JPS5929817B2 - 生物学的試薬及びその製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、−ＮＨ２基、−ＮＨ−ＮＨ２基及び；璽弄：
ら：：識二；！←化物残基を有する抗原又は抗体を化学
的に結合させて得たものを有効成分として含有して成る
生物学的試薬及びその製造方法に関する。

生物学的に活性な蛋白質（たとえば、抗原、抗体、ホル
モン等）は、蛋白質鎖のアミノ酸の反応性基と支持体の
第１級アミン基とが反応することにより、該第１級アミ
ンを末端基として持つラテツクス球を含む不溶性固体支
持体に結合されることが知られている。

また、前記で非常に簡潔に説明されているように固定さ
れた抗原を生物学的試薬として、展開試薬（Ｄｅｖｅｌ
Ｏｐｅｒａｇｅｎｔ）と共に用いることも提案されてい
る。上記の方法は、特にゞＴｈｅＪＯｕｒｎａｌＯｆＣ
ｅｌｌＢｉＯＩＯｇｙ″６４（１９７５）７５−８８に
おいてＲ．Ｓ．ＭＯＬＤＡＹ，Ｗ．Ｊ．ＤＲＥＹＥＲ，
Ａ．ＲＥＭＢＡＵＭ，Ｓ．Ｐ．Ｓ．ＹＥＮにより、また
、ＢｉＯｃｈｉｍｉｃａｅｔＢｌＯｐｈｙｓｉｃａＡｃ
ｔａ，３９４（１９７５）３７７−３８７においてＲ．
Ｗ．ＬｌＭ，Ｒ．Ｓ．ＭＯＬＤＡＹ，Ｈ．Ｖ．ＨＵＡＮ
Ｇ，ＳＨＩＡＤＯ−ＰＩＮＳ．ＹＥＮによつて述べられ
ている。これらは、抗体の第１級アミンを介して共有結
合により、抗体をラテツクス球にカツプリングさせて固
定することに関連している。そこでは、抗体はグルター
ルアルデヒド、臭化シアンあるいは水溶性カルボジイミ
ドのような活性剤の働きで活性化された第１級アミンを
側鎖の末端に付される。アミノ酸を介して蛋白質をカツ
プリングさせる斯る方法は、蛋白質鎖の生物学的に活性
なアミノ酸へカツプリングさせることが、場合によつて
は、固定された蛋白質分子の生物学的活性を減じるので
、常に実用上の困難性を生じる。

さらに、既知の方法特にＲ．Ｓ．ＭＯＬＤＡＹらの方法
は、比較的不安定な結合を生じ、また比較的低い収率で
あるのでその技術的、経済的利益を損うものである。本
発明の目的は、蛋白質鎖のアミノ酸の生物学的に活性な
基を用いずに、結合を行なうために、二↑駒―貨Ｚ＝？
？支持体上に生物学的に活性な蛋白質を化学的に結合せ
しめたものを有効成分として成る生物学的試薬及びその
製造方法を提供することにある。

実際には、抗体、抗原、ある種のホルモン、酵素のよう
な蛋白質、特に公知文献に於て化学結合による支持体上
への結合が述べられている蛋白質は、糖蛋白質であるが
、これについては配合群すなわち炭水化物残基は、分子
の生物学的活性に全然寄与していない。本発明者は、炭
水化物残基を持つ抗原又は抗体をその残基を介して支持
体の上に化学的に結合させる驚くべき方法を開発した。

この方法は、結合した抗原又は抗体のどの活性基をも用
いない上に、高収率で、結合した抗原又は抗体に特有の
活性を減じ、変性し或いは低下させることなく、非常に
高い安定性のある結合を与える。すなわち実際に、本発
明方法は、与えられた抗原又は抗体をその炭水化物残基
を介して化学的に結合させ得る。

また、本発明方法は、前記のような支持体に結合させる
際に、抗原又は抗体が炭水化物残基を含んでさえいれば
適用できる点で、従来知られている方法よりも広い適用
領域を持つている。本発明により、−ＮＨ２基、−Ｍ−
ＮＨ２基及び：―；二；＝＝＝汁抗体を化学結合させる
方法が得られる。

この方法は、第一段階で抗原又は抗体の炭水化物残基の
少くとも１つの−｛′Ｈ２ＯＨ基を酸化により−ＣＨＯ
基に変え、第二段階で、こうして生成した−ＧＤ基と、
不溶性固体支持体についている側鎖中の二肖志７＝３≠
＝ア嘩：持体上に抗原又は抗体を化学結合させることか
ら成る。

ここで反応性基が−ＮＨ２基の場合、生成するシツフ塩
基は化学的還元により安定化される。本発明の好ましい
一態様に於ては−１−ＣＨ２ＯＨ基の−ＣＨＯ基への酸
化を過沃素酸ナトリウムを用いて行なう。別の好ましい
酸化の方法としては、酵素を用いる方法がある。

他の好ましい方法としては、酸化によつて少なくとも１
つの−ＣＨ２ＯＨ基を−ＣＨＯ基に変える前に、炭水化
物鎖の末端基がシアリン酸のとき該炭水化物残基をノイ
ラミニダーゼで処理して該シアリン酸を除去する。

−ＣＨ２ＯＨ基を−ＣＨＯ基に酸化する段階が酵素によ
つて行なわれる場合、好ましくは使用する酵素は、炭水
化物鎖の最後から二番目の鎖の性質に応じて炭水化物を
酸化し得るオキシダーゼすなわち、グルコースオキシダ
ーゼ、フコースオキシダーゼ及びガラクトースオキシダ
ーゼの中から選ばれる。

換言すれば、炭水化物鎖の最後から２番目の残基がそれ
ぞれグルコース、フコース、ガラクトースのいずれであ
るかによつて選ぶ。本発明において、上記支持体の側鎖
に末端第１級アミノ基があるときは、支持体に結合され
るべき抗原又は抗体の−ＣＨＯ基と上記−ＮＨ２基が反
応してシツフ塩基を生成するが、これは、第三段階で好
ましくはＮａＢＨ４を用いて化学的還元により安定化さ
れる。

斯かる安定化は、側鎖カト一ＮＨ２基を末端に持つてい
る場合之は−｛′ＨＯ基の存在下で安定なヒドラゾンを
生成するので不要であり、また側鎖が−ＮＨ２基と−Ｓ
Ｈ基の両方を有する場合之等が−ＣＨＯ基と相互作用し
て安定な複素環式化合物（たとえば−ＳＨ基が−ＮＨ２
基に対してβ一位にあるシステインの場合は、チアゾリ
ジン）を形成するので、やはり必要でない。

炭水化物残基を含む抗原又は抗体を、−ＮＨ２基、−開
−ＮＨ２基及びＳＨ−ＣＨ２−〒Ｈ−ＮＨ２基の少くと
も１つの反応性基を有する側鎖を持つた固体不溶性支持
体の上に化学結合させる本発明方法は、特に生物学的試
薬として有用なカツプリング生成物を与える。

本発明者は、驚くべきことに、こうして得られたカツプ
リング生成物の反応性及び安定性は、側鎖の長さ自体が
充分に長ければ非常に増大することを確認した。

また、驚くべきことに、前記カツプリング生成物を含む
診断試薬は、公知の同種の診断試薬が有しない感度及び
精度を備えていることも確認した。少くとも１つの｛Ｈ
Ｏ基を持つ抗原又は抗体の化学的結合に用いる支持体は
、不溶性の固体支持体であり、ラテツクス球、アガロー
ス又はデキストランビーズ、活性化ガラスビーズ等の中
から選はれる。

これらは、結果的に酸官能基を有するものとなるアミン
類、ポリアミン類、アミノ酸、脂肪族又は芳香族ヒドラ
ジン類の中から選ばれた化合物を結合させることによつ
て、−ＮＨ２基、６＝＝讐＝ｘ二リ：！゛これらの支持
体の中で、新規で本発明の範囲内にあるものは、芳香族
アミン類、ジアミン以外のポリアミン類、置換アミノ酸
、末端に酸基を有する脂肪族あるいは芳香族ヒドラジン
類の中から選ばれた化合物を支持体に結合させた結果、
生じた：′：志７：？３Ｘ：Ｘ二：している支持体であ
る。

本発明の特に有利な実施態様によれば、既知の支持体で
あれ、本発明による新しい支持体であれ、支持体に結合
している側鎖は、その反応性基を介して脂肪族もしくは
芳香族アミン類及び脂肪族もしくは芳香族ヒドラジン類
の双方又は一方、あるいはアミノ酸、特に結合される抗
原又は抗体の−ＣＨＯ基の存在下で複素環を形成し得る
一２基と−ＳＨ基の両方を持つアミノ酸の中から特に選
ばれたやはり少くとも１つの反応性基を有する含窒素化
合物とカツプリングされる。

上記側鎖が結合している不溶性固体支持体はカルボキシ
ル基を持つていて、これによつて側鎖が支持体に結合す
るのが有利である。

本発明による支持体のもう一つの有利な実施態様によれ
ば、不溶性固体支持体は、−ＮＨ２基を有しておりこれ
によつて上記の側鎖が支持体に結合される。

本発明では、不溶性固体支持体に結合されるアミン類あ
るいはポリアミン類を、芳香族ジアミン類、脂肪族ジア
ミン類以外のポリアミン類及び置換アミノ酸類の中から
選ぶ。

上記支持体に結合される化合物としては芳香族ジアミン
類、たとえば下記二つの式であられされる第１級および
第２級アミノ基を有するポリアミン類あるいは適当な置
換アミノ酸類が好ましい。

ＮＩ−］２（ＣＨ２）ＸＮＨ（ＣＨ２）ＹＮＨ２（ここ
でＸ≧３及びｙ≧３を示す）ＮＨ２（ＣＨ２）ＸＮＨ（
ＣＨ２）ＹＮＨ（ＣＨ２）ＺＮＨ２（ここでｘ≧３，ｙ
≧４及びｚ≧３を示す）上記における置換アミノ酸の中
には次式で示されるシステインのようにＳＨ基を有する
化合物が含まれる。

