JPS60231613A - Ｔ細胞とｂ細胞の分離方法およびその分離材ならびにその分離装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ■　発明の背景 発明の分野 本発明は、リンパ球、血液成分などの体液成分の分離材
および分離装置ならびに分離方法に関するもので、更に
詳しくは、リン脂質またはリポソームの親木性基に対す
る粘着性の差を利用して体液成分を分離するための体液
成分分離材およ・び分離装置ならびに分離方法に関する
ものである。

以下の説明においては、体液成分はリンパ球を代表例と
し、その亜分画であるＴ細胞とＢ細胞の分離について行
うが、この例に限られず、血液成分、脱水成分などの他
の体液成分の分離についても本発明は広く包含するもの
である。

従来技術とその問題点 リンパ球は免疫監視機構で主役を演じている細胞であり
ながら、グツド症候群のような疾病の発生に関与すると
いう複雑な機能を持つ細胞である。したがって、生体防
御機構の解明や免疫疾患の臨床検査、細胞間相互作用を
調べる上で、リンパ球のＴ細胞、Ｂ細胞両群や特定機能
の局在したリンパ球サブセットを分離することは重要な
課題である。

リンパ球とよばれる細胞集団の中には、種々の点で性質
の異なる、少なくとも２種類の細胞集団の存在すること
がわかっている。代表的細胞集団は、胸腺由来細胞（’
ｔｈｙｍｕｓ−ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｉｙｍｐｈｏｃｙｔｅ
）であるＴ細胞と、骨髄由来細胞（ｂｏｎｅ　■ａｒｒ
ｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｌｙｗｐｈｏｃｙｔｅ　）とが
ある。

このようなＴ細胞とＢ細胞の従来の分離方法は、現状で
は一つの方法で両細胞を完全に分離することは困難であ
る。従来の末梢血からのＢ細胞、Ｔ細胞の分離方法は、
いずれもまず、　Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅなとの高密
度等張液な用いた比重遠心法により、白血球のうち７０
〜９０％のリンパ球を含む白血球浮遊液を獲得し、次い
でこれを分離処理している。この後続する分離処理の主
なものには、次の六つの方法が知られている。

（１）ノイラミニダーゼ処理したヒツジ赤血球を用いた
ロゼツト形成法 （２）ナイロン繊維を用いたカラム法 （３）多孔性表面を有する水不溶性かつ疎水性の固体あ
るいは酸性官能基を含有する粒状疎水性固体物質を用い
た分離法 （４）フルオレッセンス・セルソーターによる分離法 （５）無支持体連続電気泳動法 （６）アフィニティクロマトグラフィーしかしながら、
上記従来法には下記のような欠点がある。

第１の方法は、ヒツジ赤血球とリンパ球を共存させるこ
とにより、リンパ球を刺激してしまう。

第２の方法は、分離が十分にされず、またＴ細胞の回収
率は必ずしもよくない、さらに、ナイロンウールに粘着
したＢ細胞を活きの良い状態で溶離する適切な方法がな
い。

第３の方法は、Ｔ細胞の分離、回収率は良いが、Ｂ細胞
の回収率は低い。

第４の方法は、蛍光標識に抗血清を用いるために、細胞
に刺激や損傷を与えてしまうこと、１０７〜１０８個程
度のリンパ球の大量取得が困難である。

第５の方法は、簡便に大量分離できる利点を有している
が、細胞の成熟度によって易動度が異なり、また細胞の
機能に与える電場の影響が解明されていない。

第６の方法は、細胞の機能変化に関して未知の危険性が
含まれている。

第５の方法を除いた第１〜第６の方法に共通して、処理
操作が簡便でないか、あるいは、処理時間が長いという
欠点がある。

具体的公知例として、特開昭５６−１４０８８６、同５
８−７４６１１などがあるが、上記方法の内の一つであ
り、同様の問題点がある。

ＩＩ　発明の目的 本発明は上述した実情に鑑みてなされたもので、その目
的とするところは、リンパ球のＴ細胞とＢ細胞のような
体液成分を効率よく分離でき、機能を損なうことなく細
胞を回収でき、操作が簡便で特殊な装置を必要とせず、
さらに臨床検査だけでなく、免疫疾患治療、細胞培養に
も適用できる広い応用性を有する対液成分分離材および
分離装置ならびに分離方法を提供しようとするにある。

