ES2603203T3 - Método y medio para tratar la enfermedad inflamatoria intestinal - Google Patents

Abstract

Una columna de leucaferesis cargada con un soporte sobre el que se inmovilizan anticuerpos contra marcadores de superficie celular de leucocitos activados seleccionados de linfocitos T y granulocitos neutrofilos, en la que dichos anticuerpos contra linfocitos T activados se seleccionan de anticuerpos contra CD69 y α4ß7 integrina, y/o en la que dichos anticuerpos contra granulocitos neutrofilos activados se seleccionan de anticuerpos contra CD66b.

Description

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DESCRIPCION

Metodo y medio para tratar la enfermedad inflamatoria intestinal Campo de la invencion

La invencion se refiere a un metodo de tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal (EII), en particular la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn, y a un medio para su uso en el tratamiento.

Antecedentes de la invencion

La colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn son manifestaciones de la enfermedad inflamatoria intestinal (EII). Otras formas de EII incluyen la colitis linfodtica y la colitis colagenosa. Los pacientes con colitis ulcerosa fulminante se tratan actualmente con dosis altas de esteroides. Se estan realizando ensayos clinicos en fase III con anti-TNFa. Ambos farmacos son inhibidores generales de la inflamacion. Son eficaces en aproximadamente el 50 % de los casos, pero producen efectos adversos graves. Con frecuencia, los pacientes tambien pueden tener episodios recurrentes de colitis fulminante. En los pacientes con colitis fulminante que no responden al tratamiento medico, es necesaria una intervention quirurgica urgente. La colitis ulcerosa siempre esta restringida al intestino grueso (colon). En la colitis fulminante el colon se reseca y se construye un ileostoma externo. Despues de la recuperation y, posiblemente, el tratamiento medico adicional de la inflamacion del munon rectal en la mayoria de los pacientes se realiza una anastomosis ileorrectal o cirugia reconstructiva con una bolsa pelvica para restaurar la continuidad intestinal. Ambos procedimientos quirurgicos implican heces sueltas aproximadamente seis veces al dia y alteraciones en los equilibrios hidrico y mineral.

Los pacientes con enfermedad de Crohn generalmente presentan la inflamacion en la parte mas distal del intestino delgado y en la primera parte del intestino grueso (region ileocecal), pero la inflamacion puede localizarse en cualquier parte del tracto gastrointestinal. El tratamiento medico no puede curar la enfermedad, aunque se puede proporcionar alivio temporal mediante farmacos antiinflamatorios, tales como esteroides y azatioprina. La cirugia con resection de segmentos intestinales estenoticos y con fistulas esta indicada en aproximadamente el 50 % de los pacientes; la mitad de ellos sufrira recurrencias y necesitaran cirugia adicional. Por lo tanto, es muy necesario un metodo que pueda inactivar especificamente la inflamacion en la EII y prevenir la enfermedad recurrente en el paciente individual.

El documento WO2005113037 da a conocer un filtro y un metodo para eliminar materiales seleccionados de una muestra de fluido biologico. El filtro comprende una carcasa exterior, una entrada y una salida. Una pluralidad de superficies del filtro se proporciona dentro de la carcasa exterior y se aplica al menos un recubrimiento a las superficies del filtro. El al menos un recubrimiento comprende al menos dos modulos de union que, a su vez, se unen selectivamente entre si. Un modulo de union se une selectivamente a las superficies del filtro y otro modulo de union esta configurado para unirse selectivamente a los materiales seleccionados que se han de retirar de la muestra de fluido. Dado que se permite que la muestra de fluido pase a traves de la entrada, la carcasa exterior y la salida, los materiales seleccionados se unen selectivamente a las superficies del filtro a traves del recubrimiento. La muestra de fluido es una muestra de sangre. Un componente liquido seleccionado es un componente de la sangre elegido de entre otros, leucocitos, granulocitos y linfocitos.

Los medios de filtro y los aparatos para la separation de leucocitos de la sangre se divulgan en, entre otros: JP2003265596; US5885457; JP04187206; US4936993; JP03000074; JP02167071; JP02009823; JP10057477.

El documento WO 02/24307 da a conocer un dispositivo adsorbente para reducir el contenido de las celulas y/o plaquetas circulantes en una muestra biologica, tal como sangre, en el que el dispositivo adsorbente comprende un soporte y un agente de afinidad inmovilizado sobre el soporte. El agente de afinidad puede ser un anticuerpo que se une a una molecula expresada sobre la superficie de las celulas y/o plaquetas circulantes.

Lampinen M et al. (Eosinophil granulocytes are activated during the remission phase of ulcerative colitis, 2005, GUT vol 54; 12; 1714-1720) describen un estudio disenado para investigar los eosinofilos, neutrofilos y granulocitos intestinales mediante citometria de flujo. El articulo demuestra un aumento en la expresion de CD66b en los neutrofilos obtenidos de muestras de biopsia de colon y de ileon de pacientes con colitis ulcerosa.

