JPS5854130B2 - 白血球分離法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は血液、体液等の血球浮遊液から、白血球を選
択的に分離する方法に関するものである。

さらに詳しく述べると、血液、骨髄液、リンパ液などの
ように血液を含む体液、およびこれらの液に何らかの処
理を加えて得た血球を含む液体、たとえばデキストラン
やヒドロキシエチルスターチなどの赤血球凝集剤を加え
て得た赤血球の大部分を除去した血液、遠心分離操作に
よって得た細胞浮遊液等少なくとも赤血球および白血球
を含む液体から白血球以外の物質である赤血球、血小板
、蛋白質、脂肪等を除去し、白血球の高純度浮遊液を得
る方法に関するものである。

近年、赤血球、白血球、血小板等を血液から分離し、種
々の疾患の治療のために輸血することが行われるように
なってきた。

このような細波成分輸血は従来の全血輸血とは異なり、
不必要なものは除去して必要な成分だけを濃縮して輸血
できるという大きな利点を待っている。

特に白血球の輸血は、白血球数が異常に低下し、細菌な
どにより発熱した患者の治療や免疫療法に、広く各地の
病院で行われている。

このような目的に使用可能な従来の白血球分離技術とし
ては、血球の比重差を利用した重力遠心分離方法、血球
の粘着、付着などの作用を利用した捕捉材利用の方法、
フィルターによって分離する方法、赤血球凝集剤を用い
た分離方法等が利用されている。

白血球の分離方法としてよ（用いられているものは、赤
血球、白血球、血小板等その成分毎に異なる比重を利用
して、白血球と同じ比重の液体に血液を重層して遠心操
作を行う密度勾配遠心分離方法、白血球を捕捉する物質
を入れたカラムに血液を流し、捕捉物質に捕捉された白
血球を回収して白血球を得る方法、孔径５μｍ程度の濾
過膜や繊維を用いた濾過器を用いるフィルター利用の方
法、デキストラン、ヒドロキシエチルスターチ等の赤血
球凝集剤によって赤血球を沈降させる方法、またはこれ
らの方法の組み合わせである。

しかし、これらの方法で得られる白血球は純度が低い。

すなわち、これらの方法で得た白血球浮遊液には、必ず
赤血球やその他の血液成分が混入している。

たとえば赤血球の場合、白血球の数倍から数十倍混入し
ていることがほとんどである。

また純度をあげるために洗浄等の操作を加えてゆくと、
白血球の収率が非常に悪くなってしまい、実用上不適当
であった。

すなわち、密度勾配遠心分離方法や連続遠心分離方法等
遠心操作を行う方法では、通常必要とされる血液量を処
理するためには大型の遠心分離器を必要とし、分離した
白血球浮遊液中に含まれる赤血球、血小板、血漿等の不
必要成分を除（ためには、さらに数回の洗浄操作、すな
わち遠心分離操作が必要である。

これらの操作を行う際、白血球の一部は破壊され、白血
球の収率が悪くなり、白血球の純度も期待するほど良く
ならないのが普通であるとともに、一連の操作には熟練
を要し、非常に煩雑である。

白血球を捕捉する物質を用いる方法では、捕捉された白
血球とともに赤血球が多量に残ることが多く、回収され
た白血球浮遊液には、白血球の数倍から数十倍の赤血球
が混入していることが多い。

純度をあげるためには、白血球を捕捉させたのち洗浄液
で洗浄してやれば良いが、この際白血球の一部も流出し
、白血球の収率が下がってしまい、純度も期待するほど
あがらない。

フィルターを利用する方法は、得られた白血球浮遊液中
に赤血液の混入が多く、純度をあげるために行なう洗浄
の過程で白血球が流出して、収率が悪くなることが多い
。

赤血球凝集剤を用いる方法は、比較的簡便な操作により
白血球浮遊液を得ることができるが、白拍球のほかに赤
血球が白血球の数倍以上混じり、血小板、蛋白質等は除
けない。

また、白血球の収率も非常に悪い。

そこで、我々はこれらの問題点を解決し、簡便な操作で
純度の高い白血球浮遊液を収率良く分離できる方法を提
供することを目的に鋭意研究した結果、白血球分離用捕
捉材あるいはフィルターに白血球を捕捉した後、−捕捉
材あるいはフィルターに溶血剤を流すことにより、赤血
球混入率が白血球に対して数パーセント以下になり、血
小板、蛋白質等の混入も非常に少ない白血球浮遊液が得
られることを見出し、この発明を得るにいたった。

