DE2908721C2

DE2908721C2 - Filtereinheit zum Abtrennen von Lymphozyten aus Lymphozyten enthaltenden Suspensionen

Info

Publication number: DE2908721C2
Application number: DE2908721A
Authority: DE
Inventors: Toru Fuji Shizuoka Kuroda; Yoshinori Takenaka; Nobuaki Tsuda
Original assignee: Asahi Kasei Kogyo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1978-03-06
Filing date: 1979-03-06
Publication date: 1982-07-01
Also published as: FR2419058B1; GB2018149A; GB2018149B; US4246107A; DE2908721A1; FR2419058A1

Description

Die Erfindung betrifft eine Filtereinheit zum Abtrennen von Lymphozyten aus Lyrtiphozyten enthaltenden Suspensionen, in der Filterbehälter mit verschiedenen Fasermassen aus der Gruppe der Kunstfasern, der halbsynthetischen Fasern, der regenerierten Fasern und der natürlichen Proteinfasern in Serie angeordnet sind.

Unter dem Ausdruck »Lymphozyten enthaltende Suspension« sind hierbei Blut. Aszites, Knochenmark und andere Körperfiüssig!:eiten, die Lymphozyten oder ihre Vorläufer enthalten, zu versv hen. Dieser Ausdruck kann auch physikalisch, chemisch und/oder biologisch behandeltes Blut und andere Körperflüssigkeiten, wie z. B. mit einer physiologischen Lösung verdünntes Blut, mit Agglutin (z. B. Dextran oder Hydroxyäthylstärke) versehenes Blut, Leukozytenfilme und andere Lymphozyten enthaltende Suspensionsschichten, die durch Zentrifugieren oder Zellelektrophorese hergestellt wurden, umfassen.

In den letzten Jahren wurden auf dem Gebiet der Immunologie häufig aus Blut entnommene Lymphozyten verwendet. Zum Beispiel werden Lymphozyten bei immunologischen Untersuchungen über Gewebsverträglichkeits-Antigene und über Zellimmunität angewendet. Außerdem werden Lymphozyten zur Bestimmung der Lymphozytenblastotransformation oder zur Bestimmung des Verhältnisses T-Zellen zu B-Zellen sowie zum Versuch, Halper-T-Zellen und Suppressor-T-Zellen von T-Zellen zu trennen, verwendet. Darüber hinaus sind Lymphozytkomponententransfusionen sehr detailliert untersucht worden.

Es sind verschiedene Verfahren zur Abtrennung von Lymphozyten angewandt worden. Einige der typischen Trennverfahren sind z. B. das Dichtegradientenzentrifugierverfahren wie das Ficoll-Conray-Verfahren, das Sedimentations-(oder Zentrifugier-)Anhaftverfahren unter Aniikoagulans-Zusatz und das Verfahren der Zellelektrophorese.

Beim Zentrifugierverfahren z. B. werden mehrere Flüssigkeiten unterschiedlicher Dichte übereinander in einem Gefäß angeordnet, so daß sie aufeinanderliegende Dichtegradientenschichten bilden, das Blut wird auf die oberste Flüssigkeitsschicht gegeben, und dann werden die übereinanderliegenden Schichten zentrifu

giert, um das Blut in mehrere Schichten zu trennen.

Beim Antikoagulans-Zusatz-Sedimentations-(oder Zentrifugier-)Anhaftverfahren wird ein Antikoagulans in eine Lymphozyten enthaltende Suspension eingebracht; dann wird die Suspension mit dem Antikoagulans sedimentiert oder zentrifugiert, so daß die Suspension in ein Erythrozytensediment und eine Leukozyten enthaltende flüssige Schicht aufgeteilt wird; die Leukozyten enthaltende flüssige Schicht v. ird in eine Säule, die mit einer Fasermasse, wie ζ. Β Glaswolle, Baumwolle oder Nylonwolle, gepackt ist, eingeführt, in der die Temperatur der Flüssigkeit etwa 30 Minuten lang auf 37° C gehalten wird, so daß die Granulozyten und Monozyten in der Fasermasse eingefangen werden, und schließlich werden die Lymphozyten gewonnen.

Die obengenannten üblichen Verfahren haben einige Nachteile, die im folgenden beschrieben werden.

Das Dichtegradientenzentrifugierverfahren erfordert sehr viel Zeit und Erfahrung, um die Zentrifugierstufe vollständig durchzuführen. Wenn dieses Verfahren angewandt wird, unterliegen die Lymphozyten während des langen Zeitraums sehr elciht unerwünschten Veränderungen und werden durch das Zentrifugieren und die wiederholten Waschvorgänge geschädigt. Außerdem müssen beim Dichtegradientenzentrifugierverfahren viele teure Geräte benutzt werden. Wenn die mit diesem Zentrifugierverfahren gewonnenen Lymphozyten für eine Transfusion verwendet werden, müssen Zusätze wie Ficoll-Conray-Lösung oder Gummi arabicum aus den gewonnenen Lymphozyten entfernt werden.

Beim Sedimentations-Anhaftverfahren mit Antikoagulans-Zugabe ist viel Zeit erforderlich, um die Trennung der Lymphozyten aus der Lymphozyten enthaltenden Suspension vollständig durchzuführen, und außerdem ist es schwierig, eine an Lymphozyten reiche Suspension mit hoher Ausbeute zu gewinnen. Das Zellelektrophoreseverfahren erfordert teure Geräte und ist deshalb nachteilig.

Es waren einige Filtzrationsvenahren bekannt, mit deren Hilfe die Gesamt-Leukozytenkomponenten aus Blut abgetrennt werden können.

So wurden Leukozyten durch Filtration durch einen Stopfen aus Baumwollwatte aus dem Blut entfernt (A. Fleming. Br. J. Exp. Path., 7,281 [1926]).

Von T. J. Greenwalt et al., »A New Method for Preparing Buffy Coat — Poor Blood«, Transfusion 2, 221 (1962), wird die Verwendung von Nylonfasein, Acrylfasern, Polyesterfasern, Polyfluoräthylenfasern und Baumwolle als Filtermaterial zum Abtrennen von Leukozyten angegeben. Diese Fasern sind handelsübliche Textilfasern mit großen Durchmesser; dementsprechend wird auch eine relativ niedere Rate der Entfernung von Leukozyten erreicht.