Sandborn W.J y Targan S.R (Biologic therapy of inflammatory bowel disease, 2001, Gastroenterology vol 122; 6; 1592-1608) revisan las terapias biologicas que se estan desarrollando para el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal. Estas terapias incluyen anticuerpos frente a las integrinas a4p7, que se han desarrollado en un intento de inhibir el anclaje de los leucocitos a la mucosa del intestino.

Z Lui et al (IL-15 is highly expressed in inflammatory bowel disease and regulates local T cell-dependent cytokine production, The Journal of Immunology, vol 164; 7; 3608-3615) describen el efecto de la citocina IL-15 sobre la production de citocinas proinflamatorias por las celulas T activadas y sugiere un papel para la IL-15 en la enfermedad inflamatoria intestinal.

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Sandborn (Preliminary data on the use of apheresis in inflammatory bowel disease, Inflamm Bowel Dis, vol.12; S15- 21) describen el tratamiento de aferesis para la EII, en particular los sistemas de aferesis Adacolumn y Cellsorba. El Adacolumn es un dispositivo de filtracion relleno de perlas de acetato de celulosa, mientras que la columna Cellsorba consiste en fibras no tejidas de poliester.

Kanai et al. (The logics of leukocytapheresis as a natural biological therapy for inflammatory bowel disease, Expert Opin. Biol Ther.vol. 6(5); 453-466) es una revision que describe los resultados de ensayos clinicos en los que se analiza la leucacitaferesis para el tratamiento de la EII. Los estudios descritos se basan en el uso de los sistemas de aferesis Adacolumn y Cellsorba descritos anteriormente.

Objetivos de la invencion

En el presente documento se describe un metodo para tratar la EII, en particular la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn.

Es un objetivo de la invencion proporcionar medios para su uso en el metodo.

Otros objetivos de la invencion resultaran evidentes a partir de la siguiente descripcion corta de la invencion, de realizaciones preferentes de la misma ilustradas en un dibujo, y de las reivindicaciones adjuntas.

Sumario de la invencion

La presente invencion proporciona una columna de leucaferesis cargada con un soporte sobre el que se inmovilizan los anticuerpos contra marcadores de superficie celular de leucocitos activados seleccionados de los linfocitos T y granulocitos neutrofilos, en la que dichos anticuerpos contra los linfocitos T activados se seleccionan de anticuerpos contra CD69 y la integrina a4|37 y/o en el que dichos anticuerpos contra los granulocitos neutrofilos activados se seleccionan de anticuerpos contra CD66b.

La presente invencion tambien proporciona un soporte para leucaferesis que comprende inmovilizados sobre el mismo uno o mas anticuerpos producidos contra leucocitos activados seleccionados de los linfocitos T y granulocitos neutrofilos y en el que dichos anticuerpos contra los linfocitos T activados se seleccionan de anticuerpos contra CD69 y la integrina a4p7 y/o en el que dichos anticuerpos contra los granulocitos neutrofilos activados se seleccionan de anticuerpos contra CD66b.

En el proceso inflamatorio de la EII, las celulas T interaccionan con los leucocitos. Los leucocitos liberan agentes nocivos tras la estimulacion por ciertos cofactores. Estos agentes nocivos danan las celulas intestinales. Por citometria de flujo del material obtenido a partir de biopsias intestinales de pacientes con EII activa, los inventores identificaron marcadores de la superficie celular de los leucocitos de linfocitos T activados y de granulocitos neutrofilos y eosinofilos activados, celulas que se acumulan en el sitio de la inflamacion, pero que tambien estan presentes en la sangre periferica en circulacion.

La presente invencion se basa en la hipotesis de que estas celulas activadas son responsables del inicio y el mantenimiento de la inflamacion en la EII, y que su eliminacion de la circulacion puede reducir e incluso eliminar tal inflamacion. El concepto comprende la idea de que el estado inflamatorio de cada paciente es unico en terminos del grado de activacion de leucocitos y de la clase y proporciones relativas de celulas T invasoras, parametros que varian de un paciente a otro y con la gravedad de la enfermedad, y estan influenciados por los medicamentos administrados al paciente. La presente invencion no recurre al uso de adsorbentes de leucocitos inespecificos conocidos en la tecnica, tales como algodon y otras fibras polimericas. En el contexto de la invencion, la EII comprende principalmente la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa, pero tambien la colitis colagenosa caracterizada por diarreas acuosas, endoscopia normal, pero con acumulacion histopatologica de colageno en la submucosa intestinal, y la colitis linfocitica caracterizada por la presencia de grandes cantidades de linfocitos en la intestinal mucosa acompanada de diarrea.