■　発明の具体的構成 本発明の第１の態様によれば、親油性基および親木性基
を有する脂質の該親水性基に体液成分を接触せしめ、該
体液成分の該親木性基に対する粘着力の差を利用して体
液中から該親水性基に対して粘着し易い体液成分と粘着
しにくい体液成分とに分離することを特徴とする体液成
分分離方法が提供される。

本発明の第２の態様によれば、支持体に親油性基および
親水性基を有する脂質を該親水性基が体液成分と接触す
るようにして体液成分の該親木性基に対する粘着力の差
を利用して体液中から体液成分を分離するよう構成して
なることを特徴とする体液成分分離材が提供される。

本発明の第３の態様によれば、体液流路を経てヴいに連
通する体液流出入口を備えた本体と、該本体内に備えら
れ、該体液流路の少なくとも一部を形成する支持体に親
油性基および親水性基を有する脂質を該親水性基が体液
成分と接触するようにしてなる体液成分分離材とからな
り、体液成分の該親木性基に対する粘着力の差を利用し
て体液中から体液成分を分離するよう構成してなること
を特徴とする体液成分分離装置が提供される。

以下、本発明の内容を更に詳細に説明する。

本発明はリンパ球のような体液からその成分を分離、回
収するものである。前述の如く、ここではリンパ球の亜
分画であるＴ１８胞およびＢ細胞の分離、回収について
説明を行うが、本発明の対象はこれに限られることはな
い０例えば血小板や血球等の細胞の分離にも使用可能で
ある。要は体液中の細胞成分で粘着性の差を有するもの
であればよい。

本発明の基本的思想は、リンパ球の亜分画であるＴ細胞
およびＢ細胞の粘着性（度）の差を利用して両者を分離
、回収し、診断、治療に役立てようとするものである。

従来より特定の物質に対する粘着性の差を利用して分離
回収する方法は行われているが、満足いく状態でなかっ
たとは前述の通りである。

本発明においては、分離材として、親油性基および親水
性基を有する両親性の脂質を用いるのであるが、分離成
分が親油性基の側に接触すると、その粘着力が強すぎて
親油性基からの成分の剥・離（溶離）が困難で、剥離し
たとしてもその機能を損なって後の検査等に問題を残す
、そこで１体液分離成分は上記脂質の親水性基の側に接
触させるようにすれば、両者の粘着力は適度で、Ｔ細胞
およびＢ細胞の分離が細胞機能を損なうことなく容易に
行えることを本発明者らは見い出し、本発明に至ったも
のである。

分離材としては、脂質に限られず脂質を構成成分とする
リポソームも利用でき、親水性基と分離成分とが接触す
るよう構成した分離材または装置は生体膜に近似し、生
体適合性に優れているため、細胞を刺激したり、損傷し
たりしない上、両細胞の分離が適度な粘着力の差により
十分に行なえ、さらに粘着した細胞の剥離も円滑に行わ
れる。

尚、体液成分の前記脂質に対する粘着力には電気的引力
や物理的な結合等種々の要因があり、これらの要因を包
括して本発明においては粘着力と表現した。

脂質またはリポソームは、その親木性基が体液分離成分
と接触するように支持体または基体上に固定する必要が
ある。その固定方法および固定剤との組合せにつき詳細
に説明する。脂質またはリポソームの親木性基が体液と
接触するように固定されたものが分離材であり、この分
離材を適当な装置に組み込んだものが分離装置で、分離
材また！＋語蓋壮署で汰倍陰令ル分謄十ムことが分離方
法を意味する。

