KR20090007642A

KR20090007642A - 염증성 장질환을 치료하기 위한 방법 및 수단

Info

Publication number: KR20090007642A
Application number: KR1020087030219A
Authority: KR
Inventors: 마그너스 소언; 올라 윈크비스트
Original assignee: 아이비디 컬럼 세라피스 인터네셔널 아베
Priority date: 2006-05-12
Filing date: 2007-05-14
Publication date: 2009-01-19
Also published as: JP5266207B2; CN101443041A; EP2021025B1; IL195001A0; AU2007250552B2; SI2021025T1; PL2021025T3; CA2651883A1; PT2021025T; HUE032241T2; EP2021025A1; US8449489B2; LT2021025T; WO2007133147A1; EA016851B1; DK2021025T3; US20090192434A1; CA2651883C; CY1118286T1; ES2603203T3

Abstract

염증성 장질환(IBD)을 치료하는 방법으로서, 환자의 염증 조직으로부터 얻은 장의 생검시료를 제공하는 단계; 세포 현탁액을 얻기 위해 상기 시료를 기계적으로 처리하는 단계; 상기 현탁액 중의 T 림프구, 호중성 과립구 및 호산성 과립구로부터 선택된 활성화된 백혈구의 세포 표면 마커를 확인하는 단계; 상기 활성화된 백혈구에 대해 항체를 생성하는 단계; 상기 활성화된 백혈구에 대한 항체를 공통 지지체 또는 별개의 지지체들 상에 고정화시키는 단계; 상기 지지체가 주입된 컬럼을 제공하는 단계; 환자의 말초 혈액의 일부를 상기 컬럼에 통과시켜 상기 환자에게 재주입하기 전에 상기 활성화된 백혈구가 상기 지지체상의 항체와 커플링되도록 함으로써, 혈류로부터 상기 활성화된 백혈구를 제거하는 단계를 포함하는 염증성 장질환의 치료방법. 이를 위한 컬럼과 지지체 및 상기 방법에 있어서의 상기 컬럼과 지지체의 용도에 대해서도 개시되어 있다.

궤양성 장질환(IBD), 백혈구성분채집술, 활성화된 백혈구, 컬럼, 지지체, 항체 고정화

Description

염증성 장질환을 치료하기 위한 방법 및 수단{METHOD AND MEANS FOR TREATING INFLAMMATORY BOWEL DISEASE}

본 발명은 염증성 장질환 (inflamatory bowel disease: IBD), 특히 궤양성 결장염(ulcerative colitis)및 크론 질환(Crohn's disease)을 치료하기 위한 방법 및 그 치료방법에 사용되는 수단에 관한 것이다.

궤양성 결장염과 크론 질환은 염증성 장질환의 분명한 징후들이다. IBD의 다른 형태들로는 임파구성 결장염과 콜라겐성 결장염이 있다. 전격성(fulminant) 궤양성 결장염 환자들은 현재 높은 도우즈의 스테로이드 처치를 받는다. 항-TNFα를 이용한 3상 임상시험이 현재 진행되고 있다. 이들 약물 모두 염증의 일반적인 억제제(inhibitor)들이다. 이들은 약 50%의 케이스에서는 효과적이지만, 심각한 역효과를 일으킨다. 또한, 환자들 중에는 전격성 결장염이 재발하는 경우도 흔하다. 의학적인 처치에 반응을 보이지 않는 전격성 결장염 환자들에 있어서는, 신속한 외과적 처치가 필수적이다. 궤양성 결장염은 항상 대장(large intestine: colon)에 제한된다. 전격성 결장염에서, 대장이 절제되고, 외부 일레오스토마 (external ileostoma)가 구축된다. 회복 후, 경우에 따라 직장의 잘려진 끝 부분의 염증에 대한 추가적인 의료 처치 후, 회장 직장 연결술 또는 골반 파우치를 이 용한 재건수술이 대부분의 환자들에게서 시행되어 장의 연속성을 회복한다. 이들 모두의 수술 과정에서, 매일 약 6회의 묽은 변이 수반되고, 물과 미네랄의 밸런스의 교란이 일어난다.

크론 질환을 가진 환자들은 보통 소장의 가장 끝부분과 대장의 시작부분(ilecaecal region)에 염증을 가지고 있지만, 염증은 위장관의 어느 부분에라도 위치할 수 있다. 스테로이드와 아자-티오프린(aza-thioprine)과 같은 항염증 약물에 의해 일시적인 진통의 효과는 제공될 수 있다고 해도, 의학적인 처치로는 질병을 치료할 수 없다. 협착 및 누공화된(fustulating) 창자 부분을 절개하는 수술이 약 50%의 환자들에게서 나타나 있고, 그들 중의 절반이 재발현상을 나타내며 추가 수술을 필요로 한다. 그러므로, IBD에 있어서 염증을 특이적으로 가라앉히고 환자에게서 재발병을 방지할 수 있는 방법이 요구된다.

WO2005113037에는 생물학적 유체 시료로부터 선택된 물질을 제거하기 위한 필터 및 방법이 개시되어 있다. 이 필터는 외부 하우징, 입구 및 출구를 포함한다. 복수개의 필터 표면이 외부 하우징 내에 구비되고, 적어도 하나의 코팅이 필터 표면에 입혀진다. 상기 적어도 하나의 코팅은 적어도 2개의 결합 모듈을 포함하며, 이 결합 모듈은 다시 선택적으로 서로 결합된다. 하나의 결합 모듈이 선택적으로 필터 표면에 결합되고, 다른 하나의 결합 모듈이 유체 시료로부터 제거될 선택 물질에 선택적으로 결합하는 구조로 되어 있다. 유체 시료가 입구, 외부 하우징 및 출구를 통해 통과할 수 있게 됨에 따라, 선택된 물질은 코팅을 통해 필터 표면에 선택적으로 결합된다. 유체 시료는 혈액 시료이다. 하나의 선택된 유체 성분은 백혈구, 과립구 및 림프구로부터 선택된 혈액 성분이다.