本発明では、以下のような有利な実施態様がある。

すなわち、支持体への側鎖の結合は、ジアミン、ポリア
ミンあるいはアミノ酸のような脂肪族あるいは芳香族ア
ミンと、特にジアミン類、ポリアミン類、脂肪族あるい
は芳香族ヒドラジン類あるいはそれらの誘導体のような
他の脂肪族あるいは芳香族アミン類とをカツプリングさ
せることによつて生じる。本発明の特に有利な実施態様
として、固体の不溶性支持体は好ましくはその反応性の
−ＮＨ２基を介して、アジピン酸ジヒドラジド、ｐ−ヒ
ドラジノ安息香酸その他にカツプリングしたヘキサメチ
レンジアミン（ＨＭＤ）鎖を持つている。

本発明の更に有利な実施態様として、不溶性固体支持体
で、たとえばスペルミジン、ジアミノプロピルアミン、
スペルミンのようなポリアミン鎖を持つているものは、
その反応性のある−ＮＨ２基を介して、都合よくアジピ
ン酸ヒドラジド、ｐヒドラジノ安息香酸その他にカツプ
リングしている。

本発明の更に有利な実施態様として、不溶性固体支持体
で、たとえばβ−アラニンあるいはεアミノカプロン酸
のようなアミノ酸から成る側鎖を持つているものは、都
合よくジアミノプロパン、アジピン酸ジヒドラジド、ｐ
−ヒドラジノ安息香酸あるいはその類似化合物にカツプ
リングしている。

本発明のもう一つの有利な実施態様として、不溶性固体
支持体は、たとえばシステインのように、ＳＨ基を有す
るアミノ酸を末端に持つ側鎖を持つている。

上記実施態様による−ＳＨ基を有するアミノ酸は、脂肪
族あるいは芳香族ジアミンにカツプリングされる。

本発明において、また、ラテツクス球、デキストランも
しくはアガロースビーズ、活性化されたガラスビーズそ
の他から選ばれた不溶性固体支持体上に、−ＮＨ２基、
−ＮＨ−ＮＨ２基及び呻二＝；皆：！：？＝孟？；ある
。

この方法は、上記側鎖を適当な縮合剤の存在下で支持体
の上に結合させることから成り、この固定方法は上記側
鎖を特に、アミン類、脂肪族もしくは芳香族ヒドラジン
類、アミノ酸類の中から選ばれた含窒素化合物とカツプ
リングさせる段階を含んでいる。このカツプリングの段
階はカルボジイミドあるいはＮ−ヒドロキシルサクシン
イミドのような適当なカツプリング剤の存在下で有利に
進められる。本発明においては、縮合試薬あるいはカツ
プリング試薬あるいはその双方を兼ねるものとしてグル
タールアルデヒドあるいは次の一般式で表わされる水溶
性あるいは部分的に水溶性のカルボジイミドを用いるの
が好ましい。

Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ （ここでＲは炭素数２から１２のアルキル基特にエチル
、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、Ｓｅｃ−
ブチル、Ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチル、アミル、ヘキ
シル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシ
ル、ドデシル、炭素数５あるいは６のシクロアルキル基
、たとえばベンジル、α−あるいはβ−フエニルエチル
基のようなモノアリール置換されたアルキル基、たとえ
ばフエニル、モルホリノ、あるいはピペリジル基のよう
なモノアリール基、たとえばエチルモルホリニル基のよ
うなモルホリニル基で置換された低級アルキル基、たと
えばエチルピペリジル基のようなピペリジル基で置換さ
れた低級アルキル基、低級ジアルキルアミノ基、たとえ
ばα−，β−、あるいはγ−メチル−あるいは一エチル
ピリジル基のようなピリジル基で置換された低級アルキ
ル基、それらの酸付加塩及びそれらの四級アンモニウム
塩である。

２つのＲは同一の場合と異なる場合がある。

）本発明の方法の好ましい実施態様として、支持体上へ
側鎖を共有結合させるときは、遊離の−ＮＨ２基を含ま
ないＰＨ６．Ｏ〜８．８の非凝集性緩衝剤中で行なう。

本発明の方法のもう一つの好ましい実施態様として、共
有結合は、結合させる時に用いたのと同じ緩衝剤で透析
して得られる。

上記で得られる側鎖を持つた不溶性固体支持体は、それ
自身新規なものであり、多くの工業的用途を有する。

本発明においては、その用途の１つとして、少くとも１
つの−ＣＨＯ基を持つ抗原又は抗体の支持体として用い
る。

この抗原又は抗体は、その一ＣＨＯ基と、上記支持体の
側鎖の−ＮＨ２基、ｘ冫＝−ＳＶコΣ；＝：Ｈ．！に化
学的に結合される。

斯る用途は、炭水化物残基を含む抗原又は抗体をその炭
水化物残基を介して結合させる場合、まず炭水化物残基
の二つの隣接する官能基を−ＧＤ基に酸化し、次いで、
これらの−ＣＨＯ基を不溶性固体支持体に結合している
側鎖の−ＮＨ２基、？＊？＝：Ｘ；：リ：いう点におい
て大変有用である。

支持体に結合させるべき抗原又は抗体の炭水化物残鎖の
酸化は、ＰＨ約６で行なうのが好ましい。

過剰の酸化剤は、上記酸化反応終了時に、例えば透析又
は酸化剤によつて酸化される亜硫酸ナトリウム、グリセ
ロール、グルコース等の試薬を加えること等種々の適当
な方法で除去するのが好ましい。上記用途の利点は、少
なくとも部分的に−０Ｄ基に酸化された炭水化物残基を
持つ抗原又は抗体が、本発明における支持体に結合する
際に、糖蛋白質であるために増大する。

実際に糖蛋白質に属す抗原又は抗体の前もつてアルデヒ
ドに酸化された炭水化物残基を介して不溶性固体支持体
へ固定したものは、その遊離の蛋白部が正確な検出を可
能とする試験を行なう際有用であり、その感度はこの方
法で実現された不溶性診断試薬を用いるとナノグラム（
Ｎ９）のオーダーの抗原の検出も可能な程高いものであ
る。本発明においては、本発明のもう一つの側面を形成
している生物学的試薬を用いる際の容易さを改善するた
めに、糖蛋白質を塩基性染料の中から選ばれた−ＮＨ２
基、−ＮＨ−ＮＨ２基及び呻−リリニ↓：？：的に結合
させることが出来る。

こうして着色生物学的試薬が得られ、これにより免疫反
応が（特に抗原あるいはその抗体に関して）、直接反応
特に赤血球を媒体とする手段を行なう必要なく凝集反応
によつて示されるので、凝集反応の結果を読み取ること
は、非常に容易になつた。

本発明では、これらの固体不溶性着色支持体は、適当な
緩衝剤中で縮合剤及びカツプリング剤あるいはそのいず
れかの存在下に側鎖を支持体上に結合させたあと、カツ
プリングしなかつた試薬を脱着するという二つの段階を
踏んで得られる。

縮合剤及びカツプリング剤は二つの連続するステツプに
於て加えられ、特に、グルタールアルデヒド、Ｎ−ヒド
ロキシルーサクシンイミド及び水溶性あるいは部分的に
水溶性のカルボジイミドの中から選ぶ。着色支持体合成
の有利な方法としては、これらの試薬を使用する前に非
凝集性緩衝剤中に保存する。

本発明によつて数多くの生物学的試薬が合成され、使用
され得るが、これらの試薬はその優れた安定性と高い感
度という点で顕著な効果を発揮するＯ以上の記載に関し
て、本発明は多くの他の実施態様があるが、このことは
以下に明白に記述されている。

本発明の目的は、以上の通りであり、炭水化物残基を含
む抗原又は抗体を−ＮＨ２基、−ＮＨ−２：＝＝二？＝
ｙ；エニ？二有効成分として成る生物学的試薬及びその
製造方法を提供することである。

本発明は、以下の実施例によつてよりよく理解できるで
あろう。

これは、本発明による支持体及び新規な生成物の例に言
及してある。同様に、本発明による診断試薬の製造例に
も言及してあるが、これに関しては放射能及び比ロウ分
析による試験の範囲内で高い感度と精度が示されている
。本発明は之等実施例によつて何ら限定されるものでは
ない。実施例 Ｉ 本発明による不溶性固体支持体の製造例ＩＡ反応性
−ＮＨ２基を有する他の窒素化合物と結合するのに適し
た側鎖を有する不溶性固体支持体の製造ＩＡ−１反応性
−ＮＩｌ２基を有する側鎖を含み球形でかつ目盛を付し
たカルボキシル化ポリスチレン支持体の製造実施例 １ ヘキサメチレンジアミンから構成された側鎖を有する支
持体の製造０．１４ＭＮａＣ１及び０．０１Ｍホウ酸塩
一塩酸、ＰＨ８．ｌ（ＢＢＳ）の組成をもつホウ酸塩緩
衡液に懸濁した、遊離−ＣＯＯＨ基を有する「エスタポ
ール（ＥＳＴＡＰＯＲ）ＰＳ６８」（直径０．２２μの
球状を呈し、目盛を付したカルボキシル化ポリスチレン
、ローンープロジル（ＲｈＯｎｅ−ＰｒＯｇｉｌ）社製
）１２Ｔｆ１９に、ヘキサメチレンジアミン（ＨＩＶＤ
）８０！ＴＭを加える。

混合液を１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピノ
（ハ）カルボジイミド・塩酸塩（ＥＤＣ）０．０２Ｍの
存在下に２０℃にて３時間振とうする。次いで懸濁液を
その０．Ｄ．（光学密度）が２３０ｎｍからゼロに等し
くなるまでＢＢＳ緩衡液にて透析する。かくしてカルボ
キシル化ヘキサメチレンジアミンーエスタポール支持体
（エスタポール一ＨＭＤ）を得る。実施例 ２ ポリアミンから構成される側鎖を有する支持体の製造Ｈ
ＭＤをスペルミンに代えた以外は実施例１と同様に操作
を行う。

実施例 ３ アミノ酸から構成される側鎖の不溶性支持体への固定Ｐ
Ｈ８．ｌのＢＢＳ緩衡液に懸濁した遊離−ＣＯＯＨ基を
有する「エスタポールＰＳｌ４２」２０７！１９に、第
１級アミノ基をα位に有しないε−アミノカプロン酸２
０μＭを加える。