すなわちこの発明は、白抽球捕捉材あるいは白血球分離
フィルターを用いて細波、体液またはこれらを処理して
得られる細胞浮遊液から白血球を分離する方法であって
、捕捉材あるいはフィルターに白血球を捕捉した後、捕
捉材あるいはフィルターに溶血剤を流すことを特徴とし
た白血球の分離方法である。

ここで言う白血球捕捉材とは、例えばナイロン、アクリ
ル、綿等の繊維；ガラス、プラスチック等のビーズなど
白血球が粘着し易い素材を言い、これに血液を接触させ
て白血球を捕捉することのできるものである。

例えばビーカーや試験管などの容器中で白抽球捕捉材と
血液を接触させ、白血球捕捉剤に白抽球を粘着させた後
、ロートに移して白血球以外の血液成分を洗い流してや
り、その後白血球捕捉剤から粘着している白血球を回収
してやるという様な使い方をする。

また、ここで言う白血球分離材には、孔径５μｍ程度の
濾過膜の様に赤血球、血漿等は通過し易いが白血球は通
過し難いと言う構造を持ったものも含まれる。

次に、白血球分離フィルターとは、上記した白血球捕捉
材を流体の出入口を持つ容器に納めたものであって、実
際に白血球分離操作を行なう際、使い易い構造にしたも
のである。

本発明による白血球分離方法は、たとえば第１図に示す
ような装置により実施される。

血球浮遊液１は容器２に溜められポンプ３により白血球
分離器（白血球分離フィルター）４に送られる。

このとき弁５および９は開かれ、弁６，７，８゜１０は
閉じられている。

血球分離器４に送られた血球浮遊液１は、ここで白血球
が捕捉され、一方、赤血球、血小板、蛋白等白血球以外
の成分は容器１１に向かって送られる。

血球浮遊液１が、すべて容器２外に送り出された時点で
弁５を閉じ、弁６を開く。

すると容器１２内の洗浄液１３が血球浮遊液１と同じ回
路を通って血球分離器４に送られ、血球分離器４内の赤
血球、血小板等白血球以外の成分の大部分を洗い流す。

この時点では、血球分離器４内の赤血球は白血球の数倍
から数十倍以上残っていることが多い。

この後、弁６を閉じ、弁７を開くと、容器１４内の溶血
剤１５が血球分離器４に送られ、血球分離器４内の赤血
球を破壊する。

この後、弁７を閉じ、弁６を開くと、容器１２内の洗浄
液１３が血球分離器４に送られ、血球分離器４内の破壊
された赤血球成分である、ヘモグロビンやゴースト等を
洗い流す。

つぎに弁６゜９を閉じ、弁８，１０を開くと、容器１６
内の回収液１７が血球分離器４に送られ、ここで物理的
あるいは化学的に白血球を回収し、回収された白血球の
回収液浮遊液が容器１８に送り込まれろ。

ここで、ポンプ３は白血球に悪影響を与えないものであ
ればどんなタイプを使用しても良いが、市販の血液ポン
プのように、流量可変式のものが便利である。

血球分離器４とは、たとえばナイロン繊維、ガラスピー
ズ等白血球を捕捉する捕捉材を入れたカラムのように血
球の粘着、付着などの作用を利用した捕捉材利用の白血
球分離フィルター、および、孔径５μｍ程度の濾過膜を
容器に納めて濾過器を構成した白血球分離フィルターを
言う。

洗浄液１３とは、生理食塩水、ヘパリン加生理食塩水、
リンゲル液等、白血球に悪影響を与えないものであれば
なんでも良く、血球分離器４に残存する白血球以外の赤
血球、血小板、蛋白質等の大部分を洗い流してやる目的
で使用する液体である。

溶血剤１５とは蒸留水、０．２％食塩水等の低張溶液、
塩化アンモニウム溶液等、白血球にあまり悪影響を与え
ずに赤柚球を破壊できる溶液をいう。

溶血剤１５の使用方法は、低張溶液の場合は赤血球を破
壊するのに足りる最高濃度すなわち最大赤血球抵抗程度
かやや低い程度（０，２５〜０．３５％ＮａＣ１溶液）
の低張溶液を使用することが望ましく、また塩化アンモ
ニウムのような溶液では赤血球を破壊するのに足りる最
小濃度で使用するのが望ましい。

