JPS6119936B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は診断に有用な試薬およびその製造方法
に関する。

人間および動物の病理状態あるいは他の状態の
診断は、しばしば免疫学的原理の適用により達成
される。これらの原理は被検者の体液中の抗体ま
たは抗原の存在を決定するのに用いられる。抗原
は、それが被検者に導入されたとき、抗体と称さ
れるある種の可溶性物質を生成させる異種物質で
ある。被検者中に普通存在しない何らかの異種物
質、例えば蛋白質は適当な条件下でそれが被検者
中に導入されると抗体が生成されうる。

抗体は、その産生の後、抗原と反応し、それに
よつて微生物性またはウイルス性の侵入物の場合
には感染から保護する。

免疫学的試験方法は通常不溶化あるいは凝集に
より顕現される抗原−抗体反応に基づくものであ
る。

一般に、抗原または抗体の存在は、対応する抗
体または抗原を被検者の体液、通常は尿、血清あ
るいは特別に処理した血液抽出物〔勿論、他の体
液もまた使用可能である〕と接触させることによ
り確認しまたは診断される。被検者中の抗体また
は抗原の存在は、不溶性の抗原−抗体複合体
（complex）が生成すれば認められる。

いくつかの複合体は非常にゆつくり生成し、そ
して非常に小さな粒径を有するから、視覚的にそ
れらを識別することができるようにするために担
体を用いることが必要である。従来使用されてい
た担体には、ヒツジおよびヒトの赤血球、細菌の
細胞、ベントナイト、ラテツクス粒子、例えばポ
リスチレン、アニオン性フエノール樹脂および粉
砕されたジアゾ化アミノセルロースがある。

血清学的に決定可能な物質を物理的に結合する
公知の担体は、それらが多数の欠点を有している
ために、それらの適用性および免疫学的診断法に
おける有用性が制限されている。重要な欠点の中
には、多くの例における感度の不足と多くの場合
の安定性の乏しさとがある。これらの欠点は主と
してラテツクス粒子が血清学的に反応性の物質で
物理的に被覆されている場合に、遊離の物質と会
合した物質との間に平衡が存在するという事実に
よるものである。この結果対応する抗原または抗
体に対して、遊離の抗体または抗原とラテツクス
に結合した抗体または抗原との間に競争的な抑制
が起こる。さらに、多くの負に帯電した蛋白質
を、加水分解または酵素分解することなく不活性
なラテツクス粒子に物理的に被覆することはでき
ない。この処理の結果反応の特異性に不利益にな
り得る構造の立体配置上の変化が起りうる。小さ
なペプチドはそれ自体これらの条件下でさえも不
活性ポリマーへの物理的被覆に役たず、このこと
は多くの免疫学的診断試験へのこの方法の適用性
を制限している。

従つて、血清学的に不活性であり、広範囲の血
清学的に決定可能な物質と共に安定で、特異で且
つ感度のよい診断に有用な試薬を形成し、そして
最小の時間で容易に確かめうる視覚的な評価を与
える担体に対する要求がある。

本発明は、公知の血清学的に決定可能な物質と
アミド結合を介して縮合した血清学的に不活性な
ラテツクスポリマーの個々に分離した粒子から成
る、水とほゞ同じ比重を有する水−不溶性の免疫
学的診断剤に関する。本発明はさらに、そのよう
な試薬の製造方法に関し、その方法は血清学的に
決定可能な物質を水溶性カルボジイミドの存在下
に約５℃乃至約40℃の温度でアミド結合を形成し
うる反応基を含む血清学的に不活性なラテツクス
ポリマーと反応させることを特徴とする。

かかる本発明によれば、以前にはポリマーラテ
ツクス担体に充分に物理的に付着させることがで
きなかつた多くの血清学的に決定可能な物質、例
えば、多糖類、完全な蛋白質分子およびペプチド
は、化学的方法により血清学的に不活性なラテツ
クスポリマー担体のある種の基にアミド結合を生
成して共有結合されることができるということが
見出された。