混合物をＥＤＣＯ．Ｏ２Ｍの存在下に約２０℃にて３時
間振とうする。次いで、懸濁液をその０．Ｄ．が２３０
ｎｍからゼロに等しくなるまでＢＢＳ緩衡液にて透析す
る。支持体上へのアミノ酸の固定は支持体の遊離−ＣＯ
ＯＨ基のレベルで形成される−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）４Ｃ
００Ｈ基を介して行われる。

実施例 ４クレジル紫の固定 ＮａＣｌＯ．ｌ４Ｍ及びホウ酸塩−ＨＣＩＯ．ＯｌＭｌ
ｐＨ８．ｌ〔ＢＢＳ〕５ｄに懸濁した、遊離の一ＣＯＯ
Ｈ基を有する「エスタポール（ＥｓｔａｐＯｒ）」（カ
ルボキシル化ポリスチレン、ローンープロジル社製）１
０〜に超音波処理したクレジル紫２０〜の懸濁液を０．
２２μのミリボア（Ｍｉｌｌｌ−ＰＯｒｅ）にて済過し
て得られるクレジル紫溶液を加える。

混合物を１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド・塩酸塩〔ＥＤＣ〕０．０５Ｍの存
在下に２０℃にて１２時間振とうする。次いで上記操作
の終了時に再びＥＤＣを加え更に１２時間振とうする。
次いで、懸濁液を１時間２００００Ｇ（重力、以下同じ
）にて遠心分離し、沈澱物をＰＨ５．５の酢酸塩緩衡液
にとり、さらに遠心分離を行つて過剰のクレジル紫を除
去する。

上澄液が透明になるまで上記操作を繰返す。次いで、０
．１ＮＨＣＩにて連続３回洗浄して塩酸塩を生成させる
ことにより酢酸塩を除去し、さらに０．１ＮＮａ０Ｈに
て２回洗浄してアミノ基を再生し、次いでＰＨ８．８の
ＢＢＳにて２回洗浄して過剰のソーダを除去する。得ら
れる生成物をＰＨ７のリン酸塩緩衡液０．１Ｍ中で保存
する。実施例 ５ 塩基性フクシンの固定 クレジル紫２０ｍｇの代りに塩基性フクシンの飽和溶液
２７ＩＬ１！を用いて実施例４と同様の操作を行う。

実施例 ６タウ８１６カルボキシル化ポリスチレン支持
体の製造ローンープロジル社製カルボキシル化ポリスチ
レン「エスタポール」について前述したカツプリング反
応をタウケミカル社製「タウ８１６カルボキシル化ポリ
スチレン球」について同様に行う。

即ち上記球について前記側鎖のカツプリング反応を適用
し、「エスタポール」球と対比してこの球に配置できる
−ＣＯＯＨ基の数を計算する。タウ８１６粒子１８０〜
にＮａＣｌＯ．ｌ４Ｍ及びホウ酸塩−ＨＣＩＯ．ＯｌＭ
ｌｐＨ８．ｌの溶液２０ｄに懸濁したヘキサメチレンジ
アミン（ＨＭＤ）５６０〜を加える。１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤ
Ｃ）を最終濃度０．０５Ｍとなるように２回連続して加
える。

４℃にて１８時間振とうしたのち、タウの球を同じ緩衡
液にて３０分間２００００Ｇにて連続３回遠心分離して
後洗浄し、最後にＰＨ６の０．１Ｍのリン酸塩緩衡液１
３ｍ１に懸濁する。

ＩＡ−２反応性−ＮＨ２基を有する側鎖を含むガラス球
支持体の製造実施例 ７ ガラス球上へのＨＭＤ側鎖の固定 遊離−ＣＯＯＨ基を含むガラス球（コーニング・グラス
・ワークス（ＣＯｒｎｉｎｇＧｌａｓｓＷＯｒｋｓ）社
製、商品名「ＣＰＧ／ＣａｒｂＯｘｙｌ」、細孔径５５
０Ｘ１直径１７７〜８４０μ）１９にＰＨ７の０．１Ｍ
のリン酸緩衡液５ｍ１を加え、懸濁液を減圧下にガス抜
きする。

同じ緩衡液に溶かしたＨＭＤ５ＯμＭを加え、混合物を
０．０５ＭＥＤＣの存在下４℃にて１８時間軽く振とう
する。次いで、ガラス球をリン酸塩緩衡液にて洗浄する
。ガラス球上に固定されたＨＭＤ側鎖の末端−ＮＨ２基
をヒドラジンとカツプリングさせる。

これは脂肪族ヒドラジンを用いる場合下記実施例１１記
載の方法に従い、また芳香族ヒドラジンを用いる場合下
記実施例１８記載の方法に従う。実施例 ８ガラス球の
有するＮ−ヒドロキシル−スクシンイミド基による側鎖
末端上へのポリアミンの固定コーニング・グラス・ワー
クス社製商品名「ＣＰＧ／Ｎ−０Ｈｓｕｃｃｉｎｉｍｉ
ｄｅ」として知られ式で表わされる市販のガラス球２９
を、ＰＨ８．２のＢＢＳ緩衡液１０ｍ１に懸濁させ、次
いで減圧下にガス抜きし、これに４０ＩｔＭのスペルミ
ンを加える。

混合物を４℃にて１６時間軽く攪拌したのち、ＢＢＳ緩
衡液にて洗浄して反応生成物を除去する。ポリアミン残
基の末端−ＮＨ２基は下記実施例１１および１３にそれ
ぞれ記載した方法に従い脂肪族または芳香族ヒドラジン
とカツプリング反応する。ＩＡ−３反応性−ＮＨ２基を
含む側鎖を有するアガロースゲル球からの支持体の製造
実施例 ９ ε−アミノカプロン酸の側鎖を持つアガロースゲル球［
ＣＨ−セフアロース（ＣＨ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ）」（
スエーデン・ウプサラ・フアルマシア社製アガロースゲ
ル球）を用いる。

之は既にε−アミノカプロン酸の側鎖を有している。Ｉ
Ｂ支持体上に固定されるべき化合物の−ＣＨＯ基と反応
し得る側鎖を有する不溶性固体支持体の製造ＩＢ−１
ヒドラジンによつて構成される末端官能基の固定１Ｂ−
１．１芳香族ヒドラジンの場合 実施例 １０ 「エスタポール」−ＨＭＤ−ｐ−ヒドラジノベンゾエー
ト支持体の製造直径０．２２μの「エスタポール］−Ｈ
ＭＤ４７ｒｌｇをＰＨ８．８のＮａＣ′０．１４Ｍ及び
０．０１Ｍホウ酸塩−ＨＣＩを含むホウ酸塩緩衡液２ｍ
１に懸濁させる。

該懸濁液に、ＢＢＳに溶かしたｐ−ヒドラジノ安息香酸
２２μＭを加える。容積をＢＢＳにて４ｍ１に調節する
。これに１−エチル−３−（３ジメチルアミノプロピル
）カルボジイミド１０Ｔｎ９を加えたのち、試験管を室
温（２０℃）下に２時間振とうする。次いで、その内容
物を透析嚢内に移し、室温下ＢＢＳ３ＯＯｍｌ（３回取
換）により２４時間透析する。かくして「エスタポール
」ＨＭＩ）−ｐ−ヒドラジノベンゾエート支持体を得る
。実施例 １１ 芳香族ヒドラジンに結合したポリアミンにより構成され
る側鎖の不溶性支持体への固定ＰＨ８ｌのＢＢＳ緩衡液
１５ｍ１に懸濁させた式にて示され、上記実施例２で製
造された「エスタポール」−スペルミン．７即に、ｐ−
ヒドラジノ安息香酸１００ＩｔＭの水溶液を加える。

混合物をＥＤＣＯ．Ｏ５Ｍの存在下に室温（約２００Ｃ
）にて２４時間振とうする。次に、懸濁液をそのＱＤ．
が２３０ｎｍからゼロに等しくなるまで、ＰＨ８．８の
ＢＢＳ緩衡液によつて透析する。実施例 １２ 芳香族ヒドラジンの固定 ＰＨ７の０．１Ｍリン酸塩１０ｍ１に懸濁させた一ＮＨ
２（芳香族アミン）の形態を有する「エスタポール」１
０７ｒ１９に、ＰＨ８のホウ酸塩０．１Ｍに溶解させた
ｐ−ヒドラジノ安息香酸５０μＭを加える。

次いでＥＤＣＯ．Ｏ５Ｍの存在下に該混合物を２０℃に
て１２時間振とうし、この期間の終りにＥＤＣの添加を
更新したのち、１２時間振とうを続ける。その後、懸濁
液を１時間２００００Ｇにて遠心分離し、沈澱物をＰＨ
８．ｌのホウ酸塩０．−１Ｍに再び加えたのち、再度遠
心分離して未反応のｐ−ヒドラジノ安息香酸を除去する
。この洗浄に続けて、他に２度の洗浄（ＰＨ８．ｌのホ
ウ酸塩０．０１Ｍ）および２度のＰＨ７のリン酸塩０．
１Ｍによる洗浄を行う。得られる生成物をその最後の緩
衡液中で保存する。ＩＢ−１．２脂肪族ヒドラジンの場
合 実施例 １３ 脂肪族ヒドラジンに結合した脂肪族ジアミンによつて構
成される側鎖の不溶性支持体上への固定ＰＨ７のリン酸
塩緩衡液の０．１Ｍに懸濁させた式で示され、上記実施
例１で製造した「エスタポール］−ＨＭＤ６．Ｏ〜を最
終濃度を１．２５％にしてグルタールアルデヒドの存在
下に２０℃にして１時間振とうする。

次いで、懸濁液をＰＨ７．Ｏのリン酸塩緩衡液０．１Ｍ
にて１８時間透析する。透析後に得られる懸濁液に、ア
ジピン酸ジヒドラジド２０μＭの水溶液を加える。混合
物を２０℃にて１６時間振とうした後、透析して過剰の
アジピン酸ジヒドラジドを除去する。ＩＢ−２第１級ア
ミノ基によつて構成される末端官能基の固定実施例 １
４ ジアミンと結合したアミノ酸によつて構成される側鎖の
不溶性固体支持体への固定実施例３に従つてε−アミノ
カプロン酸を保持させた「エスタポール」球にジアミノ
プロパンを下記に述べる如くして固定する。