Como se describe en el presente documento, se realiza una colonoscopia a un paciente con EII. Se toman una o varias biopsias de tejido intestinal enfermo. A partir del material de biopsia individual o combinado se prepara una suspension de celulas individuales. La presencia de linfocitos T, linfocitos B, neutrofilos, granulocitos y granulocitos eosinofilos en la suspension de celulas unicas se determina mediante citometria de flujo usando anticuerpos contra CD4, CD8, CD3, CD15, CD19. Ademas, el estado de activacion de la mucosa que invade las celulas inmunitarias se investiga mediante el uso de anticuerpos contra marcadores de activacion, tales como CD69, CD62 L, CD25, CD27, HLA-DR, CD44 y CD66b. En principio, el estado inflamatorio de cada paciente individual es unico en terminos del grado de activacion y el tipo de invasion de celulas, y de los parametros que varian con la gravedad de la enfermedad y con los medicamentos administrados. Basandose en el resultado de esta investigation se usa una columna de leucaferesis para la eliminacion dirigida de la poblacion de celulas dominantes causantes de la inflamacion. Para la eliminacion de los anticuerpos se usan linfocitos T B activados que reconocen el marcador de activacion CD69 acoplado a un soporte solido. Para la eliminacion de los neutrofilos granulocitos activados se usan anticuerpos contra la molecula de anclaje intestinal o contra CD66b; una columna cargada con un soporte sobre el

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que se inmoviliza un anticuerpo frente a la integrina a4 p7 eliminara los leucocitos de este tipo. Por tanto, las celulas sangurneas en la circulation periferica activadas en los ganglios linfaticos que drenan el sitio intestinal inflamatorio en ruta hacia la mucosa intestinal para proporcionar inflamacion local adicional seran eliminadas mediante dicha leucaferesis basada en anticuerpos de la sangre periferica. Esto amortiguara o incluso inhibira el reclutamiento adicional de celulas T autorreactivas intestinales.

De acuerdo con la presente invention, se divulga una columna de leucaferesis de acuerdo con las presentes reivindicaciones cargadas con un soporte solido adecuado de una relation grande entre la superficie y el volumen, cuya superficie transporta anticuerpos capaces de unirse a leucocitos activados que circulan en la sangre periferica, seleccionandose los leucocitos activados de entre linfocitos T y granulocitos neutrofilos. Pasar la sangre periferica de un paciente que sufre inflamacion por EII a traves de la columna hara que los leucocitos activados se acoplen a los anticuerpos y, por lo tanto, los eliminen de la circulacion. Mediante mecanismos homeostaticos, el agotamiento de los leucocitos activados en la sangre periferica circulante da lugar a una disminucion del numero de leucocitos activados en trafico hacia el intestino y, por lo tanto, una reduction del numero de leucocitos activados en el intestino. En esta aplicacion, el termino "anticuerpo" comprende anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales, y fragmentos o modificaciones de los mismos que retienen la capacidad de union a antigeno/anticuerpo del anticuerpo correspondiente, incluyendo anticuerpos recombinantes alterados y fragmentos de union a antigeno de los mismos.

Este tipo de leucaferesis "a medida" es capaz de clasificar los leucocitos activados especificamente hacia las celulas de la mucosa intestinal, de modo que se elimina un factor importante en el proceso inflamatorio y se invierte la colitis fulminante. En pacientes con enfermedad de Crohn se aplica el mismo principio, pero los leucocitos; en este caso, los leucocitos se activan hacia el antigeno o antigenos localizados en zonas mas profundas en la pared intestinal. Mediante la identification de los antigenos que causan la inflamacion, es posible seleccionar antigenos para su presentation en un estado inmovilizado sobre un soporte solido a los leucocitos que pasan a traves de la columna, y se unen a los leucocitos activados de esta manera.

Basandose en el tipo y grado de la activation inflamatoria en el intestino, la columna de leucaferesis se usa para la elimination dirigida de la poblacion de celulas dominantes causantes de la inflamacion. Es particularmente preferente la depletion de los linfocitos T activados en sangre periferica.

Se prefiere la eliminacion de los linfocitos T activados de la sangre periferica de un paciente con EII poniendolos en contacto con anticuerpos contra CD69 o anticuerpos contra integrina a4p7; estos anticuerpos pueden usarse solos o en combination. Los granulocitos neutrofilos activados pueden eliminarse de una manera correspondiente poniendolos en contacto con anticuerpos contra CD66b.

Los granulocitos neutrofilos activados y los granulocitos eosinofilos tambien se pueden identificar en la sangre periferica de un paciente con EII.

La eliminacion de los leucocitos T activados y/o los granulocitos neutrofilos activados se puede lograr mediante el uso de una columna que comprenda mas de dos o mas tipos de anticuerpos sobre el soporte solido. Preferentemente, se usa un soporte separado para cada anticuerpo.

Los soportes separados, cada uno con un anticuerpo diferente o anticuerpos diferentes, pueden estar dispuestos en un numero correspondiente de columnas separadas. Se prefiere que las columnas se acoplen en linea.

