JPS5951355A - 抗ウイルス抗体検出用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は風疹、はしか、おたふく風邪、ノヤラインフ
ルエンザなど各種のウィルス性疾患感染の有無を簡便な
手段でＳ実に検出しうる試薬に関するものである。

従来、血清中の抗ウイルス抗体の検出方法としては、ウ
ィルス中和試験法、赤血球凝集抑制試験法、補体結合法
などが知られているが、中和試験法は測定に長時間１［
し、か；）高度の測定技術を必要とする問題点があり、
赤血球凝集抑制試験法は抗原および血球の個体差の問題
があるほか抗原が不安定で力価が低下しやすいこと、術
式か松鵜（１） でおることなどの問題があった。また、補体結合法も測
定精度および測定時間に間かがあった。一方、免疫反応
を利用した抗体の検出法としてはこのほか間接受身赤血
球凝集反応が知られているが、はとんどのウィルスはそ
れ自体が赤血球凝集能応を起すところから、抗ウイルス
抗体の検出にはこの方法は一般には使用しえないとされ
ていた。

本発明者らは抗ウイルス抗体の簡便かつ確実な検出方法
を開発すべく種々検討の結果、ウィルス抗原を本発明者
らが先に開発し特許出願したゼラチンを構成成分とする
担体など特定の担体に感作させた試薬を用いれば赤血球
凝集能を有するウィルスの抗体についても間接受身凝集
反応を行なうことができ、この抗ウイルス抗体を簡便か
つ確実に検出しうるようになることを見出して、これに
基いて本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、赤血球凝集能を有するウィルスに対
して非凝集性の担体に赤血球凝集能を有するウィルス抗
原を感作せしめた、粒径が０．５〜２０μの抗ウイルス
抗体検出用試薬に関するものｆつ） である。

担体は赤血球凝集能を有するウィルスに対して非Ｕ集件
のものである。これは本発明の試薬が間接受身凝集反応
用のものであるところから、赤血球のように担体自身に
ウィルスに対する凝集性があっては、抗ウイルス抗体検
出用凝集反応試薬としての用をなさないからである。こ
の相体は粒径が０．５〜２０μ、好ましくは１〜１０μ
程度のものである。間接受身凝集反応を行なわせるため
には粒径がこの範囲のものでなければムらす、この範囲
外の粒子では適当な凝集像が形成されない。

このほか、この相体は少なくとも間接受身凝集反応を行
なわせる際には不溶性でなければならない。形状は通常
は球形でるるか、それに限がされるものではなく、凝集
像を適切に形成できるものであれはよい。粒子の内部は
表面と同一物質であってもよく、マイクロカプセルのよ
うに別物質が充填されていてもよい。凝集像の判定を容
易にするために担体は有色のものがよく、無色であれば
着色してから使用に供することが留ましい。

担体はウィルス抗原を感作しうるものであるカζ感作方
法は化学結合であってもよく、物理吸着であってもよい
。しかしながら、定雰、性および再現性の府で特に共有
結合が好ましい。共有結合で抗原を感作する場合には相
体に官能基が必要であるが、この官能基はアミン基、カ
ルがキシル基、水酸基など酵素を固足化する公知の相体
の官能系と同じものでよい。

このような相体の例としては、本発明者が九に０１１発
し特許出願（特願昭５６−３７８５５号など）したゼラ
チンなどから製造される担体（以下、ゼラチン相体とい
う。）のほか、ポリアクリルアミドビーズ、例えばアフ
ィダル（Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ）　７０１　、同７０２、イ
ムノビーズ（Ｉｍｍｕｎｏｂｅａｄ　Ｒｅａｇｅｎｔ　
）　（いずれも間品名、バイオ・ラッド　ラがラトリー
社製品）、例えはウレタンを原料としたものなど種種ノ
マイクロカプセル、セラチア菌などの各種菌体、ポリス
チレンラテックス、炭末などを挙げることができる。こ
れらのなかでは本発明者らが開発したゼラチン相体とポ
リアクリルアミド系の担体が非特異凝集が少ないなどの
点で特に好適である。