まず第１に、リポソームのハイドロゲルにより固定した
分離手段について一例を述べるが、これに限定されるこ
とはない。

（１）　リポソームをハイドロゲルにより固定した分離
手段 （１−１）リポソームの調整 ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミ
ン、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスフ
ァチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、
スフィンゴミエリン、カルシオリビン等のようなリン脂
質より少なくとも１種の適当なリン脂質をｌθ〜１００
鵬ａ１％、リン脂質を強化する場合には例えばコレステ
ロールを２０〜５０＋ｗｏ１％、酸化防止のためにはα
−トコフェロール、アスコルビンパルミテートあるいは
アスコルビルステアレート等を０．１〜３ｍｏ１％、さ
らに電荷を付与する場合にはジセチルリン酸、ジアセチ
ルリン酸あるいはステアリルリン酸等をθ〜１５ｍｏ１
％混合し、従来既知の方法でリポソームを調整する。そ
して、遊離の脂質を除くために、超遠心分離して沈降リ
ポソームのみを捕集する。必要ならば、ニュクリボア・
メンブレン等のよりサイジングを行う。リポソームの最
終脂質濃度は５〜２０　終＋１０１／ａｌｌとするのが
よい。

なお、リポソーム調整の際には、緩衝液として、ｐ）１
７．２〜７．４のＴｙｒｏｄｅａ’ｓ　ｂｕｆｆｅｔあ
るいはＨａｎｋ’ｓ　ｂａｌａｎｃｅｄ　５ａｌｔ　５
ｏｕｌｕｔｉｏｎを使用する（以降、単にバッファとい
う）。

（１−２）リポソーム／ハイドロゲルの調整リポソーム
とハイドロゲル原液は１容：２容の割合で混合するのが
好ましい。

ハイドロゲルの原液の一例を挙げると、２２．５　ｗｌ
マ％アクリルアミドあるいは、７．５ｗハ％ポリビニル
アルコール、１５ｖ／マ％ゼラチン、２０ｗ／マ％ポリ
ビニルピロリドンに、必要に応じて架橋剤として１〜５
％のメチレンビスアクリルアミドを加えた溶液を用いる
。

なお、モノマーあるいはポリマーを溶解する液には上記
バッファを用いるのが良い。

ハイドロゲルの原液に使用しうる他のものとして、ポリ
（，２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリメタ
クリル酸、ポリ（Ｎ　、　Ｎ−ジメタルアミノエチルメ
タクリレート）、ポリエチレンオキサイド、多糖類、ア
ルギン酸ナトリウム、コラーゲン、フィブリンなどがあ
る。

（＋−３）支持体 リポソームをハイドロゲルで固定する支持体としては、
多孔壁へのホローファイバーとしては、ポリプロピレン
製、再生セルロース製、ポリメタクリル酸メチル製、エ
チレン−酢酸ビニル共重合体製などがあるが、多孔性で
ないホローファイバーでもハイドロゲルの固定が適切に
なされる処理をすれば用いることができる。また、多孔
性シートなど形体は問わない。

（１−４）分離材、分離装置の作製側 孔径２０Ａ　ＮＯ，４ｍ、長さ１〜３０　ｍ、ｐｏｒｏ
ｓｉｔｙ３０〜７０％の多孔性ホローファイバ−１〜ｌ
ＯＯ本をコイル状に束ね、両端をエポキシ樹脂あるいは
ポリウレタン樹脂で固定して、アクリル管あるいはガラ
ス管に収納する。

ホローファイバーの中空部分に前記リポソーム／ハイド
ロゲルを流し、１０〜６０分間静置後、バッファで洗浄
し、両端をバラフィルム等でおおい、γ線を約３　Ｍｒ
ａｄ照射する。次いでバッファで残存モノマーあるいは
ポリマーを洗浄し、分離材あるいは分離装置として用い
る。

なお、架橋剤としてアクリルアミドの場合は、γ線照射
の代りに、５％テトラエチルメチレンジアミンおよび２
．５％過硫酸カリウムをそれぞれ０゜５容添加した後、
１０〜３０分間放置して重合させても良い。

次に、脂質のシランカップリング剤により固定した分離
手段について述べるが、これに限定されることはない。

（２）脂質をシランカップリング剤により固定した分離
手段 （２−１）シランカップリング剤およびその結合ルトリ
メトキシシラン、オクタデシルトリメトキシシラン、Ｎ
、Ｎ−ジメチル−Ｎ−オクタデシル−３−７ミノプロビ
ルトリメトキシシリルクロライドなどを用いることがで
きる。