ε−アミノカプロン酸を結合させた「エスタポール」球
の懸濁液を含む透析のう内の内容物をジアミノプロパン
２５μＭを含む試験管に移す。

混合物をＥＤＣＯ．Ｏ５Ｍの存在下に２０℃にて３時間
振とうしたのち、上記実施例１において記載したＢＢＳ
緩衡液により透析し、その結果ジアミノプロパンを不溶
性支持体上に固定されたε−アミノカプロン酸とカツプ
リングさせる。実施例 １５ ε−アミノカプロン酸の側鎖を有するアガロースゲル球
へのＨＭＤのカツプリング実施例９で置換されたセフア
ローズ球へのＨＭＤのカツプリングは上記実施例７に記
載の方法に従い実施される。

ε−アミノカプロン酸の側鎖の置換体ＨＭＤの末端−Ｎ
Ｈ２基を、上記末端−ＮＨ２基上に置換される脂肪族ま
たは芳香族ヒドラジンとカツプリングさせる。

これは実施例１１および１３にそれぞれ記載された方法
に従つて行われる。１Ｂ−３固定すべき化合物の−ＣＨ
Ｏ基の存在下にチアゾリジン誘導体を生成し得る二暉二
＝＝轡ニ：；：嵩 定 実施例 １６ 一ＳＨ基を有するアミノ酸の遊離−ＮＨ２基を有する不
溶性固体支持体への固定ＰＨ６．５のリン酸塩緩衡液に
懸濁させた「エスＩタポール」−Ｎ？の２〜に、式ＨＳ
ＣＨ２ＣＨＣＯＯＨ．ＨＣＩを有するシステイン塩酸塩
６μＭの水溶液を加える。

混合物をＥＤＣＯ．Ｏ５Ｍの存在下に２０℃にて１６時
間振とうする。次いで、システインを固定させた「エス
タポール」球を０．２２μのミリボア淵過剤で洗浄して
過剰のシステインおよび反応生成物を除去する。かくし
て変性された球をＰＨ６．５のリン酸塩緩衡液２ｍ１に
再び懸濁させる。実施例 １７ タウ８１６カルボキシル化ポリスチレン−ＨＭＤへのシ
ステインの固定上記実施例６で得たタウ８１６カルボキ
シル化ポリスチレン−ＨＭＤの懸濁液に、ＰＨ６の０．
１Ｍリン酸塩緩衡液２ｍ１に溶解したシステイン−ＨＣ
Ｉｌ８ηを加え、次いでＥＤＣを最終濃度０．０５Ｍと
なるまで加える。

１８時間４℃としたのち、球を上記実施例６と同様に洗
浄する。

支持体に固定すべき化合物の酸化支持体上での固定にお
ける、本発明の酸化の必要性を、下記実施例１８により
示す。実施例 １８ 不溶性支持体へのグロブリンの固定においてその遊離−
ＣＨＯ基の役割ガンマ−グロブリンを下記の実施例１９
〜２７に記載したように酸化する。

該ガンマ−グロブリンは、予めトリチウムで標識し、か
つ遊離−０Ｄ基を含まないようにＮａＢ３Ｈ４の存在下
に還元しておいた。８４００ｃｐｍを含むガンマ−グロ
ブリン（０．３ｍ０をＰＨ６．Ｏのリン酸塩緩衡液０．
１Ｍの存在下に下記表に示す標品と接触させる。

４℃にて１６時間保持した後、標品を０．２２μのミリ
ボア済過剤で済過し、下記の緩衡液５ｍ１にて４回洗浄
する。

０．１％牛血清アルブミン、 ０．１０１）トリトン×１００（ＴｒｉｔＯｎ×１００
）、０．１４ＭＮａＣ瓜０．０１Ｍｔ．ウ酸塩−…Ｘｐ
Ｈ８．８上記表に示された結果から次のことがわかる。

（１）若干量の放射能が淵過剤上に保持される。（２）
上記緩衡液による洗浄は済剤そのものへの吸着をかなり
低下させる。この場合、ガンマ−グロブリン＋緩衡液の
みによる淵剤への吸着は、淵剤への吸着分（１６８０ｃ
ｐｍ）の全放射能の約２００Ｉ）を示す。（３）Ｐ剤上
に保持された放射能量は、「エスタポール６８−ＣＯＯ
Ｈ」、「エスタポール６８−Ｎ［−１２」または「エス
タポール一ＮＨ−ＮＨ２」の存在によつても実質的に増
加しない。

実際にそれらの値は緩衡液のみの場合に得られる値（３
１９ｃｐｍ）に等しいか又はより低い。従つて、使用さ
れた３種の「エスタポール」へのガンマ−グロブリンの
吸着は認められない。さらに、上記淵過法を有意義とす
るためには、酸化されたガンマ−グロブリンの存在下に
不溶性支持体とカツプリングする放射能が、酸化を受け
ていないガンマ−グロブリンの場合に比べて２０％を越
えている必要がある。ＮａＢ３Ｈ４にて還元後の酸化及
び非酸化ガンマ−グロブリンの夫々と「エスタポール一
Ｎ［−１２］との結合体の放射能含量の比較４℃にて１
８時間接触させたのち、各透析嚢内容物を、透析した流
体がもはや放射能を示さなくなるまで、ＰＨ８．８のＢ
ＢＳを１日当り３回または４回取換えて５日間透析を行
う。

各割当の調製物を次いで０．２２μのミリボアで済過し
たのち、０．１％のＳＡＢｌＯ．ｌ％のトリトン×１０
０及びＢＢＳ（ＰＨ８．８）の緩衡液にて洗滌する。他
の割当量につき「エスタポール」の濃度を決定するため
に５５０ｎｍの光学密度ＱＤ．を測定する。非酸化のガ
ンマ−グロブリンの存在下での［エスタポール６８−Ｎ
Ｈ２」について認められる放射能は、酸化されたガンマ
−グロブリンの存在下での「エスタポール６８−ＮＨ２
」につき認められる値の１７．８％を示すにすぎない（
その値は、「エスタポール］の不存在下でのガンマ−グ
ロブリンの淵剤への吸着による値と同程度である。

一方、酸化されたガンマ−グロブリンの場合、「エスタ
ポール」−ＮＨ２につき放射能量は５倍に増加する。

少なくとも−ＣＨ２ＯＨ基の１つの−ＣＨＯ基への酸化
による炭水化物残基を有する種々の化合物の酸化例を以
下に示す。

（４）ガンマ−グロブリンの酸化 実施例 １９ 水溶液中でのガソマーグロプリンの化学的酸化山羊、兎
および馬から得たガンマ−グロブリンを、（ＮＨ４）２
Ｓ０４によつて沈澱させたのちＤＥＡＥ−セルロース上
クロマトグラフイ一によつて精製する。

ＰＨ６の０．１Ｍリン酸塩緩衡液２ｍ１に溶かした馬の
ガンマ−グロブリン（抗ポリアミン抗体を含有する）６
０即に、０．１５ＭＮａ０４の水溶液０．２ｍ１を加え
る。

混合物を遮光下に４℃にて３時間放置後、ＰＨ６のＮａ
ＣｌＯ．ｌ４Ｍ−ＰＯ４Ｏ．ｌＭ緩衡液を ３回取換え
ながら１時間透析する。

該ＰＨ下に、Ｎａ［０４による酸化で得られた反応性ア
ルデヒド基とリジンあるいは蛋白質末端の−ＮＨ２基と
の間で起るシツフ架橋形成反応は減少する。実施例 ２
０ 抗ガンマ−グロブリン一抗体の化学的酸化ＢＢＳＯ．ｌ
ｍｌ中の抗兎性山羊のガンマ−グロブリン（９Ｇ）５２
０ｔｔ９に０．０３ＭＮａＩ０４の０．１ｍ１を加える
。

混合物を遮光下に４℃にて３時間放置したのち、ＢＢＳ
緩衡液を３度交換しつつ２時間透析する。実施例 ２１ ガンマ−グロブリンの化学的酸化 ＰＨ６の０．１Ｍリン酸塩緩衡液２７ＩＬ１に溶解した
馬の兎疫性グロブリン６０７１１９に０．１５ＭＮａＩ
０４の水溶液０．２ｍ１を加える。

混合液を遮光下に４℃にて３時間放置し、この期間の終
りに、最終濃度０．１５Ｍとなるグリセロールを添加し
てＮａＩＯ４の作用を抑える。

４℃にて３０分後に、反応生成物をＰＨ６のリン酸塩緩
衡液０．１Ｍによつて数回交換しながら４℃にて１８時
間透析を行う。

（Ｂ）ビールスの酸化 実施例 ２２ 酸化された風疹ビールスの調製 蛋白質１６ｍ７を含む風疹ビールスの抗原製剤５ｍ１に
、ＰＨ６の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衡液に溶かした
０．１５ＭＮａＩ０４０．５ｍ１を加える。

この混合物を遮光下に４℃にて３時間放置する。

次いで、０．１５ＭＮａ２Ｓ０３を添加してＮａＩＯ４
の作用を抑える。４℃にて３０分後、混合液を４℃にて
１８時間透析して過剰の酸化生成物を除去する。

実施例 ２３ 犬のジステッパービールス酸化体の調製 実施例２２に記載の方法に従い犬のジステッパービール
スを酸化する。

実施例 ２４ インフルエンザビールス酸化体の調製 実施例２２で記載した方法に従いインフルエンザビール
スを酸化する。

実施例 ２５ ドイツ風疹ビールス酸化体の調製 実施例２２で記載した方法に従いドイツ風疹ビールスを
酸化する。

（Ｃ）ホルモンの酸化 実施例 ２６ ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）酸化体の調製この
ホルモンを酸化するために実施した方法は上記実施例１
９および２０で記載した方法である。

予め少くとも１つの−ＣＨ２ＯＨ基を−ＣＨＯ基に酸化
された炭水化物残基を持つ化合物の支持体上へのカツプ
リング実施例 ２７ 末端−ＮＨ２基のカツプリング：支持体への抗体の固定
による。

抗ポリアミン性［エスタポーノり一ＨＭＤ一抗体試剤の
調製研究材料及び患者の血液中のポリアミン量の評価に
用いられる抗ポリアミン抗体使用による本発明試剤の調
製には、これらの抗体をスペルミンを含むガラス支持体
上へ基質親和性クロマトグラフイ一によつて固定させた
のち、之等を０．０６ＭＮａＩ０４溶液により酸化する
。