Filterkolonnen, gefüllt mit Fasern aus regenerierter Cellulose (M. Langfelder et al., »Comparison of Different Methods Used in the Preparation of Leukocyte-Free Whool Blood and Erythrocyte Concentrates«, Vox. Sang., 19. 57-63 [1970]) und Filterkolonnen, gefüllt mit Baumwollwatte (P. Diepenhorst et al., »Removal of Leukocytes from Whole Blood and Erythrocyte Suspensions by Filtration through Cotton Wool«, Vox. Sang., 23, 308-320 [1972]) wurden ebenfalls bereits zum Abtrennen von Leukozyten aus Blut bzw. Zellsuspensionen eingesetzt. Die bekannten Filtermassen aus relativ groben Fasern führen jedoch nur zu einer sehr unvollständigen Abtrennung der Leukozyten aus dem Biut und ermöglichen nicht deren

Rückgewinnung.

Die Abtrennung und Gewinnung von Granulozyten aus heparinisiertem Gesamtblut durch Filtration des Blutes durch ein Nylonwolle-Filter wird von I. Djerassi et al. »Filtration Leukophoresis for Separation and Concentration of Transfusable Amounts of Normal Human Granulocytes«, J. Med. 1, 358-3S4 (1970) beschrieben. Es findet sich jedoch keinerlei Hinweis auf die Abtrennung von im wesentlichen allen Leukozytenbestandteilen (was offensichtlich auch nicht möglich wäre, denn die verwendete Nylonwolle unterscheidet sich nicht von der üblichen für Textilzwecke angewendeten).

Aus allen bekannten Verfahren ergibt sich keine Möglichkeit, Lymphozyten aus Lymphozyten enthaltenden Suspensionen selektiv abzutrennen. Lymphozyten sind kleiner als Granulozyten, und es ist daher schwierig, Lymphozyten mit Hilfe eines Filters zurückzuhalten. Um ein solches Abfiltrieren von Lymphozyten überhaupt zu ermöglichen, müßte eine große Faserrnenge unter hoher Schüttdichte in ein Filter eingefüllt werden. Andererseits ist es jedoch nicht möglich. Blut durch ein derart dicht gepacktes Filter fließen zu lassen, ohne hohen Druck anzuwenden. Angesichts dieser Schwierigkeiten, die gemäß dem Stand der Technik bereits bei der Abtrennung der Gesamtleukozyten aus Blut auftreten, konnte keinesfalls angenommen werden, daß es durch Auswahl spezifischer Faserabmessungen möglich sei, Lymphozyten selektiv abzutrennen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Filtereinheit zur Verfugung zu stellen, welche eine selektive Abtrennung und Gewinnung von Lymphozyten aus Blut und anderen Lymphozyten enthaltenden Suspensionen ermöglicht.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch Anwendung einer Kombination aus zwei unterschiedlichen Filtern mit verschiedenen Fasermassen gelöst.

Gegenstand der Erfindung ist eine Filtereinheit zum Abtrennen von Lymphozyten aus Lymphozyten enthaltenden Suspensionen, in der Filterbehälter mit verschiedenen Fasermassen aus der Gruppe der Kunstfasern, der halbsynthetischen Fasern, regenerierten Fasern und der natürlichen Proteinfasern in Serie angeordnet sind, die gekennzeichnet ist durch

a) ein Granulozyten und Monozyten adsorbierendes Filter, das eine Fasermasse nrt einem durchschnittlichen Faserdurchmesser von mehr als 10 μπι, ab=r nicht mehr als 60 μπι, dicht gefüllt enthält, und

b) ein Lymphozyten adsorbierendes Filter, das eine Fasermasse mit einer Schüttdichte von 0,04 bis 0,40 g/cm³ und einem durchschnittlichen Faserdurchmesser von 5 bis 20 μπι dicht gefüllt enthält. wobei der durchschnittliche Faserdurchmesser von b) kleiner als von a) ist.

In der erfindungsgemäßen Filtereinheit sind die beiden Filter, d. h., das Granulozyten und Monozyten adsorbierende Filter und das Lymphozyten adsorbierende Filter, in Serie angeordnet, wobei die Auslaßöffnung des einen Filters mit der Einlaßöffnung des anderen Filters verbunden ist.

In Abhängigkeit von der Reihenfolge, in der die zu behandelnde, Lymphozyten enthaltende Suspension durch die beiden Filter der Filtereinheit geleitet wird, sind folgende Arbeitsweisen möglich:

Die Lymphczyten enthaltende Suspension wird zuerst durch da« Granulozyten und Monozyten adsorbierende Filter a) geleitet, wobei ein wesentlicher Anteil der Granulozyten und Monozyten in der Fasermasse zurückgehalten und eine an Grpnulozyten und Monozyten verarmte, Lymphozyten enthaltende Suspension erhalten wird. Diese Suspension wird direkt durch das Lymphozyten adsorbierende Filter b) geleitet, wobei ein wesentlicher Anteil der Lymphozyten in der Fasermasse des Filters b) zurückgehalten wird. Danach werden aus Filter b) die zurückgehaltenen Lymphozyten gewonnen, wobei eine an Lymphozyten reiche Suspension erhalten wird.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung sind die Filter in der erfindungsgemäßen Filtereinheil so in Serie angeordnet, daß die Lymphozyten enthaltende Suspension zunächst durch das Filter b), das mit einer Fasermasse einer Schüttdichte von 0,04 bis 0,40 g/cm³ und einem durchschnittlichen Faserdurchmesser von 5 bis 20 μπι dicht gepackt ist, strömt, wobei ein wesentlicher Anteil der Leukozytenkomponenter; in der Fasermasse zurückschalten wird. Man gewinnt die in Filter b) zurückgeh iitenen Leukozytenkomponenten und erhält eine an Leukozytenkomponenten reiche Suspension, die dann durch Filter a) geleitet wird, das eine Fasermasse mit ■inem durchschnittlichen Faserdurchmesser von mehr als 10 μπι, aber nicht mehr als 60 μιη aufweist, wobei ein wesentlicher Teil der Granulozyten und Monozyten in der Fasermasse eingefangen wird und eine an Lymphozyten .eiche Suspension erhalten wird.