ゼラチン担体のり、法の概禦を次に述べる。

ゼラチン担体はゼラチン、水溶性多糖類およびメタリン
酸塩を含む溶液から生成させる。ゼラチンは市販品でよ
いが、酸性ゼラチンが特に好ましい。水溶性多糖類は増
粘剤または糊料としうるものであり、多糖類の誘導体お
よび塩も含まれる。

例としては、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロー
ス、アルギン酸ナトリウム、寒天、カラダーナンなどを
挙けることができるが、特にアラビアゴムが好適である
。メタリン酸塩は化学式：％式％： で表わされる物理であシ、たとえは三メタリン酸ナトリ
ウム、ヘキサメタリン酸ナトリウムの如きものでおる。

これらを含む溶液を攪拌しつつ酸を加えてｐＨ２，５〜
６，０に調整する。ｐＨ％整前の溶液におけるこれら各
物質の濃度としては、ゼラチン０．０１〜２（５） ％稈度、好ましくは０．０５〜１．０％程度、そして水
溶性多糖類０．０１〜２％程度、好ましくは０．０５〜
１．０％程度である。メタリン酸塩はゼラチン乾燥重量
の３〜１５％程度を含有させるようにするのがよい。各
物質はこれらの濃度範囲において、所望の粒子の粒径お
よび物性に応じて適宜定めればよい。

ｐＨ！！ｌ整前の溶液にはそのほかのものとして、親水
性有機溶媒、界面活性剤、着色剤などを適宜加える。

溶液の温度はゼラチンのダル化温度以上でなけれはなら
ない。この温度はゼラチンの濃度等によって異なるが通
例２５〜３０℃程度である。良好な粒子形成の観点から
特に３５〜５０℃程度がよい。

ｐＨ２，５〜６．０に調整する工程は粒子を生成させる
ところである。均一な粒子を形成させるために、３５〜
５０℃に加温を続け、適度に攪拌しながら酸を滴下して
いくのがよい。ｐＨ２，５〜６．０の範囲における至適
のｐＨ１ｉ原料溶液の組成および目的とする粒径によっ
て異なるので予め実馳を行なって（６） 定めるのがよい。たとえば得られ′＃粉粒子抗原感作用
担体に用いる場合にはｏ、’；　−Ｚ　Ｏμ程度の粒径
にするのがよく、その場合至適のｐＨＦｉ４．０〜５．
５の範囲にある。とのｐＨ調整に使用する酸は特に限定
されるものでは力く無枦酸でも有機酸でもよいが、なる
べくおだやかなものがよく、たとえば酢酸などが好適で
ある。

酸の添加拶は生成した粒子の凝集を防止するために速か
に粒子分散液を冷却するのがよい。そして、液温か１０
℃以下に力っなところでアルデヒド系架橋剤を添加して
粒子を不溶化する。この架植１剤の添加Ｉはゼラチン乾
燥型１の０．１〜２００％程度であり、添加後は一夜程
度放置して架橋反応を充分に行なわせる。架橋剤の例と
しては、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、グリ
オキザール、クロトンアルデヒド、アクロレイン、アセ
トアルデヒドなどを挙けることができるが、特にグルタ
ルアルデヒドが好適である。

アルデヒド系架橋剤で処理後は粒子を遠心分離等で回収
して、必要によシ洗浄する。洗浄液は粒子分計のために
用いた界面活性剤と同じものを同濃度で含む水で２〜３
回行なえばよい。

架橋が不充分な場合には架橋剤処理を再度行なうことが
望ましい。

ウィルス抗原は赤血球凝集能を有するウィルスのもので
ある。はとんどのウィルスが赤血球凝集能を有しておシ
、例として、風疹ウィルス（ｒυ１）ｅｌｌａｖｉｒｕ
Ｉ＋）、はしかウィルス（ｍｅａｓｌｅｓ　ｖｉｒｕｓ
　）、パラインフルエンザウィルス１型（ｐａｒａｉｎ
ｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ　Ｔｙｐｅ−１）、同２型（
ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ　ｖｉｒｕｌ！１Ｔｙｐｅ
−２）、おたふく風邪ウィルス（Ｍｕｍｐｓ　ｖｉｒｕ
ｓ　）などを挙けることができる。このようなウィルス
抗原は市販品なその１ま用い扛はよく、あるいは公知の
方法によって培養し、Ｎ！！！！！シ、必要によシネ活
性化して用いればよい。

