JPS584047B2 - キンイツナスンポウノタコウシツキユウジヨウビ−ズノセイゾウホウホウ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は均一な寸法の多孔質で小さい親水性重合体球状
ビーズの製造方法に関するもので、上記ビーズを分子の
分離並びに種々の分析及び診断技術に用いることにある
。

これは生体相溶性、すなわち細胞又は他の生物学的成分
と非特異的に相互作用せず、特異蛋白質及び他の生化学
分子を確かな化学処理により共有結合し得る官能基を含
有する小さく安定な球形粒子に必要なものである。

ヒドロゲル（Ｈｙｄｒｏｇｅｌ）の商標名で知られたポ
リＨＥＭＡ，すなわちポリヒドロキシエチルメタクリレ
ートは血液相溶性を有することが確められており、コン
タクトレンズの製造に用いられている。

水酸基を臭化シアンにより活性化して蛋白質及びアミン
基を含有する他の化学薬品を重合体ラテックスに共有結
合させることができる。

負の電荷を粒子に付与するメタクリル酸残基は細胞表面
との非特異結合を防止し、カルボジイミド法を用いて種
々の生化学分子を共有結合し得るカルボキシル基を付与
する傾向がある。

重合体マトリックスの交差結合は粒子の安定度及び寸法
を光学並びに電子顕微鏡法用の生物学的試料の固定及び
脱水に通常用いられる水溶液及び有機溶媒中で維持する
のに必要である。

細胞表面上の特異受容体の性質、数及び分布の知識がホ
ルモン類及び化学伝播剤による発育、細胞連通及び調節
における細胞−細胞認知並びに正常及び腫脹細胞表面間
の差異の如き生物現象のある分子基準を理解するのに特
に重要である。

従来の研究において、細胞、特に、赤血球及びリンパ球
の表面上の抗原及び炭水化物残基の定位が抗体又はレク
チンを透過電子顕微鏡法用マーカーとして用いるフエリ
チン、ヘモシアニン又はベルオキシダーゼの如き巨大分
子に結合することにより測定されていた。

しかし、高解像度走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）の発達と
共に細胞及び組織試料の表面上の分子受容体の局所分布
をＳＥＭで解像し得る新規な現像マーカーを用いる類似
の組織化学技術により容易に測定することができる。

最近、市販のポリスチレンラテックス粒子をＳＥＭ技術
に用いるための免疫学的マーカーとして使用している。

かかるポリスチレン粒子の表面は疎水性で、従って抗体
の如き或る種の巨大分子が注意深く制御した条件下で上
記表面に吸着される。

しかし、かかる粒子は多くの表面及び分子に非特異的に
固着し、これはその広範囲な用途を著しく制限する。

これら粒子は無電荷であり、あらゆる蛋白質及び他の生
物分子とイオン結合又は共有結合することができない。

ＨＥＭＡ粒子は共有結合に適する化学基を有する。

しかし、ＨＥＭＡのホモポリマは普通多孔質ビーズを形
成するには極めて柔かく、従来の懸濁重合法では４０〜
６０μ程度のかなり大きな粒子が形成されることを確か
めた。