Como se describe en el presente documento, se pueden combinar varias biopsias obtenidas mediante colonoscopia de un paciente con EII tratadas mecanicamente para formar una suspension de celulas individuales y se analizaron por citometria de flujo para identificar la presencia de leucocitos activados seleccionados de linfocitos T, granulocitos neutrofilos y granulocitos eosinofilos, opcionalmente linfocitos B activados, mediante su exposition a anticuerpos especificos, en particular anticuerpos contra CD4, CD8, CD3, CD 15 y CD19.

Como se describe en el presente documento, el estado de activacion de las celulas inmunitarias que invaden la mucosa obtenidas de un paciente con EII mediante colonoscopia se puede determinar mediante la exposicion de las celulas inmunitarias invasoras a anticuerpos contra marcadores de activacion tales como CD69, CD62 L, CD25, CD27, HLA-DR, CD44 y CD66b.

Los linfocitos T con tendencia a migrar a la mucosa de la pared intestinal expresan el receptor a4p7 de la integrina que se une a MAdCAM-1 (molecula 1 de adhesion celular de adresina de la mucosa) expresada en el endotelio. De acuerdo con la presente invencion, tales celulas T invasoras pueden retirarse de la circulacion periferica mediante leucoferesis utilizando una columna que comprende un soporte sobre el que se inmoviliza un anticuerpo para el receptor de la integrina a4p7.

Por lo tanto, se puede someter a un paciente con EII, en el que las biopsias analizadas mediante citometria de flujo indican inflamacion activa, a leucoferesis basada en anticuerpos disenada para eliminar poblaciones celulares especificas responsables de la inflamacion intestinal local. Un acceso intravenoso se introduce en, por ejemplo, las

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venas antecubital acopladas a tubos heparinizados que se conectan a una bomba peristaltica que bombea aproximadamente 30 ml de sangre por minuto. La sangre pasa a traves de la columna de la leucaferesis de anticuerpos disenada y el tubo se vuelve a introducir en, por ejemplo, la vena antecubital contralateral. Por ejemplo, se somete al paciente a 60 minutos de leucaferesis, que eliminara las celulas activadas de aproximadamente la mitad o poco menos de la mitad del volumen de sangre (60 x 20 ml = 1800 ml). Con independencia del volumen de sangre eliminado en una leucaferesis, el tratamiento se repite durante 3-5 veces en el plazo de 1 a 3 semanas, a fin de eliminar las celulas inmunitarias activadas en el intestino transportadas por la sangre recien aparecidas. A continuacion, se puede seguir el resultado mediante investigacion adicional de las celulas individuales de biopsias intestinales mediante citometria de flujo como se ha descrito anteriormente.

En el presente documento se describe un metodo de tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) que comprende: (a) proporcionar una muestra de biopsia intestinal obtenida de tejido inflamado de un paciente; (b) tratar mecanicamente la muestra para obtener una suspension de celulas; (c) identificar marcadores de la superficie celular de leucocitos activados seleccionados de linfocitos T, granulocitos neutrofilos y granulocitos eosinofilos en la suspension; (d) producir anticuerpos contra los leucocitos activados; (e) inmovilizar los anticuerpos contra los leucocitos activados en un soporte comun o sobre soportes separados; (f) proporcionar una columna cargada con el soporte o soportes; (g) desviar una porcion de la sangre periferica del paciente para hacerla pasar a traves de la columna antes de volver a infundir al paciente para que dichos leucocitos activados se acoplen con los anticuerpos sobre el soporte o soportes, de modo que se eliminan de la circulacion sanguinea. Se prefiere que los soportes que llevan anticuerpos contra los leucocitos T activados y contra los granulocitos neutrofilos activados y/o los granulocitos eosinofilos activados se proporcionen en columnas separadas, que pueden acoplarse en linea o en paralelo. Tambien se prefiere que el metodo recurra a una unica columna cargada con soportes separados en los que se han inmovilizado anticuerpos contra dos o mas de linfocitos T activados, granulocitos neutrofilos activados y granulocitos eosinofilos activados, linfocitos B activados opcionalmente, respectivamente. Preferentemente, la columna de la invention tiene un volumen vacio de 20 a 100 ml, en particular de 30 a 50 ml, pero tambien es factible otro volumen mas grande, tal como hasta 500 ml. Cuando se usan columnas de un volumen mas grande es importante vaciarlos de sangre al final del tratamiento para mantener al minimo la perdida de sangre. Esto se puede realizar mediante su lavado con, por ejemplo, solution salina hasta que el medio de lavado haya desplazado la mayor parte de la sangre en la columna o esencialmente toda. Las superficies de la columna y los tubos que entran en contacto con la sangre deben ser de un tipo con el fin de evitar la coagulation; por lo tanto, se prefiere usar columnas y tubos con superficies heparinizadas. Los metodos para proporcionar o modificar las superficies que no activan el sistema de coagulacion son bien conocidos en la tecnica. Normalmente, de un tercio a dos tercios del volumen de la sangre del paciente, preferentemente de aproximadamente la mitad de su volumen de sangre o ligeramente menos, se hace pasar por la columna en un solo tratamiento. Por lo general, un solo tratamiento no sera suficiente para obtener la remision o la libertad a largo plazo o la supresion sustancial de los sintomas. Por tanto, el tratamiento se repite, preferentemente, de dos o tres a cinco veces y mas en un plazo de una a tres semanas desde el tratamiento inicial. La muestra de la biopsia intestinal es una de varias de tales muestras obtenidas del paciente y en las que las muestras se combinan antes del tratamiento mecanico para proporcionar una suspension celular. Son particularmente utiles en el metodo de la invencion los anticuerpos contra CD69 o el anticuerpo contra la integrina a4p7 con respecto a los linfocitos T activados en la circulacion periferica, anticuerpos que tambien se prefieren para la inmovilizacion del soporte de la invencion. La presencia de linfocitos T activados en la mucosa intestinal se detecta de forma ventajosa mediante la exposition de la suspension celular o celulas aisladas de la suspension a anticuerpos especificos contra uno o mas de los marcadores de activation CD69, CD62 L, CD25, CD27, HLA-DR, CD44, CD66b.