ウィルス抗原を担体に感作する方法としては、共有結合
させる場合にはウィルス中の蛋白部分を利用すればよく
、一般に受身凝集反応に用いられる公知の赤血球感作方
法を適用することができる。

例えば、タンニン酸、ホルマリン、グルタルアルデヒド
、ピルビックアルデヒド、ビス−ジアゾ化ベンジジン、
あるいはトルエン−２，４−ジイソシアナートを用いる
方法力どを適用することができる。

このｂか、アミノ基、カルボキシル基、水酸基などを活
用して酵素を共有結合させる公知の固定化方法によって
ウィルス抗原を担体に共有結合させてもよい。このよう
な方法の例としてヅアゾカップリング法、酸アジド法な
どを挙けることができる。しかしながら、これらの方法
のなかでは赤血球感作方法が本発明には好ましく、その
ガかでも前述のゼラチン担体の場合にはタンニン酸法お
よびグルタルアルデヒド法が特に好適であシ、ポリアク
リルアミド系の担体の場合には１−エチル−３〔３−ジ
メチルアミノゾロピル〕カルボジイミド・ＨＣｌなどの
カルボジイミド系の試薬を用いる方法が好適である。そ
のほか物理吸着させる場合などには、ｒ１１接受身凝集
反応に用いられる各釉担体へ抗体などを感作する公知の
方法に準じて感作を行なえはよい。

本発明の抗ウイルス抗体検出用試薬の製造方法（９） は、一般に抗体などを間接受身擬勢反応に用いる担体に
感作して感作担体を製造する公知の方法に準じて行なえ
ばよい。たとえは、前述の担体粒子を所定の感作あるい
は固定化試薬で活性化する。

一方、ウィルス抗原は必要によシさらに精製してから水
または適肖な緩衝液に浮遊させ、上記の活性化された相
体粒子の分散液と混合してウィルス抗原を担体に感作す
る。そして、感作粒子を分離し、必要によシ洗浄すれば
よい。

こうして得られた抗ウイルス抗体検出用試薬は懸濁液の
状態で製品形態としてもよいが通常は凍結乾燥等の手段
によって乾燥して製品とする。保存は低温下がよく、例
えは４℃で保存すればよい。

製品は、通常は、間接受身凝集反応を利用した抗体測定
方法の場合と同様、復元液、希釈液、標準血清、未感作
担体、さらに必要により非特異抗体吸収液力とと組合せ
てキットの形をとる。非特異抗体吸収試薬としては、例
えば風疹ウィルス抗原の場合にはカオリンとかヘノ母リ
ン−Ｍｎ　Ｃｌ３など、ムンゾスウイルス抗原の場合に
はＫＩＯ３、トゾシンなどｒｌｌｌ） 公知のものを用いればよい。

本発明の抗ウイルス抗体検出用試薬を用いて抗ウイルス
抗体を検出する方法は−Ｖに間接凝集反応で抗原を検出
する方法に従って行表えげよい。

本発明の抗ウイルス抗体検出用試薬は、感作する抗原の
種類を選択することによって、赤血球凝身許を有するあ
らゆるウィルスに対する抗ウイルス抗体を間接凝集反応
で検出することができる。

従って、各種のウィルス性疾患感染の有無を簡便にかつ
畑時間に確実に検出することができる。本発明の試薬は
従来品よシはるかに安定であシ、例えは風疹ウィルス抗
原の場合には従来復元ウィルス抗原を３０分以内に使用
する必要があったが本発明品の場合には復元感作粒子を
４℃で保存すれば２週間程度使用可能である。

