JPS5854129B2 - リンパ球分離法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、血液、体液またはこれらを処理して得られる
血球浮遊液から、リンパ球を純度、収率良く、簡単な操
作で短時間に分離する方法に関するものである。

さらに詳しく述べると、血球浮遊液をまず、顆粒球、単
球を捕捉するフィルターに通し、顆粒球、単球と他の成
分とを分離した後、顆粒球、単球の少ない血球浮遊液を
白血球を捕捉するフィルターに通して、この血球浮遊液
の中のリンパ球が大部分である白血球と他の成分とを分
離した後、該フィルターに捕捉されているリンパ球を回
収することからなるリンパ球の分離方法に関するもので
ある。

白血球は一般に顆粒球、単球とリンパ球が大部分からな
り、このため白血球浮遊液から顆粒球、単球を除去すれ
ばリンパ球浮遊液となる。

近年、免疫学の進歩と二もに、リンパ球を血液から純粋
に取り出し、このリンパ球浮遊液を用いて組織適合抗原
や細胞性免疫等の免疫学の研究を行ったり、また種々の
疾患の免疫療法に用いることが行われるようになり、ま
たこのリンパ球をＴ細胞やＢ細胞などのサブポピユレー
ションに分離したり、ヘルパーＴ細胞やサプレッサーＴ
細胞などのサブセットに分離する試みが、各地の病院、
研究機関で検討されている。

しかし、これらの目的に用いるリンパ球浮遊液を血液な
どから比較的大量に、簡単々操作で、純度、収率良く得
る方法としては、従来適当なものがなかった。

このような目的のために使用できる従来のリンパ球分離
法としては、フィコール・コンレイ法などの密度勾配遠
心分離法や、細胞電気泳動法、血液に赤血球凝集剤を加
えて赤血球を沈澱、除去し、得られた白血球浮遊液を、
顆粒球、単球を粘着、付着または吸着する物質に接触さ
せ、顆粒球、単球を除去してリンパ球浮遊液を得る方法
などが存在するが、多量のリンパ球を純度、収率良く短
時間に得ることは困難であり、また得られたリンパ球浮
遊液を人体に輸血する際、問題となる場合も存在する。

そこで、本発明者らは、多量の血液から簡単な操作で、
短時間にリンパ球を純度、収率良く分離でき、人体にこ
のリンパ球浮遊液を輸血しても問題とならない方法を鋭
意検討した結果、顆粒球、単球を捕捉する顆粒球分離フ
ィルターと、白血球を捕捉する白血球分離フィルターを
組合せた方汐によって、これが達成できることを発見し
、本旨間を完成するに至った。

すなわち、本発明は、血液、体液またはこれｅを処理し
て得られる血球浮遊液を、顆粒球、単列を捕捉するフィ
ルターに通し、顆粒球、単球と孔の成分を分離したのち
、顆粒球、単球の少ない好球浮遊液を白血球を捕捉する
フィルターに通しマリンバ球と他の成分とを分離し、そ
ののちフイ九ターに捕捉されているリンパ球を回収する
ことを特徴とするリンパ球以外の血球成分の少ないリン
パ球浮遊液を得る方法である。

本発明でいう血液、体液またはこれらを処理して得られ
る血球浮遊液とは、血液や体液、たと犬ば腹水や骨髄液
それ自身、およびこれらの液に介らかの処理、たとえば
デキストランやヒドロキシエチルスターチなどの赤血球
凝集剤のような血判凝集剤を加えて得た血球浮遊液や密
度勾配遠心分離などのような遠心分離操作により得た血
球鈴遊液、細胞電気泳動により得られる血球浮遊液力ど
をいう。

本発明による方法は、これらの血球浮遊液を、顆粒球分
離フィルターと白血球分離フィルターＣ両方を用いてリ
ンパ球を得るものである。

従来、顆粒球、単球が種々の物質、たとえば、綿、ポリ
エステル繊維、ナイロン繊維、シリコン処理ガラスウー
ルなどに粘着または付着し、またリンパ球もこれらの物
質に弱く粘着することはよく知られた現象である。

しかし、血液にこれらの物質を接触させるだけでは、血
液中の顆粒球、韓球や、ごく少量のリンパ球が除去され
るのみで、多量の赤血球が大部分のリンパ球と工もに回
収され、リンパ球のみを得るには、この赤血球を除法す
る操作が必要である。

現在は、この操作を密度勾配遠心分離操作や、赤血球を
低張液と接触させ破壊することにより達成している。

しかし、これらの操作は手間がか又り、また大量の血液
を処理するのは困難である。

そこで、本発明者らは、顆粒球分離フィルターと組合せ
てリンパ球を得る方法を種々検討した結果、白血球分離
フィルターと顆粒球分離フィルターを組合せれば、血液
から簡単な操作で、短時間にリンパ球を純度、収率良く
分離できることを発見した。

