JPH0558707B2

JPH0558707B2 -

Info

Publication number: JPH0558707B2
Application number: JP57052759A
Authority: JP
Inventors: Teiji Tsuruta; Yasuhisa Sakurai; Shohei Inoe; Kazunori Kataoka; Mitsuo Okano; Takao Nishimura; Mizuo Maeda; Tetsuo Watanabe; Atsushi Maruyama
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1982-03-31
Filing date: 1982-03-31
Publication date: 1993-08-27
Also published as: JPS58170717A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はリンパ球浮遊液からＢ細胞を粘着除去
し、Ｔ細胞を採取するための分離材、および該分
離材を用いたＢ細胞分離器、さらに該分離材を用
いてＢ細胞を分離除去する方法に関する。極めて複雑な生体内の細胞混合物の中から目的
の細胞だけを、できる限り純粋にしかも機能を損
なわずに分離することは、免疫学の基礎的研究に
不可欠であるのみならず、免疫疾患、血液疾患、
ガンなどの診断・治療にもきわめて有用である。
たとえば、免疫担当細胞であるリンパ球には、そ
の起源、抗原性、細胞膜表面形質、機能を異にす
るＴ細胞（胸腺由来リンパ球）とＢ細胞（骨髄由
来リンパ球）という２つの亜集団が存在するが、
これら免疫担当細胞群を選択的に分離し、量的、
質的に把握することができれば、原発性免疫不全
症あるいはリンパ系亜性腫瘍の診断・治療に対す
る有益な知見を得ることができる。この両者の分
離において、螢光色素にて標識した抗血清を用い
て、リンパ球を染色し、フルオレセイン・アクテ
イベイテツド・セル・ソーターにより、螢光標識
された細胞を分別する方法が、最近、注目されて
いる。しかしながら、この方法は、装置が高価な
こと、抗血清を処理するために細胞に刺激や損傷
を与えてしまうといつた大きな問題点をかかえて
いる。これに対し、各種細胞の高分子材料に対す
る粘着性の差を利用して細胞を分離する手法であ
る細胞粘着クロマトグラフイーは、操作が比較的
簡便であるという利点を有し、これまでにも、ナ
イロン繊維を用いたリンパ球からのＴ細胞の分離
精製法が知られている。しかしこれまでの報告例
では、分離の特異性が低くく、純度の高いＴ細胞
はわずかしか得られず、又、長時間リンパ球を繊
維と接触させるため回収細胞の機能が保持されに
くいといつた欠点も有している。ここで云うＢ細胞とは、表面に免疫グロブリン
を有するリンパ球を云い、螢光標識された抗（免
疫グロブリン）抗体により、螢光染色される。Ｔ
リンパ球は該抗体により染色されないリンパ球を
云う。本発明者らは、かかるリンパ球分離の現状をふ
まえ、Ｂ細胞を迅速かつ効率的に除去し、Ｔ細胞
を高純度かつ細胞に免疫反応的刺激を与えずに採
取することを目的として、Ｂ細胞およびＴ細胞の
異物表面に対する粘着現象について詳細な検討を
加えた結果、実におどろくべきことにリンパ球と
強い相互作用を有するアミノ基が表面に不均一に
分布して存在する固体がすみやかにＢ細胞を選択
的に除去でき、かつ粘着した細胞が構造変化をう
けにくいことを見出し、さらに種々の実験をくり
返えし、本発明を完成するに至つた。すなわち、本発明は、表面にアミノ基が不均一
に分布して存在する水不溶性固体よりなる、リン
パ球浮遊液からＢ細胞を粘着除去するＢ細胞分離
材、および該分離材を液の出入口を有し、かつ少
くとも該液出口側にフイルターを設けたカラム内
に充填してなるＢ細胞分離器、ならびに該分離材
に流動状態にて、リンパ球浮遊液を接触させるこ
とを特徴とするＢ細胞分離方法に関するものであ
る。本発明において、表面に不均一にアミノ基を有
する固体として用いられる固体物質は、水に不溶
性の物質からなるものであれば、その性質、形状
をとわずに使用できるが、なかでも水と親和性の