本明細有−における％は特に記載がなければ重ｔ％を表
わしている。

ゼラチン相体ツ４造例 等電点がｐＨ９であるゼラチン４デを４０℃の温水に１
００　Ｉｌｌになるように溶解し、１０ｑＩＱの水酸化
ナトリウム溶液を用いてｐＨ９に調整した。アラビアコ
ゝム４ｙ−を１００プになるように水に溶ＭＬ不溶物を
炉別した徒４０℃に加温した。

このようにして得られたゼラチン溶液５０ｍとアラビア
ゴム溶液５９　ｍｌを混合し、この混合液をあらかじめ
４０℃に加温した３０容量％のメチルアルコール溶液３
００１１６に注ぎ入れ、よく攪拌した。これに１０％へ
キサメタリン酸ナトリウム溶液１．６　ｍｌ、　１％ア
ルキルスルホマレイン酸（商品名デモールＥｐ１花王石
鹸（株）製品）溶液２−１および１％タ゛イレクトプル
ー溶液５　ｍｌを加えてよく攪拌した。

次いで、４０℃に保ちながら１０容ｆｉ！′％の酢酸溶
液を滴下してｐＨ４，８に調整し、粒子を生成させた。

このｐＨ？整によって得られた粒子分散液を氷冷して５
℃にしてからゲルタールアルデヒド１．３ｔを加え、よ
く攪拌後この温度で一夜静置した。それからこの粒子分
散液を２００Ｏｒｐｍで１０分間遠心分離して粒子をベ
レットとしてめ１収した。この粒子を０．００５％デモ
ールＥ、溶液に懸濁して遠心分１１ｆする洗浄操作を３
回縁返してから、４容量％ホルマリン溶液に分散し、５
℃で１週間放ｆｆ　した。

本例で得られた担体粒子は７．７テであり、その７５％
が３〜６μの範囲にあった。

実施例１ 前記のゼラチン担体製造例で得られた担体粒子を５　ｐ
ｐｍのタンニン酸を含むｐＨ７，２のリン酸緩衝生理食
塩水（以下、ＰＨ１と略記する。〕中に粒子濃度が２．
５％に衣るように分散し、３７℃で１０分間加温した。

この粒子を遠心分離して回収し、生理食塩水で４回遠心
分離決で洗浄してから、ｐ）ｉ７．２のＰＨ３中に５％
になるように分散させた。

−力、Ｖｅｒｏ細胞を用いて培養し、常法によシ精製し
た風疹ウィルスをｐＨ７，２のＰＨ３中に３２　ＨＡ単
位になるように浮遊させてウィルス抗原液とした。

上記のタンニン酸処理粒子分散液とウィルス抗原液を尋
容つつ混合し、３７℃で４０分間加温して粒子にウィル
ス抗原を感作した。感作粒子を生理食塩水で４回遠心洗
浄した徒、分散用メディウムに粒子濃度が５％になるよ
うに分督した。分散液を液体窒紫で急速凍結し、凍結乾
燥槽・で乾燥した。

このようにして得られた風疹ウィルス感作粒子を用い、
マイクロタイター法で風疹患者血清と反応させたところ
、下表に示す如き結果が得られた。

なお用いた患者血清については、従来のＨＩ法（富士臓
器製薬（枕・）製「セロディアルベラ」（商品名）使用
）によっても抗体価を求めておいたが、本発明品で得ら
れた結果はこのＴ（Ｉ法で得られた抗体価また、この感
作粒子に蒸溜水を加えて復元しｐＨ７，２のＰＢＳで粒
子濃度が１％になるように希釈した。この感作粒子分散
液を４℃に２週間放置した。一方、乾燥感作粒子を密栓
し、４０℃のオーブンに２週間放置した。これらの保存
稜に力価を実施例２ ゼラチン押体製造例で得られた担体粒子をタンニン酸を
Ｉ　Ｐｐ”％　　５　ｐＰｍまたは１０　ｐｐｍの各濃
度で含むｐＨ７，２のＰＢＳ中に２．５％になるように
分散させ、３７℃で１０分間加温した。各分散液とも遠
心分離して粒子を回収し、生理食塩水で４回遠心洗浄し
てからｐＨ７，２のＰＢＳ中に濃度５％で分散させた。

