CN101443041A - 治疗炎性肠病的方法和装置 - Google Patents

治疗炎性肠病的方法和装置 Download PDF

Info

Publication number
CN101443041A
CN101443041A CNA2007800169037A CN200780016903A CN101443041A CN 101443041 A CN101443041 A CN 101443041A CN A2007800169037 A CNA2007800169037 A CN A2007800169037A CN 200780016903 A CN200780016903 A CN 200780016903A CN 101443041 A CN101443041 A CN 101443041A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
post
activatory
holder
patient
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA2007800169037A
Other languages
English (en)
Inventor
M·瑟恩
O·温维斯特
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ITH Immune Therapy Holdings AB
Original Assignee
IBD Column Therapies International AB
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by IBD Column Therapies International AB filed Critical IBD Column Therapies International AB
Publication of CN101443041A publication Critical patent/CN101443041A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M1/00—Suction or pumping devices for medical purposes; Devices for carrying-off, for treatment of, or for carrying-over, body-liquids; Drainage systems
    • A61M1/36—Other treatment of blood in a by-pass of the natural circulatory system, e.g. temperature adaptation, irradiation ; Extra-corporeal blood circuits
    • A61M1/3679—Other treatment of blood in a by-pass of the natural circulatory system, e.g. temperature adaptation, irradiation ; Extra-corporeal blood circuits by absorption

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Anesthesiology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • External Artificial Organs (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

一种治疗炎性肠病(IBD)的方法，所述方法包括：提供从患者炎症组织获取的肠活检组织样品；机械处理该样品以获得细胞悬液；鉴定悬液中选自T淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸粒细胞的活化白细胞的细胞表面标记物；产生针对一种或多种所述活化的白细胞的抗体；将针对活化的白细胞的抗体固定在支持物上；提供用该支持物装载的柱；将患者外周血的一部分通过柱然后重新灌注到患者体内，使所述活化的白细胞与所述支持物上的抗体偶联而从血流中清除。还公开了对应的柱和支持物以及它们在所述方法中的应用。