本明細書において用いる「血清学的に決定可能
な物質」なる用語は、免疫学的原理の利用により
ヒトおよび動物の体液中で測定されうるような物
質を言い、その範囲内に、カルボジイミド縮合剤
を用いてアミド結合を生成させることにより血清
学的に不活性なラテツクス担体粒子に化学的に結
合させることのできる血清学的に決定可能な物質
のすべてが包含される。

代表的且つ適当な血清学的に決定可能な物質
は、単離されたヒトおよび動物の抗体、血清成
分、毒素、微生物性およびウイルス性成分、ホル
モン、酵素、アルカロイド、細胞および組織抽出
物、小さな分子量の物質例えばインシユリン、ア
ンジオテンシンおよびウロキナーゼ等であるが、
本発明において使用するのに特に適している特定
の代表的な物質は、ヒトガンマグロブリンであ
る。

血清学的に不活性なラテツクスポリマー担体に
結合される上記の血清学的に決定可能な物質の量
は通常約0.01重量％乃至15.0％である。しかしな
がら、各々の特定の血清学的に決定可能な物質は
診断試験において最も成功裡に用いられる量で用
いられ、従つて各々の物質はその特定の要請に適
している割合で担体と結合される。従つて本発明
は、診断に有効な試薬を提供するのに十分な量の
血清学的に決定可能な物質を血清学的に不活性な
ラテツクスポリマー担体と組合わせて使用するこ
とをその範囲内に包含するものである。

本明細書において用いる「血清学的に不活性な
ラテツクスポリマー」または「血清学的に不活性
なラテツクスポリマー担体粒子」には、水−不溶
性であり、そして約0.01ミクロン乃至約0.9ミク
ロンの範囲の粒径および水の比重に近い比重を有
し、かくして血清学的に決定可能な物質とのカツ
プリングの後に、粒子の比重は約1.0であり、そ
れらを永久的に水性懸濁液の状態に保つておくこ
とができるラテツクスポリマーが含まれる；粒子
は免疫学的診断試験に関して不活性でなければな
らず、それらはまた十分な表面電荷密度を持たな
ければならず、従つて血清学的に決定可能な物質
とカツプリングしたとき、それらの反撥力は擬集
を妨げるのに十分でなければならず、そして粒子
は第一級または第二級アミン基およびカルボキシ
ル基との縮合により血清学的に決定可能な物質と
アミド結合を生成することのできる活性な基を持
たなければならない。しかして、ポリマー担体は
カルボキシル基、アミン基もしくはそれらに変り
得る基またはこれらの基の任意の組合わせのいず
れかを持つことができる。ポリマー担体上の代表
的な適当な基は活性水素を含む基、例えば、―
COOH、―CONH²、ニトリル基、第二級アミン
基、第一級アミン基またはそれらの任意の組合わ
せである。

アミド結合を形成する化学反応は、本発明に従
えば、水溶性のカルボジイミド縮合剤の存在下に
実施される。カルボジイミドによる血清学的に決
定可能な物質とのカツプリングの程度はポリマー
中の反応性基の密度に依存する。反応性基の密度
は、診断試験において有用である十分な量の血清
学的に決定可能な物質のカツプリングを提供する
のに十分な量の反応性基が存在する限り本発明の
操作可能性には臨界的ではない。

代表的な適当な担体粒子は、通常約40％乃至約
60％の固体濃度の水性ラテツクス懸濁液として市
販されているものである。多くの型のラテツクス
ポリマーは、それらが上述の基準に合致していれ
ば、本発明において使用するのに適している。