혈액으로부터 백혈구를 분리하기 위한 필터 매질과 장치는 예를 들어 JP2003265596; US5885457; JP04187206; US4936993; JP03000074; JP02167071; JP02009823; 및 JP10057477에 기재되어 있다.

본 발명의 목적은 IBD, 특히 궤양성 결장염 및 크론 질환을 치료하기 위한 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 이용되는 수단을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적들은 후술하는 발명의 상세한 설명, 도면에 도시된 바람직한 실시에 및 특허청구범위로부터 명백해질 것이다.

IBD의 염증 프로세스에서 T-세포가 백혈구와 상호작용한다. 어떤 보조인자(cofactor)에 의해 자극을 받게 되면, 백혈구로부터 유해제(noxious agent)가 방출된다. 이러한 유해제는 장 세포를 손상시킨다. 활성 IBD를 가진 환자들에 대한 장의 생검으로부터 얻은 물질에 대해 흐름세포측정법(flow cytometry)을 실시한 결과, 본 발명자들은 활성화된 T 림프구 및 활성화된 호중성 및 호산성 과립구의 백혈구 세포 표면 마커들을 확인했는데, 이 세포들은 순환하는 말초 혈액에도 존재하지만 염증 부위에서 많아진다.

본 발명은 전술한 활성화된 세포들이 IBD에서 염증의 개시와 유지에 관여하며, 순환계에서 이들을 제거하면 그러한 염증을 감소 및 심지어 제거한다는 가설을 토대로 한다. 이러한 개념은, 개별 환자의 염증 상태는 백혈구 활성화의 정도, 침입하는 T 세표의 종류 및 상대적인 비율과, 환자 개인의 특성과 질병의 심각한 정도 및 환자에게 투여되는 약물에 의해 달라질 수 있는 파라미터에 따라 독특하게 나타난다는 생각을 포함한다. 본 발명은 면(cotton)과 그 외 폴리머 섬유와 같은, 당해 기술분야에서 알려져 있는 불특정의 백혈구 흡착제의 사용에 의존하지 않는다. 본 발명의 명세서에 있어서, IBD는 우선적으로 크론 질환 및 궤양성 결장염을 포함하지만, 내시경상으로는 정상이지만 장 점막 하부에 콜라겐의 조직병리학적 축적 및 물설사를 특징으로 하는 콜라겐성 결장염, 및 장점막에 다량의 림프구의 존재 및 설사를 특징으로 하는 림프구성 결장염도 포함한다.

본 발명에 따르면, IBD 환자는 결장 검사를 받는다. 질병 부위의 장 조직의 생검을 하나 이상 취한다. 단일의 또는 조합된 생검 물질로부터, 단일 세포 (single cell) 현탁액을 준비한다. 단일 세포 현탁액에 대해, T 림프구, B 림프구, 호중성 과립구, 호산성 과립구의 존재를 CD4, CD8, CD3, CD15, CD19에 대한 항체를 이용하여 흐름세포분석법에 의해 측정한다. 또한, 점막 침입 면역 세포(mucosa invading immune cell)의 활성화 상태는 CD69, CD62 L, CD25, CD27, HLA-DR, CD44 및 CD66b와 같은 활성화 마커에 대한 항체를 이용하여 조사한다. 원칙적으로, 개별 환자의 염증 상태는 활성화 정도, 세포 침입의 형태 및 질병의 심각도 및 투여 약물에 따라 달라지는 파라미터에 따라 독특하다. 이러한 조사의 결과를 토대로, 염증을 일으키는 주 세포집단의 표적화된 제거를 위해 백혈구성분채집 컬럼(leukapheresis column)이 이용된다. 활성화된 T 림프구와 B 림프구를 제거하기 위해, 고체 지지체에 커플링된 활성화 마커 CD69을 인지하는 항체를 이용한다. 활성화된 호중성 과립구를 제거하기 위해, 거트 호밍 분자(gut homing molecule) 또는 CD66b에 대한 항체를 이용한다; 인테그린 α4β7 항체가 고정화되어 있는 컬럼이 이러한 종류의 림프구를 제거할 것이다. 그러므로, 염증성 장 부위를 장 점막으로 전이시켜 추가적인 국부 염증을 생성하는 림프절에서 활성화된 말초 순환계의 혈액 세포는, 말초 혈액에 대한 상기 항체 베이스의 백혈구성분채집술에 의해 제거될 것이다. 이것은 거트 자가반응 T 세포의 추가적인 소집을 약화시키거나 또는 억제할 것이다.

본 발명에 따르면, 부피에 대한 표면적의 비가 큰 적합한 고체 지지체가 주입된 백혈구성분채집 컬럼이 개시되는데, 그 표면에는 말초 혈액 중의 순환하는 활성화된 백혈구와 결합가능한 항체가 존재하고, 활성화된 백혈구는 T 림프구, 호중성 과립구 및 호산성 과립구 중에서 선택된다. IBD 염증으로 고통을 받는 환자의 말초 혈액을 상기 컬럼에 통과시키면, 활성화된 백혈구가 상기 항체와 결합하게 되고, 따라서 활성화된 백혈구가 순환계에서 제거된다. 항상성 메카니즘 (homeostatic mechanism)에 의해, 순환하는 말초 혈액에서의 활성화된 백혈구의 고갈은 장으로 가는 활성화된 백혈구의 수의 감소를 초래하고, 따라서 장에서의 활성화된 백혈구의 수의 감소를 초래한다. 본 명세서에 있어서, "항체"란 용어는 항체들, 특히 모노클로날 항체, 대응하는 항체의 항원/항체 결합능력을 보유한 항체의 단편 또는 변형체로서 변형된 재조합 항체(recombinant altered antibody) 및 그것의 항원 결합 단편을 포함한다.