赤血球及びリンパ球は８〜１０μ程度の大きさであり、
これを特異受容体位置に結合するためには、上記ビーズ
は生物細胞より小さい大きさにする必要がある。

均一な寸法で交差結合した多孔質の小さいポリアクリル
ビーズは低コストで安定な吸着剤として重合体を含む有
機及び無機化合物を分離精製するのに用いる。

また、上記ビーズはクロマトグラフ分離、ろ過及びゲル
透過並びに親和カクロマトグラフに使用する。

クロマトグラフに普通用いる親水性有機ゲルは溶離剤の
高膨脹性容量で僅かにキセロゲルに交差結合する。

これらは著しい容量比を特徴とする。しかし、膨脹状態
における粒子の機械強度は交差結合の密度の減少で速か
に減少する。

溶離剤を加圧下で用いるとカラム入口にしばしば閉塞を
生ずる。

従って、これらゲルは高速ゲルクロマトグラフに適して
いない。

ゲルクロマトグラフ用の新シい親水性充填物は高い機械
的及び加水分解安定度を示す必要がある。

本発明は均一な小直径の丸くて小さい多孔質のビーズを
提供する。

該ビーズを水酸基含有アクリル単量体から製造する。

かかるビーズは加水分解に安定で、吸着剤として有機及
び無機化合物を分離精製するのに用いるに十分な機械強
度を有し、またカラム又は薄層クロマトグラフ、ゲルろ
過及び透過、分離並びに分析に使用する。

このビーズは十分特徴ある構造と、優れた純度を有する
。

抗体及び他の生物材料に共有結合した小さいビーズは走
査電子顕微鏡法用の特異細胞表面マーカーとして有用で
ある。

かかる粒子はホルモン類、トキシン類、レクチン類及び
他の分子に結合し、種々の細胞表面受容体の検出及び定
位に用途があることを確かめた。

螢光染料又は放射性分子と結合した粒子は螢光顕微鐘法
用増感マーカーとして、またレクチン類、抗原、ホルモ
ン類及び他の分子をこれら球体と共有結合させることに
よる細胞表面成分の定量的研究用の試薬として有用で、
特異な炭水化物残基、抗体、ホルモン受容体及び他の特
異細胞表面成分の検出及び定位を決定することができる
。

これら試薬は著しく敏感な放射線免疫検定において光学
、螢光及び透過電子顕微鏡法用及び特異な細胞表面受容
体の放射性定量用の視覚マーカーとして、また潜在治療
剤として用いる。

均一な寸法で丸く多孔質なビーズはアクリル単量体と交
差結合剤とを０．１〜５重量％、好ましくは０．２〜２
重量％のポリエチレンオキサイドの如き水溶性重合体の
存在下で共重合することにより製造される。

交差結合は約５０℃以上の高温度で、又は照射を併用す
ると一層低い温度で進行する。

直径２μ以下の均一な形状及び粒度分布のビーズが形成
される。

これらビーズは吸着剤としてクロマトグラフに、また細
胞表面受容体の研究用マーカーとして使用する。

上記ビーズを０．１〜５％の水溶性重合体沈殿防止剤の
存在下モノ不飽和の水酸基置換液体アクリル単量体と交
差結合剤との水性懸濁重合により製造する。

重合は触媒の存在又は不在下で還流するよう約５０℃以
上の温度で、又は重合性混合物への高エネルギ放射線を
用いると−７０℃〜７０℃の一層低い温度で進行する。

単量体としてはオキシアルキル置換アクリレート若しく
はアクリルアミド又はアミノアルキル置換アクリレート
が適している。

代表的な単量体は次式 〔式中のＲ１は水素原子又は１〜８個の炭素原子を有す
る低級アルキル基、Ｒ２は１〜１２個の炭素原子を有す
るアルキレン基、ＺはＯＨ基又はＩ Ｒ３−Ｎ−Ｒ４（式中のＲ３及びＲ４はＨ１低級アルキ
ル基又は低級アルコキシ基である）を示す〕で表わされ
る化合物から選択することができる。

オキシエチルメタクリレート、オキシプロピルメタクリ
レート、ジメチルアミノエチルメタクリレート及び２−
アミノエチルメタクリレートは市場で容易に入手するこ
とができる。

低級アルキルメタクリレート、アクリル酸、メタクリル
酸、スチレン又はビニルトルエンの如き相溶性コモノマ
を重合性混合物中に少量、すなわち１〜３５％、好まし
くは１０〜２５％の分量で存在させることができる。

交差結合剤は重合性混合物中に０．１〜３０％の分量で
存在し、単量体の不飽和基に付加重合し得るジエン又は
トリエンの如き液体ポリ不飽和化合物である。

適当な化合物としてはエチレンジメタクリレート、ジビ
ニルベンゼン、トリメチロールプロパントリメタクリレ
ート及びＮ，Ｎ’−メチレンービスーアクリルアミドの
如き低分子量液体ポリビニル化合物類がある。

オキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）及びオキシプ
ロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ）の市販品（９４％）
は少量のメタクリル酸、オキシアルコキシアルキルメタ
クリレート及びジメタクリレート類（ＨＥＭＡ）ではエ
チレンジメタクリレート、ＨＰＭＡではプロピレンジメ
タクリレート）を含有する。

ＨＰＭＡは普通主単量体が６８〜７５％の２−オキシプ
ロピルメタクリレートと、２５〜３２％の１−メチル−
２−オキシエチルメタクリレートからなる混合物である
。

ＨＥＭＡ及びＨＰＭＡの代表的な組成は重量％で次の通
りである。

単量体を水性媒質中で５〜５０重量％のレベルに希釈す
る。

水性媒質は水と水溶性重合体とからなる。

水溶性重合体は０．０５重量％の如き低い分量で存在す
ることができる。

５％以上の分量は不必要である。

その理由は重合体を最終ビーズから除去するのに追加の
時間及び労力を必要とするからである。

微細で均一な形状寸法のビーズがポリエーテルを含有す
る水性媒質中で一貫して製造される。

ポリエーテル類は普通３ ０ ０，０ ０ ０〜１０，
０ ０ ０，０ ０ ０ ，好ましくは４００，０００
〜６，０ ０ ０，０ ０ ０の分子量を有し、エチレ
ンオキサイド、プロピレンオキサイド又はその混合物の
如きアルキレンオキサイド類の重合体である。

重合は触媒なしにまたかきまぜなしに混合物を７０℃か
ら普通約１００℃の環流温度の範囲に加熱すると進行す
るか、又は遊離基を発生し、重合を開始し、オレフイン
基間の交差結合を形成し得る高エネルギー放射線を用い
ると進行する。

重合はコバルトγ源から０〜７０℃の温度で発生する０
．０５〜１．０メガランドの放射線を用いることにより
進行する。

反応は酸素のない条件下、普通反応容器を真空にするか
又は頂部空間を窒素の如き不活性ガスで置換することに
より実施するのが好ましい。

過硫酸アンモニウムの如き遊離基触媒及び他の沈殿防止
剤又は乳化剤の如き添加剤が重合性混合物中に存在する
場合がある。

重合が完了した後、重合体混合物を熱水で希釈し、枦過
し、沸騰水で洗浄してポリエーテルを除去する。

収率９０％以上の乾燥物質は個々の丸いビーズ又はビー
ズ塊状物である。

所要に応じて、該塊状物を非溶媒液体中での分散、粉砕
又は摩砕により機械的にビーズに分割する。

該ビーズは寸法が均一で、ビーズの少なくとも８０％、
好ましくは９０％が５μ以下、好ましくは０．００１〜
２μの均一な直径を有する。

交差結合した多孔質のビーズは水に不溶で膨脹せず、ま
た普通の無機及び有機溶媒に不溶である。

次に本発明を実施例につき説明する。

実施例 １ １５重量％のエチレンジメタクリレートと、０．５％の
安定剤としてのヒドロキノンとを含有スる市販の９４％
ＨＥＭＡを９７〜９９℃で１ｍｍＨｇの圧力下真空蒸留
した。

１４ｇの新しく蒸留したＨＥＭＡを１８０ｇの水に溶解
した。

約４００００００の分子量を有するポリエチレンオキサ
イド４ｇを添加し、生成した混合物を穏和な還流（９８
℃±２℃）で２４時間加熱した。

次いで、重合した物質を熱水で希釈し、金網を経て沖過
した。

金網上に分離された固体を沸騰水で洗浄してポリエチレ
ンオキサイドを除去した。

収率９０％以上の乾燥物質を個々のビーズに粉砕し、そ
の８０％は２μの直径を有した。

実施例 ２ ２００ｇの新しく真空蒸留したＨＥＭＡと、４ｇの１×
１０６の分子量ポリエチレンオキサイドと、３０ｇのト
リメチロールプロパントリメタクリレートとの混合物を
水で１ｌまで希釈し、窒素で不活性にした。

