FI106984B - Testimenetelmä ja siihen tarkoitettu reagenssipakkaus - Google Patents

Description

106984

Testimenetelmä ja siihen tarkoitettu reagenssipakkaus Tämä keksintö liittyy menetelmään analysoitavan aineen kvalitatiiviseksi tai kvantitatiiviseksi määrittä-5 miseksi vesipitoisesta mediumista.

Analysoitavien aineiden havaitseminen ja/tai määrittäminen immuunimääritysmenetelmiä käyttäen on hyvin tunnettua, mikä koskee erityisesti proteiineja, kuten antigeenejä tai vasta-aineita, sekä sokereita, lektiinejä 10 ja nukleiinihappoja. Monet nykyään käytettävät menetelmät ovat erinomaisesta herkkyydestään huolimatta kuitenkin usein työläitä, koska niissä vaaditaan useita vaiheita, joista jokainen voi olla pitkäkestoinen. Joitakin näistä määrityksistä on kuitenkin pystytty yksinkertaistamaan 15 immobilisoimalla yksi määrityssysteemin komponenteista kiinteään tukimateriaaliin, koska ylimääräisten reagens-sien poistaminen on näin helpompaa. Näissä määrityksissä käytetään tavallisesti leimalla varustettua makromolekyyliä, joka voi olla varsinainen analysoitava aine tai ana-20 lysoitavan aineen sitoutumisessa toimiva toinen osapuoli ja johon on liitetty sopiva merkkiaine, kuten radioaktiivinen isotooppi, fluorofori tai luonteenomaisen reaktion aikaansaava entsyymi.

; Yhdessä ehdotetussa yksinkertaistuksessa on käytet- * 25 ty näkyvänä merkkiaineena toimivaa värillistä yhdistettä, joka on kiinnitetty yhteen immuunimäärityksen reaktanteis- *·* * ta. Kuitenkin vain hyvin harvat värilliset yhdisteet pys- • · « *. ’· tyvät saamaan aikaan riittävän voimakkaan signaalin.

• ♦ · • V Akzona Inc. -yhtiön US-patenttijulkaisussa 4 313 734 on ♦ · · · 30 kuvattu muun muassa kolloidikullan käyttö tällaisena vä rillisenä materiaalina ja tässä mainitaan erityisesti, että kultahiukkasten hiukkaskoon on oltava ainakin 5 nano- • · · .*·*. metriä ja edullisesti 10 - 100 nm.

« | I

/ t Patenttijulkaisussa W089/06 801 on kuvattu paran- '· 35 nettu immuunimäärityssysteemi, jossa ainakin 75 % kulta- 106984 2 hiukkasista on keskiläpimitaltaan alle 5 nanometriä. Tämän oli mainittu nopeuttavan kultareagenssin reaktiota immobi-lisoidun reaktantin kanssa sekä lisäävän värin voimakkuutta. Olemme tässä keksinnössä tehneet sen löydön, että vä-5 rin voimakkuutta voidaan edelleen lisätä sitten kun patenttijulkaisun WO89/06 801 mukaiset erittäin pienet kul-tahiukkaset saatetaan uudella aggregointimenetelmällä muodostamaan suurempia hiukkasia (superaggregoituja kulta-proteiini-kolloideja). Superaggregoidut hiukkaset eroavat 10 huomattavasti immuunimäärityksissä tähän mennessä käytetyistä monoliittisista kultahiukkasista ja niillä on mahdollista analysoida yhdisteitä vieläkin pienemmissä pitoisuuksissa kuin ne huomattavan pienet pitoisuudet, jotka patenttijulkaisun WO89/06 801 mukaisilla järjestelmillä on 15 mahdollista saavuttaa.

Pieniä kultahiukkasia on myös käytetty merkkiaineina blottaussysteemissä Janssen Pharmaceutica N.V. -yhtiön US-patenttijulkaisussa 4 775 635 kuvatulla tavalla. Tässä ei ole viitattu mitenkään siihen, että hiukkaset olisivat 20 aggregoituja, vaan että ne ovat yksinkertaisesti sitoutuneet siihen komponenttiin, joka sillä halutaan visualisoida .

Tämän keksinnön mukaisesti tarjoamme käyttöön tut- ·, ; kattavassa näytteessä olevan analysoitavan aineen kvalita- ! 25 tiivisen tai kvantitatiivisen määritysmenetelmän, jossa ... leimalla varustettu reagenssi, joka käsittää kultasoolin, • · · l ' joka on sitoutuneena aineeseen, joka kykenee sitoutumaan • · · *· spesifisesti mainittuun analysoitavaan aineeseen tai tämän • » · • « < : .1 spesifisessä sitoutumisessa toimivaan toiseen osapuoleen, • · 2 ·.· · 30 saatetaan immobilisoitumaan sitoutuneessa muodossa kiin teän faasin pinnalle osoitukseksi analysoitavan aineen esiintymisestä tai sen määrästä näytteessä, ja jolle mene- « · · .***. telmälle on ominaista, että leimalla varustettu reagenssi • · · ,1 . käsittää mainitun aineen tai tämän spesifisessä sitoutumi- ’· j 35 sessa toimivan toisen osapuolen ja kultasoolin muodostaman • •et» • · » · · · 2 • 1 3 106984 superaggregoidun kompleksin, jossa ainakin 75 paino-% kultasoolin sisältämistä kultahiukkasista on keskiläpi-mitaltaan alle 20 nanometriä.

Monentyyppisissä kiinteään faasiin perustuvissa 5 määrityksissä on edullista kytkeä analysoitavan aineen analogi tai mainitun analysoitavan aineen spesifisessä sitoutumisessa toimiva toinen osapuoli kiinteään tukimateriaaliin sellaisen kiinteän faasin aikaansaamiseksi, johon leimalla varustettu reagenssi saadaan immobilisoi-10 tua. Edellä sanotun perusteella tarjoamme vielä toisena tämän keksinnön kohteena käyttöön sellaisen menetelmän nestemäisessä näytteessä olevan analysoitavan aineen kvalitatiiviseksi tai kvantitatiiviseksi määrittämiseksi, jossa mainittu näyte saatetaan kosketukseen vesipitoisessa 15 määritysmediumissa (i) kiinteän tukimateriaalin pinnalle immobilisoidun analysoitavan aineen analogin tai mainitun analysoitavan aineen spesifisesssä sitoutumisessa toimivan toisen osapuolen ja (ii) sellaisen leimalla varustetun reagenssin kanssa, joka käsittää kultasoolin, joka on 20 kiinnitetty molekyyliin, joka kykenee spesifisesti sitomaan mainitun analysoitavan aineen tai tämän spesifisesssä sitoutumisessa toimivan toisen osapuolen, ja vaihtoehtoisesti entsyymin, joka kykenee saamaan aikaan luonteenomai-•, : sen reaktion, minkä avulla tietty määrä mainittua leimalla ; 25 varustettua reagenssia saatetaan immobilisoitumaan maini- ... tulle tukimateriaalille, jonka väriä tai substraatilleen • · · • » # * . altistetun entsyymin muodostamaa väriä tarkastelemalla tai • · · *· ’· tästä tehtävällä määrityksellä osoitetaan mainitun analy- • · · I .* soitavan aineen esiintyminen tai sen määrä näytteessä, ja • « « ♦.· * 30 tässä menetelmässä leimalla varustettu reagenssi käsittää superaggregoidun kompleksin, joka muodostuu mainitusta : : aineesta tai tämän spesifisessä sitoutumisessa toimivasta • · · ·*'*: toisesta osapuolesta ja vaihtoehtoisesti mainitusta ent- .' . syymistä sekä kultasoolista, jossa vähintään 75 paino-% 106984 4 kultasoolin kultahiukkasista on keskiläpimitaltaan alle 20 nanometriä.