また、溶血剤１５の使用量は。極力大容量にした方が血
球分離器内４内に残存する赤血球を均一に溶血させるた
めに望ましいが、１つの血球に接触している時間は赤血
球を破壊するのに足りる最小限（２０秒〜６０秒）にす
ることが望ましい。

このためには、溶血液１５を流すときに多少流量をあげ
たり、血球分離器４内での流れの乱れを防ぐ等の配慮が
必要である。

また、溶血液１５を流した後、溶血液が低張溶液などの
場合は、より早く等張に戻すために、高張溶液を流して
やるような配慮をすることが望ましい。

回収液１７とは、生理食塩水、ＡＣＤ 力０血漿等白血
球に悪影響を与えないものであればなんでも良いが、使
用する血球分離器４０タイプ別に最も効果的な液体を用
いれば良い。

また、回収方法も使用する血球分離器４０タイプ別に最
も効果的な方法を採用すれば良い。

以上のようにして得られた白血球浮遊液の赤血球の混入
率は非常に低く、白血球総数に対して赤血球総数は数パ
ーセント以下であり、従来の方法と比較すると、赤血球
混入率は百分の１以下になっている。

実施例 １ 健康人の血液（赤血球数５００万／−１白血球数７００
０ ／ｎｉｌ、血小板２５万／ｍ１１、総蛋白濃度７
？／ｄｌ ） １００ｍｌにヘパリンを１０００単位採
血時に加え、この血液を血球浮遊液１として実験に使用
した。

この血液を第２図に示す実験回路を用いて処理した。

まず上記した血球浮遊液１を容器２に入れ、ポンプ３に
より血球分離器４に流量５ｒｕｌ／ｙｒｍ、で送った。

このとき弁５，９は開き、弁６，７゜２Ｌ８，１０は閉
じた状態にしであるので、血球分離器４を通った血球浮
遊液１は容器１１に入る。

血球分離器としては、直径８．５μｍ程度のポリアクリ
ロニトリル繊維の綿を０．１３Ｓ’／−の密度で直径１
８ｉπ、長さ１００１ｍの容器に詰めたフィルターを使
用した。

血球浮遊液１が容器２から完全に排出された時点で弁５
を閉じ、弁６を開いて容器１２内の洗浄液１３をポンプ
３により血球分離器４に１０ｒＩＬｌ／ｗｉｎの流量で
送った。

洗浄液１３としては、生理食塩水１００ｒＩＬｌに対し
てヘパリンを１０００単位加えたものを使用した。

洗浄液１３を５０ｍ１流した時点で弁６を閉じ、弁７を
開いて容器１４内の溶血液１５をポンプ３により血球分
離器４に流量２０ｍ１ｌ―で送った。

溶血液１５としては０．３％食塩水を用いた。

溶血液１５を２０ｒｎｌ流した時点で弁７を閉じ、弁２
１を開いて容器１９内の高張溶液２０をポンプ３により
血球分離器４に流量２０ｍ１／ｙｎｉｎで送り、等張に
戻してやった。

高張溶液２０としては１．５％食塩水を用いた。

高張溶液２０を２０ｒｒＬｌ流した時点で弁２１を閉じ
、弁６を開いて容器１２内の洗浄液１３をポンプ３によ
り血球分離器４に流量２０１ｒＬｌ／１ｒｕＩＬで送っ
た。

洗浄液１３を３９ｍ１流した時点で流量を１０ｍ１／ｖ
ｉｘに落して、さらに８０ｍ１の洗浄液を流した。

この時点で弁６，９を閉じ、弁８，１０を開いて容器１
６内の回収液１７をポンプ３により血球分離器４に流量
５ ｍｌ／ｍｉｎで送り、血球分離器４に振動を与えな
がら白血球を回収し、容器１８に白血球の回収液浮遊液
を溜めた。

