positions
AU2005269067B2 (en) * 2004-07-30 2012-02-16 Pluriselect Gmbh Device and method for isolating cells, bioparticles and/or molecules from liquids for use with animals, in biotechnology, (including biotechnological research) and medical diagnostics
JP4942034B2 (ja) * 2007-02-14 2012-05-30 旭化成クラレメディカル株式会社 自己抗体吸着材及び体外循環モジュール

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102005036505A1 (de) * 2004-07-30 2006-06-01 Adexter Gmbh Vorrichtung und Verfahren zum Isolieren von Zellen, Biopartikeln und/oder Molekülen aus Flüssigkeiten mit dem Ziel einer Anwendung zur Behandlung von Krankheiten des Menschen
WO2006125201A2 (en) * 2005-05-19 2006-11-23 Centocor, Inc. Anti-biotin-pegylated-mcp-1 mutein antibodies, compositions, methods and uses
WO2007133147A1 (en) * 2006-05-12 2007-11-22 Ibd Column Therapies International Ab Method and means for treating inflammatory bowel disease
WO2008038785A1 (fr) * 2006-09-29 2008-04-03 Toray Industries, Inc. Colonne adsorbeuse de cellules

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANONYMOUS: "Pierce Monomeric Avidin Kit", INTERNET ARTICLE, 2007, XP002600558, Completes the disclosure of WO 2006125201 with respect to the immobilized monomeric avidin (Pierce, Number 20227) *
CALDERON TINA M. ET AL.: "Overview and history of chemokines and their receptors", CURRENT TOPICS IN MEMBRANES ELSEVIER ACADEMIC PRESS INC, SAN DIEGO, CA, USA SERIES: CURRENT TOPICS IN MEMBRANES (ISSN 1063-5823 (PRINT)), 2005, pages 1-47, XP008126750, table 1 *
DATABASE Uni Prot [Online], 15 July 1998 (1998-07-15), "RecName: Full=C-C motif chemokine 25, AltName Full=Chemokine TECK, AltName Full=Smal 1-inducible cytokine A25, AltName Full=Thymus-expressed chemokine, Flags Precursor", XP002618217, retrieved from EBI accession no UNI PROT: 015444, Database accession no. 015444, sequence *
FOX JAMES M. ET AL.: "The molecular and cellular biology of cc chemokines and their receptors", CURRENT TOPICS IN MEMBRANES, SAN DIEGO, CA, US, vol. 55, 1 January 2005 (2005-01-01), pages 73-102, XP008132315, ISSN: 1063-5823, page 78, line 1 - page 80, line 9 *
NIESS JAN HENDRIK ET AL.: "Chemokines in immune surveillance of the intestine", CURRENT TOPICS IN MEMBRANES, SAN DIEGO, CA, US LNKD- DOI: 1016/51063-5823 (04)55006-8, vol. 55, 1 January 2005 (2005-01-01), pages 143-158, XP008126751, ISSN: 1063-5823, pages 151-152, paragraph VII *
PAPADAKIS K.A.: "CHEMOKINES IN NFLAMMATORY BOWEL DISEASE", CURRENT ALLERGY AND ASTHMA REPORTS, CURRENT SCIENCE, US, vol. 4, no. 1, 1 January 2004 (2004-01-01), pages 83-89, XP009055578, ISSN: 1529-7322, the whole document *
THIERRY A.-C. ET AL.: "BIOTINYLATED SYNTHETIC CHEMOKINES THEIR USE FOR THE DEVELOPMENT OF NONRADIOACTIVE WHOLE-CELL BINDING ASSAYS", JOURNAL OF BIOMOLECULAR SCREENING, LARCHMONT, NY, US LNKD- DOI 10.1177/1087057103008003009, vol. 8, no. 3, 1 June 2003 (2003-06-01), pages 316-323, XP009027971, ISSN: 1087- 0571 * abstract *
ZABEL B.A. ET AL.: "Human G protein-coupled receptor GPR-9-6/CC chemokine receptor 9 is selectively expressed on intestinal homing T lymphocytes, mucosal lymphocytes and themocytes and is required for thymus-expressed chemokine-mediated chemotaxis", THE JOURNAL OF EXPERIMENTAL MEDICINE, ROCKEFELLER UNIVERSITY PRESS, US LNKD- DOI: 10.1084/JEM.190.9.1241, vol. 190, no. 9, 1 November 1999 (1999-11-01), pages 1241-1254, XP002956581, ISSN: 0022-1007, page 1243, column 1, line 5 - line 11 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2009290694A1 (en) 2010-03-18
US20110224645A1 (en) 2011-09-15
EP2331568A2 (en) 2011-06-15
WO2010029317A3 (en) 2011-03-31
WO2010029317A8 (en) 2011-05-05
CN102186880A (zh) 2011-09-14
CA2736632C (en) 2018-07-31
KR20110057222A (ko) 2011-05-31
EA201100452A1 (ru) 2011-12-30
JP5611209B2 (ja) 2014-10-22
CA2736632A1 (en) 2010-03-18
ZA201101823B (en) 2014-08-27
AU2009290694B2 (en) 2014-09-11
EP2331568B1 (en) 2014-09-03
JP2012501708A (ja) 2012-01-26
IL211587A0 (en) 2011-05-31
WO2010029317A2 (en) 2010-03-18
KR101703785B1 (ko) 2017-02-07
US8877177B2 (en) 2014-11-04
CN106823033A (zh) 2017-06-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA023912B1 (ru) Лечение воспалительных состояний
US11504399B2 (en) Combination therapy for a stable and long term engraftment using specific protocols for T/B cell depletion
Terman et al. Extensive necrosis of spontaneous canine mammary adenocarcinoma after extracorporeal perfusion over Staphylococcus aureus Cowans II Description of acute tumoricidal response: morphologic, histologic, immunohistochemical, immunologic, and serologic findings.
ES2603203T3 (es) Método y medio para tratar la enfermedad inflamatoria intestinal
US8507212B2 (en) Process for in vivo treatment of specific biological targets in bodily fluids
EP2717941B1 (en) Treating cancer
De Vries et al. Acute‐phase response patterns in isolated hepatic perfusion with tumour necrosis factor α (TNF‐α) and melphalan in patients with colorectal liver metastases
JP2007505608A (ja) 肝細胞の単離方法
JP2009178052A (ja) 膵臓の膵島病変を予防、緩和または治療する化合物のスクリーニング方法
Kubes et al. Essential Role for Neutrophil Recruitment to
AU2011202946A1 (en) Method and means for treating inflammatory bowel disease
AU2004274512A1 (en) Method for isolating hepatocytes
NZ627549B2 (en) A combination therapy for a stable and long term engraftment using specific protocols for t/b cell depletion

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KZ KG MD TJ TM

PC4A Registration of transfer of a eurasian patent by assignment