Kiinteä faasi, jolle leimalla varustettu reagenssi saatetaan immobilisoitumaan, voi vaihtoehtoisesti olla 5 inertti, ja se voi immobilisoida leimalla varustetun rea-genssin sitoutuneen muodon estämällä viimeksimainitun poispääsyn kiinteästä faasista fysikaalisesti esimerkiksi siten, ettei kiinteä faasi päästä leimalla varustetun rea-genssin sitoutunutta muotoa kulkeutumaan huokostensa läpi, 10 mutta päästää sitoutumattoman leimalla varustetun reagens-sin kulkeutumaan näiden huokosten läpi.

Termi "analysoitavan aineen analogi" tarkoittaa tässä keksinnössä mitä tahansa molekyylityyppiä, joka kykenee sitoutumaan spesifisesti määritettävänä olevan ana-15 lysoitavan aineen spesifisesssä sitoutumisessa toimivaan toiseen osapuoleen ja termi kattaa siten vielä uuden erän kyseistä analysoitavaa ainetta.

Hiukkasen, jonka ei välttämättä tarvitse olla täysin pyöreä, keskiläpimitta on hiukkasen suurimmasta ja 20 pienimmästä läpimitasta laskettu keskiarvo. Superaggregoi-dun kompleksin muodostavista kultahiukkasista on edullisesti vähintään 75 paino-% keskiläpimitaltaan alle 5 nm ja erityisen edullisesti tämän rajan alittaa vähintään 80 % , kultahiukkasista. Sopiva hiukkasten keskiläpimitan alaraja ; 25 on 1 nm. Käyttökelpoisiksi ovat osoittautuneet tietyt val- ... mistuserät Jansson Life Sciences Products -yhtiön histolo- * # gisessa värjäyksessä käytettäväksi myymästä Colloidal Gold • 1 · *· 1· Sol G5 -tuotteesta. Yhdessä tietyssä valmistuserässä 85 % t ♦ ·

• · C

l .1 hiukkasista oli läpimitaltaan alle 5 nm keskiläpimitan • · « ·.· · 30 ollessa 4,5 nm ja Gaussin jakauman asettuessa välille 1,1 - 7,6 nm. Tunnettuja menetelmiä hiukan muuttamalla : : voidaan myös kätevästi valmistaa keskiläpimitaltaan välil- • · · ·1’1: lä 2 - 4 nm olevia kultasooleja, esimerkiksi muuttamalla .1 . tanniinihapon konsentraatiota Slotin ja Geuzen menetelmäs- • | 35 sä (Eur. J. Cell. Biol. 38 (1985) 87 - 93). Olemme havain- · 1 · · 5 106984 neet, että keskiläpimitaltaan välillä 4 - 4,5 nm olevat hiukkaset ovat edullisia.

Superaggregoituja komplekseja voidaan muodostaa kultasoolista ja leimalla varustettavaksi tarkoitetusta 5 reagenssista (proteiinista) sekoittamalla liuokseen haluttu määrä kumpaakin, säätämällä pH arvoon 1-5, edullisesti arvoon 3 - 4 ja edullisemmin arvoon 3,5, lisäämällä siihen sellainen määrä happoa, esimerkiksi etikkahappoa, että lopulliseksi konsentraatioksi tulee noin 10 mmol/1, 10 ja keräämällä näin muodostuneet makroskooppiset aggregaatit talteen käyttämällä suodatusta ja sen yhteydessä pesua tai vaihtoehtoisesti sentrifugoimalla ja uudelleensuspen-doimalla useita kertoja peräkkäin. Makroskooppiset aggregaatit suspendoidaan uudelleen vaihtoehtoista ultraäänikä-15 sittelyä käyttäen neutraalissa pH:ssa olevaan liuokseen, joka sisältää esimerkiksi 2 paino-% naudan seerumin albumiinia (BSA) . Makroskooppisten aggregaattien yllättävän nopean häviämisen jälkeen syntyy stabiilien superaggregoi-tujen kulta-proteiini-kompleksien muodostama suspensio.

20 Superaggregoituja komplekseja voidaan myös muodos taa joidenkin proteiinien kanssa neutraalissa pH:ssa edellyttäen, että kolloideilla on proteiineihin nähden mooliylimäärä ja että käytetyssä proteiinissa on käytetys-\' sä todellisessa pH:ssa tietty määrä (>2) positiivisesti tt2 5 varautuneita ryhmiä. Parhaat tulokset saadaan kuitenkin ... tavallisesti happamassa pHrssa.

; . Tämän keksinnön mukaisissa menetelmissä käytettyjen • · · '· ” superaggregoitujen kompleksien tarkoituksenmukainen koko • « · : .1 on 50 - 5 000 nm, edullisesti 50 - 500 nm ja edullisimmin ·.· · 30 100 - 200 nm. Kultasoolihiukkasten määrä kompleksia kohti määräytyy luonnollisesti hiukkasten koon ja kompleksin koon mukaan, mutta tästä voidaan esittää esimerkki, jossa • « · ·1': 5 nm hiukkaset ovat 10 nm etäisyydellä toisistaan niiden . väliin jäävien proteiinien erottamina. Tällaisissa olosuh- • ; 35 teissä 50 nm kompleksi sisältää noin 15 hiukkasta ja · 6 106964 5 000 nm kompleksi noin 20 miljoonaa hiukkasta. 200 nm kompleksin havaittiin sisältävän noin 1 000 hiukkasta, mikä on yhdenmukainen sen tosiseikan suhteen, että hiukkaset ovat 10 nm päässä toisistaan.

5 Edellä kuvatuilla menetelmillä aikaansaatavissa olevat superaggregoidut kultakompleksit ja niiden valmistusmenetelmät ovat uusia ja ne muodostavat sellaisenaan vielä yhden tämän keksinnön kohteen.

Tavanomainen tapa, joka muodostaa jyrkän vastakoh-10 dan edellä kuvatuille menetelmille, proteiinin ja kullan konjugoimiseksi on siirtää proteiini pienen suolapitoisuuden sisältävään liuokseen, jonka pH on lähellä proteiinin pl-arvoa. Suositeltu pH-arvo on tavallisesti yhden yksikön pl-arvon yläpuolella. Tällaisessa tilanteessa proteiinissa 15 on pienin mahdollinen määrä positiivisesti varautuneita kemiallisia ryhmiä. Kun tämä liuos sekoitetaan yhteen kul-takolloidien kanssa, joiden pintaosiin arvellaan paikallistuvan runsaasti elektroneja, niin proteiinin ja kolloidin välille muodostuu vain muutama sidos. Tässä tilantees-20 sa monista proteiineista muodostuvien yksiköiden ja kolloidien väliset sillat jäävät muodostumatta ja kolloidit pysyvät liuoksessa yksittäisinä proteiinimolekyylien peit-täminä hiukkasina.