白血球分離フィルターとしては、血液から白血球を捕捉
でき、フィルター内を白血球が回収されないような生理
的溶液、たとえば生理食塩水などで洗浄することにより
、白血球以外の成分を大部分除去でき、またフィルター
内の白血球を容易に回収できるものであればよい。

この一例としてはカラムに繊維状物質を詰め、繊維状物
質に対する白血球の粘着作用や、繊維状物質がつくる空
間に白血球をひっかけて捕捉することを利用したものが
ある。

これらはリンパ球が捕捉できるように上記の点が考慮さ
れている点で、従来知られている顆粒球分離フィルター
などとは異なるものであるなかでも、平均直径１０μ以
下の繊維状物質を用いたフィルターは、白血球が粘着で
きる表面積を大きくできる上に、繊維状物質がつくる空
間を小さくできるので用いるのが好ましい。

この場合、繊維状物質とは、平均直径に比べ長さが非常
に長いものである。

また平均直径りとは、そのものＳ重さをＸｌ、長さをｙ
ＣＩｒｔ、密度をρＰ／ｉとすると、Ｄ＝２／逼逼二で
定義されるものをいう。

捕捉された白血球を回収する方法としては、たとえば白
血球がフィルター内の物質と何らかの粘着を起している
場合は、粘着阻害剤を加えたり、物理的外力を与えなが
ら液を流すことにより、また白血球がフィルター内の物
質がつくる空間にひつか亙っている場合は、空間の大き
さを変えたり、また外部から物理的な力を与えながら液
を流すことにより、回収が可能となる。

また顆粒球分離フィルターは、リンパ球がフィルター内
の物質がつくる空間にひつかよることかなく、またリン
パ球を非特異的に粘着したりしないものであり、顆粒球
、単球をよく捕捉できるものである。

この一例としては、カラムにポリエステル繊維、ナイロ
ン繊維などを詰めた市販のフィルターがある。

本発明では、これらの二つのフィルターを用い、リンパ
球を簡単な操作で分離できるものである。

第１図は本発明によるリンパ球分離法の一つの例を示す
工程説明図である。

図中１は液が入る入口、２は液が出る出口、３は顆粒球
分離フィルター、４は白血球分離フィルター、５はこれ
らを接続する部分である。

１から入った血球浮遊液は、顆粒球分離フィルター３お
よび白血球分離フィルター４を通り出口２から出ていく
。

この間に、血球浮遊液中の顆粒球、単球と、赤血球など
の一部は顆粒球分離フィルター３に捕捉され、白血球分
離フィルター４には、大部分がリンパ球からなる白血球
と、他の血球成分の一部が捕捉される。

次に入口１から顆粒球、単球やリンパ球が回収されない
ような生理的溶液を送り、顆粒球分離フィルター３およ
び白血球分離フィルター４に入っている白血球以外の成
分を出口２から流し出す。

この後、入口１からリンパ球を回収するための液を送り
、白血球分離フィルター４に捕捉されているリンパ球を
出口２から取り出すものである。

第２図も本発明によるリンパ球分離法の一つの例を示す
工程説明図である。

図中１は第１図と同じくリンパ球分離を行う主要部へ液
が入る入口、２は出口、３は顆粒球分離フィルター、４
は白血球分離フィルター、５は接続部、６は液を送るた
めのポンプ、７は１以外の液が入る入口、８は液を適切
なところに送るためのコックである。

血球浮遊液は入口１を通り顆粒球分離フィルター３およ
び白血球分離フィルター４を経て、出口２から出ていく
、この間に、顆粒球分離フィルター３で顆粒球、単球が
捕捉され、白血球分離フィルター４で大部分がリンパ球
からなる白血球が捕捉される。

しかし、顆粒球分離フィルター３には顆粒球、単球以外
にリンパ球や他の血球の一部が捕捉されているので、こ
のリンパ球をも回収したい時には、顆粒球、単球の溶出
しないようは生理的溶液を入口１から顆粒球分離フィル
ター３に流し、白血球分離フィルター４に入れてやると
よい。

次に入ロアから白血球またはリンパ球を回収しないよう
な洗浄液を白血球分離フィルター４に流して、フィルタ
ー内の赤血球や血小板を流し出す。

この後、入ロアから白血球またはリンパ球を回収する液
を送り、出口２からリンパ球浮遊液を得る。

なお、これらの図は本発明による方法の一部を示したに
すぎず、たとえば第１図において二つのフィルターは接
続しているが、これなどは各部分を切り離し、一旦顆粒
球分離フィルター３で顆粒球、単球を除去した血球浮遊
液を取り出し、この液をさらに白血球分離フィルター４
に入れるようにしてもリンパ球は分離できる。

また洗浄液を使用しない場合もありうる。

コックの位置や管の接続なども、図では一例を示したに
すぎない。

また提供者から直接リンパ球を分離する場合も、本方法
に加えて、静脈血を取り出す接続部や返却部を提供者に
接続することにより、提供者にリンパ球以外の血球を返
しながら、大量のリンパ球を得ることができる。