低い、いわゆる疎水性化合物とアミノ基を有する
化合物とが、夫々海島状若しくはラメラ状に存在
する固体であることが望ましい。アミノ基を表面
に不均一に保持させるためには、ポリアミノ化合
物と疎水性重合体との混合、アミノ化合物の疎水
性重合体へのグラフト重合、高分子アミノ化合物
を含む単量体と疎水性単量体との共重合などの手
段によつて達成できるが、アミノ化合物が共有結
合により、疎水性重合体に結合したグラフト重合
体、共重合体がより好適に用いられる。アミノ化合物は疎水性重合体に対して、５〜25
重量％、より好ましくは７〜20重量％の範囲が好
適に用いられる。アミノ化合物が多すぎても、少
なすぎても、リンパ球の粘着が強くおこるため
に、Ｔ細胞とＢ細胞との粘着挙動に差が小さくな
り、好ましくない。アミノ化合物は分子量1000〜10000、より好ま
しくは2000〜5000の範囲が好適に用いられる。分
子量が小さすぎる場合には、充分な大きさの島状
構造が存在せず、分子量が大きすぎる場合には、
島状構造の数が少なくなり好ましくない。本発明に用いられるアミン化合物としては、ア
ルキレンイミンおよびその誘導体、ジビニルベン
ゼンとジアミンとの重付加化合物など特にその化
学構造に限定されずに用いられるが、次の一般式
で示される化合物 R₁、R₂、R₃＝C_lH_2l+1（ｌ＝０〜３）ｍ＝１〜３がより好適に用いられる。なかんづく、次式で示
される分子量1000〜10000、より好ましくは2000
〜5000のアミノ基を含む単量体 R₁、R₂、R₃＝C_lH_2l+1（ｌ＝０〜３）ｍ＝１〜３を用い、疎水性単量体との共重合を行なつて得ら
れる共重合体が特に好適に用いられる。ここで云
う疎水性単量体とは、スチレン、メチルスチレ
ン、ジフエニルエチレン、エチルスチレン、ジメ
チルスチレン、ビニルナフタリン、ビニルフエナ
ントレン、ビニルメシチレン、クロルスチレン、
ブロムスチレン、メトキシスチレン、メタクリル
酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸シ
クロヘキシル、ビニルピリジンなどが含まれる。本発明のＢ細胞分離材は、前記した重合体単独
でもよいが、ガラス粒子や他の水不溶性重合体粒
子および繊維などにコーテイングしたものも好ま
しい実施態様の一つであり、なかでも粒径40〜60
メツシユの球状粒子にコーテイングしたものが好
ましい。本発明におけるＢ細胞分離材は前記したポリア
ミノ化合物及びスチレン又はスチレン誘導体が不
均一に分布して存在する水不溶性固体に蛋白質を
付着せしめたものが好ましい。付着の際、用いる蛋白質溶液は、血清アルブミ
ン、γ−グロプリンもしくは動物血清、動物胎児
血清などに含まれる血清蛋白質を0.02％以上、さ
らに好ましくは0.1％以上含む培養液もしくは緩
衝液である。付着方法は、該不溶性固体を、上記蛋白質を含
む液中に浸し、１時間以上、好ましくは12時間以
上静置し、その後吸引過により蛋白質を含む液
を除き、乾燥を行う。静置温度は、蛋白質が変質しない温度であれば
いずれでもよく、４℃から室温（18〜25℃）の範
囲が好ましい。本発明において、Ｂ細胞分離材に蛋白質を付着
せしめることにより、リンパ球の粘着性を全般的
に減少させ、Ｔ細胞とＢ細胞との分離の選択性を
向上させることができる。本発明に用いるＢ細胞分離器の１例を図面に基
づいて説明すると、リンパ球浮遊液を注入するた
めの入口１とリンパ球浮遊液を流出させる出口２
とを持つたカラム３に、出口の所にＢ細胞分離材
が流出しない程度の孔径を有する、ポリアミドも
しくはポリエステルなどから作られるフイルター
４を取り付け、カラム３内に前記したＢ細胞分離
材５が充填されてなるものである。なお、フイル
ター４は入口側にも設けてよい。前記分離器のカラムは長さ５cm以上、より好ま
しくは８cm以上、カラム長さ／カラム径（Ｌ／
Ｄ）の比は10以上、より好ましくは20以上のもの
が好適に用いられる。上記の如きＢ細胞分離器を用いて、リンパ球浮
遊液中のＢ細胞を分離するには、まずリンパ節、
ヒ臓もしくは血液より、遠心法、比重遠心法など
の方法により調整したリンパ球を生理的浸透圧を
有する培養液、緩衝液に浮遊せしめる。細胞濃度