暗室中４℃にて３０分のちに、抗体をＰＨ８．８のＢＢ
Ｓにて洗滌して過剰のＮａＩＯ４を除去する。［エスタ
ポール」−ＨＭＤ（１０Ｔｒ１９）２ｍ１（上記実施例
１記載の方法と同様にして調製する）を上記実施例１９
〜２１で記載した方法と同様に抗体酸化体と混合する。

懸濁液を４℃にて１４時間回転させながら軽く振とうす
る。生成したシツフ塩基を間歇的に振とうしつつ４℃に
て５時間ＮａＢＨ４（３μＭ）で処理して安定化させる
。懸濁液を５分間１００００回／分にて遠心分離する。
上澄を回収し、沈澱物をＢＢＳにて４回洗滌後、全上澄
を集める。実施例 ２８ ヒドラジンのカツプリング：反応性「エスタポール」−
ＨＭＤ−ｐ−ヒドラジノーベンゾエート一抗１ｇＧ抗体
試剤の調製溶液中で遊離抗体の使用モデルを構成する「
エスタポール」一抗兎性１９Ｇ抗体を調製する。

最終製剤は非常に広範な利用域を有する、それは間接法
による立証に、兎１ｆ！Ｇを使用する全める免疫反応を
検出することを可能とする。実施例２０で得たガンマ−
グロブリン酸化体（２６０μ９）の溶液０．１ｍ１を「
エスタポール」一ＨＭＤ−ｐ−ヒドラジノーベンゾエー
ト１．７〜に加える。

混合物を４℃にて３時間振とうする。上記実施例２７に
おいて、記載された処理のあとで、抗体を含む「エスタ
ポール」球を洗滌したのち、蔗糖の１０％溶液を使用し
て６０％蔗糖相上に沈降させて濃縮する（４℃にて１時
間１０００００Ｇ）。

相間に濃縮した１エスタポール」を透析して過剰の蔗糖
を除去する。実施例 ２９ 末端−ＳＨ基のカツプリング：酸化したガンマ−グロブ
リンの−ＣＨＯ基への遊離末端−ＳＨ基を持つ不溶性支
持体のカツプリング「エスタポール］−ＳＨ２〜に、実
施例１９と同様にして酸化したガンマ−グロブリン１〜
を加える。

４℃で３０分間接触したのち、チアゾリジンの形成によ
り「エスタポール」−ＳＨ粒子の綿毛様沈澱が認められ
る。

その綿毛様沈澱は、「エスタポール」−ＮＨ２にもまた
非酸化のガンマ−グロブリンを固定した「エスタポール
」−ＳＨにも生起しない。本発明物質のアイソトープに
よる標識の例実施例 ３０ ３Ｈまたは１４Ｃエタノールアミンでラテツクス支持体
を予め標識化した放射性の本発明カツプリング化物の製
造「エスタポール」球に共有結合にて３Ｈまたは１４Ｃ
エタノールアミンを固定させて放射性とする。

ＢＢＳに懸濁させた「エスタポール］２０Ｗ１９に、全
容積４．０ｍ１にて１０μＣｉｌ４Ｃエタノールアミン
０．０５ｍ１（１．６μＭ）および１−エチル−３一（
３−ジメチルアミノプロピル）一カルボジイミド６．０
７！Ｚｇを加える。２０℃にて２時間回転振とうさせた
のち、ＨＭＤ２ＯμＭおよび１−エチル３−（３−ジメ
チルアミノプロピル）カルボジイミド２０μＭを加える
。

振とうを２時間続けたのち、管内容物をＢＢＳにて透析
して遊離の放射能を除去する。得られる生成物は［エス
タボール」１ｍ９当り放射能２．２×１０６ｃｐｍを示
す。

抗体の固定は実施例２７と同様に行う。

得られる生成物は、炭水化物部分のラテツクスへの固定
以外にどんな化学的処理も受けず、高い放射性を示す抗
体に相当する。生成物は、直接法または間接法にて実施
して、放射免疫学的定量の全ゆる適用の可能なものであ
る。反応は、膠着した抗原一抗体複合体あるいは未反応
の球の放射能を決定することにより同定され、分離は遠
心分離または淵過によつて行われる。これらの（放射性
）試剤によりスライド上に固定した放射能を算定して、
細胞表面の抗原を定量的に測定できる。

また予めこれらの球について走査型電子顕微鏡による観
察で得られるデータを量化することができる。実施例２
７および２８において非制限的に記載された、炭水化物
残基を介して少くとも活性−ＮＨ２基を有する支持体と
糖蛋白質、とくに抗体とのカツプリング生成物に関して
、医学病理学に関係する相異る抗原に対して特異な抗体
を含む球は、各種病気について迅速かつ容易な血清診断
を可能にする。

抗ガンマ−グロブリン抗体を含む球は、間接法を導入し
て使用可能性をさらに拡大する。定量は直接希釈法又は
競争法のいずれにおいても容易であり且つ正確である。
この方法は免疫反応に基づく全ゆる配量（ホルモン、薬
物等）に適用できる。

放射性球の利用は、ヨウ素化の過程で抗体または抗原を
変化させる危険を減少させ、他の全ての放射免疫法と同
様に本方法を鋭敏とさせる。上述した方法は、現在使用
されている方法（放射免疫配量、蛍光、遊離ラジカルの
研究、免疫酵素配量等）に比較して、下記の利点を示す
。

即ち特別の設備を必要とせずその使用が簡便である。使
用法が簡単であるため見習が早い。良好な感度、数ケ月
間保存できる安定性及び非常に低い原価を有する。実施
例 ３１ 抗体をアイソトープ標識したカツプリング生成物の調製
（１） トリチリウムによる標識 ＰＦｌ６の０．１４ＭＮａＣ１０．０２Ｍリン酸塩緩衡
液２ｍ１に、混合した抗ポリアミン山羊のガンマ−グロ
ブリン１．５Ｔｆ９を溶かしこれに、ＰＦｌ６のリン酸
塩緩衡液に溶かした０．０６ＭＮａ１０４の０．６５ｍ
１を加える（ＮａＩＯ４の最終濃度は０．０１５Ｍであ
る）。

混合物を遮光下４℃にて３時間放置したのち、３度交換
を行いながらＰＨ６の０．１４ＭＮａＣ１及び０．０２
Ｍリン酸塩緩衡液により透析して過剰のＮａＩＯ４を除
去する（澱粉一ヨウ素紙によつて同定）。

この聞にて、かくして生成した反応性−ＣＨＯ基と、リ
ジンまたは蛋白質の末端−ＮＨ２基との間で起るシツフ
架橋形成反応は減小する。透析のう内容物を次いで管に
移す。過剰量の結晶性ＮａＢ３Ｈ４（１００ｍＣｉ／Ｍ
Ｍ）（ニユーイングランドニユクレア社製）を加えたの
ち、Ｐｌｌ８．８の０．１Ｍホウ酸塩−ＨＣＩ緩衡液１
ｍ１（この…の変化は−ＣＨＯ基から−ＣＨ２ＯＨ基へ
の還元を意味する）を加える。

換気をよくした炉蓋の下で４℃にて１６時間接触したの
ち、管内容物を透析のうに移し、かつ透析液が完全に放
射性を失うまで透析する。かくして蛋白質１μｇ当り６
７０ｃｐｍのポリアミン抗体標識体を得る。下記の手順
で抗体の特異性を増加することも可能である。

即ち酸化したガンマ−グロブリン１．５ｍｇにＰＦＩ８
．８の３Ｈエタノールアミン２０μＣｉ（３．８Ｃｉ／
ＭＡ）を加え、生成するシツフ架橋を４゜Ｃ１８時間Ｎ
ａＢ３Ｈ４にて還元して安定化させる。過剰量のＮａＢ
３Ｈ４を透析により除去する。これにより１８０７ｃｐ
ｍＶμ９の特異性を有する抗ポリアミンガンマ−グロブ
リンを得る。１４Ｃエタノールアミンを使用し、かつＮ
ａＢ３Ｈ４による還元を行う以外は同様にして１４Ｃを
標識した抗体を得る。

（）酸化したガンマ−グロブリンの−ＣＨＯ基への少く
とも１つの反応性−ＮＨ２基を有する側鎖を含む不溶性
支持体のカツプリングおよび生成するシツフ塩基のＮａ
Ｂ３Ｈ４による還元による安定化実施例２７及び２９記
載の方法に従う。

得られた試薬は、長期に亘つて極めて安定であり、（放
射性ヨウ素を用いて蛋白質鎖中のチロシン基のヨウ素化
により標識（ラベル）するという信頼できる公知の方法
によつても）ガンマ線を発することなく、またその生物
学的活性は変化しない。

Ｖ免疫薬の例 実施例 ３２ 置換支持体と酸化された風疹ビールスとの反応により得
られる生成物から構成される風疹用診断薬の製造（１）
置換着色支持体の製造 ａ）実施例１と同様にしてジアミンで構成される末端→
晶基を有する側鎖を結合させる。

ｂ）実施例１６に記載の方法を採用して前工程で得られ
る「エスタポール→２」上に−ＳＨ基を有するアミノ酸
を固定する。

（）酸化された風疹ビールスの製造 実施例２０と同様にして風疹ビールスを酸化する。

（自） 「エスタポール一ＳＨ」への風疹ピールスのカ
ツプリングＰＨ６．Ｏの０．１Ｍリン酸塩緩衡液に上記
で得られた「エスタポール一ＳＨ」２０Ｗ９を懸濁させ
た液に上記で得られた酸化された風疹ビールス１０ｍｇ
を加える。

該混合物を４゜Ｃで１８時間攪拌する。

次いで６０００Ｇで６０分間遠心分離を行う。上澄液を
回収し、残渣を２度ＰＨ６．Ｏのリン酸塩緩衡液を用い
て洗浄する。上澄液中に残存する蛋白質の量から「エス
タポール一ＳＨ］１ηにつきビールスの蛋白質１３０μ
９が固着していることが測定される。

実施例 ３３置換支持体と酸化された犬のジステッパー
ビールスとの反応生成物から構成される犬のジステッパ
ービールス病用診断薬の製造実施例３２の（），（）及
び１（］１１）と同様にして犬のジステッパービールス
病用診断薬を製造する。