이러한 형태의 "맞춤형" 백혈구성분채집술은 장의 점막 세포쪽으로 특이적으로 활성화되는, 활성화된 백혈구를 분리해 낼 수 있어서, 염증화 프로세스에서 중요한 인자를 제거하고 전격성 결장염을 약화시킨다. 크론 질환을 앓고 있는 환자들의 경우에도, 백혈구를 제외하고는 비슷한 원리가 적용되는데, 이 경우에, 장 벽의 깊은 곳에 위치한 항원쪽으로 백혈구가 활성화된다. 염증을 야기하는 항원을 확인함으로써, 고체 지지체에 고정화된 상태로 컬럼을 통과하는 백혈구에 제시하기 위한 항원의 선택과, 이러한 방식으로 활성화된 백혈구와의 결합이 가능하다.

장의 형태와 염증 활성화도에 따라, 염증을 일으키는 주 세포집단의 표적화된 제거를 위해 백혈구성분채집 컬럼이 이용된다. 말초 혈액 중의 활성화된 T 림프구의 고갈이 특히 바람직하다.

IBD 환자의 말초 혈액을 CD69 또는 인테그린 α4β7에 대한 항체와 접촉시킴으로써 상기 말초 혈액으로부터 T 림프구를 제거하는 것이 바람직하다; 이들 항체들은 단독으로 또는 조합된 형태로 이용가능하다. 활성화된 호중성 과립구 및 호산성 과립구는 각각 CD66b 및 CD9에 대한 항체와의 접촉에 의해 마찬가지 방식으로 제거될 수 있다.

본 발명에 따르면, 그러한 활성화된 호중성 과립구 및 호산성 과립구는 IBD 환자의 말초 혈액에서 확인될 수도 있다.

본 발명의 제1면에 따르면 활성화된 T 백혈구 및/또는 활성화된 호중성 과립구 및/또는 활성화된 호산성 과립구의 제거는 고체 지지체 상에 2종 이상의 항체를 포함하는 컬럼을 이용함으로써 달성된다. 바람직하기로는, 각각의 항체에 대해 별개의 지지체를 이용한다.

본 발명의 제2면에 따르면, 상이한 항체 또는 상이한 항체들을 가진 별개의 지지체를 상응하는 수의 별개의 컬럼에 위치시킨다. 컬럼들이 일렬로 커플링되는 것이 바람직하다.

본 발명의 제3면에 따르면, 결장검사에 의해 IBD 환자로부터 얻은 여러개의 생검을 결합하고 기계적으로 처리하여 단일 세포 현탁액을 형성한 다음 흐름세포측정법에 의해 분석하고, 특이 항체, 특히 CD4, CD8, CD3, CD15 및 CD19에 대한 항체와 같은 특이 항체에 노출시킴으로써 T 림프구, 호중성 과립구, 및 호산성 과립구, 선택적으로는 B 림프구로부터 선택된 활성화된 백혈구의 존재를 확인한다.

본 발명의 제4면에 따르면, 결장검사에 의해 IBD 환자로부터 얻은 점막 침입 면역 세포의 활성화 상태는, 상기 점막 침입 면역 세포를 CD69, CD62, CD25, CD27, HLA-DR, CD33 및CD66b와 같은 활성화 마커에 대한 항체에 노출시킴으로써 측정된다.

장 벽의 점막으로 이동하는 경향이 있는 T 림프구는 내피 상에 발현되는 MAdCAM-1(Mucosal Addrsssin Cell Adhesion Molecule-1)에 결합하는 α4β7 인테그린을 발현한다. 본 발명에 따르면, 그러한 점막 침입 T 세포는 α4β7 인테그린 수용체에 대한 항체가 고정화되어 있는 지지체를 포함하는 컬럼을 이용한 백혈구성분채집술에 의해 말초 순환계로부터 제거될 수 있다.

그러므로, 흐름세포측정법에 의해 조사된 생검이 활성 염증을 나타내는 IBD 환자는 국부적인 장 염증과 관련된 특정 세포 집단을 제거하도록 디자인된 항체 베이스의 백혈구성분채집술(antibody based leudapheresis)의 대상이 될 수 있다. 정맥 액세스(intravenous access)가, 예를 들어 1분당 약 30ml의 혈액을 펌핑하는 연동 펌프(peristaltic pump)에 연결된, 헤파린 처리된 튜브에 커플링된 팔꿈치앞쪽 정맥(antecubital vein)에 도입된다. 상기 디자인된 항체 베이스 백혈구성분채집 컬럼을 혈액이 통과하도록 하고, 상기 튜브가 예를 들어 반대측 팔꿈치앞쪽 정맥에 다시 도입된다. 예를 들어, 환자는 60분간의 백혈구성분채집술을 받는데, 그러면 혈액 용적(60 x 30ml=1800ml)의 대략 절반 또는 절반에 약간 못미치는 양으로부터 활성화된 세포가 제거될 것이다. 1회의 백혈구성분채집술에서 제거되는 혈액 용적과 관계 없이, 혈액에서 새로이 생겨나는 장의 활성화된 면역세포를 제거하기 위해서 상기 처리를 1-3주 이내에 3-5회 반복한다. 그런 다음 장의 생검으로부터의 단일 세포에 대해 전술한 바와 같이 흐름세포측정법에 의해 추가로 조사가 이루어질 수 있다.