Description

治疗炎性肠病的方法和装置
发明领域
本发明涉及治疗炎性肠病(IBD)，尤其是溃疡性结肠炎和克罗恩病的方法以及用于治疗的装置。
发明背景
溃疡性结肠炎和克罗恩病是炎性肠病(IBD)的表现形式。其他形式的IBD包括淋巴细胞结肠炎和胶原性结肠炎。目前用高剂量的甾体来治疗爆发型溃疡性结肠炎患者。抗TNFα的III期临床试验也在进行当中。这两种药物是广谱炎症抑制剂，在约50％的情况下有效但产生严重的副作用。通常，爆发型结肠炎患者还可能复发。在对药物治疗没有响应的爆发型结肠炎患者中，必须立即进行手术干预。溃疡性结肠炎总是局限在大肠(结肠)。在爆发型结肠炎中，切除结肠并构建外部回肠造瘘(ileostoma)。恢复和可能地进一步药物治疗直肠残肢炎症之后，在大多数患者中进行回肠直肠吻合术或骨盆陷凹重建术以恢复肠连续性。这两种手术都会导致每天约六次的稀粪并且破坏了水和矿物质的平衡。
克罗恩病患者通常在小肠的最远端部分和大肠的第一段(回盲区)处患有炎症，但炎症也可位于胃肠道的任何部分。虽然抗炎药如甾体和硫唑嘌呤能够暂时减轻疾病，但药物治疗不能治愈疾病。约50％的患者需要手术切除狭窄或成瘘肠段；其中一半患者将复发而需要进一步的手术治疗。因此，非常希望能够在个体患者中特异性地关闭IBD的炎症并防止疾病复发的方法。
WO2005113037公开了一种滤器以及从生物液体样品中去除选定物质的方法。滤器包括外壳、进口和出口。外壳内提供多个过滤面并对过滤面施加至少一种涂层。所述至少一种涂层包括至少两个结合模块，这两个模块相互间又选择性地结合。一个结合模块选择性地结合于过滤面，另一个结合模块被构造成能够选择性地结合选定物质，而将该物质从液体样品中去除。当液体样品通过进口、外壳和出口时，选定物质通过涂层选择性地结合于过滤面上。液体样品是血液样品。一种选定的液体组分是例如选自白细胞、粒细胞和淋巴细胞的的血液组分。
从血中分离白细胞的过滤介质和装置例如在JP2003265596；US5885457；JP04187206；US4936993；JP03000074；JP02167071；JP02009823；JP10057477中描述。
发明目的
本发明的目的是提供治疗IBD，尤其是溃疡性结肠炎和克罗恩病的方法。
本发明的另一个目的是提供该方法中使用的装置。
通过本发明的简短说明，通过附图所示的优选实施方式以及所附的权利要求书，本发明的其他目的将显而易见。
发明概述
在IBD的炎症过程中，T-细胞与白细胞相互作用。某些辅因子刺激白细胞释放有害物质。这些有害物质破坏肠细胞。从活跃IBD患者的肠活检组织获得的物质的流式细胞术分析，我们在活化的T淋巴细胞以及活化的中性粒细胞和嗜酸粒细胞上鉴定到白细胞表面标记物，这些细胞富集在炎症部位，而且存在于循环的外周血中。
本发明建立在以下假设的基础上，即这些活化的细胞能够启动和维持IBD的炎症，并且从循环去除它们能够减轻炎症、甚至消除炎症。所述概念包括以下观点：每位患者的炎症状态在白细胞活化的程度、类型和侵袭性T细胞的相对比例方面是独特的，参数随患者个体以及疾病的严重性而变化，并且受到给予患者的药物的影响。本发明不需要使用本领域已知的非特异性白细胞吸附剂，例如棉花和其他聚合物纤维。在本发明的内容中，IBD主要包括克罗恩病和溃疡性结肠炎，以及特征为水样腹泻、内窥镜检查正常但在肠粘膜下层有胶原组织病理学蓄积的胶原性结肠炎，和特征为肠粘膜中存在大量淋巴细胞且伴随腹泻的淋巴细胞结肠炎。
根据本发明，对IBD患者进行结肠镜检查。取一个或多个患病肠组织活检样本。从单个或混合的活检材料制备单细胞悬液。采用针对CD4、CD8、CD3、CD15、CD19的抗体，通过流式细胞术测定单细胞悬液中T淋巴细胞、B淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸粒细胞的存在。此外，使用针对活化标记物如CD69、CD62L、CD25、CD27、HLA-DR、CD44和CD66b的抗体来探究粘膜侵袭性免疫细胞的活化状态。原则上，每位患者的炎症状态在活化程度、细胞侵袭类型方面是独特的，参数随疾病严重性以及给定药物而变化。基于该研究结果，使用白细胞分离柱来靶向清除主要引起炎症的细胞群。为清除活化的T和B淋巴细胞，使用偶联于固体支持物的能够识别活化标记物CD69的抗体。为清除活化的中性粒细胞，使用针对肠归巢分子或CD66b的抗体；用上面固定有整联蛋白α4 β7抗体的支持物装载的分离柱能够清除这种类型的白细胞。因此，从发生炎症的肠部位引流至肠粘膜而导致额外的局部炎症的淋巴结中活化的外周循环中的血细胞也能通过这种基于抗体的外周血白细胞分离法来清除。这将妨碍或者甚至抑制肠自体反应性T细胞的进一步补充。
根据本发明，公开了一种白细胞分离柱，其装载有大表面容积比的合适的固体支持物，所述支持物表面载有能够结合外周血中循环的活化白细胞的抗体，所述活化的白细胞选自：T淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸粒细胞。使来自IBD炎症患者的外周血通过柱，将导致活化的白细胞与抗体偶联，从而将这些白细胞从循环中清除。通过动态平衡机制，排除循环外周血中活化的白细胞将导致转移至肠的活化白细胞数量减少，从而降低肠道中活化白细胞的数量。在本申请中，术语“抗体”包括抗体，尤其是单克隆抗体及其保留相应抗体的抗原/抗体结合能力的片段或修饰形式，包括重组改变的抗体及其抗原结合片段。