０．１メガランドの放射線を混合物に常温でコバルトγ
−源から約１５分間照射した。

生成したビーズを沖過し、沸騰水で数回洗浄し、遠心分
離して９９％の収率で得た。

走査電子顕微鏡により、乾燥ビーズは丸く、少くとも９
０％が１６μの直径であることを確かめた。

実施例 ３ 下記の水性混合物を製造した。

この混合物を窒素で不活性にし、０．１メガランドの放
射線を常温で、コバルトγ−源から１５分間照射した。

ビーズを実施例２における如く９９％の収率で回収分離
した。

走査電子顕微鏡によりビーズの９０％以上の直径が１〜
２μであることを確かめた。

この共重合体ビーズは水酸基並びにジメチルアミノ基を
含有する。

この処理を０℃の水浴中で０．２メガラットの放射線を
３０分間照射することにより繰返して上記と同じ結果を
得た。

実施例 ４ 下記の水性混合物を製造した。

この混合物を実施例３の条件下で重合してビーズ塊状物
を得、これを１〜２μの直径を有する個個のビーズに分
割した。

実施例 ６ 下記の水性混合物を製造した。

この混合物を窒素で不活性にし、０．１メガランドのコ
バルトγ−放射線を１５分間照射した。

１〜２μの直径の個々のビーズを得た。

本発明の均一な寸法で丸く小さい純粋なビーズをリンパ
球の如き生物細胞の標識付けに利用することができる。

抗体をビーズに結合し、該ビーズを人体血清と混合し、
ビーズが沈殿又は凝集反応を生ずる特異抗原位置に結合
しているか否かを観察することにより疾病状態を診断す
ることができる。

ＯＨ，ＣＯＯＨ及びアミノ基がビーズに存在すると、ハ
ブテン類、酵素類、抗体又はレクチン類の如き生物分子
をビーズに臭化シアン、カルボジイミド又はグルタルア
ルデヒド反応により共有結合させることができる。

診断し得る状態は肝炎、淋病、変形関節炎、連鎖球菌感
染及び姓娠である。

標識付けしたビーズは血液型判定法にも使用することが
できる。

また、ビーズはけい光染料と結合するので、けい光顕微
鏡法に使用する。

該染料はビーズ粒子に結合し、抗体に結合しないため、
高感度を要する研究に対し抗体活性に悪影響を及ぼすこ
となく高度の結合を達成することができる。

けい光染料と結合したビーズは細胞用マーカーとして該
ビーズを細胞に試験管内又は生体内で添加することによ
り作用することができるので、特異細胞への結合を観察
することができる。

実施例 ６ 実施例２のビーズ０．２ｇを２０ｍｌのＨ２０に懸濁さ
せ、ガラス均等器内で均質にし、ビーカに移した。

０．８ｇの臭化シアンをかきまぜながら添加した。

ｐＨを２Ｎ−ＨａＯＨの添加により１０〜１１に維持し
た。

５ｍｇのε−ダンシル リシンを添加し、かきまぜを１
時間続けた。

生成した混合物を蒸留水で６回遠心分離した。

上澄液は６回目の遠心分離後けい光性でなかった。

けい光顕微鏡法により測定して著しくけい光性のビーズ
を回収した。

実施例 ７ ０．１ｇの９−アミノアクリジンヒドロクロライドを実
施例６の処理に従い実施例２のビーズ０．２ｇに結合さ
せた。

このビーズは著しくけい光性であった。

均一な寸法で丸く多孔質のビーズの親水性及び純度特性
により、該ビーズを親和カクロマトグラフ、カラム又は
薄層クロマトグラフ、ゲル沖過又は透過に用いる。

このビーズは著しく帯電された合成及び天然の高分子電
解質を精製することができ、また有機及び無機分子を分
離するのに使用することができる。

本発明の実施に当っては以下の諸項を実施上の条件とす
ることができる。

（１）ポリエーテルは３０００００〜１０００００００
の分子量を有するポリアルキレンオキサイドで、重合性
混合物中に０．２〜２重量％の分量で存在する特許請求
の範囲記載の方も （２）ポリエーテルはエチレンオキサイド、プロピレン
オキサイド又はその混合物よりなる重合体で、分子量が
４０００００〜６００００００である前項記載の方法。