본 발명의 특히 바람직한 실시예에 따르면, 염증성 장질환(IBD)을 치료하는 방법이 개시되는데, 이 방법은: (a) 환자의 염증 조직으로부터 얻은 장의 생검시료를 제공하는 단계; (b) 세포 현탁액을 얻기 위해 상기 시료를 기계적으로 처리하는 단계; (c) 상기 현탁액 중의 T 림프구, 호중성 과립구 및 호산성 과립구로부터 선택된 활성화된 백혈구의 세포 표면 마커를 확인하는 단계; (d) 상기 활성화된 백혈구에 대해 항체를 생성하는 단계; (e) 상기 활성화된 백혈구에 대한 항체를 공통 지지체 또는 별개의 지지체들 상에 고정화시키는 단계; (f) 상기 지지체가 주입된 컬럼을 제공하는 단계; (g) 환자의 말초 혈액의 일부를 상기 컬럼에 통과시켜 상기 환자에게 재주입하기 전에 상기 활성화된 백혈구가 상기 지지체상의 항체와 커플링되도록 함으로써, 혈류로부터 상기 활성화된 백혈구를 제거하는 단계를 포함한다. 활성화된 T 백혈구, 활성화된 호중성 과립구 및/또는 활성화된 호산성 과립구에 대한 항체가 지지되는 지지체는 별개의 컬럼들에 제공되는 것이 바람직한데, 상기 별개의 컬럼들은 일렬로 또는 평행한 상태로 커플링될 수 있다. 또한, 2종 이상의 활성화된 T 림프구, 활성화된 호중성 과립구 및 활성화된 호산성 과립구, 선택적으로는 활성화된 B 림프구에 대한 항체가 각각 고정화된 별개의 지지체가 주입된 단일 컬럼을 이용하는 것도 바람직하다. 바람직하기로는, 본 발명의 컬럼은 용적(empty volume)이 20-100 ml, 특히 30-30 ml이지만, 이보다 큰 용적으로서 예를 들어 500 ml 정도까지도 이용될 수 있다. 큰 용적의 컬럼이 이용되는 경우에는, 처리과정의 종료시 컬럼으로부터 혈액을 비워내어 혈액 손실을 최소로 유지하는 것이 중요하다. 이는, 컬럼 중의 혈액의 대부분 또는 전부를 예를 들어 생리식염수와 같은 관류액(flushing medium)으로 대체시킬 때까지 컬럼을 관류액으로 관류시킴으로써 달성될 수 있다. 컬럼의 표면과, 혈액과 접촉하게 되는 튜브의 표면은 응고를 방지하기 위해 동일한 종류로 되어 있어야 한다; 그러므로 헤파린 처리된 표면을 가진 컬럼과 튜브를 이용하는 것이 바람직하다. 응고 시스템을 활성화시키지 않는 표면을 제공하거나 변형시키는 방법은 당해 기술분야에서 잘 알려져 있다. 통상적으로는, 1회 처리시 환자의 혈액 용적의 1/3 내지 2/3, 바람직하기로는 약 절반 또는 절반보다 약간 적은 양의 혈액이 컬럼을 통과하도록 한다. 일반적으로, 1회처리로는 증상을 완화시키거나 장기 효과를 기대하거나 또는 증상을 실질적으로 억제시키기에는 불충분할 것이다. 그러므로, 상기 처리는 바람직하기로는 2회 또는 3-5회 또는 그 이상으로 하여 1차 처리후 1-3주 이내에 반복실시한다. 장의 생검 시료는 환자로부터 얻은 여러 개의 그러한 시료 중의 하나이며, 세포 현탁액을 제공하기 위해 기계적인 처리를 하기에 앞서 시료들을 조합한다. 본 발명의 방법에서 특히 유용한 것은 말초 순환계 중의 활성화된 T 림프구와 관련하여, CD69에 대한 항체 또는 인테그린 α4β7 항체이며, 이러한 항체들은 본 발명의 지지체에 고정화되기에 바람직하다. 장의 점막 중에 있어서의 활성화된 T 림프구의 존재는, 세포 현탁액 또는 이 현탁액으로부터 분리된 세포를 하나 또는 그 이상의 활성화 마커 CD69, CD62L CD25, CD27, HLA-DR, CD44, CD66b에 대한 특이적인 항체에 노출시킴으로써 검출된다.

"항체를 생성" 한다는 의미는 전술한 항체를 상업적 공급원 또는 기타 공급원으로부터 입수하는 것을 포함한다.

본 발명은 이하 도면에 도시된 바람직한 실시예를 참조하여 보다 상세히 설명될 것이다.

도1 내지 도4는 말초 혈액과 장의 점막으로부터의 CD4+ T 세포와 호중성 과립구(호중구) 상의 활성화 마커의 발현을 나타낸다.

도5 내지 도9는 MACS(Magnetically Activated Cell Sorting) 컬럼 상에서의 활성화된 말초 혈액 CD4+ T 세포 및 호중성 과립구의 분리 효과를 나타낸다.

도10은 환자의 순환계와 커플링된 본 발명의 컬럼을 나타낸다.

재료 및 방법

시료의 수집 및 제조.

전격성 궤양성 결장염을 앓고 있는 IBD 환자의 결장 검사 과정에서, 생검 시료를 수집한 다음 즉시 생리식염수가 들어 있는 튜브에 옮기고 1 시간 이내에 추가 가공처리했다. 균질화기(loosely fit glass homogeniser)을 이용하여 생검 세포의 단일 세포 현탁액을 얻었다. 이어서, 세포를 형광활성세포분류(Fluorescence activated cell sorting: FACS)용 완충용액으로서, PBS 중의 0.05% NaN₃, 0.1% BSA(bovine serum albumin) 및 0.4% 트리소듐 시트레이트 디하이드레이트를 함유하는 완충용액으로 2회 세척하였다.

동일한 환자로부터의 헤파린 처리된 말초 혈액을 0.83 중량%의 수성 암모늄클로라이드로 용혈시킨 다음 FACS 완충용액으로 2회 세척하여 백혈구 현탁액을 얻었다.