は0.5〜2.5×10⁴個／mm³程度が好ましい。この浮遊
液を、あらかじめ培養液もしくは緩衝液にて分離
材を湿潤状態にした分離器に連続的に注入し、分
離器出口より流出するリンパ球浮遊液を採取する
ことにより行う。リンパ球を浮遊させるための液
はCa²⁺、Mg²⁺イオンを含まないことがより好ま
しい。リンパ球浮遊液の分離器への注入速度は、カラ
ム内の滞留時間が１分以上、より好ましくは３分
以上になるように設定することが好ましい。以上の方法により流出したリンパ球浮遊液中に
は、Ｂ細胞はほとんど含まれない。又、粘着した
Ｂ細胞は、分離材を混合撹拌することにより容易
に溶出させることができる。分離操作の際の温度は、細胞障害を与えない温
度であればいずれでもよいが、室温（18〜25℃）
から37℃程度の範囲が好ましい。このようにして得られたＴ細胞は、生存率、幼
若化能、抗体産生調節能などはいずれも、分離操
作前と比較して変化は認められなかつた。以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説
明する。実施例分離材の調整：高分子量アミノ基を有する単量体の調整テトラヒドロフラン100ml中に、ジビニルベ
ンゼル0.1モル、Ｎ，N′−ジエチルエチレンジ
アミン0.1モルおよびリチウム・ジイソプロピ
ルアミド５ミリモルを混合溶解し、窒素雰囲気
下にて、20℃で４日間、さらに０℃で３日間、
−13℃にて３日間反応させることにより、分子
量5000（ゲル・パーミエシヨン・クロマトグラ
フイーにより測定した。）の次の化学構造を有
する単量体（ポリアミン(1)と略す）を得た。高分子量アミノ基を有する共重合体の調整ガラス・アンプル中にて、スチレン、ポリア
ミン(1)およびアゾビスイソブチロニトリルをベ
ンゼン50mlに溶解したのち、窒素下に封じ、10
〜20時間、60℃に加熱し、共重合を行つた。所定の時間ののち、反応液を大過剰のメタノ
ール中に投じ、沈殿した共重合体（SAx：ｘ
ポリアミン含量wt％）をベンゼンに再溶解し
たのち、凍結乾燥した。水不溶性固体の調整前記の共重合体をテトラヒドロフラン溶液と
したのち、40〜60メツシユのガラス・ビース上
に溶液を塗布したのち、溶媒を蒸発させコーテ
イングした。カーボン蒸着したコロジオン膜上へ、同様に
コーテイングを行ない、オスミウム酸または酢
酸鉛にて染色し、透過型電子顕微鏡にて観察
し、ポリスチレンの海状の中に島状のポリアミ
ン層が存在することを確認した。分離器の作成該分離材を、出口側に100メツシユのナイロン
ネツトのフイルターを取付けた内径４mm、長さ10
cmのポリ塩化ビニル製カラム（図１参照）に充填
する。その後、カラム入口より、0.06wt％のラツ
トアルブミンを含むリン酸緩衝液を注入し、カラ
ム内を満す。16時間室温にて、静置したのち、ハ
ンクス液にてカラムを洗浄する。以上の操作により分離器を作成した。分離操作：５週齢の近交系ラツトの腸間膜リンパ節より採
取したリンパ球の、ハンクス（Ca²⁺、Mg²⁺イオ
ン、未添加）浮遊液を調整した（リンパ球濃度：
1.6±0.6×10⁴個／mm³；Ｂリンパ球38±５％）。リンパ球浮遊液をシリンジ型マイクロポンプを
用いて、0.4ml／分の流速にて、分離器に注入し、
流出するリンパ球を採取した。リンパ球の分析：フロオロセイン・イソチオシアネートで標識さ
れたウサギ抗ラツトIgGでリンパ球を処理し、表
面にIgGを持つたＢ細胞を螢光顕微鏡にて分析し
た。カラム注入前およびカラム流出後の全リンパ球
中のＢ細胞の割合を定量し、カラムから流出して
くるリンパ球、およびカラム内に粘着するリンパ
球におけるＢ細胞の割合の、カラムに注入する前
のＢ細胞の割合に対する変化をα_eおよびα_aで表わ
した。すなわち、 α_e＝（f_B／f_T）／（F_B／F_T） α_a＝｛（F_B−Ｅ・f_B）／（F_T−Ｅ
・f_T）｝／（F_B／F_T）ここで、F_B、f_Bはカラムに注入する前と流出後
の全リンパ球中のＢ細胞の割合であり、F_T、f_Tは
Ｔ細胞のそれである。（F_T＝１−F_B、f_T＝１−
f_B）。Ｅはカラム注入前の全リンパ球に対する流
出リンパ球の割合である。結果を表−１および図−２に示した。