·, ; Proteiiniliuoksen pH:ta alennettaessa kunkin pro- j ! 25 teiinimolekyyIin sisältämien positiivisesti varautuneiden ... ryhmien määrä lisääntyy. Niinpä proteiinin ja kolloidin • · · • · · * . välisten mahdollisten ionisidosten määrä kasvaa, mikä joh- • · · *· 1· taa useiden siltojen muodostumiseen sekä makroskooppisten • · # : .* aggregaattien muodostumiseen. Tätä pidetään normaalisti • · · ·.· · 30 erittäin epäsuotuisana tilanteena, jota tulisi välttää.

Tässä keksinnössä tätä ilmiötä kuitenkin käytetään hyväk- :***: si. Proteiinia edelleen lisättäessä makroskooppiset aggre- • · · gaatit yllättäen liukenevat ja muodostavat liuoksen, joka . koostuu tasakokoisista, proteiinin ja kultakolloidien muo- • · » *· i 35 dostamista superaggregaateista. Koska kolloidien välissä » • · · 7 106984 on proteiinimolekyylejä, arvelemme pinta-alan kussakin superaggregaatissa kasvaneen huomattavasti. Koska metalli-kolloidien muodostaman värin arvellaan olevan kolloidien pinta-alaan liittyvä fysikaalinen ilmiö, aiheutuu signaa-5 Iin massiivinen lisääntyminen todennäköisesti kunkin su-peraggregaattikompleksin pinta-alan vastaavasta massiivisesta lisääntymisestä.

Tällä keksinnöllä aikaansaatavia parannuksia kuvaavaa on se, että se värinvoimakkuus, joka saadaan käyttäen 10 kiinteän tukimateriaalin pinnalle immobilisoituja ja analysoitavaa ainetta vastaavaa toista sitoutumisosapuolta sisältäviä superaggregoituja komplekseja, voi tietyn käytetyn järjestelmän mukaan olla 5-30 kertaa suurempi kuin väri, joka havaitaan käytettäessä patenttijulkaisun 15 W089/06 801 mukaista 4 nm kulta-vasta-aine-kompleksia.

On mahdollista muodostaa superaggregoituja kulta-komplekseja, jotka sisältävät kahden- tai useammantyyppi-siä proteiinimolekyylejä, mistä saadaan siten käyttöön useita vaihtoehtoja tämän keksinnön mukaisten määritysme-20 netelmien joustavuuden ja herkkyyden lisäämiseksi. Yksi mahdollisuus on aggregoida analysoitavaan aineeseen sitoutumaan kykenevä yhdiste (tai tätä vastaava spesifisessä sitoutumisessa toimiva toinen osapuoli) ja luonteenomaisen ·, ; reaktion aikaansaamiseen kykenevä entsyymi superaggregoi- 25 duksi kompleksiksi. Tämä antaa mahdollisuuden määrittää ... analysoitavan aineen esiintyminen tai sen määrä tarkaste- • · · « 8 106984 soolin väri on analysoitavan aineen määrittämiseksi havaittavan rajan alapuolella, niin kultasoolisuperaggre-gaatti toimii erityisen lievänä proteiinien välisen sil-loittumisen muotona, jolla on etuja tietyissä olosuhteissa 5 tavanomaiseen kovalenttiseen silloittumiseen verrattuna. Vaihtoehtoisesti voidaan muodostaa superaggregaatti, joka sisältää kaksi erilaisiin kohdemolekyyleihin sitoutumaan kykenevää yhdistettä, esimerkiksi toisaalta analysoitavaa ainetta vastaan suunnatun vasta-aineen (Abi) ja 10 toisaalta eri antigeeniä vastaan suunnatun vasta-aineen (Ab2). Sitten kun kompleksi on sitoutunut analysoitavaan aineeseen Abi:n välityksellä, joka puolestaan on sitoutunut suoraan tai epäsuorasti kiinteään tukimateriaaliin, niin tämän kokonaisuuden saattaminen sitten toisen super-15 aggregoidun kompleksin yhteyteen, joka sisältää vasta-ainetta Ab2 vastaavan antigeenin (Ag2), saa aikaan toisten kompleksien keräytymisen ryhmäksi ensimmäisen ympärille sekä kultasoolin värin kokonaismäärän lisääntymisen. Tapahtumasarjaa voitaisiin haluttaessa jatkaa vielä uusina 20 vaiheina, esimerkiksi toinen kompleksi voisi sisältää kaksi antigeeniä Ag2 ja Ag3, joista viimeksi mainittu toimisi kiinnittymiskohtana vielä yhdelle kompleksille, joka sisältää tätä vastaan suunnatun vasta-aineen (Ab3).

; Tällaisessa amplifikaatiosysteemissä voidaan luon- ! 25 nollisesti odottaa käytettävän muita reseptori-ligandi-pa- • · ... reja, kuten (strept)avidiini-biotiini, entsyymit ja ent- *·' | syymi-inhibiittorit, lektiinit ja glykoproteiinit, pro- • · · *· *! teiini Aja immunoglobuliinit ja niin edelleen.

• · · : V Tämä systeemi voidaan myös saattaa muodostamaan • · · V * 30 kasvavia aggregaattikomplekseja lisäämällä samanaikaisesti kahta hybridiaggregaattia, joista toinen voi sitoutua ana-lysoi tavan aineen immobilisoituun reseptoriin ja jotka • · · kumpikin erikseen sisältävät useita reagoivia ryhmiä, joi- .* . ta on ainakin kahta eri tyyppiä, joista toinen reagoi toi- ’· *· 35 sen aggregaatin kanssa. Lopputulokseksi muodostuu aggre- • · # j 1 J o • « 9 106984 gaattiverkosto, joka muodostuminen voi olla annoksesta riippuvainen, mikäli materiaali lisätään immobilisoidun analysoitavan aineen sisältävään läpivirtaussysteemiin.

Kultakolloidit, jotka on aggregoitu analysoitavan 5 aineen antigeenin kanssa reagoivalla vasta-aineella, voivat agglutinoitua analysoitavaa ainetta lisättäessä. Tämä reaktio saattaa olla hidas. Amplifioituminen voidaan saada aikaan muodostamalla ensimmäinen hybridiaggregaatti, joka perustuu kultakolloideihin ja analysoitavan aineen anti-10 geeniä Agl vastaan reagoivaan ensimmäiseen vasta-aineeseen Abi ja toiseen vasta-aineeseen Ab2. Tähän lisätään toista aggregaattia, joka sisältää useita Ab2:n kanssa reagoivia Ag2-antigeenejä, jolloin agglutinaatioreaktio nopeutuu.