"Producir anticuerpos" incluye la obtencion de tales anticuerpos a partir de fuentes comerciales o de otro tipo.

La invencion se describira a continuacion con mas detalle con referencia a realizaciones preferentes de la misma ilustradas en un dibujo.

Breve descripcion de las figuras

Las figuras 1 - 4 muestran la expresion de marcadores de actividad sobre celulas T CD4+ y granulocitos

neutrofilos de sangre periferica y de la mucosa intestinal;

Las figuras 5 - 9 muestran los efectos de la separation de las celulas T CD4+ activadas de sangre periferica y los

granulocitos neutrofilos en columnas MACS (clasificacion de celulas activada magneticamente);

La figura 10 muestra una columna de la invencion acoplada con la circulacion de un paciente.

Descripcion de las realizaciones preferentes

Materiales y metodos

Obtencion y preparacion de muestras. Durante la colonoscopia de un paciente de EII con colitis ulcerosa fulminante se obtuvieron muestras de biopsia, se transfirieron inmediatamente a tubos llenos de solucion salina fisiologica y se procesaron despues en una hora. Se obtuvieron suspensiones celulares individuales usando un homogeneizador de vidrio adaptado holgadamente. Despues, las celulas se lavaron dos veces con un tampon de clasificacion de celulas

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activada por fluorescencia (FACS) que contiene 0,05 % de NaN3, 0,1 % de seroalbumina bovina (BSA) y 0,4 % de citrato trisodico dihidrato en PBS.

La sangre periferica heparinizada de un mismo individuo se hemolizo con un 0,83 % en peso de cloruro de amonio acuoso y se lavo dos veces en el tampon de FACS para obtener una suspension de leucocitos.

Las suspensiones de celulas se incubaron por separado con anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromo durante 30 minutos a temperatura ambiente en oscuridad. Despues de un lavado final, se suspendieron las celulas en 500 |jl del tampon de FACS y se analizaron.

Anticuerpos. Se usaron AcMo de raton anti-humanos conjugados con isotiocianato de fluoresceina (FITC), ficoeritrina (PE), o proteina clorofila peridinina (PerCP) para todos los antigenos (CD4, CD69, CD66b). Tambien se realizo marcaje de control de isotipo equivalente utilizando IgM k e IgG2bK de raton anti-humanas conjugadas con fluorocromo como controles para la tincion no especifica. Todos los anticuerpos utilizados para la citometria de flujo se adquirieron en Becton Dickinson (BD) Biosciences/Pharmingen, San Diego, EE.Uu. Las anti-microperlas conjugadas con FITC (particulas supramagneticas de tamano nano acopladas a anticuerpos especificos) se adquirieron en Miltenyi Biotech, GmbH, Alemania.

Ensayo de citometria de flujo. El ensayo de citometria de flujo se realizo en un citometro de dos laser FACS Calibur (BD Immunocytometry systems, San Jose, CA, EE.UU.). Se contaron diez mil celulas y se analizaron en cada muestra. Para el analisis de los datos, se utilizo el software Cell Quest Pro de Becton Dickinson.