一方、乾燥麻疹ウィルスＨＡ抗原（デンカ生砿株）製、
力価１　：３２）に蒸溜水１ｄを加えて復元しｐＩ（７
，２ＰＢＳで２倍づつ階段希釈してウィルス抗原液とし
た。

上記のタンニン酸処理粒子分散液とウィルス抗原液を等
容づつ混合し、３７℃で４０分間加温して粒子にウィル
ス抗原を感作した。感作粒子を実施例１と同様に洗浄し
、凍結乾燥した。

こうして得られた麻疹ウィルス感作粒子を用いてマイク
ロタイター法で抗麻疹ウィルス抗血清（デンカ住所（株
）製、力価１　：　１２８）と反応させたところ、下表
に示す結果が得られた。

実施例３ ポリアクリルアミドビーズアフィゲル７０１（バイオ轡
うッドラがラドリーズ社製品）をビスマルクブラウンで
染色した。染色したビーズＩＰをｐＨ７，２のＰＢＳ　
１９　ａｇに分散させた。

実施例１と同様にして風疹ウィルスのウィルス抗原液を
訓鷺し、その２０１１１７を上記ビーズ分散液に加えて
４℃で１時間放置した。

この混合液に２０Ｔｖの１−エチル−３〔３−ジメチル
アミノプロピル〕カルがジイミド−ＨＣｌ　（ＥＤＡＣ
。

バイオ−ラッド　ラがラドリーズ社和品）を加えてよく
攪拌し、４℃で３時間反応させた。反応終了稜生理食塩
水で１０回遠心洗浄し、１襲牛血消アルブミンを含む０
．００５Ｍリン酸緩衝液にビーズ濃度が１％になるよう
に分散した。

こうして得られた風疹ウィルス感作ビーズを風疹患者血
清とマイクロタイター法で反応でせたところ下記に示す
結果が得られた。

実施例４ ７フイグル７０１を青色色素ダイレクトブルーで染色し
、これを相体として使用した。この染台ビーズ１１をｐ
Ｈ７，２のＰＢＳ　１９　ｍｌに分散させ、５％分散液
とした。

乾燥麻疹ウィルスＨＡ抗原（力価１：３２）に蒸溜水１
　ｍｌを加乏て復元し、さらにｐＨ７，２のＰＢＳで３
２倍に希釈した。このウィルス抗原液２０ｍと上記ビー
ズ分散液を用いて実施例３と同様に処理し、麻疹ウィル
ス感作ビーズの１％分散液を得た。

こうして得られた麻疹ウィルス感作粒子をマイクロタイ
ター法で抗麻珍ウィルス抗血清（力価１：１２８）と反
応させたところ下記に示す結果が実施例５ ゼラチン担体製造例で得られた担体粒子をｌｐｐｍのタ
ンニン酸を含むｐＨ７，２のＰＢＳを用いて実施例２と
同様に処理した。ウィルス抗原にはノやラインフルエン
ザ１型ウィルス歴抗原（デンカ主訴（株）製、力価１：
６４）を用いて実施例２と同様に上記担体粒子に感作し
、このｐ作粒子を生理食塩水で４回遠心洗浄し分散用メ
ディウムに１％濃度に分散した。

こうして得られたパラインフルエンザウィルス１型）ｆ
Ａ抗摩感作粒子をマイクロタイター法で抗パラインフル
エンザウィルス１型抗泊清（デンカ主訴（株）製、力価
１：１２８）と反応させたところ下表に示す結果が得ら
れた。

実施例６ アフィゲル７０１をビスマルクブラウンで染色したもの
を担体として使用した。染色したビーズをｐＨ７，２の
ＰＢＳに５％に分計した。このビーズ分散液１０ＷＬｔ
と５　ｐｐｍのタンニン酸を含むｐＨ７，２のＰＢＳ　
１０−とを混合し、３７℃で１０分間反応させた。生理
食塩水で１０回遠心洗浄し、ｐＨ７，２のＰＢＳに５％
濃度に分散した。