Tämän keksinnön mukaisia menetelmiä voidaan sovel-15 taa mihin tahansa kiinteään faasiin perustuvaan järjestelmään analysoitavien aineiden havaitsemiseksi tai määrittämiseksi. Seuraavantyyppiset määritykset ovat tyypillisiä : 1. Sandwich-määritys, jossa komponentti A on kyt-20 ketty kiinteään tukimateriaaliin. Tähän lisätään analysoitavaa ainetta B sisältävää tutkittavaa liuosta, jolloin B sitoutuu A:hän. Lisätään kultaleimalla varustettua komponenttia C ja koska C sitoutuu B:hen, niin kolloidikulta : immobilisoituu ja värjää kiinteän tukimateriaalin.

<ιι<; 25 Kukin komponenteista A, B ja C on reseptori-ligan- « · ... di-tyyppejä, joissa sekä A että C kykenevät vuorovaikutuk- • · ·

I I I

• , seen B:n kanssa, kun taas A ja C eivät sitoudu suoraan • « · ’· *· toisiinsa.

• · · « · « : .* 2. Kohdan 1 mukainen sandwich-määritys, lukuunotta- * · « V · 30 matta sitä, että analysoitavaa ainetta B sisältävä tutkit tava liuos ja kultaleimalla varustettu komponentti C se-koitetaan keskenään ja seos lisätään kiinteälle tukimate- • · · riaalille, johon komponentti A on kytketty.

• · » , 3. Kompetetiivinen määritys, jossa komponentti A on 1 * · ” 35 kytketty kiinteään tukimateriaaliin. Analysoitavaa ainetta 10 106984 B sisältävään tutkittavaan liuokseen sekoitetaan tunnettu määrä kultaleimalla varustettua analysoitavaa ainetta B ja seos lisätään kiinteälle tukimateriaalille. B ja kultaleimalla varustettu B kilpailevat sitoutumisesta A:hän ja 5 kolloidikullan värin heikkeneminen kiinteän tukimateriaalin pinnalla osoittaa analysoitavan aineen B määrien suurenemista tutkittavassa liuoksessa.

4. Muutoin kohdan 3 mukainen kompetitiivinen määritys mutta tutkittava liuos ja kultaleimalla varustettu B

10 lisätään peräkkäin.

5. Ylimäärin komponenttia A on varustettu kolloidi-kultaleimalla ja sekoitettu tutkittavaan liuokseen, joka sisältää tuntemattoman määrän analysoitavaa ainetta B. Tämän jälkeen A ja B sitoutuvat toisiinsa. Liuos lisätään 15 huokoisen tukimateriaalin pinnalle, jolle komponentti B on immobilisoitu. Jäljelle jäävä sitoutumaton leimalla varustettu A kytkeytyy kiinteällä tukimateriaalilla olevaan immobilisoituun B:hen.

6. Analysoitava aine B saatetaan reagoimaan kulta- 20 leimalla varustetun komponentin C kanssa, vaihtoehtoisesti

yhdessä yhden tai useamman muun analysoitavan aineen B

sitoutumisessa toimivan sitoutumisosapuolen kanssa, yhdis- telmäaggregaatin muodostamiseksi. Reaktioseos diffundoi- . . daan sellaisen inertin suodatinväliaineen läpi, jonka huo- * « « ‘ 25 koset ovat liian pieniä päästääkseen yhteisaggregaatin kulkeutumaan lävitseen, mutta tarpeeksi suuria päästääk- • · ·

*·1 2 ’ seen ylimääräisen kultaleimalla varustetun komponentin C

• · *. 31 kulkeutumaan lävitseen.

• · · • 1.· Kiinteä faasi tai tukimateriaali, jonka pinnalle • 3 « : 30 leimalla varustettu reagenssi saatetaan immobilisoitumaan, voi olla useassa eri muodossa, joista kuvaavia esimerkkejä .***. ovat: 9 9 9 9 9 .3·, “ Muov.itikku, joka on vaihtoehtoisesti päällystetty M1 • mistä tahansa huokoisesta materiaalista valmistetuilla • ♦ « « « • 1 · * · r · · « 2 • · 3 11 106984 tyynyillä. Tikku voidaan kastaa reaktioliuoksiin määrityksen eri vaiheiden suorittamiseksi.

- Koeputken seinämä, mikrotiitterilevyn kuoppa tai minkä tahansa muun sopivan reaktiokammion seinämä.

5 - Huokoinen materiaali, jollaiseksi soveltuu memb- raani, jossa reaktioliuosten diffuusio voi tapahtua sen läpi poikittaissuunnassa tai diffuusio voi olla lateraalista. Mikäli kyseessä on suodatusperiaatteen käyttö, on edullista, että nämä materiaalit päästävät ylimääräiset 10 reagenssit lävitseen, ja niihin voidaan tarkoituksenmukaisella tavalla yhdistää tällaisia ylimääräisiä nesteitä absorboivaa materiaalia.

- Rakeet (mikropalloset mukaan lukien), jotka voidaan eristää sentrifugoimalla, suodattamalla tai, mikäli 15 rakeet sisältävät ferromagneettisia yhdisteitä, magneetin avulla.

Määritettävän analysoitavan aineen analogi tai analysoitavan aineen spesifisessä sitoutumisessa toimiva toinen osapuoli voidaan kytkeä tukimateriaaliin kovalentti-20 sesti, sähköstaattisesti tai hydrofobisesti tai näiden muotojen yhdistelmällä. Nämä menetelmät ovat tällä alalla vakiintuneita menetelmiä.

Tämän keksinnön mukaista menetelmää voidaan käyttää monien erilaisten analysoitavien aineiden havaitsemiseen 25 tai määrittämiseen, joita aineita ovat esimerkiksi seuraa- ... vat ligandi-reseptori-parit: antigeeni/vasta-aine, » · · '·’ [ hapteeni/vasta-aine, hormoni/hormonin reseptori, soke- • · « *'1 ri/lektiini, biotiini/avidiini- (streptavidiini), pro- M · * 1 1 : .· teiini A/immuoglobuliini, entsyymi/entsyymin kofaktori, • · · V · 30 entsyymi/entsyymin inhibiittori ja nukleiinihappoparit (DNA-DNA, DNA-RNA tai RNA-DNA). Ainakin toinen tällaisista reaktion osapuolista voidaan kytkeä tai kompleksoida toi- • · · siin molekyyleihin. Niinpä biotiini tai avidiini tai monet « · · .1 . erilaiset vasta-aineet voidaan kytkeä toisiin molekyylei- • ♦ · *· 1j 35 hin viimeksi mainittujen määrittämiseksi. Spesifinen * r 1 « « • · « Φ • eri® 12 106984 nukleiinihappokoetin voidaan esimerkiksi varustaa leimalla liittämällä siihen biotinyloituja nukleosiditrifosfaatte-ja. Analysoitavaan DNA:hän tai RNA:han sitouduttuaan tällainen koetin voidaan havaita tai määrittää käyttämällä 5 kultasoolileimalla varustettua avidiinia tai streptavidii-nia.

Yleensä silloin, kun analysoitava aine kuuluu yllä lueteltujen joukkoon, niin tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettävä sitoutuva osapuoli on parin toinen 10 komponentti. Sandwich-systeemeissa, joissa analysoitava aine sitoutuu sekä immobilisoituun sitoutumisosapuoleen että kultasoolileimalla varustettuun sitoutumisosapuoleen, voivat sitoutumisosapuolet olla joko samanlaisia tai erilaisia. Kukin sitoutumisosapuoli on edullisesti analysoi-15 tavan aineen erilaisia, toisistaan selvästi erillään sijaitsevia determinantteja vastaan suunnattu vasta-ainerea-genssi.