这种“定制的”白细胞分离术能够筛选出导致肠粘膜细胞特异性活化的活化的白细胞，从而清除炎症过程中的重要因子并逆转爆发型结肠炎。在克罗恩病患者中，相同的原则应用于白细胞；但在该情况下，白细胞活化靶向位于肠壁较深处的抗原。通过鉴定导致炎症的抗原，可以选择抗原，将抗原以固定在固体支持物上的状态递呈给通过柱的白细胞，并以该方式结合活化的白细胞。
基于肠道类型和炎症活化的程度，使用白细胞分离柱来靶向清除主要的导致炎症的细胞群。尤其优选去除外周血中的活化的T淋巴细胞。
从IBD患者的外周血中去除活化的T淋巴细胞，优选使它们与CD69抗体或整联蛋白α4β7抗体相接触；这些抗体可单独使用或联用。可以相应的方式去除活化的中性粒细胞和嗜酸粒细胞，即使它们分别与CD66b和CD9抗体相接触。
根据本发明，IBD患者外周血中也可鉴定到这些活化的中性粒细胞和嗜酸粒细胞。
根据本发明第一个优选的方面，通过使用固体支持物上包括两种或多种抗体的柱，来清除活化的T白细胞和/或活化的中性粒细胞和/或活化的嗜酸粒细胞。优选地，每种抗体使用单独的支持物。
根据本发明第二个优选的方面，以对应数量的单独柱中设置单独的支持物，每种支持物具有不同的抗体。优选各柱串联。
根据本发明第三个优选的方面，将通过结肠镜检查获取的IBD患者的几种活检组织进行合并，机械处理形成单细胞悬液，通过流式细胞术分析鉴定选自T淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸粒细胞、任选活化的B淋巴细胞的存在，所述方法包括使它们接触特定抗体，尤其是CD4、CD8、CD3、CD15和CD19的抗体。
根据本发明第四个优选的方面，通过使侵袭性免疫细胞接触针对活化标记物如CD69、CD62L、CD25、CD27、HLA-DR、CD44和CD66b的抗体，来确定结肠镜检查获取的IBD患者的粘膜侵袭性免疫细胞的活化状态。
T淋巴细胞倾向于迁移到表达α4β7整联蛋白受体的肠壁粘膜中，结合内皮上表达的MAdCAM-1(粘膜定居因子细胞粘附分子-1)。根据本发明，这种侵袭性T细胞可通过白细胞分离法从外周血中去除，该方法采用表面上固定有α4β7整联蛋白受体的抗体的支持物构成的柱。
因此，对流式细胞术检验活检组织表明活跃性炎症的IBD患者应用基于抗体的白细胞分离法，能够清除引起局部肠道炎症的特定细胞群。引入静脉内途径，例如在肘前静脉中连接肝素化管路，该管路与蠕动泵相连，蠕动泵以每分钟约30毫升的速率泵送血。血通过经设计的抗体白细胞分离柱，例如在对侧肘前静脉中重新引入管路。例如，患者经过60分钟的白细胞分离法，能够从大约一半或一半稍少一些的血容量(60 x 20ml＝1800ml)中清除活化的细胞。不管一次白细胞分离术清除的血容量多少，在1-3周的时间内重复处理3-5次，以去除血中新产生的肠活化免疫细胞。然后，通过上述流式细胞术再次检查肠活检组织单细胞。
根据本发明尤其优选的方面，公开了一种治疗炎性肠病(IBD)的方法，该方法包括：(a)提供从患者炎症组织获取的肠活检组织样品；(b)机械处理该样品以获得细胞悬液；(c)鉴定悬液中选自T淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸粒细胞的活化白细胞的细胞表面标记物；(d)产生针对活化的白细胞的抗体；(e)将针对活化的白细胞的抗体固定在通用支持物或单独支持物上；(f)提供用该支持物装载的柱；(g)将患者外周血的一部分通过柱，然后重新灌注到患者体内，而使活化的白细胞与支持物上的抗体偶联而从血流中清除。优选在单独的柱中提供负载有针对活化的T白细胞和针对活化的中性粒细胞和/或活化的嗜酸粒细胞的抗体的支持物，可串联或并联。还优选，该方法采用单个柱，柱装载有单独的支持物，支持物上固定有分别针对活化的T淋巴细胞、活化的中性粒细胞和活化的嗜酸粒细胞和任选的活化的B淋巴细胞中的两种或多种的抗体。优选地，本发明柱的排空容积为20-100毫升，特别是30-50毫升，但其他更大的容积，例如一直到500毫升也是可行的。如果采用较大容积的柱，重要的是在处理结束时排空柱以使血液损失最少。这可通过例如用盐水冲洗柱直到冲洗介质已更换柱中大多数或基本上所有的血液。与血液接触的柱和管路表面应能够防止凝血；因此优选使用表面肝素化的柱和管路。提供或修饰表面使其不会激活凝血系统的方法是本领域众所周知的。通常，一次治疗过程有三分之一或三分之二的患者血液，优选约一半或一半稍少一些的血液通过柱。通常，一次治疗不足以减轻或长时间消除或基本上抑制症状。因此，优选从开始治疗起在1-3周的时间内重复治疗2或3次直到5次和更多次。肠活检组织样品是从患者获取的多个该样品之一，所述样品合并后进行机械处理而形成细胞悬液。就外周循环中活化的T淋巴细胞而言，尤其适用于本发明方法的是CD69抗体或整联蛋白α4β7抗体，这些抗体也优选固定在本发明的支持物上。肠粘膜中活化的T淋巴细胞的存在优选通过使细胞悬液或从悬液分离的细胞接触针对一种或多种活化标记物CD69、CD62L、CD25、CD27、HLA-DR、CD44、CD66b的特异性抗体来检测。