Die Erfindung wird nachstehend ausführlicher erläutert. In den Zeichnungen bedeutet

Fig. 1 ein Diagramm, das die Abhängigkeit des Prozentsatzes an eingefangenen Lymphozyten und an Granulozyten plus Monozyten vom durchschnittlichen Faserdurchmesser bei einer Schüttdichte von 0,085 g/cm³ zeigt,

F i g. 2 bis 4 schematische Darstellungen von Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Filtereinheit.

F i g. 5 eine Schnittansicht einer für die erfindungsgemäße Filtereinheit geeignete Auslaßleitung,

Fig. 6 eine Draufsicht auf die in Fit/. 5 gezeigte Auslaßleitung,

F i g. 7 und 8 Schnittansichten von zwei geeigneten Einlaßleitungen für die erfindungsgernäße Filtereinheit,

Fig. 9 eine schematische Darstellung einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Filtereinheit mit einem Beispiel für die Verbindung der beiden Filter und

Fig. 10 eine schematische Darstellung einer anderen Ausfuhrungsform der Verbindung der beiden Filter der erfindungsgemäßen Filtereinheit.

' 1 g. 1 zeigt den Zusammenhang zwischen dem durchschnittlichen Durchmesser der Einzelfasern in dem Filter und dem durch das Filter c'ngefangenen prozentualen Anteil an Leukozytenkomponenten, d. h., an Lymphozyten. Granulozyten und Monozyten. In Fig. I zeigt die Kurve Ly den prozentualen Anteil an Lymphozyten und Kurve CM den prozentualen Anteil an Granulozyten plus Monozyten, die durch das Filter zurückgehalten werden.

Der Prozentsatz der jeweiligen Leukozytenkomponenten ist durch folgende Gleichung definiert:

°/o eingefang.ne Leukozytenkomponente
= [(A-By A]- 100,

wobei A die Anzahl der Zellen jeder Leukozytenkoni-

ponente in einem Mikroleiter der ursprünglichen (el. h. unbehandelten) l.ymphozyten enthaltenden Suspension und B die Anzahl der Zellen jeder l.eukozytenkomponente in einem Mikroleiter der durch das Filter geleiteten Suspension ist.

Der hier verwendete Ausdruck »Faserdurchmesser« ist durch folgende Gleichung definiert:

Π -

■ ι> ■ γ

wobei D der Durchmesser der Faser in cm. ν this Gewicht der Faser in g. \ die Lange der Faser in cm und i) die Dichte der Faser in g/cm¹ ist. Die verwendeten Fasern haben im allgemeinen kreisförmigen Quer

j:~ ~u; ri.,r;„;.: f;v_ λ

Faserdurchmesser auch für Fasern mit nichtkreisförmigcm Querschn tt angewandt werden.

Die Kurven CM und Ly in Fig.! wurden in folgenden Versuchen erhalten. Polyacrylnitrilfasern mit unterschiedlichem durchschnittlichem Durchmesser wurden gesondert in eine zylindrische Polyvinylchloridsäule gepackt, und zwar mit einer Fülldichte von 0.085 g/cm'. Die zylindrische Polyvinylchloridsäule hatte einen Innendurchmesser von 1.0 cm und eine Länge von 10 cm. 20 ml Blut wurden in die mit Polyacrylnitrilfasern gepackte Säule gepumpt, das Blut floß durch die Säule mit einer Fließgesehwmdigkeit von 2 ml/min, und 12.7 ml Blut passierten das Filter.

Bei dem verwendeten Blut handelte es sich um heparinisiertes Blut einer Temperatur von 25 C mit 5.0 · 10^h Erythrozyten/Mikroütei, 5600 Leukozyten/Mikroliter (.?J00 Lymphozyten/Mikroliter und 4300 Granulozvteiv.MikOliter plus Monozyten Mikroliter) und 2.5 ■ 10' Blutplättchen/Mikroliter. Der Versuch wurde bei einer Temperatur von 25^r C durchgeführt.

Wie aus F i g. 1 hervorgeht, ist der prozentuale Anteil an Lymphozyten. der durch die gepackten Fasern zurückgehalten wird, um so größer. ;e kleiner der Durchschnittsdurchmesser der gepackten Fasern ist. Speziell dann, wenn der Durchschnittsdurchmesser der gepackten Fasern nicht mehr als 10 um beträgt, ist der Prozentsatz der eingefangenen Lymphozyten zufriedenstellend. Der durch die gepackten Fasern zurückgehaltene Prozentsatz an Granulozyten plus Monozyten ist selbst dann hoch, wenn der durchschnittliche Faserdurchmesser groß ist. Aus diesen Tatsachen ist ersichtlich. daP Filter a) in der erfindungsgemäßen Filtereinheit, das aus Fasern mit relativ großem durchschnittlichem Durchmesser besteht, zum selektiven Zurückhalten von Granulozyten und Monozyten geeignet ist und daß Filter b) mit Fasern mit relativkleinem durchschnittlichem Durchmesser sich zur selektiven Abtrennung von Leukozyten einschließlich Lymphozyten eignet.

Die Fasern, welche in den Behälter eines jeden der beiden Filter eingefüllt werden, werden aus der Gruppe der synthetischen Fasern, halbsynthetischen Fasern, regenerierten Fasern. Naturfasern, wie Baumwolle und Seide, und der anorganischen Fasern, wie Kohlenstoff a sem. Glasfasern und Metallfasern, ausgewählt. Jede dieser Faserarten kann für sich oder in Form einer Kombination aus verschiedenen Fasertypen eingesetzt werden. Die verwendeten Fasern sollten keine schädlichen Auswirkungen auf Lymphozyten und andere Blutbestandteile haben. Die Fasern sollten daher nicht aus Polymeren hergestellt sein, welche Monomereinheiten enthalten, die beispielsweise hömolytische Funktion besitzen, und sollten nicht mit Nachbehandlungsmitteln behandelt sein, die schädlich dem Blut gegenüber sind. Geeignete F'asern können aus der Gruppe der synthetischen Fasern ausgewählt werden, wie Fasern aus Acrylnitril-Polymeren (Homopolymer- und Copolymerfasern), Polyamidfasern und Polyesterfasern, der halbsynthetischen Fasern, wie Celluloseacetatfasern, und der natürlichen Proteinfasern, wie Seide.