세포 현탁액을 각각 형광색소가 접합된 모노클로날 항체(fluorochrome-conjugated monoclonal antibody)와 함께 실온의 어둠 속에서 30분 동안 배양하였다. 최종 세척 후, 세포를 500 ㎕의 FACS 완충용액에 현탁시킨 다음 분석을 실시했다.

항체.

플루오레신 이소티오시아네이트(FITC), 파이코에리트린(PE) 또는 페리디닌 클로로필 프로테인(PerCP)에 접합된 마우스-항-인간 mAb를 모든 항원(CD4, CD69, CD66b)에 대해 이용하였다. 비-특이적 염색에 대한 대조군으로서 형광색소 접합된 마우스 항-인간 IgMκ 및IG2bκ를 이용하여 아이소토우프-매치형 콘트롤 라벨링(isotope-matched control labelling)도 실시하였다. 흐름세포측정법에 이용된 모든 항체는 벡톤 디킨슨(BD) 바이오사이언시스/파밍겐(San Diego, 미국)으로부터 구입한 것이었다. 항 FITC-접합된 마이크로비즈(특이적 항체와 커플링된 나노크기의 초자성 입자)는 밀테나이 바이오텍사(Miltenyi Biotech, GmbH, 독일)로부터 구입하였다.

흐름세포측정 분석.

흐름세포측정 분석은 2개의 레이저 FACS Calibur Cytometer(BD Immunocytometry system, San Jose, CA, 미국)를 이용하여 실시하였다. 각각의 시료에 대해 10,000개의 세포를 카운트하여 분석하였다. 데이터 분석을 위해, Cell Quest Pro 소프트웨어(벡톤 디킨슨)를 이용하였다.

백혈구성분채집 컬럼.

제1 카뉼라(1) 형태의 정맥 액세스가 팔꿈치앞쪽 정맥(8)에 도입된다. 제1카뉼라(1)는 제1 헤파린 처리된 튜브(2)에 커플링되고, 상기 튜브(2) 상에서 연동 펌프가 작동하여 1분당 약 30ml의 혈액을 펌핑한다. 제1 헤파린 처리된 튜브(2)의 다른 쪽 단부에는 백혈구성분채집 컬럼(4)의 한 쪽 단부가 연결되고, 이 컬럼은 용적이 50 ml이고, 세파로오스(Sepharose®)와 같은 입자상 고체 지지체(5)로 채워져 있으며, 지지체 상에는 환자로부터 수집한 활성화된 T 백혈구에 대해 생성된 항체가 고정화되어 있다. 고정화된 항체가 지지된 고체 지지체(5)는 제1 및 제2 필터 바디(10, 11)에 의해 제 위치에 유지된다. 백혈구성분채집 컬럼의 다른 쪽 단부는 제2 헤파린 처리된 튜브(6)에 연결되고, 이 튜브(6)의 다른 쪽 단부는 제2 카뉼라(7)에 커플링된다. 제2 카뉼라(7)는 반대측의 팔꿈치앞쪽 정맥(9)에 도입된다. 한쪽의 팔꿈치앞쪽 정맥(8)으로부터 반대측의 팔꿈치앞쪽 정맥(9)으로 흐르도록 되어 있는 정맥 혈액은 따라서 컬럼(4)를 통과하게 되고, 컬럼에서 활성화된 T 림프구가 지지체(5) 상의 항체와 커플링되어 컬럼 내에 머무르게 된다. 백혈구성분채집 세션(cession)은 전형적으로 1회 60분이며, 혈액 용적(개인의 체중에 따라 다름; 60 x 30 ml=1800 ml) 의 대략 절반 또는 절반보다 약간 적은 양으로부터 활성화된 세포를 제거할 것이다. 이러한 처리는 예를 들어 1-3주 이내에 3-5회 반복되어 혈액에서 새로이 생겨나는 장의 활성화된 면역 세포를 제거한다. 그런 다음 장의 생검으로부터의 단일 세포에 대해 전술한 바와 같이 흐름세포측정법에 의해 추가로 조사가 이루어질 수 있다. 마찬가지 방법으로, 활성화된 호중구 및/또는 활성화된 호산구에 대해 백혈구성분채집술이 이루어진다. 본 발명에서 유용한 친화력 크로마토그라피법으로 고체 지지체에 항체를 부착하는 방법은 논문(Nisevitch M and Firer, MA, J Biochem Biophys Methods 49 (2001) 467-480)에 기재되어 있으며, 그 내용은 원용에 의해 본 출원에 포함된다.

실시예 1

MACS 분리.

건강한 공여자로부터의 2 ml의 헤파린 처리된 말초 혈액에 대해 SEB(4 ㎍/mL)와 항 CD28 모노클로날 항체(10 ㎍/mL)로 2시간 동안 37℃에서 자극을 가하여 활성화된 T 세포와 호중성 과립구를 얻었다. 활성화 상태와 휴지 상태의 세포의 혼합 집단을 얻기 위해, 2 ml의 비-자극처리된 혈액을 부가하였다. 백혈구를 고정하고, 적혈구를 저장성 용혈(hyptonic lysis)에 의해 제거하였다. 백혈구를 세척한 다음 FITC-접합된 항 CD69 또는 CD66b와 함께 배양하였다. 4℃의 어둠 속에서 10분간 배양한 후, 세포를 세척하고 항-FITC 마이크로비즈와 함께 추가로 15분간 배양하였다. 세포를 MACS 컬럼상에서 분리하여; 음성 및 양성 분획을 별개의 튜브에 수집하였다. 마지막으로 세포를 세척하고 FCS에 의해 분석하였다.

실시예 2

IBD 환자들은 말초 혈액과 장에 활성화된 CD4+ T 세포를 가지고 있다.