Columna de leucaferesis. Un acceso por via intravenosa en forma de una primera canula 1 se introduce en la vena antecubital 8. La primera canula 1 esta acoplada a un primer tubo heparinizado 2 en el que funciona una bomba peristaltica 3, bombeando aproximadamente 30 ml de sangre por minuto. En su otro extremo el primer tubo heparinizado 2 se conecta a un extremo de una columna de leucaferesis 4 que tiene un volumen de 50 ml rellenos de un soporte solido granular 5 tal como Sepharose® en el que se inmoviliza un anticuerpo producido contra los leucocitos T activados cosechados de un paciente. El soporte solido 5 con el anticuerpo inmovilizado se mantiene en su lugar mediante los cuerpos del primero y el segundo filtro 10, 11. El otro extremo de la columna de leucaferesis 4 esta conectado a un segundo tubo heparinizado 6 que esta acoplado a una segunda canula 7 en su otro extremo. La segunda canula 7 se introduce en la vena antecubital contralateral 9. La sangre venosa que se ha hecho que fluya desde la vena antecubital 8 a la vena antecubital contralateral 9 de este modo se hace pasar a traves de la columna 4, en la que los linfocitos T activados se acoplan al anticuerpo sobre el soporte 5 y son retenidos en la columna. Normalmente, una sesion de leucaferesis es una de 60 minutos, que eliminara las celulas activadas a partir de aproximadamente la mitad o poco menos de la mitad del volumen de sangre (en funcion del peso corporal de la persona; 60 x 20 ml = 1800 ml). El tratamiento se repite, por ejemplo, 3-5 veces en un plazo de1 a 3 semanas para eliminar las celulas inmunitarias activadas en el intestino transportadas por la sangre. A continuacion, se puede seguir el resultado mediante investigacion adicional de las celulas individuales de biopsias intestinales mediante citometria de flujo como se ha descrito anteriormente. De un modo correspondiente se realiza la aferesis de los neutrofilos activados y/o los eosinofilos activados. Otros metodos para la union de anticuerpos a soportes solidos en la cromatografia de afinidad utiles en la invention se describen en Nisevitch M y Firer, MA, J Biochem Biophys Methods 49 (2001) 467-480.

Ejemplo 1

Separacion por MACS. Dos ml de sangre periferica heparinizada de un donante sano se estimulo con SEB (4 jg/ml) y el anticuerpo monoclonal anti-CD28 (10 jg/ml) durante 2 horas a 37 °C para obtener celulas T y granulocitos neutrofilos activados. Con el fin de obtener una poblacion mixta de celulas activadas y en reposo, posteriormente se anadieron 2 ml de sangre no estimulada. Los leucocitos se fijaron y los eritrocitos se eliminaron mediante lisis hipotonica. Los leucocitos se lavaron y se incubaron con anti-CD69 o CD66b conjugados con FITC. Despues de 10 minutos de incubation a 4 °C en oscuridad, las celulas se lavaron y se incubaron durante otros 15 minutos con microperlas anti-FITC. Las celulas se separaron en una columna MACS; se recogieron las fracciones tanto negativas como positivas en diferentes tubos. Finalmente, las celulas se lavaron y se analizaron mediante FACS.

Ejemplo 2

Los pacientes con EII tienen celulas T CD4+ en sangre periferica y en el intestino. Los inventores investigaron suspensiones de celulas individuales de biopsias de sangre y de colon intestinal de 10 pacientes con Mb Crohn y 12 pacientes con colitis ulcerosa. Los pacientes con EII presentan celulas T CD4+ en sangre periferica con un fenotipo activado, ya que se encontraron celulas T colaboradoras que expresaban el marcador de activation muy temprano (Figura 1). En las biopsias de colon de pacientes con EII, la mayoria de las celulas T CD4+ expresan el marcador de activacion CD69 como un signo de respuesta inflamatoria de celulas T acumulado en la pared intestinal del colon responsable de la destruction autoinmune del colon (Figura 2). Las celulas T activadas que se encuentran en la sangre periferica son, probablemente, celulas T que se han activado en un ganglio linfatico intestinal procedente del segmento de colon inflamatorio y estas celulas estan en la ruta de la inflamacion, una poblacion de celulas que se debe eliminar.

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Ejemplo3

Los pacientes con EII tienen granulocitos neutrofilos activados en sangre periferica y en el intestino. Los granulocitos neutrofilos son una parte del sistema inmunologico innato y participan en la activacion y el mantenimiento de la inflamacion local. En la sangre periferica de pacientes con EII, la mayoria de los granulocitos neutrofilos expresan cantidades bajas de CD66b, sin embargo, una fraccion de los granulocitos neutrofilos expresan cantidades altas de CD66b que indican un fenotipo activado (Figura 3). Una parte sustancial de los granulocitos neutrofilos de biopsias de colon de pacientes con EII activa son CD66bHi (Figura 4), lo que demuestra una activacion del sistema inmunologico innato probablemente implicada en el desencadenamiento de la inflamacion intestinal.

Ejemplo4

Los linfocitos T CD4+ activados se pueden eliminar de la sangre periferica. Se puede lograr la eliminacion de los linfocitos T activados que expresan el marcador de activacion CD69 de sangre periferica (Figura 5), las celulas que estan en la ruta a la mucosa de colon inflamada, mediante el uso de anticuerpos especificos y una columna. Una suspension acuosa de linfocitos T marcados con el marcador de activacion CD69 se hizo pasar a traves de una columna cargada con un anticuerpo secundario conjugado a perlas magneticas anti-FIT. Los linfocitos T no activados se separaron con exito y enriquecieron en el eluato de la columna, que muestra que la mayoria de las celulas CD69+ se puede eliminar de la sangre periferica (Figura 6).