Der Filterbehälter, in den die Fasermasse gepackt wird, kann jede beliebige Form haben und besitzt mindestens eine Einlaßleitung und mindestens eine Auslaßleitung, durch die Lymphozyten enthaltende Suspension und andere behandelte Körperflüssigkeiten oder physiologische Lösungen in den Behälter eingeführt bzw. aus ihm entfernt werden können. Günstig ist

tnp At λ Γ7^»>·η

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Außerdem ist es günstig, wenn der Behälter auf beiden Seiten der Fasermasse Maschennetze oder andere ähnliche Filter aufweist, damit die Fasern nicht aus dem Behälter entweichen. Der Behälter kann aus unschädlichem Material, wie Glas. Polyäthylen. Polypropylen. Polystyrol und Polyvinylchlorid, gefertigt sein.

Die hier verwendete Bezeichnung »Schüttdichte« bedeutet den in g/cm' angegebenen numerischen Wert, der dv ;'rh Division des Gewichtes (in g) der Fasermasse durch das Volumen der Fasermasse erhalten wird, d. h..

, durch das Innenvolumen des Behälters, wenn der Behälter vollständig mit der Fasermasse gefüllt ist.

Die in den Behälter gepackt? Fasermasse sollte nach Möglichkeit in allen Teilen der Fasermasse die gleiche Fülldichte haben. Die Fasern sollten, bevor sie in die

'·. Behälter gepackt werden, in einzelne Fasern aufge-•rennt werden. Außerdem sollten die Fasern eine bestimmte Länge haben, durch die die Fasern in Form einer verflochtenen oder verschlungenen Masse zusammengehalten werden können. Wenn die Fasern zu kurz

:■■ sind, entweichen sie leicht zusammen mit der durch den Behälter fließenden Flüssigkeit aus dem Behälter. Aus diesem Grunde sollten die Fasern eine Länge besitzen. die mindestens der von handelsüblichen Fasern, wie sie in der Textilindustrie verwendet werden, ungefähr

:-. gleich ist. Insbesondere sind Fasern mit einer Länge von mindestens 30 cm, die aus endlosen Fäden geschnitten sind, in diesem Fall besonders geeignet.

Die Anzahl der einzufüllenden Fasern wird hauptsächlich durch die Menge der jeweiligen Lymphozyten

"·" enthaltenden Flüssigkeit, die zu behandeln ist, und ihre Fließgeschwindigkeit bestimmt. Fasern aus verschiedenen Werkstoffen und/oder mit verschiedenem Durchmesser können kombiniert verwendet werden, wenn der durchschnittliche Durchmesser in den obengenannten

v. Bereichen liegt Die Fasermasse sollte in Form von verflochtenen oder verschlungenen Fasern sein, doch kann eine solche Masse in gewebter, nicht gewebter oder Maschenform sein.

F i g. 2 zeigt ein Ausführungsbeispiel der erfindungs-

po gemäßen Filtereinheit mit einem Filter 1 zum Einfangen von Granulozyten und Monozyten und einem Filter 5 zum Einfangen von Leukozyten, einschließlich Lymphozyten. Die Fasermasse 3 des Filters 1 und die Fasermasse 6 des Filters 5 sind in ein und denselben Behälter 2 gepackt, und ein Maschennetz 8 ist zwischen den beiden Fasermassen 3 und 6 vorgesehen, so daß die Fasern der einen Fasermasse nicht mit den Fasern der anderen Fasermasse vermischt werden. Der Behälter 2

hat cine Linlaßleitiinp 4 und eine Auslaßleitung 7.

Ι·" i g. 5 /cigl oiii anderes Ausführuiigsheispiel der erfindungsgemäßen Filtereinheit; die Fasermasse 5 des Kilters I und die Kasermasse 6 des Killers ΐ sind getrennt in zwei Behälter 2 bzw. 10 gepackt.

K i g. 4 zeigt ein weiteres Ausführungsbcispicl der erfindiingsgeniäßen Kiltereinhcit: diese Vorrichtung un', scheidet sich von der in K i g. J dargestellten darin, daß tine Pumpe 14 und ein Dreiwegehahn 12 in der Leitung 4 vorgesehen sind. Fine Leitung 1.3 geht vom Dreiwegehahn 12 zum Verbindungspiinkt zwischen einer Leitung 9 des Kilters 1 und einer Leitung Il ties Kilters 5. Durch Drehen des Dreiwegehahns 12 IiUIt sich die lließbalin der Klüssigkeil so ändern, daß du. Suspension entweder durch das zweite Kilter I oder die Leitung 13 geleitet wird.

Die in den Behälter des Kilters b gepackten Käsern sollen einen durchschnittlichen Durchmesser von 5 bis 20 ,! haben. Wenn der durchschnittliche Kaserdurchmes scr zu klein ist, wird eine zufriedenstellende Anzahl von Lymphozyten vom ersten Kilter eingefangen, aber es ist schwierig, die eirigefanger.cn Lymphozyten hier zu sammeln. Kolglich ist die prozentuale Ausbeute an Lymphozyten niedrig, und es wird schwierig, eine an Lymphozyten reiche Suspension mit einer bestimmten Konzentralion zu erhalten, die für Komponententransfusionen und verschiedene medizinische Tests und Untersuchungen erforderlich oder erwünscht ist. Wenn hingegen der durchschnittliche Kaserdurchmesser zu groß ist. ist der Prozentsatz an Lymphozyten. die vom KiI ?r b cingefaiigeri werden, zu niedrig, und die prozentuale Ausbeute an l.\mphozyten i«-1 'htilich gering.

Die Kaserschüttdichte des [liters b sollte zwischen 0.0-1 und 0.4 g/cm' liegen. Wenn die Schüttdichte zu niedrig ist. ist der Prozentsatz an Lymphozyten. die einwefangen werden, niedrig, was zu einer Verringerung de. Konzentration der gewonnenen Suspension führt. W-'nn hingegen die Schüttdichte zu hoch ist. wird es seh\- ierig. die Lympho/yten aus dem Kilter £> zu gewinnen. Kolglich ist die prozentuale Ausbeute an Lymphozyten niedrig.