Mb 크론 질환을 가진 10명의 환자와 궤양성 결장염을 가진 12명의 환자의 혈액과 장의 결장 생검으로부터의 단일 세포 현탁액을 조사하였다. 매우 초기의 활성화 마커를 발현하는 T 헬퍼 세포가 발견되었기 때문에(도 1), IBD 환자들은 말초 혈액에 활성화된 표현형으로 CD4+ T 세포를 나타낸다. 도 1에서, 활성화 마커 CD69의 발현은 말초 혈액 CD4+ T 림프구에서는 상대적으로 낮다 (3.8%의 CD4+ T 세포에 의해 발현되고, 평균형광강도(mean fluorescence intensity: MFI)는 20.0이다). IBD 환자의 결장 생검에서는, 결장의 자가면역 파괴와 관련하여, 결장의 장 벽에 축적된 염증성 T 세포 반응의 표시(sign)로서 대다수의 CD4+ T 세포가 CD69 활성화 마커를 발현한다 (도 2). 도 2에서, 결장 점막으로부터의 CD4+ T 림프구는 CD60의 증가된 발현을 나타낸다 (72.8%, MFI 33.5). 말초 혈액에서 발견되는 활성화된 T 세포는 염증성 결장 부분을 생성하는 장의 림프절에서 활성화되었던 T 세포 일 것이고, 이러한 세포들은 제거되어야 하는 세포의 집단인 염증으로 전이되는 경로에 있는 것이다.

실시예 3

IBD 환자들은 말초 혈액과 장에 호중성 과립구를 가지고 있다.

호중성 과립구는 선천적인 면역 시스템의 일부이며 국부적인 염증의 활성화와 유지에 관여한다. IBD 환자로부터의 말초 혈액에서 대다수의 호중성 과립구는 적은 양의 CD66b를 발현하지만, 호중성 과립구의 분획은 활성화된 표현형을 나타내는 많은 양의 CD66b를 발현한다 (도 3). 도 3에서, 대부분의 말초 혈액 호중성 과립구는 소량의 CD66b를 발현하지만, 11.5%는 세포 활성화를 의미하는 증가된 발현을 나타내며, 게이트 M1에서 세포의 MFI는 104.3이다. 활성 IBD를 가진 환자의 결장 생검으로부터의 호중성 과립구의 실질적인 부분은 CD66Hi 이며(도 4), 이는 장의 염증의 유발에 관여하는 선천적인 면역 시스템의 활성화를 나타낸다. 도 4에서, 결장 점막으로부터의 호중성 과립구는 높아진 MFI의 CD66b (게이트 M1에서 629,7)와 증가된 비율의 활성화된 호중성 과립구를 나타낸다.

실시예 4

활성화된 CD4+ T 림프구는 말초 혈액으로부터 제거될 수 있다.

염증화된 결장 점막으로 이동하는 도중에 있는 세포인, CD69 활성화 마커를 발현하는 활성화된 T 림프구를 말초 혈액으로부터 제거하는 것은 (도 5), 특이적인 항체와 컬럼을 이용함으로써 달성될 수 있다. 도 5는, CD69-양성 세포의 분리 이전의 CD4+ T 림프구를 나타내며, 5.9%의 세포가 CD69를 발현한다. 활성화 마커 CD69로 라벨링된 T 림프구의 수성 현탁액을, 항-FITC 자성 비드가 접합된 제2 항체가 주입된 컬럼에 통과시켰다. 컬럼에서 성공적으로 분리되고 농축된 비-활성화된 T 림프구가 용출되는데, 이는 대다수의 CD69+ 세포는 말초 혈액으로부터 제거될 수 있다는 것을 보여준다 (도 6). 도 6은, CD69-양성 세포의 분리 이후의 CD4+ T 림프구를 나타내며, 양성 분획은 61.6% CD69-양성 CD4+ T 세포로 구성되어 있다.

실시예 5

말초 혈액으로부터의 활성화된 호중성 과립구의 제거.

높은 수준의 세포 표면 마커 CD66b로 나타나는 (도 7) 그들의 발현에 의해 확인되는 활성화된 호중성 과립구를 항-FITC 자성 비드 접합된 제2 항체와 배양한 다음 컬럼을 이용하여 정제하였다. 도 7는, CD66b-양성 세포의 분리 이전의 호중성 과립구를 나타내며, 42.7%의 세포가 중간 내지 높은 수준의 CD66b 발현을 나타낸다. 중간 내지 다량의 CD66b 활성화 마커를 발현하는 활성화된 호중구의 대다수는 컬럼에 포획됨으로써 말초 혈액으로부터 제거되었다 (도 8). 도 8은, CD66b-양성 세포의 분리 이후의 호중성 과립구를 나타내며, 양성 분획 중의 86.6%의 호중성 과립구가 중간 내지 높은 수준의 CD66b 발현을 나타낸다.

실시예 6

IBD 환자의 치료의 예.

IBD 환자에 대해 결장 검사를 실시한다. 여러 개의 생검을 취한다. 조합된 생검으로부터 단일 세포 현탁액을 준비한다. 단일 세포 현탁액 중의 활성화된 백혈구, 즉 T 림프구, B 림프구, 호중성 과립구 및 호산성 과립구를, 예를 들어 CD4, CD8, CD3, CD15, CD19에 대한 항체를 이용하여 흐름 세포측정법에 의해 확인한다. 또한, 점막 침입 면역 세포의 활성화 상태는 예를 들어 CD69, CD62L, CD25, CD27, HLA-DR, CD44 및 CD66b와 같은 활성화 마커에 대한 항체를 이용하여 측정한다.