代表的な適当なラテツクスポリマーはカルボキ
シル化アクリロニトリル系ポリマー、である。

本発明に従えば、血清学的に決定可能な物質
は、縮合剤として水溶性の式 Ｒ―Ｎ＝Ｃ＝Ｎ―Ｒ 〔式中、Ｒは環中に５乃至６個の炭素原子をも
つシクロアルキル；２乃至12個の炭素原子をも
つアルキル、例えばエチル、ｎ−プロピル、イ
ソプロピル、ｎ−ブチル、sec−ブチル、イソ
ブチル、tert−ブチル、アミル、ヘキシル、ヘ
プチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシ
ルおよびドデシル；モノアリール置換低級アル
キル基、例えばベンジル、α−およびβ−フエ
ニルエチル；モノアリール基、例えばフエニ
ル；モルホリノ；ピペリジル；低級アルキル置
換モルホリニル基、例えばエチルモルホリニ
ル；低級アルキル置換ピペリジル基、例えばエ
チルピペリジル；ジ−低級アルキルアミノ低級
アルキル基；低級アルキル置換ピリジル基、例
えばα，βおよびγメチルまたはエチルピリジ
ルである〕 により表わされるモノカルボジイミド、それらの
酸付加塩及び第四級アミンを用いることにより担
体の個々に分離した粒子に共有結合的にカツプリ
ングされる。

カルボジイミドはE.Schmidt，F.Hitzlerおよ
びE.Lahde，71，1933（1938）の一般的方法に従
つて、対応するチオ尿素からアセトン中での酸素
水銀（）での酸化により製造される。チオ尿素
は対応するアミンから、対称チオ尿素の場合には
二硫化炭素との反応により製造される。非対称チ
オ尿素はアミンとイソチオシアネートより製造す
ることができる。カルボジイミドはまた対応する
尿素から製造し得る。

上述のように、水溶性カルボジイミドは本発明
において使用するのに最も適している。カルボジ
イミドが末端アノ基を有する場合、ハロゲン化水
素酸、列えばHCl、HBrまたはHI；硫酸、スルホ
ン酸、硫酸、リン酸およびホスホン酸との酸付加
塩を生成させることにより水溶性にすることがで
きる；また第四級アミノ基は適当な第四級化剤、
例えばメチルトシレート、臭化メチル、ヨウ化メ
チル、臭化ベンジル、ヨウ化エチル、臭化エチ
ル、ヨウ化ベンジル、エチルトシレート、硫酸メ
チル、硫酸エチル等で第四級化することにより水
溶性にすることができる。

前記のすべては本発明の実施に有用な縮合剤と
して適当である化合物の例である。

血清学的に決定可能な物質および担体は、本発
明に従えば、好ましくは室温（約20℃乃至約25
℃）にて水性媒質中で反応せしめられる。しかし
ながら、反応には約５℃乃至約40℃の温度が適し
ている。血清学的に決定可能な物質の担体への化
学的カツプリングを確実にするために、十分な量
の縮合剤を用いて、利用可能なアミド結合のすべ
てが形成されるのを保証する。一般に、粒子の重
量を基準にして約0.05重量％乃至約2.0重量％の
水溶性カルボジイミドが適当であるが、通常は約
１重量％が用いられる。

PHが蛋白質反応成分を変性させるようなもので
あつてはならないから反応のPHは重要である。通
常５乃至7.5のPHが適当である。このPHは、リン
酸緩衝液等のような適当な常用の無機緩衝系の使
用により維持される。

反応は約５分乃至約24時間内に完了する。一般
に約４乃至５時間で十分である。

生じる生成物は、用いる特定の系および血清学
的に決定可能な物質の安定性の要求に依存して、
約5.0乃至8.5のPHに緩衝された水性媒質中に懸濁
された水−不溶性の物質である。生成物の比重は
水とほゞ同じであり、その結果生成物の懸濁液は
安定となるという結果をもつ。生成物は例ば遠心
分離により単離することができ、そして白色の幾
分チキソトロピー性の粘稠な粘土様物質である。
化学的には、生成物はアミド結合により血清学的
に不活性な担体の個々の分離した粒子に縮合した
単層の血清学的に決定可能な物質からなる。生成
物中の血清学的に決定可能な物質は単一の活性な
成分であるか、あるいは不純物が存在しても、そ
れらは反応の特異性に干渉しない。