Insbesondere liegen der durchschnittliche Kaserdurchmesser zwischen 7 und 10 um und die Kaserschüttdichte zwischen 0.04 und 0.25 g/cm'.

Das Innenvolumen des Behälters des Filters b kann normalerweise 0.5 bis 300 ml betragen, je nach dem Verwendungszweck der gewonnenen, an Lymphozyten reichen Suspension.

Die im Kilter b eingefangenen Lymphozyten können gewonnen werden, indem man eine physiologische Lösung in das Filter preßt. Die benutzte physiologische Lösung ist nicht kritisch und kann z. B. eine physiologische Kochsalzlösung. Serum. Plasma oder eine Mischungdaraussein.

Wenn die in F i g. 4 gezeigte Anordnung benutzt wird, sollte eine solche physiologische Gewinnungslösung in das Filter b gepreßt werden, während man das Filter mechanisch vibriert z. B.. indem man den Filterbehälter außen mit einem Holzstock beklopft oder während die Fließgeschwindigkeit bei einem hohen Wert gehalten wird oder während der innere Flüssigkeitsdruck des Filterbehälters diskontinuierlich geändert wird. Wenn die in F i g. 2 oder 3 gezeigte Anordnung benutzt wird, sollte die physiologische Gewinnungsflüssigkeit in das Filter 5 gepreßt werden, so daß die Lösung mit einer erhöhten Fließgeschwindigkeit durch das Filter a und von dort in das Filter b fließt.

Die Fasern in dem Behälter des Kilters u sollten einen durchschnittlichen Durchmesser von mehr als ΙΟμπι. aber nicht mehr als 60 μηι haben. Der durchschnittliche r.iserdurchmesser sollte außerdem größer sein als der des Kilters b. Wenn der durchschnittliche Kascrdtircli messer des Fillers α unter diesem Bereich liegt, hält dieses eine erhebliche Menge an Lymphozyten. Granulozyten und Monozyten zurück, was zu einer Verringerung der prozentualen Ausbeute an Lympho- ·" zyten führt. Wenn hingegen der durchschnittliche Kaserdurchmesser über diesem Bereich liegt, nimmt der Prozentsatz der im Kilter .) eingefangenen Granulo/yten und Monozyten ab. so daß die Reinheit der gewonnenen l.vmpliozyten geringer ist.

Die I aserfülldichte im Behälter des (liters ,·/ läßt sich nach Bedarf ändern, je nach der fließgescln«. indigkeit der f lüssigkcit und ihrer temperatur. Die [•"aserfülldichte sollte in einem Bereich von 0,05 bis 0.5 g/cm¹ liegen, noch besser aber in einem Bereich von 0.1 bis 0.4 c/cm'.

Das Innenvolumen des Behälters des filters b) laß; sich ebenfalls innerhalb eines großen Bereiches ändern, und zwar je nach dem Verwendungszweck der gewonnenen, an I.vmpliozyten reichen Suspension.

K i g. 5 und 6 zeigen ein Ausführungsbeispiel einer Auslaßleitiing der erfindiingsgeniäßen Filtereinheit; die Form der Auslaßleitiing 7 ist so. daß sie mit einem Injektor verbunden werden kann, indem man den Aiislaßnippul eines Injektors in die Leitung 7 einsetzt.

K i g. 7 und 8 zeigen Sehnittansichten von zwei Ausführungsbeispielcn einer F.inlaßlcitung für die erfindungsgemäße Filtereinheit: die Form der Kiulaßleitung 4 ist so. da« ·■ mit einem Injektor verbunden werden kann. Anstt'le der in Fig./ gezeigten Form kann die Einlaßleitj >c 4 selbst eine Iniektornadel sein. Wenn die Einlaßlei'jng 4 eine Injektornadel ist. kann Blut direkt von einem Spender entnommen und in das Filtriergerät gesaugt werden.

Fig. 9 ist eine schematische Darstellung einer

Ausführungsform der erfindungsgemäßen Filtereinheil.

Ur die relativ klein ist und sich zur Herstellung von Lvmphoz.yisuspensionen für verschiedene Tests und Untersuchungen eignet. Das Filter Γ zum Einfangen von Granulozyten und Monozyten und das erste Filter 5' zum Finfangen von Leukozyten sind ähnlich wie in

.:-. Fig. 3 angeordnet, abgesehen davon, daß die beiden Filter durch Einsetzen einer Leitung 1 Γ des Filters 5' in eine Leitung 9' des Filters Γ miteinander verbunden sind. Jede Fasermasse 3' und 6' ist zwischen zwei Maschennetzen 15 angeordnet, so daß die Fasern nicht

.μ aus den jeweiligen Behältern entweichen können.

Das Innenvolumen des Filters 1 der kleinen Filtereinheit in F i g. 9 kann in einem Bereich von 0,5 bis 5 ml liegen, besser noch von 1 bis 3 ml. »Innenvolumen eines Filters« bedeutet hier das Volumen, das man erhält, indem man das von den Fasern eingenommene Volumen vom Innenvolumen des Behälters subtrahiert. Wenn das Innenvolumen zu klein ist. ist viel Zeit zur Trennung von Granulozyten und Monozyten erforderlich oder die Reinheit der gewonnenen Lymphozyten ist κ· geringer. Wenn das Innenvolumen zu groß ist, wird eine große Menge an Lymphozyten enthaltender Suspension benötigt, um die gewünschte Menge an Lymphozytsuspension zu erhalten.

Das Innenvolumen des Filters 5' in Fig. 9 kann im

,5 Bereich von 02 bis " ir.i liegen, besser noch von 0,5 bis 3 ml. Bei einem ^ kleinen !nncnvolurncn ist es schwierig, die gewünschte Menge an Lymphozytsuspensionen zu erhalten, und durch ein zu eroßes Innenvolu-

men wird tlie pro/en malt Ausbeute an Ly mphozyten verringert.