“提供抗体”包括从商业或其他来源获取抗体。
现在将参考附图所示的优选实施方式更详细地描述本发明。
附图简要说明
图1-4显示了外周血和肠粘膜的CD4+T细胞和中性粒细胞上活性标记物的表达。
图5-9显示了在MACS(磁力活化细胞筛选)柱上分离活化的外周血CD4+T细胞和中性粒细胞的作用。
图10显示了与患者循环系统相连的本发明的柱。
具体实施方式
材料和方法
样品的收集与制备：结肠镜检查期间收集带有爆发型溃疡性结肠炎的IBD患者的活检组织样品，立即转移到充满生理盐水的试管中并在1小时内进行进一步的处理。采用大致匹配的玻璃匀浆器获取活检细胞的单细胞悬液。然后用PBS配制的含0.05％ NaN3、0.1％牛血清白蛋白(BSA)和0.4％二水合柠檬酸三钠的荧光活化细胞筛选(FACS)缓冲液洗涤细胞2次。
用0.83重量％氯化铵水溶液溶解来自同一个体的肝素化外周血，在FACS缓冲液中洗涤2次，获得白细胞悬液。
将该细胞悬液与偶联荧光染料的单克隆抗体避光在室温下单独孵育30分钟。最后洗涤之后，将细胞悬浮在500μl FACS缓冲液中进行分析。
抗体：所有抗原(CD4、CD69、CD66b)使用偶联异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)或多甲藻素叶绿素蛋白(PerCP)的鼠抗人mAb。也进行同种型匹配的对照标记，采用偶联荧光染料鼠抗人IgM κ和IgG2bκ作为非特异性染色的对照。用于流式细胞术分析的所有抗体都购自美国圣地亚哥的BD生物科学/药学公司(Becton Dickinson(BD)Biosciences/Pharmingen，SanDiego，USA)。抗-FITC偶联微珠(偶联特异性抗体的纳米大小的超级磁性颗粒)购自德国美天旎生物技术有限责任公司公司(Miltenyi Biotech，GmbH，Germany)。
流式细胞术分析：在双激光FACS Calibur流式细胞仪上(美国加利福尼亚州圣乔治的BD免疫细胞计数系统公司(BD Immunocytometry systems，SanJosé，CA，USA))进行流式细胞术分析。每个样品计数1万个细胞并进行分析。数据处理采用BD公司(Becton Dickinson)的Cell Quest Pro软件。
白细胞分离柱：将第一插管1形式的静脉通路引入肘前静脉8。第一插管1与第一肝素化管路2相连，蠕动泵3作用于管路2，每分钟泵送约30毫升血液。在其另一端，肝素化管路2与容积50毫升的白细胞分离柱4的一端相连，白细胞分离柱4中填充有颗粒性固体支持物5如
Figure A200780016903D00101
支持物上固定有针对从患者收集的活化的T白细胞的抗体。固定有抗体的固体支持物5通过第一和第二过滤体10、11保持在原位。白细胞分离柱4的另一端与第二肝素化管路6相连，管路6在其另一端与第二插管7相连。第二插管7被引入对侧的肘前静脉9中。这样，静脉血从肘前静脉8通过柱4流动到对侧的肘前静脉9中，在柱4中活化的T淋巴细胞与支持物5上的抗体偶联而保留在柱中。白细胞分离过程通常是60分钟，能够清除约一半或一半稍少一些的血液中的活化细胞(取决于患者体重60 x 20ml＝1800ml)。例如在1-3周的时间内重复上述过程3-5次以除去血中新产生的肠活化免疫细胞。然后，通过上述流式细胞术再次检查肠活检组织单细胞。以相应的方式完成活化的中性粒细胞和/或活化的嗜酸性细胞的分离性输血。本发明亲和色谱法中使用的使抗体附连于固体支持物的其他方法在Nisevitch M和Firer，MA，J BiochemBiophys Methods 49(2001)467-480中描述，其内容被纳入本文作为参考。
实施例1
MACS分离：对2毫升来自健康供者的肝素化外周血用SEB(4μg/mL)和抗-CD28单克隆抗体(10μg/mL)在37℃下刺激2小时，得到活化的T细胞和中性粒细胞。为了获得活化细胞和静息细胞的混合物，再加入2毫升未刺激的血液。将白细胞固定，通过低渗溶胞作用除去红细胞。对白细胞进行洗涤并与偶联FITC的抗CD69或CD66b一起孵育。4℃下避光孵育10分钟后，洗涤细胞并与抗FITC微珠再孵育15分钟。在MACS柱上分离细胞；在不同试管中收集阴性和阳性馏份。最后，洗涤细胞并通过FACS进行分析。
实施例2
IBD患者的外周血和肠中具有活化的CD4+T细胞：我们对10位Mb克罗恩病患者和12位溃疡性结肠炎患者的血液和结肠活检组织的单细胞悬液进行研究。IBD患者的外周血中显示活化表型的CD4+T细胞，因为发现T辅助细胞表达非常早期的活化标记物(图1)。在IBD患者的结肠活检组织中，大多数CD4+T细胞表达CD69活化标记物，作为蓄积在结肠肠壁中的导致结肠自体免疫性破坏的炎症T细胞的反应征兆(图2)。外周血中发现的活化的T细胞是类似的T细胞，在肠淋巴结中活化从炎症结肠段引流趋向炎症部位，是应该清除的细胞群。
实施例3