本発明によるリンパ球分離法の例として、第１図および
第２図の場合について説明したが、液を送る力としては
ポンプの他、重力を用いることができる場合がある。

このようにして得たリンパ球浮遊液は、赤血球や血小板
、顆粒球、単球の混入が少なく、また、これを得るため
の操作も非常に簡単である。

また得られたリンパ球は種々の分裂原、たとえばフィト
ヘマグルチニンやボーク・ウイード・マイトジェンによ
って幼若化する能力がよく保たれており、またＴ細胞、
Ｂ細胞の比率も、フィルターの使用条件により、もとの
血液とはｇ同じものや、変化したものが得られる。

以上のように、本発明によって、血液等の血球浮遊液か
ら簡単な操作で、また無菌的に、純度、収率よくリンパ
球を分離することができ、各種医療施設においてリンパ
球浮遊液を用いた研究や、リンパ球成分輸血が容易に行
えるものである。

実施例 １ １．５デニールで長さ４ＣｒｆＬから７ｃＩｒＬのポリ
エステル繊維を詰めた顆粒球分離フィルターと０．７デ
ニールで長さ４ｃｍｊＪ・ら７ののポリアクリロニトリ
ル系繊維を詰めた白血球分離フィルターを用い、第２図
に示した方法により、健康人のヘパリンを１０００単位
含む血液１００ｍ１からリンパ球を分離した。

まず１００ｍ１の血液をポンプ６で３ ｍｌ／ｗｔｉｙ
ｔ（７）流速で顆粒球分離フィルター３に通し、そのま
又白血球分離フィルター４に流した。

次に顆粒球分離フィルター３に残存しているリンパ球を
白血球分離フィルター４に入れるため、顆粒球分離フィ
ルター３に生理食塩水を３１ｒＬｌ／−の流速で３０ｍ
１流し、この液をそのま〜白血球分離フィルター４に流
した。

次に白血球分離フィルター４に捕捉されているリンパ球
以外の血球成分を除去するため、７０入口から２００１
ｒＬｌの生理食塩水を１０ｍ１／ｍｍで流し、出口２か
ら出した。

この後、白血球分離フィルター４に捕捉されているリン
パ球を回収するため、血漿を含む生理的溶液を１００ｍ
ｌ、 ５ｒｎｌ！／ｍ１ｔｔの流速でフィルターに物理
的力な与えながら流し、リンパ球浮遊液１００ＴＬｌを
回収した。

この液には、リンパ球はもとの血液の５３％、顆粒球、
単球は６％、赤血球は０．３％、血小板は３％含まれて
いた。

実施例 ２ １．５デニールで長さ４αから７ｃｒｒＬのポリエステ
ル繊維を詰めた顆粒球分離フィルターと、０．７デニー
ルで長さ４ｃｒｒＬから７ｃｒｒＬのポリアミド繊維を
詰めた白血球分離フィルターを用い、第２図に示した方
法によって、実施例１と同じ操作をして、健康人の血液
１ｏｏｍｌからリンパ球浮遊液ｉｏ。

ｍｌを得た。

この液には、リンパ球はもとの血液の４８％、顆粒球、
単球は５％、赤血球は０．３％、血小板は４％含まれて
いた。

実施例 ３ ・′ １．５デニールで長さ４（１７７１から７ＣｒｆＬのポ
リエステル繊維を詰めた顆粒球分離フィルターと、０．
７デニールで長さが４ｃｒｒＬから７ｃｍのポリアクリ
ロニトリル系合成繊維を詰めた白血球分離フィルターを
用い、第２図に示した方法によって、健康人の血液１０
０ｍ１に分子量２０万のデキストラン溶液を加えて得た
赤血球かもとの５％、リンパ球かもとの７０％の血球を
含む液から、実施例１と同様の操作でリンパ球浮遊液１
００ｍ１を得た。

この液には、リンパ球はもとの血液の３６％、顆粒球、
単球は３％、赤血球は０．０２％、血小板は０．３％含
まれていた。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は、本発明によるリンパ球分離法の
例を示す工程説明図である。 １・・・・・・血球浮遊液の入口、２・・・・・・血球
浮遊液の出口、３・・・・・・顆粒球分離フィルター、
４・・・・・・白血球分離フィルター ５・・・・・・
接続部、６・・・・・・ポンプ、７・・・・・・入口、
８・・・・・・コック。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 血液、体液またはこれらを処理して得られる血球浮
   遊液を、顆粒球、半球を捕捉するフィルターに通し、顆
   粒球、単球と他の成分を分離したのち、顆粒球、単球の
   少ない血球浮遊液を白血球を捕捉するフィルターに通し
   て、リンパ球と他の成分とを分離し、そののちこのフィ
   ルターに捕捉されているリンパ球を回収することを特徴
   とするリンパ球以外の血球成分の少ないリンパ球浮遊液
   を得る方法。