Ejemplo5

Eliminacion de granulocitos neutrofilos activados de la sangre periferica. Los granulocitos neutrofilos activados identificados por su expresion de niveles altos del marcador de superficie celular CD66b (Figura 7) se incubaron con un anticuerpo secundario conjugado con perlas magneticas anti-FITC y se sometieron a purification en columna. La mayoria de los neutrofilos activados que expresan cantidades de intermedias a altas del marcador de activacion CD66b quedaron atrapados en la columna y, por tanto, se eliminaron de la sangre periferica (Figura 8).

Ejemplo6

Ejemplo de tratamiento de un paciente con EII. Un paciente con EII se somete a una colonoscopia. Se toman varias biopsias. Se preparo una suspension de celulas individuales a partir de las biopsias combinadas. Los leucocitos activados, es decir linfocitos T, linfocitos B, granulocitos neutrofilos y granulocitos eosinofilos, en la suspension de celulas individuales se identifican mediante citometria de flujo usando anticuerpos contra, por ejemplo, CD4, CD8, CD3, CD15, CD19. Ademas, el estado de activacion de la mucosa que invade las celulas inmunitarias se determina mediante el uso de anticuerpos contra marcadores de activacion, tales como, por ejemplo, CD69, CD62 L, CD25, CD27, HLA-DR, CD44 y CD66b.

Se prepara una columna de leucaferesis que comprende anticuerpos contra los leucocitos y las celulas inmunitarias que invaden la mucosa que se encuentran activadas. El volumen de la columna puede variarse dentro de amplios limites, pero, por razones de economia y para mantener al minimo la perdida de sangre se prefiere un volumen de aproximadamente 30 - 50 ml. Los anticuerpos se inmovilizan sobre un soporte adecuado, tal como Sepharose®, por cualquier tecnica para acoplar covalentemente los anticuerpos a un soporte solido. Por ejemplo, en un paciente en particular se usan anticuerpos contra el marcador de activacion CD69 para la eliminacion de las celulas T activadas y anticuerpos contra el anclaje al intestino o contra CD66b para la eliminacion de los granulocitos neutrofilos activados o contra el anticuerpo frente a CD9 para la eliminacion de los granulocitos eosinofilos activados. La columna se puede proporcionar precargada con un soporte sobre el que se inmovilizan uno o varios anticuerpos o se prepara de forma individual, tal como mediante una estrategia de inmovilizacion no covalente usando, por ejemplo, un soporte que contiene proteina A o estreptavidina que se unira al dominio Fc del anticuerpo o un anticuerpo biotinilado, respectivamente. La columna de leucaferesis ya preparada o preparada individualmente esta acoplado a la circulation periferica del paciente de forma similar a un rinon artificial durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que pasen a su traves varios volumenes de sangre, preferentemente de aproximadamente tres a aproximadamente cinco volumenes de sangre.

Ejemplo 7

Columnas de leucaferesis para atrapar una poblacion celular espeafica o una combinacion de poblaciones de celulas espeaficas. Una columna que comprende un soporte cargado con un anticuerpo frente a integrina ~ a4p7 elimina las celulas T que expresan la molecula de anclaje intestinal (Figura 9), por tanto, las celulas sanguineas perifericas activadas en los ganglios linfaticos que drenan el sitio inflamado del intestino en la ruta a la mucosa intestinal y causan inflamacion local adicional seran eliminadas en el procedimiento de la leucoferesis basada en anticuerpos. La carga de la columna con un soporte que lleva un anticuerpo contra CD69 eliminara los linfocitos T y B activados de la corriente sanguinea, de modo que se inhibe el reclutamiento adicional de las celulas T autorreactivas intestinales. De una manera similar, una columna cargada con un soporte que lleva un anticuerpo contra CD66b eliminara los granulocitos neutrofilos activados; para la eliminacion correspondiente de los granulocitos eosinofilos activados se prefiere el anticuerpo CD9. Estos soportes se pueden utilizar uno por uno o en

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combinacion, tal como en columnas acopladas en paralelo o consecutivamente, conteniendo cada una un tipo de soporte o una sola columna que contiene varios tipos de soporte, tales como, por ejemplo, uno que lleva CD69 y otro que lleva CD66b. Para optimizar la eliminacion de las celulas T en una columna de un tamano dado y un soporte solido se pueden variar la densidad del anticuerpo sobre la superficie de soporte, la afinidad de los anticuerpos, el caudal de la sangre que pasa a traves de la columna, etc.