IBD患者的外周血和肠中具有活化的中性粒细胞：中性粒细胞是先天免疫系统的一部分，参与局部炎症的活化与维持。IBD患者的外周血中，大多数中性粒细胞少量表达CD66b，而一部分中性粒细胞大量表达象征活化表型的CD66b(图3)。活跃型IBD患者的结肠活检组织中大部分中性粒细胞是CD66bHi(图4)，表明先天免疫系统的活化同样涉及肠炎的启动。
实施例4
可从外周血中清除活化的CD4+T淋巴细胞：从外周血中清除表达CD69活化标记物的活化的T淋巴细胞(图5)，采用特异性抗体和柱可以识别趋向炎症结肠粘膜的细胞。用活化标记物CD69标记的T淋巴细胞水悬液通过负载偶联第二抗体的抗-FITC磁珠的柱。在柱洗脱液中成功分离并富集非活化的T淋巴细胞，表明大多数CD69+细胞可从外周血中清除(图6)。
实施例5
从外周血中清除活化的中性粒细胞：将表达高水平细胞表面标记物CD66b的活化的中性粒细胞(图7)与偶联第二抗体的抗-FITC磁珠一起孵育并进行柱纯化。大多数表达中等到高水平CD66b活化标记物的活化的中性粒细胞被俘获在柱中，而从外周血中清除(图8)。
实施例6
IBD患者的示例性治疗：对IBD患者进行结肠镜检查。取一些活检组织。从合并的活检组织制备单细胞悬液。采用针对例如CD4、CD8、CD3、CD15、CD19的抗体，通过流式细胞术鉴定单细胞悬液中的活化的白细胞，即T淋巴细胞、B淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸粒细胞。此外，采用针对活化标记物如CD69、CD62L、CD25、CD27、HLA-DR、CD44和CD66b的抗体来测定粘膜侵袭性免疫细胞的活化状态。
制备白细胞分离柱，它包括针对活化的白细胞和粘膜侵袭性免疫细胞的抗体。柱容积可在宽范围内变化，但出于经济原因和保持血液损失最少的考虑，优选容积约30-50毫升。通过能使抗体与固体支持物共价偶联的任何技术使抗体固定在合适的支持物如
Figure A200780016903D0013081754QIETU
上。例如，具体患者中采用针对活化标记物CD69的抗体以清除活化的T细胞，采用针对肠归巢分子或针对CD66b的抗体以清除活化的中性粒细胞，或针对CD9的抗体以清除活化的嗜酸粒细胞。可用固定有一种或多种抗体的支持物预先填充柱，或者可单独制备，例如通过非共价固定方案，例如利用含蛋白A(protein A)或链霉亲和素的支持物分别与抗体或生物素化抗体的Fc区域结合。现成或单独制备的白细胞分离柱与患者外周循环系统相连，以类似于人工肾脏的方式，持续足够的时间以使一些血液容积，优选约3-5个血液容积通过其中。
实施例7
用于俘获特定细胞群或特定细胞群的组合的白细胞分离柱：柱包括负载整联蛋白α4β7抗体的支持物，能够清除表达肠归巢分子的T细胞(图9)，因而在基于抗体的白细胞分离柱过程中清除了导致其他局部炎症的从炎症肠部位引流趋向肠粘膜的淋巴结中活化的外周血细胞。用带有抗CD69抗体的支持物填充的柱能够清除血流中活化的T和B淋巴细胞，从而抑制肠自体反应性T细胞的进一步补充。以类似的方式，用带有抗CD66b抗体的支持物填充的柱能够清除活化的中性粒细胞；相应地为清除活化的嗜酸粒细胞，优选CD9抗体。这些支持物可串联或并联使用，例如平行或连续相连的柱，每个柱包含一种支持物或一个柱包含几种支持物，例如一种带有CD69，另一种带有CD66b。为在给定大小和固体支持物的柱中优化T细胞清除，可改变支持物表面抗体的密度、抗体亲和力以及通过柱的血液流速等。
因此，对流式细胞术研究活检组织表明活跃性炎症IBD患者进行基于抗体的白细胞分离法，以清除导致局部肠道炎症的特定细胞群。例如，将静脉通路引入肘前静脉，肘前静脉连接肝素化管路，该管路与蠕动泵相连，蠕动泵以每分钟约30毫升的速率泵送血。血通过本发明的白细胞分离柱，例如在对侧肘前静脉中重新引入。患者经过60分钟的白细胞分离，能够从大约一半的血容积中清除活化的细胞(60 x 20ml＝1800ml)。在1-3周的时间内重复治疗3-5次，以去除血中新产生的肠活化免疫细胞。然后，通过上述流式细胞术再次检查肠活检组织单细胞。
附图说明
图1：外周血CD4+T淋巴细胞上活性标记物CD69的表达较低(3.8％的CD4+T细胞表达，平均荧光强度(MFI)20.0)。
图2：结肠粘膜CD4+T淋巴细胞中CD69表达升高(72.8％，MFI 33.5).
图3：大多数外周血中性粒细胞表达低水平CD66b；但11.5％表达升高，表明细胞活化。M1期细胞的MFI为104.3。
图4：结肠粘膜中性粒细胞具有较高的CD66b MFI(M1期629.7)，活化的中性粒细胞群增加。
图5：分离CD69-阳性细胞之前的CD4+T淋巴细胞：5.9％的细胞表达CD69。
图6：分离CD69-阳性细胞之后的CD4+T淋巴细胞：阳性部分由61.6％CD69-阳性CD4+T细胞构成。
图7：分离CD66b-阳性细胞之前的中性粒细胞：42.7％的细胞中等到高表达CD66b。
图8：分离CD66b-阳性细胞之后的中性粒细胞：阳性部分中86.6％的中性粒细胞中等到高表达CD66b。
图9：分离α4β7整联蛋白阳性细胞之前和之后的CD4+T淋巴细胞：MACS之前37，4％的细胞中等到高表达α4β7整联蛋白，MACS之后为92.9％。