On selvää, että termiin "vasta-aine" kuuluu tässä keksinnössä 20 (a) mikä tahansa immunoglobuliinien useista eri luokista tai alaluokista, esimerkiksi IgG ja IgM, jotka ovat peräisin mistä tahansa tavanomaisesti käytetystä eläimestä; (b) monoklonaaliset vasta-aineet; ja 25 (c) sellaiset monoklonaalisten tai polyklonaalisten vasta-aineiden fragmentit, joissa vasta-aineeseen sitoutu- »Il 1' . va kohta on säilynyt, toisin sanottuna fragmentit, joista • · · .1 ,1 puuttuu Fc-osa (eli Fab, Fab' , F(ab'))2) tai niin sanotut * 1 e "puolimolekyyli "-fragmentit, jotka on saatu aikaan pilkko- • · · *·1 ' 30 maila pelkistävissä olosuhteissa ehjän vasta-aineen ras kaan ketjun komponentteja toisiinsa kiinnittävät disulfi-

• M

disidokset.

* .1 Seuraavaksi on esitetty epätäydellinen luettelo : niistä immunogeenityypeistä, joita voidaan havaita tai • · ♦ 35 kvantitoida tämän keksinnön mukaisen menetelmän avulla.

« t « « « » « · · 13 106984 proteiinit glykoproteiinit nukleoproteiinit peptidihormonit seerumin proteiinit komplementin proteiinit hyytymistekijät mikrobisidiset tuotteet 5 virustuotteet bakteerituotteet sienten tuotteet spesifiset immunogeenit albumiini angiotensiini bradykiniini kalsitoniini karsinoembryonaa- kreatiniinikinaasin 10 linen antigeeni isoentsyymit korionmammotropiini koriongonadotropiini kortiokotropiini erytropoietiini hyytymistekijä VIII fibrinogeeni alfa-2-H-globuliini fibriinin hajoamis- 15 follitropiini tuotteet gastriini gastriinisulfaatti glukagoni gonadotropiini haptoglobiini hepatiitti-B:n pinta- immunoglobuliinit antigeeni 20 (A,D,E,G,M) ihmisen C-reaktiivinen insuliini proteiini kallidiini lipotropiini melanotropiini myoglobiini oksitosiini pankreotsymiini « 4 25 istukan somato- paratryiini mammotropiini prolaktiini • · · .·. ; proangiotensiini relaksiini • · · .1 .* somatotropiini somatomediini • t *..* sekretiini tyrotropiini • · · *·" * 30 somatostatiini vasotosiini tymopoietiini ·...· vasopressiini -ij#: alfa-l-fetoproteiini alfa-2-H-globuliini .·. ; Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä suoritetta- 35 vaa määritystä varten erityisen mielenkiintoisia analysoi- 1« 106984 tavia aineita ovat veren proteiinit:;, kuten fibriinin hajoamistuotteet, esimerkiksi D2, jotka sitoutuvat immunoglo-buliineihin, kuten IgG:hen; ihmisen C-reaktiivinen proteiini; kreatiniinikinaasin isoentsyymit; ja myoglobiini. 5 Analysoitava aineen liuosta voidaan käyttää suoraan tai se voidaan laimentaa esimerkiksi sopivalla puskuri-liuoksella. Kultasoolivalmiste voidaan myös valmistaa vaihtelevansuuruisina laimennoksina tarkoituksenmukaista puskuriliuosta käyttäen, jolloin laimennokset valitaan 10 siten, että määrityksen kaikkien vaiheiden jälkeen saadaan haluttu värinvoimakkuus {toisin sanottuna absorbanssi tai heijastus), Taustan värin vähentämiseksi voi olla haluttua pestä tukimateriaali ennen määritystä esimerkiksi puskuri-liuoksella ylimääräisten reagenssien poistamiseksi.

15 Milloin määritys perustuu immobilisoidun tukimate riaalin pintaan jääneen kultasoolin kokonaismäärään, voidaan väri arvioida reflektometriä, densitometriä tai muuta tämän tyyppistä laitetta käyttäen.

Toisen määrityksessä olevan sitoutumisosapuolen tai 20 analysoitavan aineen analogin immobilisointiin käytetty tukimateriaali voi olla esimerkiksi nitroselluloosaa, paperia tai reagenssien, kuten syaanibromidin, avulla aktivoitua selluloosa-asetaattia tai nailonia, joka on modifi-. ·,: oitu tertiaarisia aminoryhmiä lisäämällä. Tällaisia tuki- 25 materiaaleja käytetään käyttötarkoituksiinsa huokoisten membraanien muodossa.

• · · .·. ; Tämän keksinnön mukaisessa erityisen edullisessa • · · .! menetelmässä inertti tukimateriaali on membraani, esimer- • · » kiksi nailonmembraani, kuten Hybond 1ST (tätä pitää kaupan « · « • ’ 30 yhtiö Amersham International), joka adsorboi helposti pro teiineja ja jonka huokoset kykenevä:; päästämän nestettä • · · *...· lävitseen. Membraanin toiselle puolelle asetetaan edulli- • · · sesti absorboiva tyyny, kuten selluloosasta valmistettu .·. : imupaperi, ja tyynyn päälle asetetaan nestettä läpäisemä- • « · [ 35 tön ja edullisesti valkoinen liuska. Membraanin toiselle 15 106984 puolelle asetetaan samanlainen nestettä läpäisemätön liuska ja tähän liuskaan on tehty esimerkiksi noin 3,5 mm suuruinen reikä, jonka kautta analysoitavaa ainetta sisältävä liuos ja määritysnesteet voidaan lisätä membraanille. En-5 sin membraani aktivoidaan lisäämällä pieni erä, esimerkiksi noin 2 μΐ, vesipitoista liuosta, joka sisältää tunnetun määrän analysoitavan aineen toista sitoutumisosapuolta, jonka jälkeen se kuivataan esimerkiksi jättämällä se kuivumaan huoneenlämpöön. Tämän jälkeen membraanille lisätään 10 tunnetun suuruinen määrä, esimerkiksi noin 25 μΐ, analysoitavaa ainetta sisältävää vesipitoista liuosta ja sen annetaan kulkeutua tämän läpi alla olevaan absorboivaan tyynyyn. Tämän jälkeen membraanille lisätään esimerkiksi 25 μΐ vesipitoista liuosta, joka sisältää tunnetun määrän 15 kolloidikultasoolihiukkasia, jotka on varustettu analysoi tavan aineen sitoutumisessa toimivasta toisesta osapuolesta, joka voi olla sama tai eri aine kuin membraanille ensin lisätty aine, muodostuvalla leimalla, ja tämän annetaan kulkeutua membraanin läpi.

20 Membraanille voidaan lisätä vaihtoehtoisesti pieni erä vettä tai puskuria, jotta kultasoolireagenssi saataisiin huuhdeltua tämän läpi ja tausta siten värjäytymään mahdollisimman vähän. Membraanille immobilisoituneen kul-tasoolin määrä määritetään sitten reflektometrillä tai 25 paljaalla silmällä väriasteikkoon vertaamalla.