「エスタポール」一風疹についての上述の実施例で記載
された条件下で該診断薬につき試験を行なつたが、抗犬
のジステッパービールス性のウサギの血清の存在下では
膠着物は得られなかつた。実施例 ３４球状ラテツクス
ーインフルエンザビールスの診断薬の製造風疹ビールス
をインフルエンザビールスに代える以外は実施例３２と
同様にして球状ラテツクスインフルエンザビールスの診
断薬を製造する。

実施例 ３５球状ラテツクスードイツ風疹ビールスの診
断薬の製造風疹ビールスをドイツ風疹ビールスに代える
以外は風疹用診断薬の製造について記載した実施例３２
と同様にして球状ラテツクスードイツ風疹ビールスの診
断薬を製造する。

実施例 ３６ 球状ラテツクス矩大細胞ビーノベＣｙｔＯｍｅｇａｌｉ
ｃｖｉｒｕｓ）の診断薬の製造風疹ビールスを巨大細胞
．ビールスに代える以外は実施例３２と同様にして球状
ラテツクス一巨大細胞ビールスの診断薬を製造する。

実施例 ３７ 「エスタポール」一抗体診断薬の製造 （１）置換支持体の製造 末端−ＮＨ２基を有する側鎖のラテツクス球への固定及
び−ＳＨ基を有するアミノ酸の該側鎖への固定を実施例
３２と同様にして行う。

（）酸化されたγ−グロブリンの製造 実施例２１と同様にしてγ−グロブリンを化学的に酸化
する。

（１１）（１）で得られる「エスタポール」−ＳＨへの
酸化されたγ−グロブリンのカツプリング実施例２９と
同様にしてカツプリングを行う。

この操作により抗ポリアミン抗体を含有するγ−グロブ
リン類、γ−グロブリン類（抗ヒトフイプリン低下物質
（ＦＰＤ））、γ−グロブリン類（抗ヒト９Ｇ）、γ−
グロブリン類（抗ヒト９Ｍ）、γ−グロブリン類（抗ウ
サギＩ９Ｇ）及びγ−グロブリン類（抗モルモツトＩ９
Ｇ）のカツプリングが達成される。実施例 ３８ 「エスタポール」−ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ
）の製造（１）置換「エスタポール」の製造 末端−ＮＨ２基を有する側鎖のラテツクス球への固定及
び−ＳＨ基を有するアミノ酸の該側鎖への固定実施例１
６と同様にして行う。

（）酸化されたヒト絨毛性ゴナドトロピンの製造実施例
２６に於てγ−グロブリンについて記載されている方法
と同様にして酸化を行う。

申 「エスタポール」−ＳＨとヒト絨毛性ゴナドトロピ
ンのカツプリング実施例２９と同様にしてカツプリング
を行う。

斯くして得られる診断薬の効果を次のに記す。本発明免
疫薬の効力抗原抗体反応は各ケース毎に最も適当な条件
例えば温度、接触時間等を選択して行なわれる。

上記反応は球の凝集により明らかとなる。その結果は歯
槽板（ＡｌｖｅＯｌａｒｐｌａｔｅｓ）での巨大凝集（
ＭａｃｒＯａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉＯｎ）によるかある
いは微細凝集（ＭｉｃｒＯａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉＯｎ
）によるかいずれかの凝集反応を評価することにより測
定される。

比ロウ測定により、又は遠心法及び残存するラテツクス
球の光学密度を調べることにより、あるいはフイルタ一
もしくは残渣のいずれかに存在するラベルされたラテツ
クスの放射能を測定することにより該反応を定量化し得
る。（４）ガラス板上での巨大凝集テスト 実施例 ３９ 「エスタポール一ＳＨ」一酸化された風疹ビールスの凝
集活性テスト抗血清剤は１（Ｆｆ）の牛の血清アルブミ
ン、０．１４ＭＮａＣ１及び０．０１Ｍ少量の塩酸（Ｔ
ｒｉｓ州Ｃ′）とのＰＨ８，２の混合物により稀釈され
た。

本発明法に従つて製造されたラテツクス一風疹ビニルス
試薬は６７５μｇ／ｍｌでこのテストに使用さねた。ガ
ラス板上での巨大凝集テストの結果は第４図に示す通り
である。但し該第４図に於いてその左側は兎の抗ＶＳＶ
血清を用いた比較の場合の結果を、またその右側は兎の
抗風疹血清を用いた場合の結果を示す。実施例 ４０ ［エスタポール一ＳＨ］一酸化された犬のジステッパー
ビールスの凝集活性テスト実施例３９と同じ条件で実施
した。

比較として兎の抗ＶＳＶ血清を用いた場合及び本発明の
サンプルとして兎の抗ジステッパー血清を用いる場合の
いずれの場合も実施例３９と同じ結果を得た。実施例
４１プレート上の巨大凝集による「エスタポールＨＣＧ
」の凝集活性テスト結果：１／１６０に希釈された兎の
抗ＨＣＧ血清は陽性であつた。

尚この場合、妊娠した女性（人間）の尿は陽性を抑制す
る作用があつた。実施例 ４２［ダウーラテツクス一抗
フイブリノーゲン」反応性球のプレート上での巨大凝集
による反応活性テスト「タウ抗ＦＤＰ］の球状体を下記
組成の緩衡剤に懸濁した。

〈緩衡剤の組成〉 １０１）牛の血清アルブミン、 ０．１４ＭＮａＣ１１ ０．１Ｍ０Ｔｒｉｓ−ＨＣ′、 から成るＰＨ８．２のものに更に濃度８ｍｑ／ＭｌＯＯ
．ＯＯｌ５Ｍのソジウムアジドを加えたものこの場合４
μ９／ｍｌの人のフイブリノーゲンでは第５図に示す通
り陽性であり、また１／１０に希釈されたヒトの血清で
も陽性であつた。

実施例 ４３ ガラスプレート上での巨大凝集による尿中のポりアミン
含量の測定前記実施例２で製造された「エスタポール」
−ポリアミンの球状体を次の組成の緩衡剤に懸濁したＯ
く緩衡剤の組成〉 １％の牛の血清アルブミン、 ０．１４Ｍ（７）ＮａＣｌｌ Ｏ．ｌＭＯ）Ｔｒｉｓｌ から成るＰＨ８．３のものに０．００１５Ｍのソジウム
アジドを濃度４７１１ｇラテツクス／１１１で加えたも
の。

同じ緩衡剤を使用し且つ１／３０ｒｄに希釈された抗ポ
リアミン山羊血清では凝集性は陽性であり、また免疫前
では同じ山羊血清は陰性であつた。

上記いずれの場合に於いても妊娠した女性（人間）の尿
は抑制作用があつた。（Ｂ）歯槽板上での巨大凝集テス
ト 実施例 ４４ 「エスタポール一ＳＨ］一風疹ビールス酸化体の巨大凝
集活性テスト実施例４で得られた着色「エスタポール」
を用いた結果を第３図に示す〇抗血清希釈剤を０．１４
ＭＮａＣ１及び０．０１Ｍホウ酸塩−ＨＣＩ（ＰＨ８．
ｌ）の緩衡剤を用いて作製した。

Ａ：細胞（ＥｒＯｃｅｌｌ）上で作られた兎Ｊの抗風疹
血清Ｂ：細胞（ＶｅｒＯｃｅｌｌ）上で作られた兎Ｍの
抗風疹血清Ｃ：比較例としての兎Ｂの抗ＶＳＶ（小水庖
疹の口内炎ビールス）血清上記血清Ａ−Ｃの希釈は次の
様にして行なわれたＯサンプルには緩衡剤だけ 本発明のラテツクス一風疹ビールス試剤は６７５μ９／
ｍｌで使用した。

Ａ１〜Ａ６は陽性、Ａ７〜Ａｌ２（オ陰性であつた。

またＢ１〜Ｂ５は陽性、Ｂ６〜Ｂｌ２は陰性であつた。
Ｃ１〜Ｃｌ２は陰性であつた。第３図からも明らかな通
り、三つの比較例Ａ，２，Ｂｌ２及びＣｌ２は陰性であ
り、また血清Ｃについては反応は認められなかつた。

反応の感度は１％トリチユウムＸ−１００による予備処
理に本発明のラテツクス一風疹ビールスを適用すること
により増加した。

ラテツクス一風疹ビールスで処理されたトリトンの場合
は血清ＪはＡｌＯまでは反応せずまた血清ＭではＢ６ま
で反応しなかつた。血清Ｃはすべて陰性であつた。この
反応の感度をラテツクス一ＶｅｒＯ〔風疹ビールスの製
造に使用した細胞（ＶｅｒＯｃｅｌｌ）からの抽出物を
本発明の実施例３２の（［１１）でのべた条件でラテツ
クスに結合させたもの〕によるテストにより比較した。
反応性ラテツクス一ＶｅｒＯと血清Ｊ，Ｍ及びＣとの間
では何等の反応も生じなかつたがこの反応性ラテツクス
一ＶｅｒＯは本発明により製造されたラテツクス風疹剤
とは顕著に高感度で反応した。（０直接比ロウ測定法に
よる診断薬の定量実施例 ４５ 本発明支持体上に酸化されたγ−グロブリンを結合させ
たものの比ロウ測定法による直接計測抗ポリアミン支持
体と抗原との直接凝集反応を行うために、実施例３７の
［エスタポール」一抗ポリアミン薬剤の２μ９／７Ｔ１
１を公知の使用量（抗原の１５〜５００ｎｇ／７７ＺＯ
のＰＨ８．ｌのトリトンＸｌＯＯ−ＢＢＳ緩衡剤の０．
１％液に添加混合し、４５時間放置する。

該混合物による９００での分散が測定される。この結果
を第１図に示す。第１図中カーブＩは抗原としての正常
な兎のγ−グロブリンをまたカーブはポリ−Ｌ−グルタ
ミン酸スペルミンを示す。また横軸は使用された抗原の
量を、縦軸は９０。での分散を示す。測定の感度及び精
度をＮ９の単位で示す。実施例 ４６ 診断薬［エスタポール」一抗体の比ロウ計測法による活
性試験抗原及びラテツクス一抗ポリアミン抗体を「ミリ
ボア」フイルタ一（０．２２μ）で淵過した。