Claims (30)

1.一种治疗炎性肠病(IBD)的方法，所述方法包括：(a)提供从患者炎症组织获取的肠活检组织样品；(b)机械处理该样品以获得细胞悬液；(c)鉴定悬液中选自T淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸粒细胞的活化白细胞的细胞表面标记物；(d)产生针对所述活化的白细胞的抗体；(e)将针对所述活化的白细胞的抗体固定在通用支持物或单独支持物上；(f)提供用该支持物装载的柱；(g)将患者外周血的一部分通过柱，然后重新灌注到患者体内，使所述活化的白细胞与所述支持物上的抗体偶联而从血流中清除。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在串联或并联的单独的柱中提供所述带有针对所述活化的白细胞的抗体的支持物。
3.如权利要求2所述的方法，所述方法包括用支持物装载的单个柱，针对所述活化的白细胞的抗体固定在支持物上。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，排空容积为20-100毫升。
5.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，排空容积为30-50毫升。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，一次治疗中使三分之一到三分之二的患者血容量通过柱。
7.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，一次治疗中使大约一半或比一半稍少一些的患者血容量通过柱。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，在1-3周的时间内重复治疗3-5次或更多次。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述肠活检组织样品是从患者获取的数个该样品之一，并将所述样品合并后进行机械处理以形成细胞悬液。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，通过使它们接触抗CD4、CD8、CD3、CD15、CD19的特异性抗体中的一种或多种，来鉴定活化的T淋巴细胞的存在。
11.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，通过使它们接触抗CD69、CD62L、CD25、CD27、HLA-DR、CD44的特异性抗体中的一种或多种，来鉴定活化的T淋巴细胞的存在。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其特征在于，固定在支持物上的所述针对活化的白细胞的抗体选自CD69和整联蛋白α4β7抗体。
13.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其特征在于，固定在支持物上的针对活化的中性粒细胞的抗体是CD66b。
14.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其特征在于，固定在支持物上的针对活化的嗜酸粒细胞的抗体是CD9。
15.一种用支持物装载的白细胞分离柱，所述支持物上固定有针对选自T淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸粒细胞的活化的白细胞的细胞表面标记物的抗体，所述活化的白细胞是从炎性肠病(IBD)患者的炎症肠组织获取的活检组织样品经机械处理而获得的细胞悬液中的活化的白细胞。
16.如权利要求15所述的柱，其特征在于，所述柱的外水体积为20-100ccm。
17.如权利要求15所述的柱，其特征在于，所述柱的外水体积为30-50ccm。
18.如权利要求15-17中任一项所述的柱，其特征在于，所述针对活化的T淋巴细胞的抗体选自CD69抗体和整联蛋白α4β7抗体。
19.如权利要求15-17中任一项所述的柱，其特征在于，所述针对活化的中性粒细胞的抗体选自CD66b抗体。
20.如权利要求15-17中任一项所述的柱，其特征在于，所述针对活化的嗜酸粒细胞的抗体选自CD9抗体。
21.一个或多个如权利要求15-19中任一项所述的白细胞分离柱并联和/或串联的组合。
22.一种白细胞分离设备，其包括如权利要求15-21中任一项所述的柱、与所述柱串联的血泵以及将所述泵和柱连接于患者静脉系统的装置。
23.如权利要求22所述的设备，其特征在于，所述将泵和柱连接于患者静脉系统的装置包括两个插管。
24.如权利要求22或23所述的设备，其特征在于，所述泵是在与柱相连的软管上运行的蠕动泵。
25.一种T-白细胞分离的支持物，所述支持物上固定有一种或多种针对从炎性肠病(IBD)患者的炎症肠组织分离的选自T淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸粒细胞的活化的白细胞的抗体。
26.如权利要求25所述的支持物，其特征在于，所述活化的白细胞是从炎症肠组织获取的一个或多个活检组织样品中分离的。
27.如权利要求25或26所述的支持物在治疗克罗恩病中的应用。
28.如权利要求25或26所述的支持物在治疗溃疡性结肠炎中的应用。
29.如权利要求25或26所述的支持物在治疗胶原性结肠炎中的应用。
30.如权利要求25或26所述的支持物在治疗淋巴细胞结肠炎中的应用。
CNA2007800169037A 2006-05-12 2007-05-14 治疗炎性肠病的方法和装置 Pending CN101443041A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE06010755 2006-05-12
SE0601075 2006-05-12