활성화되는 것으로 밝혀진 점막 침입 면역 세포와 백혈구에 대한 항체를 포함하는 백혈구성분채집 컬럼을 준비한다. 컬럼의 용적은 넓은 범위 내에서 다양할 수 있지만, 경제적인 이유와 혈액 손실을 최소화시키고자 하는 이유로 약 30-50 ml인 것이 바람직하다. 항체를 적절한 지지체 (예: Sepharose®)에 고정화시키는데 있어서, 고정화방법으로는 항체를 고체 지지체에 공유적으로 커플링시키는 방법들 중 임의의 방법을 이용한다. 예를 들어, 활성화된 T 세포를 제거하기 위해서 활성화 마커 CD69에 대한 항체, 또는 활성화된 호중성 과립구를 제거하기 위해서 거트 호밍 또는 CD66b에 대한 항체, 또는 활성화된 호산성 과립구를 제거하기 위해서 CD9에 대한 항체가 특정 환자에게 이용된다. 하나 또는 여러 개의 항체가 고정화된 지지체를 컬럼에 미리 주입할 수도 있고, 또는 이를 개별적으로 준비할 수도 있는데, 이와 같은 개별적인 준비는 예를 들어 비-공유성 고정화에 의해 이루어지는데, 예를 들어 항체의 Fc 도메인 또는 바이오테닐레이티드 항체(biotenylated antibody)와 각각 결합하는 단백질 A 또는 스트렙타비딘 함유 지지체를 이용한다. 미리 준비된 백혈구성분채집 컬럼 또는 개별적으로 준비된 백혈구성분채집 컬럼은, 인공 신장의 경우에 사용되는 방법과 유사한 방법으로, 몇 배 정도의 용적의 혈액, 바람직하기로는 약 3-5배 정도의 용적의 혈액이 컬럼을 통과하기에 충분한 시간 동안, 환자의 말초순환계에 커플링된다.

실시예 7

특정 세포 집단 또는 특정 세포집단들의 조합을 포획하기 위한 백혈구성분 채집 컬럼.

인테그린 α4β7 항체가 지지된 지지체를 포함하는 컬럼은 거트 호밍 분자를 발현하는 T 세포를 제거하므로 (도 9), 염증이 있는 장 부위를 장 점막으로 전이시켜 추가적인 국부 염증을 일으키는 림프절에서 활성화된 말초 혈액 세포는 항체 베이스의 백혈구성분채집술에 의해 제거될 것이다. 도 9는, α4β7 인테그린 양성 세포의 분리 이전 및 이후의 CD4+ T 림프구를 나타내며, MACS 이전에는 37.4%의 세포가 중간 내지 높은 수준의 α4β7 인테그린의 발현을 나타내며 MACS 이후에는 92.9%의 세포가 나타낸다. CD69에 대한 항체가 지지된 지지체를 컬럼에 주입하면, 혈류로부터 활성화된 T 림프구와 B 림프구를 제거함으로써, 장의 자가반응성 T 세포의 추가적인 소집이 억제될 것이다. 이와 유사한 방식으로 CD66b에 대한 항체가 지지된 지지체가 주입된 컬럼은 활성화된 호중성 과립구를 제거할 것이며; 활성화된 호산성 과립구를 마찬가지 방식으로 제거하기 위해서는 CD9에 대한 항체가 바람직하다. 이러한 지지체들은 하나씩 사용될 수도 있고, 조합된 형태로 사용될 수도 있는데, 예를 들어 평행하게 연결된 컬럼 또는 일렬로 연결된 컬럼으로 사용될 수 있으며, 각각의 컬럼은 한 종류의 지지체를 포함할 수도 있고, 하나의 컬럼이 여러 종류의 지지체를 포함할 수도 있는데, 즉 하나는 CD69, 다른 하나는 CD66b에 대응하도록 할 수 있다. 주어진 크기와 고체 지지체를 가진 컬럼에서 T 세포 제거를 최적화시키기 위해, 지지체 표면상의 항체의 밀도, 항체 친화성, 컬럼을 통과하는 혈액의 유속 등을 변화시킬 수 있다.

그러므로, 흐름세포측정법에 의해 조사된 생검이 활성 염증을 나타내고 있는 IBD 환자에 대해 그러한 국부적인 장의 염증에 관여하는 특정 세포 집단을 제거하도록 디자인된 항체 베이스의 백혈구성분채집술을 수행한다. 정맥 액세스를, 예를 들어, 헤파린 처리된 튜브에 커플링된 팔꿈치 앞쪽 정맥에 도입하고, 튜브에는 분당 약 30 ml의 혈액을 펌핑하는 연동 펌프를 연결한다. 본 발명의 백혈구성분채집 컬럼을 통해 혈액이 통과하도록 하고, 튜브를 예를 들어 반대측의 팔꿈치 앞쪽 정맥에 다시 주입한다. 환자에 대해 60분간의 백혈구성분채집술을 수행하면, 혈액 용적(60 x 30 ml = 1800 ml)의 약 절반으로부터 활성화된 세포가 제거될 것이다. 혈액에서 새로이 생겨나는 장의 활성화된 면역 세포를 제거하기 위해, 이러한 처리를 1-3주 이내에 3-5회 반복한다. 그런 다음 장의 생검으로부터의 단일 세포에 대해 전술한 바와 같이 흐름세포측정법에 의해 추가로 조사가 이루어질 수 있다.