ホウ酸塩−ＢＢＳ緩衡液で希釈する（ホウ酸塩緩衡液は
０．０１Ｍ０）Ｎａ２Ｂ４Ｏ７、０．１５Ｍ０ＮａＣ１
及びＨＣ′でＰＨ８．ｌに調整したもの）。試薬を混合
した後、テストサンプル及び対照を３７℃で１時間次い
で室温で培養する。ラテツクス一抗ポリアミン（ポリア
ミンに対し免疫性の山羊からの抗体とカツプリングされ
たラテツクス）の２μ９の存在下、ポリ−Ｌ−グルタミ
ン酸とカツプリングされたスペルミン（Ｐ．Ｌ．Ｇ．Ｓ
ｐｍ）の０．１ｎＭの場合、培養４５時間目に平衡に達
した。本反応の特異性はＰ．Ｌ．Ｇ．Ｓｐｍ抗原と、一
方ではラテツクス一抗ポリアミンとの共存下及び他方で
は対照としての兎のグロブリンとカツプリングしたラテ
ツクスとの共存下で、それぞれの凝集反応を比較するこ
とにより示される。抗原の測定に（才等量点の決定が必
要である。

この等量点は（ラテツクス一抗体）／抗原の比の関数と
しての拡散光輝度の増大の最大点である。等量点での上
記比はそれぞれのラテツクス一抗体について一定である
。従つて等量点でのラテツクス一抗体濃度が判れば、未
知の抗原の濃度が推定可能である。実際に濃度不明の抗
原の製造に直面した場合、ラテツクス一抗体の濃度の程
度を決めることが好ましい。

対照区及び一定量の抗原を与えられた区を以下の如く作
製する。

Ｉは対照区の拡散光輝度を示す。

１′は抗原を含むテストサンプルの拡散光輝度を示す。

１（寸テスト領域（６２。

５ｎ９〜８μ９／ｍｌ）におけるラテツクス一抗体濃度
の一次関数である。

該領域のそれぞれの点において、Ｖ／Ｉの比（（：Ｆｔ
）はそれぞれ相当する抗原の存在下でのラテツクス球の
凝集合を表わす。ヒトのフイブリノーゲンに免疫性を有
する山羊のグロブリンとカツプリングされ、０．３５ｎ
９のフイブリノーゲンに対するラテツクスを、ラテツク
ス一抗フイブリノーゲンの濃度を変化させて製造する場
合、ラテツクス一抗フイブリノーゲンについて等量点は
２００ｎ９に達する。

これは（ラテツクス一抗体）／抗原の比が５７０に相当
する。この製造はヒトのフイブリノーゲンを７０ｎ９と
いう最少量まで充分正確に測定可能とする。等量点での
比はラテツクス一抗体試薬を４℃で数ケ月間貯蔵してい
る間は、著しくは変化しない。これはおそらく抗体のラ
テツクスへの共有結合に起因し、結合後は結合された抗
体の溶出が起こるに過ぎないからと思われる。（自）光
学密度測定による診断反応の定量実施例 ４７ ［エスタポール」一抗ポリアミンとポリアミンとの直接
凝集反応を行なうために、実施例２７で作つた「エスタ
ポール」一抗ポリアミンの一定量（６μ９）に抗原（ス
ペルミン、スペルミジン、ポリ−Ｌ−グルタミン酸と連
結したプトレスシン及びリジン塩酸塩）の３１〜２００
０ｎＭの漸次増加量を添加する。

混合物を２５℃で３０分間放置後、次いで４℃で一晩放
置する。「エスタポール」球及び之に固定された抗原を
沈澱させるために、毎分３０００回転で１５分間遠心分
離を行つた後、上澄液の光学密度を２３０ｎｍで測定す
る。結果を第２図に示す。図において反応順に、力ーブ
Ｉはスペルミン、はスペルミジン、はリジン、はプトレ
スシン及びはブランクの場合を夫々示す。スペルミンの
検知限界は３２ｎＭである。縦軸に光学密度を、横軸に
添加した抗原の量（ＮＭ）を表わす。（Ｆ４）ラベルさ
わたラテツクスの放射能測定による診断反応の定量実施
例 ４８ 本発明により製造された試薬の優れた鋭敏性は、従来Ｒ
．Ｓ．ＭＯｌｄａｙ等により開示された（文献名は前記
で引用した）如きカツプリング生成物と前記実施例３０
で得られた放射性カツプリング生成物との、それぞれと
の凝集反応を比較研究することにより明らかとなる。

以下之について記す。一部はモルデイ（ＭＯｌｄａｙ）
に依り、他は本発明に依つて得られたカツプリング生成
物の凝集反応の比較試験（１）放射性１４Ｃで標識化し
たエタノールアミンを付与したカルボキシル化ポリスチ
レンの０．３０μ球状体（ローン・プロジル社製［ＰＳ
６８」）に実施例１に従いヘキサメチレンジアミンで置
換後、之を１．２５％グルタルアルデヒドと１時間室温
（２０℃）で反応させて活性化し次いで長時間透析に付
して過剰のグルタルアルデヒドを除去する。

斯くして得られた置換球状体は１ｍ１当り５６０μ９で
放射能は９５０００ｃｐｍ／ｍｌである。

兎の抗ガンマ−グロブリンに対する山羊抗体の５２０μ
９をこれに加え撹拌しつつ５時間室温（２０℃）で接触
させる。（）予めフイルタ一上で精製し、１４Ｃエタノ
ールアミンで標識付けした０．３０μの「ＰＳＩ６８」
球状体を、実施例１０に従いヘキサメチレンジアミンお
よびｐ−ヒドラジノ安息香酸で置換する。

斯くして１ｍ１当り５６０μ９の置換球状体が得られ、
その放馴目ま８７０００ｃｐｍ／ｍｌである。これら球
状体に、本発明に従つて過沃素酸ソーダで予め酸化した
兎の抗ガンマ−グロブリンに対する山羊抗体０．１５ｍ
１（即ち５２０μ９）を加える。

上記２つの場合に、１０％蔗糖相を通して遠心分離によ
り球状体一抗体複合物と遊離の抗体とを分離し、過剰の
蔗糖を透析によつて除去する。

蝿 比較試験 上記（１）および（…）で製造された試料１及びを普下
記の通り処理する。

Ａ）上記各試料０．１５ｍ１に下記物質を加える。

２％の補体を除去した子牛血清 ０．２５ｍ１下記希
釈度の兎の血清 ０．１１１１１／５００１
／１０００ １／５０００ １／１００００ Ｂ）対照の組成を下記の通りとする。

試料１および 各０．１５ｍ１２０！）
補体除去子牛血清 ０．２５ｍ１ＢＢＳ緩衡
液（ＰＨ８．８） ０．１ｍ１各試料１および
に対し、実１験区Ａの試５験管４本および対照区Ｂの試
験管を解卵器に入れ４℃で４８時間保ち、次いで各試験
管から０．４ｍ１をとり、２％補体除去子牛血清で予め
飽和した０．８０μのミリボアフイルタ一で済過する。

フイルタ一を２％子牛血清２ｍ１で４回、次いでＢＢＳ
緩衡液１０ｍ１１更にＢＢＳ緩衡液２ｍ１で４回洗浄す
る。フイルタ一はトリトン×１００／トルエン１：２（
容量／容量）１０ｍ１中で計数する。得られた結果を次
表に記載する。

上記の表に示される如く、本発明固定法では等量点１／
５０００が得られるのに比して、モルデイらの方法によ
るラテツクス粒子への抗体の固定では等量点は１／５０
０であり、後者の方法は感度の大きな損失をもたらすこ
とを示している。