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101443041A true CN101443041A (zh) 2009-05-27

Family

ID=38694153

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2007800169037A Pending CN101443041A (zh) 2006-05-12 2007-05-14 治疗炎性肠病的方法和装置

Country Status (21)

Country Link
US (1) US8449489B2 (zh)
EP (1) EP2021025B1 (zh)
JP (1) JP5266207B2 (zh)
KR (1) KR20090007642A (zh)
CN (1) CN101443041A (zh)
AU (1) AU2007250552B2 (zh)
CA (1) CA2651883C (zh)
CY (1) CY1118286T1 (zh)
DK (1) DK2021025T3 (zh)
EA (1) EA016851B1 (zh)
ES (1) ES2603203T3 (zh)
HU (1) HUE032241T2 (zh)
IL (1) IL195001A0 (zh)
LT (1) LT2021025T (zh)
NO (1) NO20085180L (zh)
PL (1) PL2021025T3 (zh)
PT (1) PT2021025T (zh)
SG (1) SG171684A1 (zh)
SI (1) SI2021025T1 (zh)
WO (1) WO2007133147A1 (zh)
ZA (1) ZA200809429B (zh)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101252941A (zh) 2005-08-31 2008-08-27 Ith免疫治疗控股股份公司 治疗炎性肠病
ES2603203T3 (es) 2006-05-12 2017-02-24 Ith Immune Therapy Holdings Ab Método y medio para tratar la enfermedad inflamatoria intestinal
US20110081649A1 (en) * 2007-08-02 2011-04-07 Iss Immune System Stimulation Ab Diagnosis, staging and monitoring of inflammatory bowel disease
WO2010029317A2 (en) 2008-09-10 2010-03-18 Ibd Column Therapies International Ab Treating inflammatory conditions
US11285494B2 (en) 2009-08-25 2022-03-29 Nanoshell Company, Llc Method and apparatus for continuous removal of sub-micron sized particles in a closed loop liquid flow system
US10099227B2 (en) 2009-08-25 2018-10-16 Nanoshell Company, Llc Method and apparatus for continuous removal of sub-micron sized particles in a closed loop liquid flow system
US9993590B2 (en) * 2011-01-18 2018-06-12 The Regents Of The University Of California Real-time adaptive immune system and method
US8979787B2 (en) * 2011-01-20 2015-03-17 Henry John Smith Treatment of pre-eclampsia using targeted apheresis
ES2688081T3 (es) * 2011-06-13 2018-10-30 Tla Targeted Immunotherapies Ab Tratamiento de dolencias asociadas a septicemia
WO2012172339A2 (en) * 2011-06-13 2012-12-20 Ith Immune Therapy Holdings Treating inflammatory arthritis
WO2012172345A2 (en) * 2011-06-13 2012-12-20 Ith Immune Therapy Holdings Treating conditions associated with allergy
WO2012172343A2 (en) * 2011-06-13 2012-12-20 Ith Immune Therapy Holdings Treating primary sclerosing cholangitis
US9726666B2 (en) 2011-06-13 2017-08-08 Tla Targeted Immunotherapies Ab Diagnosing and treating inflammatory diseases
EP2718311B1 (en) * 2011-06-13 2018-01-17 TLA Targeted Immunotherapies AB Treating multiple sclerosis
WO2012172337A2 (en) * 2011-06-13 2012-12-20 Ith Immune Therapy Holdings Treating cardiovascular disease
EP3228631B1 (en) * 2011-06-13 2020-06-24 TLA Targeted Immunotherapies AB Treating respiratory conditions
EP2718310B1 (en) * 2011-06-13 2017-08-23 TLA Targeted Immunotherapies AB Treating mental disorders
WO2012172336A2 (en) * 2011-06-13 2012-12-20 Ith Immune Therapy Holdings Treating inflammatory skin diseases
US10073097B2 (en) * 2012-11-28 2018-09-11 Charles C. Caldwell Diagnostic assays and methods of treating pneumonia, sepsis and systemic inflammatory response syndrome
WO2015158855A1 (en) 2014-04-16 2015-10-22 Genovie Ab Regulatory t-cells for use in the treatment of inflammatory disorders of the human gastrointestinal tract
US10646515B2 (en) * 2014-04-16 2020-05-12 Genovie Ab CD8+ regulatory T-cells for use in the treatment of inflammatory disorders of the human gastrointestinal tract
WO2021063708A1 (en) * 2019-09-30 2021-04-08 Hemotune Ag Assembly for extracorporeal treatment of body fluids

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002024307A2 (en) * 2000-09-15 2002-03-28 Allied Therapeutics Limited Reducing the content of particular cell types in a biological sample

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS639449A (ja) 1986-07-01 1988-01-16 テルモ株式会社 血液成分分離用器具
JPH0649653B2 (ja) 1988-06-29 1994-06-29 テルモ株式会社 白血球分離材、分離器および分離方法
JPH02167071A (ja) 1988-12-19 1990-06-27 Terumo Corp 非ヒト動物由来白血球系細胞の分離材、分離器および分離方法
JPH0374A (ja) 1988-12-31 1991-01-07 Tonen Corp 白血球吸着分離材
JPH04187206A (ja) 1990-11-19 1992-07-03 Toyobo Co Ltd 白血球分離装置及び白血球分離材料の製造方法
US5728306A (en) 1994-12-23 1998-03-17 Baxter International Inc. Leukodepletion filter and method for filtering leukocytes from freshly drawn blood
DE19538641C2 (de) * 1995-10-05 2000-09-21 Privates Inst Bioserv Gmbh Patientenspezifische Immunadsorber für die extrakorporale Apherese und Verfahren für deren Herstellung
JPH1057477A (ja) 1996-08-26 1998-03-03 Asahi Medical Co Ltd 白血球除去フィルター材および白血球除去フィルター装置
JP4197545B2 (ja) * 1997-12-01 2008-12-17 旭化成クラレメディカル株式会社 特異的細胞除去材料
EE200100123A (et) 1998-08-31 2002-06-17 Biogen, Incorporated CD2 siduva aine kasutamine ja mäluefektor-T-lümfotsüütide populatsioon
JP2003265596A (ja) 2002-03-12 2003-09-24 Asahi Kasei Corp 白血球選択吸着剤及びその評価選択方法
US6936222B2 (en) * 2002-09-13 2005-08-30 Kenneth L. Franco Methods, apparatuses, and applications for compliant membrane blood gas exchangers
US20060234210A1 (en) 2004-04-14 2006-10-19 Affinergy, Inc. Filtration device and method for removing selected materials from biological fluids
DE102005036505A1 (de) 2004-07-30 2006-06-01 Adexter Gmbh Vorrichtung und Verfahren zum Isolieren von Zellen, Biopartikeln und/oder Molekülen aus Flüssigkeiten mit dem Ziel einer Anwendung zur Behandlung von Krankheiten des Menschen
WO2006125201A2 (en) 2005-05-19 2006-11-23 Centocor, Inc. Anti-biotin-pegylated-mcp-1 mutein antibodies, compositions, methods and uses
ES2603203T3 (es) 2006-05-12 2017-02-24 Ith Immune Therapy Holdings Ab Método y medio para tratar la enfermedad inflamatoria intestinal
WO2008038785A1 (fr) 2006-09-29 2008-04-03 Toray Industries, Inc. Colonne adsorbeuse de cellules