In der in I' i p. 9 gezeigten Filtereinheit werden zuerst l.ymphozyten in dem Filter 3' eingefangen, während Granulozyten und Monozylen in Tilter Γ zurückgehalten werden. Danach wird I ilter Γ von F-Mter 5 getrennt und nur Filter 5 ausgewaschen, wobei die zurückgehaltenen l.ymph'izyten gewonnen werden. Anstelle dieser in F i g. 9 gezeigten, lösbaren Verbindung kann die crfindungsgemäBe filtereinheit auch die in Fig. IO <■■ gezeigte Anordnung haben, in der die beiden Leitungen II' und 9' mit Hilfe eines Dreiwegehalms I?'. der mi; einer anderen Leitung lh '.erblinden ist. miteinander verbunuen «erden können. Durch Anwendung diese. Dreiwegehalnis 12' kann da^k Wavlien niif dos eitlen Filters 5' und die Gewinnung von ! wnpln>/vten daraus '.•ι folget!.

Nachstehend wird die WirkungsA eise de ι e rl ι !idling ν gemäßen Filteivinlieit /ur -VbireritiuiiL· ' rni l.yinpho.'v '.en aus finer lyrnpho/yten cnthaitenden Suspension erläutert

lk"i d'T it¹ I ig. > ode^r i gezeigten ! ihereinlien wird eine I.;·.inph<■ -vten enthaltend·.· Suspension. / R mr einer l'innpe. durch die Leitung 4 in Filtc I geprell', worin ein wesentlicher l\ i! de" iti der ursprünglicher Suspension vorhandenen Gi anulo/y ten und Mono/vi, -i festgehalten win' Die anstehen-- an Granulozvu·;, iiTiic nil·! iin Mi'i"iii/Aieii arwe Suspension wire¹ in F i'ler ϊ gepreli', w<i ein erheblicher Teil der I ympho,·'. ten eingel.iiigen wird, lim die .:ewüi_:.sch'en I .vniphozvtep hoher Reinheit /u erhalten, sollten im Filter 5 verbleibende Anteile an Lrvthro/.ytc;. Blutpläucher uvd Plasma ausgespült wc-Jeti. D^;esi_ Ausspülung l-il.t: s:·. h durchführen, indem man <n FiIIe₁ 5 eine physiologisch'.· Lösung, z. B. physiologische Kochsalzlosung, durch I eitiing 7 einführt, und <!,iß die von· Filler I eingefangenen Grantilo/vten nicht in «Jas F ilte gelangen können. Wenn ein Serum als Waschflüssig··.:'! benutz", wird, kann dieses durch die Leitung 4 ·: in geführt werden, obwohl dies nicht vorzuziehen ist. Nachdem die ; .Spülflüssigkeit aus der Leitung 4 entfern·, ist, wird eine nhysj!.logische. Lösung durch Leitung 4 in Filter S hei erhöhter Fließgeschwinuigkeit gepreßt, so daß eine :\n I vmphozvten reiche Suspension mit hoher Reinheit aus Leitu:·;: 7 erhallen wird

Be; der in F ι g. -t gezeigten Filtereinheit wird eine i _. -, pno/yten enthaltende Suspension durch die Pumpe 14 djrch den Dreiwegehahn 12 in Filtc I und dann in Filter 5 gepreßt. Nachdem ein erheblicher Teil der (iranulozy'.en und Monozyten vom Filter I eingefangen ■■ wurde und ein erhebliche· Teil der Lymphozyten vom Filter 5 eingefangen wurde, wird eine physiologische Losung durch .i:e Leitung 4. den Dreiwegehahn 12 und die Leitung 13 in Filter 5 gepreßt, um Erythrozyten. Biutplättchen und Plasma, die im Filter 5 zurückgeblie- ν ben sind, auszuspülen. Dann wird eine physiologische Gewinnungsiösung in gleicher Weise in Filter 5 gepreßt, um eine an Lymphozyten reiche Suspension zu erhalten.

Die erfindungsgemäße Filtereinheit ermöglicht die Gewinnung einer an Lymphozyten reichen Suspension « in einfacher Verfahrensweise und innerhalb relativ kurzer ZeiL Dieses Suspension enthält nur sehr geringe Mengen an Erythrozyten. Monozyten und Granuiozyten. d. h- die Reinheit der Suspension ist hoch. Die Ausbeute an Lymphozyten ist ebenfalls hoch. Somit e ermöglicht die erfindur^s^emäße Füteneinhcit die leichte Durchführung von Kompor.ententn.nsfusionen in medizinischen Einrichtungen. Außerdem lassen sich leicht geringe Mengen an Lymphozyten, wie sie für verschiedene medizinische Tests oder Untersuchungen benötigt werden, fraktionieren oder aufnehmen.

In den folgenden Beispielen wird die !!rfindung näher erläutert. Wenn nichts anderes angegeben ist. beziehen sich die l'rozentzahlen auf die Anzahl der /eilen. Die Versuche wurden bei Raumtemperatur vorgenommen.

Beispiel I

3,817 g Pnlyncrylnitrilfnsern mit einem durchschniltli dien Durchmesser von 8.2 um und einer Lunge von etwa 4cm wurden gi< 'chmäl.iig mit einer Schüttdichte von 0.1 3 g/cm' in eine zylindrisch!' l'olyvinylchloridsäii-Ie mit einem Innendurchmesser von 1,8cm und einer Länge von 10 cm gepackt, so daß ein erstes F-V..er erhallen wurde. t,9S2g PoK ;iiiidfasern im; einem durchschnittlichen Durchmesser von 20.7 μηι und einer i.auge von etwa 4 citi winden giei« tiinaui^ nni uiti^-i .Schüttdichte von 0,082 g/cm¹ in eine andere zylindrische Polwmyichloridsüule mit einem Innendurchmesser von ? cm und ei η or I untre von 7.5 cm gepackt, so daß ein zweites Filter hergestellt war. Das erste und /weite Filter wurden wie in I ι g. 4 gezeigt angeordnet.