（３）重合を−７０℃から還流温度までの範囲で行い、
生成するビーズの少なくとも８０％が２μを越えない直
径とする上記第（１）項記載の方法。

（４）高エネルギー放射線を重合性物質に照射する前項
記載の方法。

（５）重合を６〜７０℃の温度でコバルトγ源からの０
．０５〜１．０メガランドの放射線を混合物に照射して
行う前項記載の方も （６）単量体として次式 〔式中のＲ１は水素原子又は１〜８個の炭素原子を有す
る低級アルキル基、Ｒ２は１〜１２個の炭素原子を有す
るアルキレン基、ＺはＯＨ又はＲ３−Ｎ−Ｒ４（式中の
Ｒ３及びＲ４はＨ，１〜１０個の炭素原子を有する低級
アルキル基又は１〜１０個の炭素原子を有する低級アル
コキシ基）を示す〕で表わされる化合物を使用する前項
記載の方法。

（７）単量体としてオキシエチルメタクリレート、オキ
シプロピルメタクリレート、ジメチルアミノエチルメタ
クリレート、２−アミノエチルメタクリレート又はアク
リルアミドを使用する前項記載の方法。

（８）重合体は低級アルキルメタクリレート、アクリル
酸、メタクリル酸、スチレン及びビニルトルエンから選
択したコモノマをアクリル単量体に対し１〜３５重量％
の分量で含有する上記第（６）項記載の方法。

（９）交差結合剤は重合性混合物に０．１〜３０％の分
量で存在し、液体ポリ不飽和化合物である上記第（６）
項記載の方法。

（１０） 交差結合剤としてエチレンジメタクリレー
ト、ジビニルベンゼン、トリメチロールプロパントリメ
タクリレート又はＮ，Ｎ’−メチレンービスアクリルア
ミドを使用する前項記載の方法。

（１１）少なくとも８０％が０．００１〜２μの直径を
有し、次式 〔式中のＲ１は水素原子又は１〜８個の炭素原子を有す
る低級アルキル基、Ｒ２は１〜１２個の炭素原子を有す
るアルキレン基、ＺはＯＨ又は（式中のＲ３及びＲ４は
Ｈ、低級ア ルキル基又は低級アルコキシ基）を示す〕で表わされる
アクリルアミド又はアクリレートから選択したアクリル
単量体と、０．１〜３０重量％の液体ジエン又はトリエ
ン交差結合剤との交差結合重合体よりなる均一な寸法の
親水性で膨脹性の丸い多孔質ビーズ。

（１２）１ｌの水に重量割合で５〜５０％のアクリルミ
ド、ヒドロキシアルキル置換アクリレート及びアミノア
ルキル置換アクリレートから選択したアクリル単量体と
、１〜３０％のジェン又はトリエン交差結合剤と、０．
０５〜５％の３０００００〜１０００００００の分子量
わ有するポリエーテルとを含有する水性重合性混合物。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ５μ以下の平均直径を有する均一な寸法の多孔質球
   状ビーズを製造するに当り、水酸基置換アクリレート、
   アミノ置換アクリレート、アクリルアミド又はその混合
   物から選択したアクリル単量体と少量の低分子量液体ポ
   リビニルジエン又はトリエン化合物からなる交差結合剤
   とを０．０５〜５重量％の水溶性ポリエーテルを含有す
   る水性媒質中で共重合し、生成するビーズを回収するこ
   とを特徴とする均一な寸法の多孔質球状ビーズの製造方
   法。