パラインフルエンザ１型ウイルスＨＡ抗掠（力価１：６
４）に蒸溜水１　ｍｌを加えて復元し、さらにｐＨ７，
２のＰＢＳで６４倍に希釈し、ウィルス抗原液とした。

このウィルス抗原液ＩＱｍｊと上記のタンニン酸処理ビ
ーズ分散液１（）―とを混合し、３７℃で４０分間加温
してビーズにウィルス抗原を感作した。ｇ作ビーズを生
理食塩水で１０回遠心洗浄し、１％牛血清アルブミンを
含む０．００５Ｍリン酸緩衝液に１％濃度に分散した。

こうして得られたパラインフルエンザ１型ウィルス感作
粒子をマイクロタイター法で抗パラインフルエンザｌ型
ウィルス抗血清（力価１：１２８）（２１） と反応させたところ下記に示す結果が得られた。

実施例７ ゼラチン担体製造例で得られた担体粒子を５ｐｐｍ　　
　　’のタンニン酸を含むｐＨ７，２のＰＢＳを用いて
実施例２と同様に処理した。ウィルス抗原にはムンプス
ウィルス臥抗ル（デンカ主訴（株）製、力価１　：３２
　）を用い、この抗原に蒸溜水１ｍｌを加えて復元し、
さらにｐＨ７，２のＰＢＳ　７　ｍｌを加えて８倍に希
釈した。

このウィルス抗原液５　ｍｌと上記タンニン酸処理粒子
分散液５　ｍｌとを混合し、３７℃で４０分間加温して
粒子にウィルス抗原を感作した。感作粒子を生理食塩水
で４回洗浄後分散メゾイムに分散し凍結乾燥した。

乾燥ムンプスウィルス感作粒子に蒸溜水を加えて復元し
、マイクロタイター法で抗ムンゾスウイルス抗血清（デ
ンカ主訴（株）製、力価１：１２８）（２２） と反応≧せ六ところ下記に示す結果が得られた。

実施例８ アフィゲル７　ｕ　１をビスマルクブラウンで染色し、
その０．５１をｐ）Ｔ７．２のＰＢＳ　９．５　ＷＬｔ
に分散した。

乾燥ムングスウイルスＨＡ抗磨（力価１：３２）に蒸溜
水ｌ　ｍｌを加えて４元し、さらにｐＨ７，２のＰＢＳ
で１６倍に希釈した。

このウィルス抗掠液ＩＱ肩／を上記の粒子分散液に加え
、４℃で１時間数量した。この混合液に１０〜のＥＤＡ
Ｃ’ｌ（加えてよく攪拌し、４℃で３時ｒ１１１反応さ
せた。反応影了後生理食塩水で１０回遠心洗浄し、１％
牛血清を含む０．ＵＯ５Ｍ！Ｊン酸緩衝液に粒子濃度が
１％になるように分散した。

こうして得られたムングスウイルス感作粒子をマイクロ
タイター状で抗ムンプスウィルス抗血清（力価１：１２
８）と反応させたところ、下記に示ず結夕１が得られた
。

特許出願人　　富士林器製薬株式会社 代理人　弁理士田中政浩 手続　補　正　書（方式） ％式％ １事件の表示 特願昭５７−１６０８８６号 ２発明の名称 抗ウイルス抗体検出用試薬 ３補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　富士臓器製薬株式会社 ４代理人 居所　〒１０４東京都中央区京橋二丁目１番３号京和ビ
ル５階電話（０３）２７１−１１７７氏名　弁理士（８
５１０）　　　１）中　政　浩５桶正命令の日付　昭和
５８年１月２５日６糊正の対象　　明細書全文

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 赤血球凝集能を有するウィルスに対して非凝集性の担体
   Ｋｚ赤血球凝年能を有するウィルス抗原を感作せしめた
   、粒径が０．５〜２０μの抗ウイルス抗体検出用試薬。