（２−２）脂質およびその吸着 脂質としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジル
エタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジル
セリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジル
グリセロール、スフィンゴミエリン、カルシオリピンな
どのリン脂質を少なくとも１種用いるのが好適である。

例えば、ホスファチジルコリンを３５〜１００ｍｏ１％
、電荷を付与する場合には、ジセチルリン酸、ジアセチ
ルリン酸あるいはステアリルアミン等をθ〜１５ｍｏ１
％混合し、クロロホルム溶液とする。最終脂質濃度は５
〜２０終■ｏｌ　／−とするのが良い。

この液を、上記処理を施したガラスキャピラリーの中空
部分あるいはプラスチックカップ内の捨て、蒸留水で軽
く洗浄する。次いで１２時間以−Ｆ減圧乾燥してこれを
分離材として使用する。

（２−３）分離装置の作製例 上記処理を施した長さ１〜３０ｍのガラスキャピラリー
１−１００本をコイル状に束ね、両端をエポキシ樹脂あ
るいはウレタン樹脂で固定してアクリル管またはガラス
管に収納する。あるいは、−上記処理を施したガラスピ
ーズを、低面にナイロンネットあるいはステンレスメツ
シュを取り付けたアクリル製カラムまたはガラス製カラ
ムに充填する。

■　発明の具体的作用 次に、本発明の作用を、第１図を参照しつつ、体液成分
の分離、回収操作について説明する。

ヘパリン加ヒト末梢血からソジウムメトリゾエートーフ
イコール混液（２０℃で比重１．０７７　）を使って、
比重遠心法により分離し、バッファで洗浄した白血球分
画を１０６〜１０７個／ｄの濃度で、バッファに懸濁さ
せる。

これを細胞分離装置ｌの細胞貯蓄容器２に入れ、コック
４を調節して静かにリンパ球分離器５に流した後、あら
かじめ溶離液貯溜容器３に入れておいたバッファを連続
的に流す。分離基５内の分離材６は上記のいずれでも良
い、この時、流出液の濁度をフローセルを使用した検出
装置７で測定する。記録装置８の記録紙上に描かれるピ
ークを見ながら、必要な流出液分画を捕集装置９に一定
量づつ捕集し、細胞を回収する。

分離材として、多孔性ホローファイバーの支持体上にリ
ポソームをハイドロゲルで固定した例について説明する
。

この分離材の一構成例を第２図に示す。第２ａ図に見え
るように、ホローファイバーｌＯの中・空部にはその多
孔１４によりハイドロゲル１１が固定され、このハイド
ロゲルによりＯ印で示すリポソーム１２が固定されてい
る。この時、多数の脂質で構成されるリポソームは、脂
質の親油性基が内側となり、親水性基が外側表面に並ぶ
構造となっていて、親水性基がホローファイバーの中空
部分すなわち体液成分の流路に露出している形となって
′おり、これを誇張して第２ａ図にはＯで１２として示
している。

前述した分離、回収操作のようにして、ホローファイバ
ーに体液を流すと、第２ｂ図に印で示されるように、リ
ンパ球の亜分画の内Ｂ細胞１３がリポソーム１２に粘着
する。一方、Ｔ細胞はＢ細胞に比べてリポソームへの粘
着力が小さいのでそのままホローファイバーの中空部を
流出していく。したがって、検出装置７においては、最
初に実質的にＴ細胞のみが検出され、捕集される。リポ
ソームにより粘着されたＢ細胞は例えばバッファのよう
な溶離液によりリポソームより分離すれば、実質的にＢ
細胞のみが回収される。

次に、分離材として、ガラスキャピラリーの支持体上に
脂質をシランカップリング剤で固定した例について説明
する。

この例では、第２図において、１０を多孔１４のないガ
ラスキャピラリーとし、１１をシランカップリング剤、
１２を脂質、１３をリンパ球と老女れぽ、リンパ球のＢ
ｍ胞の脂質への粘着を前記と全く同じ説明でカバーする
ことができるのは明白である。