上述した様に、゛いかなる方法を実施しようとも又適用
しようとも炭水化物の残基を含有する化合物を、その−
ＣＨＯ基を介して、該−ＣＨＯ基と反応する−ＮＨ２基
、−ＮＨ−ＮＨ２基及びＳＨ−ＣＨ２−ＣＨ−ＮＨ２基
の少くとも１つの反応性基を有する側鎖を持つ不溶性固
体支持体とカップリングせしめることによつて得られる
本発明の生物学的試薬は大きな安定性と非常に高い感度
を有することが判る。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のγ−グロブリン酸化体を担持させた試
薬を用いた際の比ロウ分析結果、第２図は実施例４７に
従い本発明試薬を用いて抗原を固定した時の上澄液の光
学密度測定結果、第３図は本発明の風疹ビールス酸化体
を担持させた試薬を用いた際の巨大凝集テスト結果、第
４図及び第５図は夫々上記第３図と同様に本発明試薬に
つき得られる巨大凝集テスト結果を示すものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 炭水化物残基を有し且つ−ＣＨ＿２ＯＨ基を予め酸
   化することにより変換された−ＣＨＯ基を有する抗原又
   は抗体と、−ＮＨ＿２基、−ＮＨ−ＮＨ＿２基及び▲数
   式、化学式、表等があります▼基の少くとも１つの反応
   性基を側鎖として有する不溶性固体支持体とをカップリ
   ングして得られるものであつて、上記抗原又は抗体は該
   −ＣＨＯ基を介して上記−ＮＨ＿２基、−ＮＨ−ＮＨ＿
   ２基及び▲数式、化学式、表等があります▼基の少くと
   も１つと結合していると共に上記不溶性固体支持体は最
   終的には酸官能基となり得るアミン、ポリアミン、アミ
   ノ酸、脂肪族又は芳香族ヒドラジンから選ばれた化合物
   であつて上記反応性基を有するものを球状ラテックス、
   アガロース又はデキストランビーズ、活性化ガラスビー
   ズのなかから選ばれたものと結合せしめたものであるも
   のを有効成分として成ることを特徴とする生物学的試薬
   。 ２ 不溶性固体支持体が少くとも１つの反応性−ＮＨ＿
   ２基又は−ＮＨ−ＮＨ＿２基を持つ脂肪族もしくは芳香
   族の側鎖を有するラテックス類から選ばれたポリマーで
   あり、且つビース及び（又は）微細ビーズの形態を有す
   るものである特許請求の範囲第１項記載の試薬。 ３ 支持体を構成するポリマーが、少なくとも１つの反
   応性−ＮＨ＿２基又は−ＮＨ−ＮＨ＿２基を持つ脂肪族
   もしくは芳香族の側鎖を有するカルボキシル化されたポ
   リスチレン及びカルボキシル化されたスチレン−ブタジ
   エン共重合体から選ばれたものである特許請求の範囲第
   １項又は第２項記載の試薬。 ４ −ＮＨ＿２基、−ＮＨ−ＮＨ＿２基及び▲数式、化
   学式、表等があります▼基の少くとも１つの反応性基を
   持つ不溶性固体支持体上に特異的病理状態に対応する抗
   原に対する特異的抗体をカップリングしたことによつて
   特徴付けられる抗原の検出のための特許請求の範囲第１
   項記載の試薬。 ５ ポリスチレン−ジアミン−抗ポリアミン抗体がその
   炭水化物残基によつて不溶性固体支持体の側鎖に結合し
   ている特許請求の範囲第４項記載の試薬。 ６ ポリスチレン−ヘキサメチレンジアミン−ｐ−ヒド
   ラジノベンゾエート−抗免疫性ガンマーグロブリン抗体
   がカップリングしている特許請求の範囲第４項記載の試
   薬。 ７ ポリスチレン−ジアミン−システイン−抗体がカッ
   プリングしている特許請求の範囲第４項記載の試薬。 ８ −ＮＨ＿２基、−ＮＨ−ＮＨ＿２基及び▲数式、化
   学式、表等があります▼基の少くとも１つの反応性基を
   側鎖に持ち、塩基性染料を含有するラテックスビーズに
   、酸化により少くとも１つの−ＣＨＯ基を有する精製さ
   れた風疹（ｍｅａｓｌｅｓ）ビールスを、上記反応性基
   を介して結合している特許請求の範囲第１項記載の試薬
   。 ９ −ＮＨ＿２基、−ＮＨ−ＮＨ＿２基及び▲数式、化
   学式、表等があります▼基の少くとも１つの反応性基を
   側鎖に持つラテックスビーズに、酸化により少くとも１
   つの−ＣＨＯ基を有する精製された犬のジステンパービ
   ールスを、上記反応性基を介して結合している特許請求
   の範囲第１項に記載の試薬。 １０ −ＮＨ＿２基、−ＮＨ−ＮＨ＿２基及び▲数式、
   化学式、表等があります▼基の少くとも１つの反応性基
   を側鎖に持つラテックスビーズに、酸化により少くとも
   １つの−ＣＨＯ基を有する精製されたインフルエンザビ
   ールスを、上記反応性基を介して結合している特許請求
   の範囲第１項に記載の試薬。 １１ −ＮＨ＿２基、−ＮＨ−ＮＨ＿２基及び▲数式、
   化学式、表等があります▼基の少くとも１つの反応性基
   を側鎖に持つラテックスビーズに、酸化により少くとも
   １つの−ＣＨＯ基を有する精製されたドイツ風疹ビール
   スを、上記反応性基を介して結合している特許請求の範
   囲第１項記載の試薬。 １２ −ＮＨ＿２基、−ＮＨ−ＮＨ＿２基及び▲数式、
   化学式、表等があります▼基の少くとも１つの反応性基
   を側鎖に持つラテックスビーズに、酸化により少くとも
   １つの−ＣＨＯ基を有する精製された巨大細胞ビールス
   を、上記反応性基を介して結合している特許請求の範囲
   第１項記載の試薬。 １３ −ＮＨ＿２基、−ＮＨ＿−ＮＨ＿２基及び▲数式
   、化学式、表等があります▼基の少くとも１つの反応性
   基を側鎖に持つラテックスビーズに、酸化により少くと
   も１つの−ＣＨＯ基を有するヒト絨毛性ゴナドトロピン
   を、上記反応性基を介して結合している特許請求の範囲
   第１項記載の試薬。 １４ −ＮＨ＿２基、−ＮＨ−ＮＨ＿２基及び▲数式、
   化学式、表等があります▼基の少くとも１つの反応性基
   を側鎖に持つラテックスビーズに、酸化により少くとも
   １つの−ＣＨＯ基を有する抗フィブリノーゲン分解物ガ
   ンマーグロブリンを、上記反応性基を介して結合してい
   る特許請求の範囲第１項記載の試薬。 １５ （ｉ）酸官能基となるアミン、ポリアミン、アミ
   ノ酸、脂肪族又は芳香族ヒドラジンから選ばれた化合物
   であつて、−ＮＨ＿２基、−ＮＨ−ＮＨ＿２基及び▲数
   式、化学式、表等があります▼基の少くとも１つの反応
   性基を側鎖として有するものを、球状ラテックス、アガ
   ロース又はデキストランビーズ、活性化ガラスビーズの
   なかから選ばれた不溶性固体支持体と適当な縮合剤の存
   在下に結合する第１工程、（ｉｉ）炭水化物残基を有す
   る抗原又は抗体の少くとも１つの−ＣＨ＿２ＯＨ基を酸
   化によつて−ＣＨＯ基に変換する第２工程、並びに（ｉ
   ｉｉ）かくして得られた抗原又は抗体の−ＣＨＯ基と上
   記不溶性固体支持体の−ＮＨ＿２基、−ＮＨ−ＮＨ＿２
   基及び▲数式、化学式、表等があります▼基の少くとも
   １つとを反応させて結合せしめる ことを特徴とする生物学的試薬の製造方法。 １６ 不溶性固体支持体に結合されるアミン類がジアミ
   ン類である特許請求の範囲第１５項記載の方法。 １７ ジアミン類がヘキサメチレンジアミン及びジアミ
   ノプロパンから選ばれたものである特許請求の範囲第１
   ６項記載の方法。 １８ ヒドラジン類がｐ−ヒドラジノ安息香酸又はアジ
   ピン酸ジヒドラジドである特許請求の範囲第１５項記載
   の方法。 １９ ポリアミン類がスペルミジン、ジアミノプロピル
   アミン及びスペルミンから選ばれたものである特許請求
   の範囲第１５項記載の方法。 ２０ アミノ酸がβ−アラニン、ε−アミノカプロン酸
   、カルボキシル基をＮ−ヒドロキシルサクシンイミドに
   よつてエステル化されたアミノ酸類及び支持体に結合さ
   れるべき抗原又は抗体の−ＣＨＯ基の存在下にヘテロ環
   を形成し得る−ＳＨ基及び−ＮＨ＿２基を有するアミノ
   酸から選ばれたものである特許請求の範囲第１５項記載
   の方法。 ２１ 不溶性固体支持体に共有結合によつて結合された
   アミノ化合物が塩基性染料から選ばれたものである特許
   請求の範囲第１５項乃至第２０項のいずれかに記載の方
   法。 ２２ 縮合剤および（または）カップリング剤としてグ
   ルタールアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシルサクシンイミド
   又は一般式Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ〔式中二つのＲは同一又
   は相異つて、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ
   −ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブ
   チル、アミル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル
   、デシル、ウンデシル、ドデシル等の炭素数２〜１２の
   アルキル基；炭素数５〜６のシクロアルキル基；ベンジ
   ル又はα−もしくはβ−フェニル−エチル等のモノアリ
   ル置換低級アルキル基；フェニル、モルホリノ又はピペ
   リジル等のモノアリール基；エチルモルホリニル等の低
   級アルキル置換モルホリニル基；エチルピペリジル等の
   低級アルキル置換ピペルジル基；低級ジアルキルアミノ
   基；α−、β−もしくはγ−メチル又はエチル−ピリジ
   ル等の低級アルキル置換ピリジル基；上記の酸付加塩又
   は上記の第４級アンモニウム塩を示す〕で表わされる水
   可溶性のもしくは部分的に水可溶性のカルボジイミドを
   用いる特許請求の範囲第１５項乃至第２１項のいずれか
   に記載の方法。 ２３ 支持体側鎖の共有結合反応が、遊離の−ＮＨ＿２
   基を含有せずｐＨが６．０〜８．８である非凝集性緩衝
   液中で行なわれる特許請求の範囲第１５項乃至第２２項
   のいずれかに記載の方法。 ２４ 共有結合反応に次いで残存する非共役試薬の脱離
   反応を行なう特許請求の範囲第１５項乃至第２３項のい
   ずれかに記載の方法。 ２５ カップリング剤及び（又は）縮合剤の添加を二段
   階操作で行なう特許請求の範囲第１５項乃至第２４項の
   いずれかに記載の方法。 ２６ 側鎖に結合される不溶性固体支持体が、カルボキ
   シル基を持ち、該基を介して側鎖に結合される特許請求
   の範囲第１５項乃至第２５項のいずれかに記載の方法。 ２７ −ＣＨ＿２ＯＨ基を過沃素酸ナトリウムを用いて
   −ＣＨＯ基に酸化して得られる炭水化物残基を含有する
   抗原又は抗体を、−ＮＨ＿２基、−ＮＨ−ＮＨ＿２基及
   び▲数式、化学式、表等があります▼基の少なくとも１
   つの反応性基を有する不溶性固体支持体に側鎖によつて
   担持させる特許請求の範囲第１５項記載の方法。 ２８ −ＣＨ＿２ＯＨ基を酵素の作用により−ＣＨＯ基
   に酸化する特許請求の範囲第１５項記載の方法。 ２９ −ＣＨ＿２ＯＨ基の−ＣＨＯ基への酸化を酵素的
   に行ない且つ酵素として炭水化物残基の末端から二番目
   の基がグルコース、フコース又はガラクトースであるに
   応じて夫々グルコースオキシダーゼ、フコースオキシダ
   ーゼ及びガラクトースオキシダーゼから選ばれたオキシ
   ダーゼを用いる特許請求の範囲第２８項記載の方法。 ３０ 支持体に結合されるべき抗原又は抗体の炭水化物
   残基の酸化反応を、ｐＨ約６で行なう特許請求の範囲第
   ２７項乃至第２９項のいずれかに記載の方法。 ３１ 過剰の酸化剤を、酸化反応の終りに透析、濾過、
   遠心分離又は該酸化剤を酸化し得る化学薬品の添加によ
   つて除去する特許請求の範囲第１５項及び第２７項乃至
   第３０項のいずれかに記載の方法。 ３２ 不溶性固体支持体に結合されるべき抗原又は抗体
   の−ＣＨＯ基と−ＮＨ＿２基との反応によつてシツフ塩
   基を形成させ、之をＮａＢＨ＿４等の還元剤により安定
   化させることを特徴とする末端に第１級アミンを持つ側
   鎖を有する不溶性固体支持体に炭水化物残基を含有する
   抗原又は抗体を固定する特許請求の範囲第１５項記載の
   方法。