Claims

염증성 장질환(IBD)을 치료하는 방법으로서,

(a) 환자의 염증 조직으로부터 얻은 장의 생검 시료를 제공하는 단계; (b) 세포 현탁액을 얻기 위해 상기 시료를 기계적으로 처리하는 단계; (c) 상기 현탁액 중의 T 림프구, 호중성 과립구 및 호산성 과립구로부터 선택된 활성화된 백혈구의 세포 표면 마커를 확인하는 단계; (d) 상기 활성화된 백혈구에 대해 항체를 생성하는 단계; (e) 상기 활성화된 백혈구에 대한 항체를 공통 지지체 또는 별개의 지지체들 상에 고정화시키는 단계; (f) 상기 지지체가 주입된 컬럼을 제공하는 단계; (g) 환자의 말초 혈액의 일부를 상기 컬럼에 통과시켜 상기 환자에게 재주입하기 전에 상기 활성화된 백혈구가 상기 지지체상의 항체와 커플링되도록 함으로써, 혈류로부터 상기 활성화된 백혈구를 제거하는 단계를 포함하는 염증성 장질환의 치료방법.
제1항에 있어서, 상기 활성화된 백혈구에 대한 항체를 지지하는 상기 지지체가 일렬로 또는 평행하게 커플링된 별개의 컬럼에 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 활성화된 백혈구에 대한 항체가 고정화되어 있는 지지체가 주입된 단일 컬럼을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컬럼의 공간 용적(empty volume)이 20 내지 100 ml인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컬럼의 용적이 30 내지 50 ml인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 5항 중 어느 한 항에 있어서, 1회 처리시, 환자의 혈액 용적의 1/3 내지 2/3의 혈액이 상기 컬럼을 통과하도록 되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 5항 중 어느 한 항에 있어서, 1회 처리시, 환자의 혈액 용적의 약 절반 또는 절반에 다소 못미치는 양의 혈액이 상기 컬럼을 통과하도록 되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 처리는 1-3주 이내에 3-5회 이상 반복되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 8항 중 어느 한 항에 있어서, 1회 처리시, 상기 장의 생검 시료는 상기 환자로부터 얻은 여러 개의 생검 시료 중의 하나이며, 상기 시료들은 세포 현탁액을 제공하기 위한 기계적인 처리를 거치기 전에 조합되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 9항 중 어느 한 항에 있어서, 활성화된 T 림프구의 존재는 상기 활성화된 T 림프구를 CD4, CD8, CD3, CD15, CD19에 대한 하나 또는 그 이상의 특이 항체에 노출시킴으로써 확인되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 9항 중 어느 한 항에 있어서, 활성화된 T 림프구의 존재는 상기 활성화된 T 림프구를 CD69, CD62L, CD25, CD27, HLA-DR, CD44에 대한 하나 또는 그 이상의 특이 항체에 노출시킴으로써 확인되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 11항 중 어느 한 항에 있어서, 지지체 상에 고정화된, 활성화된 백혈구에 대한 상기 항체는 CD69 및 인테그린 α4β7 항체로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 11항 중 어느 한 항에 있어서, 지지체 상에 고정화된, 활성화된 호중성 과립구에 대한 상기 항체는 CD66b 인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 11항 중 어느 한 항에 있어서, 지지체 상에 고정화된, 활성화된 호산성 과립구에 대한 상기 항체는 CD9 인 것을 특징으로 하는 방법.
백혈구성분채집 컬럼으로서, T 림프구, 호중성 과립구 및 호산성 과립구로부터 선택되는 활성화된 백혈구의 세포 표면 마커에 대한 항체가 고정화되어 있는 지지체를 포함하며, 상기 활성화된 백혈구는 염증성 장질환 (IBD)을 앓고 있는 환자의 염증 부위의 장 조직으로부터 얻은 다음 세포 현탁액을 얻기 위해 기계적으로 처리된 생검 시료 중의 활성화된 백혈구인, 컬럼.
제15항에 있어서, 공간 용적(void volume)이 20 - 100 ccm인 컬럼.
제15항에 있어서, 공간 용적(void volume)이 30 - 50 ccm인 컬럼.
제15항 내지 17항 중 어느 한 항에 있어서, 활성화된 T 림프구에 대한 상기 항체는 인테그린 α4β7 항체 및 CD69에 대한 항체로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 컬럼.
제15항 내지 17항 중 어느 한 항에 있어서, 활성화된 호중성 과립구에 대한 상기 항체는 CD66b에 대한 항체로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 컬럼.
제15항 내지 17항 중 어느 한 항에 있어서, 활성화된 호산성 과립구에 대한 상기 항체는 CD9에 대한 항체로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 컬럼.
하나 이상의 백혈구성분채집 컬럼의 조합으로서, 제15항 내지 19항 중 어느 한 항에 따른 컬럼이 평행하게 및/또는 일렬로 커플링된 컬럼의 조합.
백혈구성분채집용 장치로서, 제15항 내지 21항 중 어느 한 항에 따른 컬럼과, 상기 컬럼에 커플링된 혈액 펌프와, 상기 펌프와 컬럼을 환자의 정맥 시스템에 연결하는 수단을 포함하는 장치.
제22항에 있어서, 상기 펌프와 컬럼을 환자의 정맥 시스템에 연결하는 수단은 2개의 카뉼라를 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
제22항 또는 23항에 있어서, 상기 펌프는 상기 컬럼에 연결된 유연성 튜브상에서 작동하는 연동 펌프인 것을 특징으로 하는 장치.
T-백혈구성분채집용 지지체로서, 염증성 장질환(IBD)을 앓고 있는 환자의 염증 부위의 장 조직으로부터 분리된, T 림프구, 호중성 과립구, 및 호산성 과립구로부터 선택된 활성화된 백혈구에 대해 생성된 하나 이상의 항체가 상기 지지체 상에 고정화되어 있는 지지체.
제25항에 있어서, 상기 활성화된 백혈구는 염증 부위의 장 조직으로부터 취 한 여러 개의 생검 시료 중의 하나인 것을 특징으로 하는 지지체.
크론 질환을 치료하기 위한, 제25항 또는 26항에 따른 지지체의 용도.
궤양성 결장염을 치료하기 위한, 제25항 또는 26항에 따른 지지체의 용도.
콜라겐성 결장염을 치료하기 위한, 제25항 또는 26항에 따른 지지체의 용도.
임파구성 결장염을 치료하기 위한, 제25항 또는 26항에 따른 지지체의 용도.