リンパ球の亜分画の内Ｂ細胞が上述したように脂質また
はリポソームの親水性基により粘着され、捕獲される理
由については複合的であると考えられている。Ｂ細胞は
Ｔ細胞に比べて電子顕微鏡観察によると凹凸が激しく表
面はなめらかではない。このため、脂質やリポソームの
親油性基あるいはナイロン繊維などにからまれると、そ
の粘着力が強くなりすぎて、溶離が困難になると思われ
る。これに対し、脂質やリポソームの親水性基に対する
粘着力はＴ細胞との粘着力差を十分に発揮し、かつ溶離
も簡単な程度であるのである。。

また、Ｂ細胞の脂質またはリポソームの親木性基に対す
る粘着力は電気的な引力によっても発現されていると考
えられている。このようにＢ細胞の粘着は物理的あるい
は電気的な結合力に基いていると考えられる。

■　発明の具体的効果 本発明においては、支持体、細胞分離作用を有する物質
および支持体と細胞分離作用物質を適当に選択して組み
合わせることにより優れた分離材、分離装置および分離
方法が得られる。

多孔性ホロファイバー、ハイドロゲル、リポソームの組
合せおよびガラスキャピラリー（ガラスピーズ）、シラ
ンカップリング剤、脂質の組合せは特に優れたもので、
支持体へのリポソームまたは脂質の固定は確実で簡単に
行うことができ、脂質またはリポソームの親水性基は体
液流路に整然と並べられ、親油性基が体液流路に並べら
れるようなことはなく、優れた分離能が付与される。

脂質またはリポソームのＢ、Ｔ細胞の分離能はその親木
性基に対する粘着力がＢ細胞では大きく、Ｔ細胞では小
さく、その差は適度なものである。従って、Ｂ、Ｔ細胞
は確実に分離され１回収される。また、脂質またはリポ
ソームの親木性基に粘着されたＢ細胞の剥ＩＩＩ（溶離
）も例えばバッファを流すなどの極めて簡単な操作で行
うことができ、細胞機能を損なうことなく細胞を回収す
ることができる。

本発明の上述した組合せで得られる分離材を用いた分離
装置の操作において、体液を流し、次いでバッファを流
すといった簡単な操作のみでよく、従来のように他に特
殊な装置を必要としない。

本発明によれば、細胞機能を損なうことなく、Ｂ細胞お
よびＴ細胞を分離、回収することができるので、臨床検
査だけでなく、免疫疾患治療、細胞培養に利用できる。

■　実施例 次に、本発明を実施例につき具体的に説明する。

〔実施例１〕 下記組成（ａ）、（ｂ）のリポソームを（１−１）で述
べたようにして調製した。

リポソーム成分モル比 脂質濃度１８．３　＃Ｌａｏｌ／ｄ ｏｃｐ　：　ジセチルホスフェート このリポソームを、？、５ｗ／マ％ポリビニルアルコー
ル（重合度的２，０００）及び１，５ｍハ％Ｎ。

Ｎ−メチレンビスアクリルアミドを含むバッファーより
なる組成のハイドロゲル原液に混合し、３　Ｍｒａｄの
γ線を照射して重合、架橋した。

このようにして得られたリポソーム／ハイドロゲル液を
、孔径０．５５−、　ｐｏｒｏｇｉｔ７４５％のポリプ
ロピレン製ホローファイバーの中空部をエタノールで濡
らした後、ホローファイバーの中空部にコーティングし
て分離材を得た。

これを第１図に示すような装置にセットして以下に述べ
るようにして分離、回収操作を行い、細胞分離状態を検
出した。上記組成（ｂ）の結果を第３図のグラフに示す
。

なお、組成（ａ）でも、（ｂ）とほぼ同等の結果であっ
た。

正常人末梢血より採取したリンパ球の懸濁液（５Ｘ　１
０６　ｃｅｌｌｓ／ｄ）をカラムに流し、続いてバッフ
ァーを流した。モしてカラム流出液の濁度（波長４００
　ｎ園）を連続的に測定、記録し、フラクションコレク
ター（東洋製作新製、角型重量式フラクションコレクタ
ー、型式：５Ｆ−１６０２）で２．５ｄずつ分画採取し
て細胞を回収した。