上述の基準に適合しておりそしてそれら自身が
上述の基準に適合している反応成分から生じるす
べてのそのような生成物は本発明により包含され
る。

一旦生成物が生じれば、それは免疫学的原理を
用いる特定の診断試験に利用することができる。
それは特定の試験に依存して任意の便利な濃度で
用いることができるが、約1.0重量％乃至約2.5重
量％の濃度が適当であり、1.3重量％が好適であ
る。ガンマグロブリンを担体粒子にカツプリング
させたときに生じる生成物は、患者が変形関節炎
をもつかどうかを決定する診断試薬として用いる
ことができる。これは例えば、スライド上に緩衝
された試験血清を置きそして１滴のガンマグロブ
リン−担体試薬を水性懸濁液中に混合することに
より達成することができる。１分以内に試薬結果
が観察されそして約80％の精度である。

免疫学的試験方法に有用な試薬物質は商業的目
的のために包装するのが便利であり、例えば、一
方の容器には適当な抗血清を含み、他方の容器に
は血清学的に不活性な担体にアミド結合を介して
結合している血清学的に決定可能な物質を水性懸
濁液中に含む２個の別々の容器を含む診断試薬キ
ツトにすることができる。アミド結合を介して血
清学的に不活性な担体に結合している血清学的に
決定可能な物質の水性懸濁液の濃度は任意の適当
な濃度とすることができる。しかしながら、約
1.0重量％乃至約2.5重量％が好適である。

次の実施例は本発明をさらに説明するものであ
る。

実施例 １ コーン・フラクシヨン（Cohn Fraction）を
蒸留水で１％溶液になるまで希釈することにより
変性したガンマグロブリンを製造する。得られる
懸濁液を室温で一晩放置し、次いで10000rpmで
30分間遠心分離する。上澄液を注ぎ出し、ワツト
マン（Whatman）No.１の紙を通して過す
る。

カルボキシル化アクリロニトリル系ポリマーラ
テツクスであるハイカー・ラテツクス1571の１：
10水懸濁液20mlを上記の如くして製造した変性し
た１％のガンマグロブリン20mlと混合する。１−
シクロヘキシル−３−〔２−モルホリニル−４−
エチル〕−カルボジイミドメト−ｐ−トルエンス
ルホネートの１％水溶液10mlを次いで加える。反
応混合物を56℃の水浴中で10分間熱する。生じる
懸濁液を15000rpmで１時間遠心分離する。上澄
液を注ぎ出し、残渣をPH8.2の0.1Mグリシン−食
塩緩衝液50ml中に再び懸濁させる。懸濁液を再び
遠心分離し、残渣すなわち0.01〜１％のガンマグ
ロブリンを含み且つ約0.09μの平均粒径および
1.01の比重をもつ白い粘土様の物質の粒子を回収
する。

ガンマグロブリン−担体粒子をPH8.2の0.1Mグ
リシン−食塩水緩衝液中に懸濁し、次のようにし
て変形関節炎の免疫学的診断試験に用いる：50ラ
ムダ（Lambda）の試験血清を清浄なスライド上
に移す。PH8.2の0.1Mグリシン−食塩水緩衝液１
滴を加え、木製の塗布棒で混合する。製造した試
薬２滴を加え、次いで試薬を再び混合する。スラ
イドを前後に静かに１分間傾むける。試験の結果
を次いで観祭する。スライド上の凝集反応はリウ
マトイド因子を含む血清の存在を示し、非凝集反
応は血清がリウマトイド因子を含まないことを示
す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 変性ガンマグロブリンがアミド結合を介して
   縮合している、約0.01〜約0.9ミクロンの粒径を
   有するカルボキシル化アクリロニトリル系ラテツ
   クスポリマーの個々に分離した粒子から成ること
   を特徴とする、人体の外部で用いるための水とほ
   ぼ同じ比重を有する水−不溶性の免疫学的診断試
   薬。 ２ 変性ガンマグロブリンを、水溶性カルボジイ
   ミドの存在下に、約５゜Ｃ乃至約40゜Ｃの温度に
   おいて、約0.01〜約0.9ミクロンの粒径を有する
   カルボキシル化アクリロニトリル系ラテツクスポ
   リマーと反応させることを特徴とする特許請求の
   範囲第１項記載の水−不溶性の免疫学的診断試薬
   の製造方法。