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002024307A2 (en) * 2000-09-15 2002-03-28 Allied Therapeutics Limited Reducing the content of particular cell types in a biological sample

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KATSUYA HIRAISHI ET AL: "Studies on the Mechanisms of Leukocyte Adhesion to Cellulose Acetate Beads: An In Vitro Model to Assess the Efficacy of Cellulose Acetate Carrier-based Granulocyte and Monocyte Adsorptive Apheresis", 《THERAPEUTIC APHERESIS AND DIALYSIS》 *
WILLIAM J. SANDBORN: "Preliminary data on the use of apheresis in inflammatory bowel disease", 《INFLAMM BOWEL DIS》 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2009536944A (ja) 2009-10-22
CY1118286T1 (el) 2017-06-28
JP5266207B2 (ja) 2013-08-21
EP2021025A4 (en) 2010-08-18
LT2021025T (lt) 2017-01-25
AU2007250552A1 (en) 2007-11-22
CA2651883A1 (en) 2007-11-22
EA016851B1 (ru) 2012-08-30
SI2021025T1 (sl) 2017-02-28
KR20090007642A (ko) 2009-01-19
US20090192434A1 (en) 2009-07-30
EP2021025A1 (en) 2009-02-11
HUE032241T2 (en) 2017-09-28
PL2021025T3 (pl) 2017-04-28
ES2603203T3 (es) 2017-02-24
CA2651883C (en) 2017-05-30
SG171684A1 (en) 2011-06-29
IL195001A0 (en) 2011-08-01
AU2007250552B2 (en) 2011-07-07
PT2021025T (pt) 2016-11-21
WO2007133147A1 (en) 2007-11-22
DK2021025T3 (en) 2016-12-12
NO20085180L (no) 2008-12-11
ZA200809429B (en) 2009-08-26
EA200802086A1 (ru) 2009-06-30
US8449489B2 (en) 2013-05-28
EP2021025B1 (en) 2016-08-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101443041A (zh) 治疗炎性肠病的方法和装置
US7892766B2 (en) Continuous flow chamber device for separation, concentration, and/or purification of cells
AU731766B2 (en) Cell separation method
US5514340A (en) Device for separating magnetically labelled cells
CN101057141B (zh) 一种从流体中分离细胞、生物颗粒和/或分子以应用于动物、生物技术（包括生物学研究）和医疗诊断的方法和仪器
CN106823033A (zh) 炎症的治疗
US20070178084A1 (en) Continuous flow chamber device for separation, concentration, and/or purfication of cells
US20090022768A1 (en) Continuous flow chamber device for separation, concentration, and/or purification of cells
Zeijlemaker et al. Human lymphocyte subpopulations involved in MLC and CML
JP4437335B2 (ja) ヒト未分化造血幹細胞およびその分離方法ならびに分離装置
JPS6324975B2 (zh)
JPS5854128B2 (ja) リンパ球の分離方法およびその装置
JPS5854129B2 (ja) リンパ球分離法
AU2011202946A1 (en) Method and means for treating inflammatory bowel disease
JP4043094B2 (ja) 細胞分離器
JP2000139454A (ja) 細胞分離回収方法及び回収必要細胞含有液
WO1994026104A1 (en) Target cell isolation method
JPS6330888B2 (zh)
JP2003116521A (ja) Ｓｐ細胞の分離濃縮方法及び装置
JPS5914008B2 (ja) リンパ球の採取方法および装置
JPH09322757A (ja) 細胞分離精製材、細胞分離精製器及び細胞分離精製方法
JPH10262643A (ja) 細胞除去器、細胞除去方法及び輸血用血液
JPH06269499A (ja) 細胞分離方法及びその装置
Belak et al. Exploring the feasibility of selective depletion of T lymphocyte subsets by whole blood immunoadsorption cytapheresis

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: ITH IMMUNE THERAPY HOLDINGS AB;HASH(0X1D84DA0)

Free format text: FORMER OWNER: IBD COLUMN THERAPIES INTERNAT

Effective date: 20101112

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
COR Change of bibliographic data

Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: STOCKHOLM, SWEDEN TO: S?DERK?PING, SWEDEN

TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20101112

Address after: Snow city, Sweden

Applicant after: ITH Immune Therapy Holdings AB

Address before: Stockholm

Applicant before: IBD Column Therapies Internat

C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20090527