Edellä esitetyssä käyttömenetelmässä (5) membraani » · · I , voi olla halutun huokoisuuden omaavaa liuskamateriaalia, • « · / joka voi olla inerttiä, koska sen ainoana tehtävänä on • · • ·1 toimia suodattimena. Analysoitavan aineen aggregoitumista • « « ·.· · 30 komponentin C kanssa voidaan tehostaa lisäämällä kaksi tai useampi erilaista analysoitavan aineen sitoutumisessa toi- im mivaa osapuolta, jotta saadaan aikaan sen tyyppinen sil- ·1’1: loittuminen, joka johtaa suurempien aggregaattien muodos- .' . tumiseen. Komponentti C voi vaihtoehtoisesti käsittää ana- • 1 « * | 35 lysoitavan aineen sitoutumisosapuolen immobilisoituna ra- • · ♦ 16 106984 keisiin, esimerkiksi monodispersseibin rakeisiin, kuten Dynosphere-rakeisiin (Dynal A/S, Oslo, Norja).

Tämä keksintö sisältää myös tämän keksinnön mukaisen menetelmän suorittamiseen tarvittavat testipakkaukset, 5 jotka käsittävät (a) kiinteän faasin, jonka pinnalle leimalla varustettu reagenssi saatetaan immobilisoitumaan osoitukseksi analysoitavan aineen esiintymisestä tai määrästä näytteestä ja (b) leimalla varustetun reagenssin, jolle on tunnusomaista, että leimalla varustettu reagenssi 10 käsittää superaggregoidun kompleksin, joka muodostuu aineesta, joka kykenee spesifisesti sitoutumaan mainittuun analysoitavaan aineeseen tai tämän spesifisessä sitoutumisessa toimivaan toiseen osapuoleen, ja kultasoolista, jossa ainakin 75 paino-% kultasoolin kultahiukkasista on kes-15 kiläpimitaltaan alle 20 nanometriä. Testipakkauksen edullinen muoto käsittää (a) kiinteän tukimateriaalin analysoitavan aineen analogin tai analysoitavan aineen spesi-fisesssä sitoutumisessa toimivan toisen osapuolen tai analysoitavan aineen ja yhden tai useamman muun reagenssin 20 muodostaman kompleksin immobilisoimiseksi, (b) mainitun analysoitavan aineen analogin tai sitoutumisessa toimivan toisen osapuolen ja (c) reagenssin, joka käsittää superaggregoidun kompleksin, joka muodostuu molekyylistä, joka ,1',:' kykenee sitoutumaan spesifisesti analysoitavaan aineeseen .25 tai tämän spesifisessä sitoutumisessa toimivaan toiseen osapuoleen, ja kultasoolista, jossa ainakin 75 % kulta- ,·, ; soolin hiukkasista on keskiläpimitaltaan alle 20 nano- • · · .!.* metriä. Kun superaggregoituun kompleksiin liitetään ent-

• · I

*.,! syymi, joka kykenee saamaan aikaan luonteenomaisen reak-

• · I

*·* ' 30 tion, niin testipakkaukseen voidaan liittää myös pakkaus, josta saadaan käyttöön entsyymin substraatti.

·...· Testipakkauksen sisältämä kiinteä faasi voi vaihto- • · « ehtoisesti olla analysoitavan aineen kanssa kosketukseen .·. : saatettavaksi kelpaava käyttövalmis kiinteä tukimateriaa- ' · 35 li, missä on käytetty analysoitavan aineen analogin tai 1’ 106984 analysoitavan aineen spesifisessä sitoutumisessa toimivan toisen osapuolen kytkemistä tukimateriaaliin etukäteen. Joissakin määrityksissä tällainen reagenssipakkaus voi sisältää vakiomäärän analysoitavaa ainetta, vakiomäärän 5 tämän spesifisessä sitoutumisessa toimivaa toista osapuolta ja kultasoolireagenssin. Vakiomäärät analysoitavaa ainetta tai spesifisesssä sitoutumisessa toimivaa toista osapuolta tai reagenssia voivat olla vesipitoisina liuoksina tai ne ovat tavallisemmin lyofilisoituja valmisteita, 10 jotka on tehty liuotettaviksi juuri ennen käyttöä. Yhdessä määritysmuodossa kiinteä tukimateriaali voi olla inertti huokoinen membraani, jonka tehtävänä on pitää analysoitavan aineen ja sitoutumisessa toimivan toisen osapuolen muodostama kompleksi aggregoituneessa muodossa, mutta mah-15 dollistaa kultasoolireagenssin diffusoituminen menetelmän 6 mukaisesti. Tällaisessa systeemissä analysoitavaa ainetta sisältävän kompleksin kokoa voidaan suurentaa käyttämällä mainittua sitoutumisessa toimivaa toista osapuolta tai analysoitavaa ainetta suhteellisen suuriin hiukkasiin, 20 esimerkiksi edellä mainittuihin Dynosphere-hiukkasiin, kiinnitettynä.

Vaikka tässä tarkastelussa ja seuraavissa esimerkeissä päähuomio on kiinnitetty reseptori-ligandi-määri-tyksiin, niin on selvää, että uusilla superaggregoiduilla 25 komplekseilla on hyvin monia erilaisia muita käyttömuotoja aloilla, joilla kultakolloideille on löytynyt sovellutuk- • « « ,·. ; siä. Niinpä aggregaatteja voidaan käyttää blottausmenetel- • · · .! .* missä kytkettynä vasta-aineeseen tai muuhun sitoutuvaan • · materiaaliin, joka on suunnattu näytteessä esiintyväksi • · · *·* 3 0 epäiltyä yhdistettä vastaan; ne ovat käyttökelpoisia myös värjättäessä kudosleikkeitä valo- tai elektronimikrosko- • · · ·...· piaa tai muita värjäysmenetelmiä varten; sentrifugoinnissa *...ϊ ne ovat käyttökelpoisia merkkiaineina; ja agglutinaatio- .·. : määrityksissä ne voivat korvata nykyään käytetyt lateksi- 35 hiukkaset. Ammattimies kykenee helposti näkemään muita ia 106984 sovellutusmuotoja, joissa superaggregoidut kompleksit voivat korvata muuntyyppisiä nykyään käytettyjä hiukkasia,

Seuraavat esimerkit on tarkoitettu ainoastaan tätä esimerkkiä valaiseviksi esimerkeiksi: 5 Esimerkki 1

Keskiläpimitaltaan 4 nm hiukkasista koostuva kulta-kolloidi valmistettiin julkaisussa Mulphfordt, Experientia 38 (1982) s. 1127 - 1128, kuvatulla tavalla.

Fibriinin hajoamistuotetta, D-dimeeriä, vastaan 10 suunnattu hiiren monoklonaalinen vasta-aine S4H9 kehitettiin tavanomaista hybridoomateknologiaa käyttäen, vasta-aine valmistettiin hiiren askites-nesteessä ja lopuksi puhdistettiin. Ennen käyttöä puhdistettu vasta-aine dia-lysoitiin tislattua vettä vastaan ja sen konsentraatio 15 säädettiin arvoon 1,5 mg/ml.