〔実施例２〕 下記組成の脂質を内径０．２５■■、長さ２５ｍのガラ
スキャピラリー内面上に１％Ｎ、Ｎ−ジメチルーＮ−オ
クタデシル−３−アミノプロピルトリメトキシシリルク
ロライドを用いて（２−２）で述べたようにして固定し
、分離材を得た。

これを第１図に示すような装置にセットして実施例１と
同様にして細胞分離を行った。

成分モル比 ＋１１ｉ　Ｉｆ　１ｍ　麻ｉｎ　ａ　ｓｏ　ｌ／ｄ　−
ＣＭＣＩ＊ＥＰＣ：　卵黄ホスファチジルコリン ＳＡ：　ステアクリルアミン （ｄ）の結果を第４図のグラフに示す、なお、（ｃ）で
も、はぼ同等であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の体液成分分離装装置の一構成例を示す
線図、第２ａ図は多孔性ホロファイバーにリポソームを
ハイドロゲルで固定した分離材の線図的断面図、第２ｂ
図は第２ａ図の分離材にリンパ球を通した時リンパ球の
Ｂ細胞が粘着された状態を示す図、第３図は、リポソー
ム／ハイドロゲル液をホローファイバーの中空部内面に
コーティングして得た分離材を用いてリンパ球を分離し
た時のクロマトグラム、第４図はシランカップリング剤
をガラスキャピラリーの中空部内面にコーティングして
得た分離材を用いてリンパ球を分離した時のクロマイト
グラムである。 符号の説明 ｌ・・・細胞分離装置、２・・・細胞貯溜容器、３・・
・溶離液貯溜容器、４・・・コック、５・・・リンパ球
分離基、６・・・分離材、７・・・検出装置、８・・・
記録装置、９・・・溶出液分画捕集装置、ｌｏ・・・ホ
ローファイバー、１１・・・ハイドロゲル、１２・・・
リポソーム、１３・・・リンパ球（Ｂ細胞）、１４・・
・多孔 特許出願人　チル七株式会社 第２図 第３図 ；飛　出　液量　（ｍり 第４図 製出液量（ｍｌ） 手続補正書印発） 昭和６０年　５月　１日 １、事件の表示 昭和５９年特許願第８６５６９号 ２、発明の名称 体液成分分離方法およびその分離材ならびにその分離装
置３、補正をする者 事件との関係　特許出即人 住　所　東京都渋谷区幅ケ谷二丁目４４番１号名　称　
チル七株式会社 代表取締役　戸　澤　三　雄 ４、代理人　〒ｌｏｔ 住　所　東京都千代田区岩本町３丁目２番２号千代田岩
本ビル４階 □□□□〜 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 ６、補正の内容 （１）　明細書第１４頁第４行目と第５行目の間に次の
文章を加入する。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）親油性基および親水性基を有する脂質の該親木性
   基に体液成分を接触せしめ、該体液成分の該親水性基に
   対する粘着力の差を利用して体液中から該親木性基に対
   して粘着し易い体液成分と粘着しにくい体液成分とに分
   離することを特徴とする体液成分分離方法。
2. （２）支持体に親油性基および親水性基を有する脂質を
   該親木性基が体液成分と接触するようにして体液成分の
   該親水性基に対する粘着力の差を利用して体液中から体
   液成分を分離するよう構成してなることを特徴とする体
   液成分分離材。
3. （３）体液流路を経て互いに連通ずる体液流出入口を備
   えた本体と、該本体内に備えられ、該体液流路の少なく
   とも一部を形成する支持体に親油性基および親木性基を
   有する脂質を該親木性基が体液成分と接触するようにし
   てなる体液成分分離材とからなり、体液成分の該親水性
   基に対する粘着力の差を利用して体液中から体液成分を
   分離するよう構成してなることを特徴とする体液成分分
   離装置。