I leparinisiertes Blut von einem gesunden menschlichen Spende! wurde auf 37 C erwärmt; dann ließ man es mit ll'lte der Pumpe 14 durch den Dreiwegehahn 12. das zweite Filter I und das erste Filter 5 mit einer Fallgeschwindigkeit von 4 ηι1·ιιιιη fließen. Als 100 m! Blut durch die F.inkißöffiiung 4 geleitet waren, wurde die Pimpc 14 abgeschaltet, und der Dreiwegehahn 12 wurde um ^O im Uhrzeigersinn gedreht. Dann ließ man 150 ml einer physiologischen Kochsalzlösung mit Hilfe der Pumpe 14 durch den Hahn 12. die Leitung 13 und dann das erste Filter 5 mit einer Fließgeschwindigkeit von lOml/mn fließen. Schließlich wurden bei einer Fließgeschwindigkeit von 10 ml min 100 m¹ einer Gewinnungsfüjssigkei; mit einem pFF-Wert von b.5 bestehend aus 39.8"/n Albumina;. ;2.5°>Ό einer AC D-ALösung ¹J?'d ¹⁷.7°'i' einer physiologischen Kochsalzlösung, dir.h ias erste Filter 5 gepun Tt. während lOOmal'iiiin mit einem Hol/stock gegen die Säule geklopft wurde. Die so gewonnene, an l.vmph"/yten reiche Suspension enthielt 45'V der ursprünglichen Lymphozvteri und hatte eine LebenMähigkeit von <Wo. Die Gesamtmenge an Granulozyten und Monozyten in der gewonnenen, an Lymphozv ten reichen Suspension betrug ' Vo der Gesamtmenge alier Leukozytkomponenten, d. h., die Menge der in der gewonnenen Suspension enthaltenen Lymphozyten war 99% der Gesamtmenge aller Leukozytenkomponenten (die Reinheit der Lvmphozyten betrug 99°·Ό). Ferner enthielt die an Lymphozyten reiche Suspension 1% der ursprünglichen Erythrozyten und 5°/o der ursprünglichen Biutplättchen.

Beispiel 2

1.93g Polyamidfasern mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 21 μΐη und einer Länge von etwa 5 cm wurden mit einer Schüttdichte von 0,3g/cm³ gleichmäßig in eine zylindrische Polyvinylchloridsäule mit einem Innendurchmesser von 15 mm und einer Länge von 36 ml genackt, wobei ein Filter a erhalten wurde. Das Volumen des Filters a betrug 4,7 ml. 0,263 g Polyacrylnitrilfasern mit einem durchschnittlichen Durchmesser

Il

von S.I6 μιη und einer Länge von etwa JO mm wurden mil einer Schüttdichte von 0,1Ji f/cm^! gleichmäßig in L-ine andere zylindrische l'olyviiiylchloridsäule mit einem Innendurchmesser von 10 mm und einer Länge von 25,5 mm gepackt, wobei ein Filter b hergestellt -> wurde. Das Volumen des Filters b betrug 1,78 ml. Die beiden mit Fasern gepackten Säulen wurden wie in F i g. 9 angeordnet.

Der Auslaßnippel eines 25-ml-lnjektors wurde in die Leitung T des ersten Filters 5' eingesetzt. 5 ml w heparinisiertes Blut von einem gesunden menschlichen Spender wurden auf eine Temperatur von ?7"C erwiirmt und dann mit I lilfc de= Injektors in die I .citung 4' des Filters 1' (Filter ;() gesaugt und flössen mit einer Fließgeschwindigkeit von 3 ml/min durch Filter I und Filter 5'. Als das Blut sich nicht mehr vom Filter Γ /um Filter 5' bewegte, wurde auch die durch den Injektor bewirkte Saugung beendet, und die beiden Filter 1 und 5' wurden voneinander getrennt. Dann wurden 20 ml lließgcschwindigkeit von 2 ml'min. Der Injektor wurc¹.· von der Leitung 7 gelöst und an der Leitung 4 angebracht, und dann wurden 30 ml einer physiologischen Kochsalzlösung durch die Leitung 7 in die beiden Filter gesaugt und durchströmten diese mit einer Fließgeschwindigkeit von 4 ml/min. Dann wind·.- der Injektor von der Leitung 4 gelöst, und anstelle des Injektors wurde ein anderer mit 2 m! einer physiologischen Kochsalzlösung gefüllter Injektor an der Leitung 4 angebracht. Die physiologische Kochsalzlösung wurde sofort in die beiden Filter 1 und 5 gepreßt, so daß 2 ml einer an l.ympho/yten reichen Suspension aus der Leitung 7 gewonnen wurden. Die Konzentration de·' gewonnenen l.ympho/yten in der Suspension u.r i^xv der ursprünglichen Lympho/ytenkon/enir,,iio:i mi BIu;. Die gesamte in der gewonnenen Suspension entlia't^ne Menge an Granulozyten und Monoz.vten war 8"· .'.er gesamten Menge aller Leiikozvtkomponcnter.. .1 l·... die Mentrc der I ympho/yten in tier Suspension het-ug '-O¹Vi,

pnyMVMUt: ■ >Li"lt r\.OCu.S5i/iOSüiij; in uiC i.Ciiiifig ■ ' GCS Filters 5' mit Hilfe des Injektors gesaugt und flössen mit einer FlieBgeschwindigkeit von 5 ml/min durch Filler V Dann wurde der Injektor von der Leitung 7' gelöst, und danach wurde ein anderer Injektor, der mit 2 ml einer physiologischen Kochsalzlösung gefüllt war. an der Leitung 7' angebracht. Die physiologische Kochsalzlösung wurde sofort in Filter 5' gepreßt, so dn!> 1 ml einer an Lymphozy ten reichen Suspension aus der Leitung 11 gewonnen wurden. Die Konzentration der gewonnener Lympho/ytsn in der Suspension war 70'Vc der ursprünglichen Lymphozytenkon/.entration im R¹Ut. Die L.ympho/yten hatten eine Lebensfähigkeit von mindestens 1°)%. Die gesamte in der gewonnenen, an Lymphozyten reichen Suspension enthaltene Meng·.· an Granulozyten und Monozyten war 7% der gesamten Menge aller Leukozytkomponenten, d. h.. die in der Suspension enthaltene Menge an Lympho/ytcp war 93% der gesamten Menge aller Leukozvtkomponenteii (die Reinheit der Lymphozyter war 9J¹Vn). Ferner enthielt die gewonnene, an Lymphozyie"·, reiche Suspension Ο.8^ΟΊ", der ursprünglichen Erythrozyten und 4% der ursprünglichen Blutplättchen.