Käytettiin kultakolloidisusperisiota, jonka optinen tiheys oli 540 nm:n aallonpituudella 40 (arvioituna kol-loidisuspension laimennuksesta) . Suspensio valmistettiin sentrifugoimalla, poistamalla 90 - 95 % supernatantista ja 20 suspendoimalla se ennen käyttöä uudelleen tislattuun veteen. 25 ml:aan tätä liuosta lisättiin etikkahappoa, jonka lopulliseksi konsentraatioksi tuli 10 mmol/1, millä pH asettui arvoon noin 3,5, jonka jälkeen lisättiin välittö- .'.j mästi 15 ml vasta-aineen S4H9 dialysoitua liuosta. Seosta < * 25 sekoitettiin 20 minuutin ajan. Makroskooppiset aggregaatit tulivat välittömästi näkyviin. 20 minuutin kuluttua sus- « · · ; pensio sentrifugoitiin 5000 x g:n voimalla 10 minuutin • · · .1 / ajan. Supernatantti poistettiin ja sedimentoituneet aggre- • · gaatit suspendoitiin uudelleen tislattuun veteen siten, • » · *·* 30 että lopulliseksi tilavuudeksi saatiin 40 ml. Lisättiin 10 ml 10-%:ista naudan seerumin albumiini (BSA) -liuosta.

• · · ·...· Suspensio jäähdytettiin jäillä ja sen jälkeen sille suo- * * · ritettiin lievä ultraäänikäsittely noin 15 sekunnin ajan.

.·, : Tätä suuremmat tilavuudet voidaan edullisesti käsitellä • · · 35 ultraäänellä läpivirtausjärjestelmässä. Suspensio laimen- « • · 19 106984 nettiin nelinkertaisesti 200 ml lopputilavuuteen, jonka jälkeen se steriilisuodatettiin 0,22 mikrometrin suodattimena ja lopuksi sen NaCl-konsentraatio säädettiin arvoon 20 mmol/1. Elektronimikroskopoimalla saatiin selville, 5 että kolloidit esiintyivät läpimitaltaan 100 - 200 nm:n suuruisina ryhmittyminä (kuvio 1).

Suspensio läpäisi 0,22 mikrometrin suodattimen (= 220 nm) , kun taas 100 nm:n ja 50 nm:n läpimittaiset suodattimet pidättivät värilliset kolloidit täydellisesti. 10 Valmistettiin standardikonjugaatti käyttäen vasta- aineiden normaalia leimausmenetelmää Slotin ja Geuzen kuvaamalla tavalla (Eur. J. Cell. Biol. 38 (1985) s. 87 - 93). Tässä menetelmässä ei muodostunut aggregaatteja, koska konjugaatiomenetelmän aikana pH pidettiin lähellä vas-15 ta-aineen pl-arvoa. Kullan ja vasta-aineen suhteen arvioitiin tuloksena olevissa konjugaateissa olevan 1 : 1 ja elektronimikroskopialla varmistettiin, että kultahiukkaset olivat sattumanvaraisesti jakautuneena liuoksessa (kuvio 2) .

20 Konjugaatit tutkittiin seuraavalla testivälineellä: lxl cm:n pala nitroselluloosamembraania, jonka huokoskoko oli 0,6 μτη, asetettiin 0,28 mm paksun valkoisen polyvinyylikloridiliuskan (PVC) alle siten, että siinä oleva 3,5 mm:n reikä oli membraanin keskellä. Membraani 25 kiinnitettiin muoviin kaksipuolista teippiä käyttäen. Tä-män jälkeen kiinnitetyllä membraanilla varustettu PVC- • · · l' . liuska kiinnitettiin 1 mm paksuiseen selluloosapaperityy- • · .1 nyyn sille teipin alueelle, jota membraani ei peittänyt.

• « · Väline suljettiin toisen 0,40 mm paksuisen PVC-liuskan • · · *·* * 30 alle kiinnittämällä liuska tyynyyn kaksipuolista teippiä käyttäen. Tällainen rakenne mahdollistaa nesteen kulun • « · ylemmässä PVC-liuskassa olevan reiän kautta membraanin • · « ’"/· läpi ja sen kertymisen tyynyyn. Membraani aktivoitiin li- .·. : säämällä 2 μΐ S4H9-vasta-aineliuosta, jonka pitoisuus oli • · · • · « • « • · « · 20 106984 3,0 mg/ml, ja sen annettiin kuivua ennen sen käyttöä seu-raavissa vaiheissa.

Membraanin pinnalle lisättiin testivälineessä oleviin rinnakkaisiin reikiin 25 μΐ plasmanäytettä, jonka 5 tiedettiin sisältävän D-dimeeriä. Noin 20 sekunnin kuluttua plasma oli kulkeutunut membraanin läpi tyynyyn. Kum paankin kahteen rinnakkaiseen reikään lisättiin erikseen 25 μΐ kultakonjugaatteja aggregoitu.neessa muodossa ja 25 μΐ kultakonjugaattia aggregoitumatlomassa muodossa. Kun 10 neste oli kulkeutunut membraanin läpi, lisättiin pisara 0,15-molaarista NaCl:a ylimääräisen konjugaatin huuhtelemiseksi pois. Kontrolliksi suoritettiin näitä kahta konju-gaattia käyttäen samat vaiheet plasmanäytteelle, jonka tiedettiin sisältävän normaalin pienen pitoisuuden D-di-15 meeriä. Tulokset luettiin laitteiden avulla käyttäen IBM-PC-tietokoneeseen liitettyä reflektometriä (Color Eye, Macbeth) ja Macbethin tietokoneohjelmaa.

Saadut tulokset osoittivat, että normaalilla plasmalla, jonka D-dimeeripitoisuus oli pieni, muodostunut 20 väri antoi 540 nm:n aallonpituudella vastaavan pienen reflektanssin, joka oli <0,18. Aggregoitumattoman konjugaatin avulla muodostunut väri oli tavallisesti heikko, kun taas aggregoitua konjugaattia käyttäen saatu väri oli reflektanssiarvojen perusteella noin kymmenen kertaa voi-25 makkaampi. Tulokset osoittavat, että uusi konjugaattimuoto ... sai aikaan huomattavasti suuremman nettotuloksen kuin ta- • · · • · · I . vanomaiset konjugaatit. Aggregoituminen ei vaikuttanut • · · [’ taustasignaaliin.

» · · : ·* Lisäksi suodatustesti osoittaa., että aggregoitunei- • · · *.* * 30 den kultakolloidien koko oli alueella 100 - 200 nm. Tämä varmistettiin elektronimikroskopian avulla.

• · · • ϊ Esimerkki 2 • · · ·*”: Tässä esimerkissä osoitetaan., että aggregoituja .* . konjugaatteja voidaan muodostaa myös edellistä menetelmää 2i 106984 yksinkertaisemmalla menetelmällä ilman ultraäänikäsitte-lyä.