【表】比較例１ポリスチレン（PSt）を用い、実施例１と同様
にして、分離器を作成し、分離実験を行つたとこ
ろ、（１−α_a）×100は28％、（１−α_e）×100は37％
であつた。これらの結果を図２、図３に併せて図
示した。比較例２ポリ（ｐ−ジエチルアミノエチルスチレン）
（PEAS）を用い、アミノ基が均一に分散して、
存在する分離材より分離器を作成し、分離実験を
行つたところ、（１−α_a）×100は９％、（１−α_e）
×100は50％であつた。これらの結果についても
図２、図３に併せて図示した。実施例２実施例１にて調製した分離材を用いて、長さ５
cm、10cm、15cmのカラムを作成し分離実験を行つ
た。リンパ球浮遊液の注入速度をそれぞれ、0.2、
0.4、0.4ml／分とした。結果を表２に示した。

【表】以上、詳細に説明したように本発明によれば、
リンパ球浮遊液からＢ細胞を免疫的に刺激せずに
迅速に分離することができ、免疫学、細胞学の基
礎的研究ならびに、ガンや自己免疫病など免疫反
応の関与した疾病の診断、治療にきわめて有用で
ある。

【図面の簡単な説明】

図１は本発明のＢ細胞分離器の一例を示す断面
図である。図２はカラム内に粘着するＢ細胞の選
択率（１−α_a）を示す。図３はカラムより流出す
るＢ細胞の選択率（１−α_e）を示す。１：液の入口、２：液の出口、３：カラム、
４：フイルター、５：Ｂ細胞分離材。

Claims

【特許請求の範囲】１ポリアミノ化合物及びスチレン又はスチレン
誘導体が不均一に分布して存在する水不溶性固体
よりなる、リンパ球浮遊液よりＢ細胞を粘着除去
するＢ細胞分離材。２ポリアミノ化合物が次式で示される化合物で
ある特許請求の範囲第１項記載の分離材。 R₁、R₂、R₃＝C_lH_2l+1（ｌ＝０〜３）ｍ＝１〜３３動物血清蛋白質を付着せしめた特許請求の範
囲第１項記載の分離材。４液の出入口を有し、かつ少なくとも該液出口
側にフイルターを設けたカラム内に、ポリアミノ
化合物及びスチレン又はスチレン誘導体が不均一
に分布して存在する水不溶性固体よりなる、リン
パ球浮遊液よりＢ細胞を粘着除去するＢ細胞分離
材を充填してなるＢ細胞分離器。５ポリアミノ化合物及びスチレン又はスチレン
誘導体が不均一に分布して存在する水不溶性固体
よりなる、リンパ球浮遊液よりＢ細胞を粘着除去
するＢ細胞分離材に、リンパ球浮遊液を流動状態
で接触させることを特徴とするリンパ球浮遊液か
らＢ細胞を分離除去する方法。