Beispiel 3

1.448 g eier Polyesterfasern mit einem durehscrr ·<ϋ chen Durchmesser von 14.3 μιη und einer Länge '-or etwa 50mn; wurden mit einer Schüttdichte von 0,18 g/cm' gleichmäßig in eine zylindrische Polyse.rolsäule mit einem Innendurchmesser von 16 mm und einer Länge von 40 mm gepackt, so d,i3 ein Filter ,·; erhalten wurde. 0,471 g Polyamidfasern mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 10.6 μιη und einer Länge von etwa 30 mm wurden mit einer Schüttdichte von 0.20 g/cm³ gleichmäßig in eine zylindrische Polystyrolsäule mit einem Innendurchmesser von 10 mm und einer Länge von 30 mm gepackt, so daß ein Filter b erhalten wurde. Die beiden so hergestellten Filter wurde"! wie in F i g. 3 angeordnet.

Der Auslaßnippel eines 25-ml·Injektors wurde in die Leitung 7 des Filters 5 eingesetzt. 9 m! heparinisiertes Blut von einem gesunden menschlichen Spender wurden auf eine Temperatur von 37= C erwärmt und dann mit Hilfe des Injektors durch Leitung 4 in Filter 1 und in Filter 5 mit einer Fließgeschwindigkeit von etwa 2 ml/min gesaugt. ASs beide Filter mit Blut gefüllt waren. wurde die vom Injektor bewirkte Saugung beendet. Dann wurden 2 ml Serum vom AB-Typ auf ähnliche Weise in die zwei Filter gesaugt, und zwar rr.it einer (die Reinheit der gewonnenen Lymphozyten war -IJ!'¹/, ι lerner entiutlt die gesammelte Suspension 1.4" de ursprünglichen Erythrozyten und W« der Ursprung chen Blutplättchei..

Beispiel 4

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0 198 g Polyesterfasern mit einem dui'i-hse' Durchmesser von 12 4 μπι und einer Langt vor e'w.i 3,8 cm wurden mit einer Schüttdichte von (MJ! c .-nr gleichmäßig in eine /ylitutrische PolystyroMiuie mi; einem Innendurchmesser von i-vl mm und einer Langt von iOcm gepackt, so daß ein F'Uer n erhalten würde Das Volumen des Filiers ,·. betrug 1.3 m,. U.2-M g PoIv₁ esterfasern mit einem durchschnittlichen messer von *■'μηι and eine: Länge von etw.i wu'\:>.i: mit iner Schütu'vhte von 0.1 ng. cm¹ andere z.\iir.Urisi.iie PoKsivrolsäule mit einen durchtr sser wn '2.5 mm und eine,' Or-te \o; gepäck., so daß ein Fiite- b hergebe'¹' w Volumen des erster FiU-'-s war !,6Jj;r. V": tasergepackten Säulen vv.i: den w_:e in F ■ t" ° '. er

Der -VislabYiippel eines ^^■ml-lniekt'T'- ·> I.eiturig 1 des Filters 5 emgeset/i Injek-irnade! wurde mit der Leitung 4 ei verbunden. Ltwj 3.2 rr\ Blut wurden aus .;e gefunden menschlichen Spenders durch die C¹O! mit einer Fließgesdiwiiidigkeit von e:· cr.üiommon. Dann wurden die beiden I vorieip.ir.de getrennt. 20 ml einer ;Μ;ν-.,,Ί.^!χ Kochsalzlösung wurden dann durch (!■; Leuung 11 einer Flioßgeschwindigkeit von etw . 5 mi ;v,;-- \- l^:i!ter 5 gesaugt. Dann wurde der injek'or von Je: "Leitung 7" gelöst, und anstelle des Injektors wurde ein. anderer mit 2 ml einer physiologischen Kochsalzlösung gefüllter Injektor an der Leitung T angebr.-cht. Die physiologische Kochsalzlösung wurde sofort ir Filter 5 gepreßt, so daß 2 m! eine an Lymphozyten reichen Suspension aus der Leitung 11' gewonnen wurden. Ϊ m! heparinisiertes Blut wurde vom gleichen Spendeentnommen, und ein vergleichender Test dieses Birne? mit der gewonnenen, an Lymphozyten reichen. Suspension wurde durchgeführt. Der vergleichende Test zeigte, daß die Konzentration der gewonnenen Lymphozvten in der Suspension 60% der ursprünglichen Lvmphozytenkonzentration im Blut war. Die Reinheit der gewonnenen Lymphozyten war 95%. Ferner enthielt die Suspension 0.6% der ursprünglichen Erythrozyten und 3% der ursprünglichen Blutkörperchen Oowc:-,, be'_:

und 5

diesem Experiment kein Antikoagi'lans verwendet
wurde, koagulierte die gewonnene, an Lymphozyten
reiche Suspension nicht. Diese Tatsache weist deutlich
darauf hin, daß Antikoagulantien, die normalerweise bei
der Trennung von Lymphozyten benutzt werden, bei

I-

Anwendung der erfindungs Trennung von Lymphozyte müssen. Die mit Hilfe der er heit gewonnenen Lymphoz; Antikoagulantien beeinträch

Hier/u 4 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentanspruch:

Filtereinheit zum Abtrennen von Lymphozyten aus Lymphozyten enthaltenden Suspensionen, in der Filterbehälter mit verschiedenen Fasermassen aus der Gruppe der Kunstfasern, der halbsynthetischen Fasern, regenerierten Fasern und der natürlichen Proteinfasern in Serie angeordnet sind, gekennzeichnet durch

a) ein Granulozyten und Monozyten adsorbierendes Filter, das eine Fasermasse mit einem durchschnittlichen Faserdurchmesser von mehr als ΙΟμπι, aber nicht mehr als 60μπι, dicht gefüllt enthält, und is

b) ein Lymphozyten adsorbierendes Filter, das eine Fasermasse mit einer Schüttdichte von 0,04 bis 0,40 g/cm³ und einem durchschnittlichen Faserdurchmesser von 5 bis 20 μιπ dicht gefüllt enthalt, wobei der durchschnittliche Faserdurchmesser von b) kleiner als von a) ist.