回収液１７としては、ＡＣＤ加アルブミン溶液を用いた
。

回収液１７を１００ｍ１流した時点でポンプ３を止め、
容器１８内に得られた白血球の回収液浮遊液１００１ｒ
Ｌｌを検査したところ、この実験に供された血球浮遊液
の総量に対して、白血球は６５％回収され、赤血球は０
．００２％であり、赤血球の白血球に対する割合は２％
程度であった。

また、血小板は２％以下、蛋白質は回収液１７の成分と
同等であった。

比較例 １ 実施例１と同様の回路を使用し、容器１４゜１９、弁７
，２１．溶血液１５、高張溶液２０は使用しなかった。

本比較例では、まず血球浮遊液１を流した後、洗浄液１
３を流量１０ｍ１／ｍｍで２００ｍ１流し、溶血処理を
しないで白血球を回収した。

その他の実験条件は実施例１と同一である。その結果、
容器１８内に得られた白血球の回収液浮遊液１００ｍ１
を検査したところ、この実験に供された血球浮遊液の総
量に対して白血球は６５％回収されたが、赤血球が０．
３％も含まれており、赤血球の白血球に対する割合は３
３０％すなわち３倍を越えていた。

また、血小板も１％程度と多かった。

蛋白質は抽出液１７の成分と同等であった。

実施例 ２ 実施例１と同様の回路を使用し、細球分離器４として白
血球捕捉材として知られるナイロン繊維を０．１５ｙ／
−の密度で直径１８闘、長さ１００山のカラムに詰めた
ものを使用した以外は、実施例１の実験条件と同じ条件
で実験した。

ここで使用したナイロン繊維の直径は７．５μｍであっ
た。

その結果得られた白血球の回収液浮遊液１００ｒｒＬｌ
を検査したところ、この実験に供された血球浮遊液の総
量に対して白血球は６０％（白血球の内容別では顆粒球
が多くリンパ球は少なかった）であったが、赤血球は０
．００１５％と低く、赤血球の白血球に対する割合は２
％弱であった。

また、血小板は１．５％程度、蛋白質は回収液１７の成
分と同等であった。

比較例 ２ 実施例１と同じ条件で採取した血液５０ｍ１をリン酸緩
衝生理食塩水で２倍に希釈し、これを比重１．０７７の
液体に重層させたものを２本用意し、スイング型ロータ
ーで４００ＸＳ’で遠心分離し、中間層にある白血球層
を集め、さらにリン酸緩衝溶液で１回遠心洗浄した。

その結果得られた白血球浮遊液を検査したところ、この
実験に供された血液の総量に対して白血球は３０％（白
血球の内容別ではリンパ球がほとんどを占めていた）で
あったが、赤血球が０．３％も含まれており、赤血球の
白血球に対する割合は７倍以上であった。

また血小板は１５倍であった。比較例 ３ 実施例１と同じ条件で採取した血液１００ｒｒｌｌに、
分子量３０万のデキストラン５％溶液１００ｒＩｌｌを
加え、１時間後に上清の白血球層を採取した。

この液を検査したところ、この実験に供された加液の総
量に対して白血球は６０％回収できたが、赤血球が２％
も含まれており、赤血球の白血球に対する割合は約２４
倍であった。

また、血小板、蛋白質、デキストラン等は残ったままで
あった。

以上述べたように、この発明の血球分離方法を用いるこ
とにより、従来では不可能であった高純度の白血球を、
高い収率で得られるようになった。

すなわち、従来の方法では、白血球総数に比して赤血球
や血小板等の混入率が数倍から数十倍もあり、白血球の
収率低下なしには高純度の白血球は得られなかったのに
対し、本発明の方法によれば、白血球総数に比して赤血
球や血小板の混入率は数十分の−から数百分の−となり
、白血球の収率も６０％程度以上になった。

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図は、それぞれ本発明による白血球分離法
を実施するための装置の例を示す模式図である。 １〜血球浮遊液、３〜ポンプ、４〜血球分離器、１３〜
洗浄液、１５〜溶血剤、１７〜回収液、２０〜高張溶液
。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 白血球捕捉材あるいは白血球分離フィルターを用い
   て血液、体液またはこれらを処理して得られる細胞浮遊
   液から白血球を分離する方法であって、捕捉材あるいは
   フィルターに白血球を捕捉した後、捕捉材あるいはフィ
   ルターに溶血剤を流すことを特徴とした白血球分離法。