Por lo tanto, se somete a un paciente con EII, en el que las biopsias analizadas mediante citometria de flujo indican inflamacion activa a leucoferesis basada en anticuerpos disenada para eliminar poblaciones celulares especificas responsables de la inflamacion intestinal local. Un acceso intravenoso se introduce en, por ejemplo, las venas antecubital acopladas a tubos heparinizados afectados por una bomba peristaltica que bombea aproximadamente 30 ml de sangre por minuto. Se hace pasar la sangre a traves de la columna de la leucaferesis de la invencion y el tubo se vuelve a introducir en, por ejemplo, la vena antecubital contralateral. Se somete al paciente a 60 minutos de leucaferesis, que eliminara las celulas activadas de aproximadamente la mitad del volumen de sangre (60 x 20 ml = 1800 ml). El tratamiento se repite 3-5 veces en un plazo del a 3 semanas para eliminar las celulas inmunitarias activadas en el intestino transportadas por la sangre. A continuacion, se puede seguir el resultado mediante investigacion adicional de las celulas individuales de biopsias intestinales mediante citometria de flujo como se ha descrito anteriormente.

Leyendas de las figuras

Figura 1 La expresion del marcador de actividad CD69 ES relativamente baja en los linfocitos T CD4+ de sangre periferica (expresado por el 3,8 % de las celulas T CD4+, con una intensidad media de fluorescencia (IMF) 20,0).

Figura 2 Los linfocitos T CD4+ de la mucosa del colon tienen un aumento de la expresion de CD69 (72,8 %, IMF 33,5).

Figura 3 La mayoria de los granulocitos neutrofilos de sangre periferica expresa cantidades bajas de CD66b;

pero el 11,5 % tiene un aumento de la expresion, lo que indica activacion celular. El IMF de las celulas en la puerta M1 es 104,3.

Figura 4 Los granulocitos neutrofilos de la mucosa del colon tienen un IMF mas alto de CD66b (629,7 en la puerta M1) y una mayor proporcion de granulocitos neutrofilos activados.

Figura 5 Linfocitos T CD4+ antes de la separation de las celulas positivas para CD69: el 5,9 % de las celulas expresan CD69.

Figura 6 Linfocitos T CD4+ despues de la separacion de las celulas positivas para CD69: la fraction positiva consiste en un 61,6 % de celulas T CD4+ positivas para CD69.

Figura 7 Granulocitos neutrofilos antes de la separacion de las celulas positivas para CD66b: el 42,7 % de las

celulas tiene una expresion de intermedia a alta de CD66b.

Figura 8 Granulocitos neutrofilos despues de la separacion de las celulas positivas para CD66b: el 86,6 % de

los neutrofilos en la fraccion positiva tiene una expresion de intermedia a alta de CD66b.

Figura 9 Linfocitos T CD4+ antes y despues de la separacion de celulas positivas para integrina a4p7: el 37,4

% de las celulas tiene una expresion de intermedia a alta de la integrina a4p7 antes de MACS y el 92,9 % despues de MACS.

Claims (9)

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   REIVINDICACIONES

   1. Una columna de leucaferesis cargada con un soporte sobre el que se inmovilizan anticuerpos contra marcadores de superficie celular de leucocitos activados seleccionados de linfocitos T y granulocitos neutrofilos,

   en la que dichos anticuerpos contra linfocitos T activados se seleccionan de anticuerpos contra CD69 y a4p7 integrina, y/o

   en la que dichos anticuerpos contra granulocitos neutrofilos activados se seleccionan de anticuerpos contra CD66b.
2. 2. La columna de la reivindicacion 1 que tiene un volumen de vacio de 20 cc a 100 cc.
3. 3. La columna de la reivindicacion 1 que tiene un volumen de vacio de 30 cc a 50 cc.
4. 4. La combinacion de dos o mas columnas de leucaferesis de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 acopladas en paralelo o en linea.
5. 5. Un aparato para leucaferesis que comprende la columna de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, una bomba de sangre acoplada en linea con la columna y medios para el acoplamiento de la bomba y la columna al sistema venoso de un paciente.
6. 6. El aparato de la reivindicacion 5, en el que los medios de acoplamiento de la bomba y de la columna al sistema venoso de un paciente comprenden dos canulas.
7. 7. El aparato de las reivindicaciones 5 o 6, en el que la bomba es una bomba peristaltica que trabaja en un tubo flexible conectado a la columna.
8. 8. Un soporte para leucoferesis que comprende inmovilizado sobre el mismo uno o mas anticuerpos producidos contra leucocitos activados seleccionados de linfocitos T y granulocitos neutrofilos, y

   en donde dichos anticuerpos contra linfocitos T activados se seleccionan de anticuerpos contra CD69 y a4p7 integrina, y/o

   en donde dichos anticuerpos contra granulocitos neutrofilos activados se seleccionan de anticuerpos contra CD66b.
9. 9. El soporte de la reivindicacion 8, en el que los leucocitos activados se han aislado de una o varias muestras de biopsia tomadas de tejido intestinal inflamado.