Kultakolloidit, testiväline ja vasta-aineet valmistettiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla- Kultakolloidisus-5 pensio valmistettiin kuvatulla tavalla siihen vaiheeseen saakka, jossa pH säädetään arvoon 3,5 etikkahappoa käyttäen. 25 ml kolloidisuspensiota, jonka pH oli säädetty, lisättiin 12,5 ml:aan S4H9-liuosta, jonka pitoisuus oli

1,5 mg/ml. Kun suspension oli annettu olla 25 minuuttia 10 20 °C:ssa, se lisättiin 10-%:iseen BSA-liuokseen, jonka pH

oli säädetty arvoon 9,0. BSA:n lopullinen konsentraatio oli 0,2 %. Tämän jälkeen suspension Tris-HCl-konsentraatio säädettiin arvoon 40 mmol/1 (pH 7,3). Kun suspensio jätettiin sekoittumaan yön yli, näkyvät aggregaatit hävisivät 15 ja suspensio läpäisi steriilisuodattimen, jonka huokoskoko oli 0,22 pm, mutta ei 100 nm suodatinta. Elektronimikroskopialla saatiin selville, että aggregaatteja muodostui, vaikkakaan niiden pakkautuminen ei ollut yhtä tiiviistä kuin esimerkissä 1 kuvatussa menetelmässä. Esimerkin 1 20 mukaisella tutkimusohjelmalla suoritetussa tutkimuksessa ilmeni, että signaali lisääntyi noin viisinkertaiseksi tavanomaisiin aggregoitumattomiin konjugaatteihin verrattuna.

Esimerkki 3 * « 25 Esimerkin 1 mukaiset vaiheet toistettiin sillä ai- « · noalla poikkeuksella, että kultakolloidisuspensioon lisät- e · · t’,' . tiin NaCl: a konsentraatioon 5 mmol/1 ja suspensio jätet- • · · .* tiin 4 °C:seen 14 päivän ajaksi ennen käyttöä. Tämän mene- • · · * ·* telmän avulla saadaan kultakolloidit muodostamaan selvem- • · · « · « *·’ ' 30 min havaittavia aggregaatteja. Kun konjugaatit tutkittiin esimerkin 1 mukaista tutkimusohjelmaa noudattaen, olivat • » » värisignaalit noin kolmekymmentä kertaa voimakkaammat kuin

»M

' : aggregoitumatonta kultaa käyttäen saadut signaalit. Taus- .·] ; tataso kasvoi hieman, mikä osoittaa, että muodostuneet ♦ · * 35 aggregaatit olivat läpimitaltaan suurempia.

22 106984

Esimerkki 4 Tässä esimerkissä osoitetaan, että tietyt vasta-aineet saattavat muodostaa aggregaatteja kultakolloidien kanssa lähes neutraalissa pH:ssa. Tällaisten aggregaattien 5 aikaansaamaa signaalia ja niiden kokoa voidaan säätää vaihtelemalla konjugointimenetelmässä käytettävää proteiinin ja kullan keskinäistä suhdetta.

Ihmisen seerumialbumiinia kohtaan spesifinen hiiren vasta-aine, jolle annettiin nimitys 2D2, kehitettiin tun-10 nettua hybridoomatekniikkaa käyttäen. Vasta-aineen tuotantoa kohotettiin käyttäen hiiren askites-nestemenetelmiä, vasta-aine puhdistettiin ja dialysoitiin 2-millimolaarista natriumfosfaattipuskuria (pH 6,8) vastaan. Vasta-aineen lopullinen konsentraatio oli 1,0 mg/ml.

15 Kultakolloidit valmistettiin esimerkissä 1 kuvatul la tavalla. Kolloidisuspension absorbanssi. säädettiin arvoon 40 540 nm aallonpituudella.

Vasta-aineliuos ja kultakolloicisuspensio sekoitettiin keskenään suhteissa 1+2, 1+2,2, 1 +2,5, 1 + 3 ja 20 1 + 3,5.

Kun liuoksia oli pidetty 25 minuuttia 20 °C:n lämpötilassa, niihin lisättiin yhtä suuri tilavuus l-%:ista BSA-liuosta.

Konjugaatit tutkittiin välineissä esimerkissä 1 i i 25 kuvatulla tavalla. Membraanit aktivoitiin lisäämällä 2 ui * « 1 ,···. liuosta, joka sisälsi toista ihmisen seerumin albumiinia » « · '· . vastaan suunnattua hiiren monoklonaalista vasta-ainetta • c · • · · / (2D3), jonka pitoisuus oli 3,0 mg/ml, Membraanien annet- • · · • a tiin kuivua ennen käyttöä.

• · « *·1 1 30 Ihmisen virtsanäytteet, joihin kuhunkin oli lisätty albumiinia pitoisuuteen 0 (kontrolli), 10, 25, 50, 100 ja m ·...· 200 mg/1, laimennettiin suhteessa 1+20 NaClrlla, jonka • t · *i(<: konsentraatio oli 0,15 mol/1. Testivälineiden viiteen rin- .·] : nakkaiseen reikään lisättiin 25 μΐ kutakin laimennosta.

• 9 1 ! 35 Kun laimennetut näytteet olivat imeytyneet membraaniin, • · • I > i · • « « 23 106984 lisättiin yksi tippa kutakin konjugaattia kuhunkin rinnakkaisen sarjan reikään. Lopuksi lisättiin yksi tippa 0,15-molaarista NaCl-liuosta membraanin huuhtelemiseksi ja kukin reikä luettiin reflektometrin avulla esimerkissä 1 5 kuvatulla tavalla.

Tulokset on esitetty kuviossa 3 ja niistä käy ilmi, että tulokseksi saatu signaali lisääntyy huomattavasti vasta-aineen määrän noustessa. Yhdessäkään tapauksessa liuoksesta ei kyetty löytämään vapaita (kultahiukkasiin 10 konjugoitumattomia) vasta-aineita. Tästä sekä reflektans- siarvojen suhteellisesta kasvusta johtuen ei signaalin voimistumista voida selittää pelkällä reagoivien vasta-aineiden lukumäärän lisääntymisellä. 50 nm:n suodattimia käyttäen suoritetut kokeet osoittivat myös, että suodatin 15 pidätti pääasiassa suhteessa 1+2 valmistetun konjugaa- tin, kun taas suhteessa 1 + 3,5 valmistetut konjugaatit läpäisivät sen esteettä. Niinpä ne aggregaatit, joiden signaalinmuodostamiskyky oli kasvanut, olivat muodostuneet vasta-aine 2Γ2:η kanssa lähes neutraalissa pH:ssa.

20 Esimerkki 5

Esimerkin 1 mukaiset suoritusvaiheet toistettiin sillä ainoalla poikkeuksella, että vasta-aine korvattiin monoklonaalisella vasta-aineella T11G8, joka oli suunnattu t' C-reaktiivista proteiinia vastaan. Vasta-aineen konsent- 25 raatio, vasta-aineen liuotin, kolloidikulta ja kaikki käy-

« I

tetyt suoritusvaiheet olivat samanlaiset kuin esimerkissä • ♦ · l . 1. Suodatustutkimuksessa havaittiin läpäisy 200 nm suodat- • ♦♦ .1 .1 timilla, muttei 50 eikä 100 nm:n suodattimilla.

• ♦ · • ·1 Vertailun vuoksi valmistettiin vertailukonjugaatti • · · *·1 1 30 pitämällä pH arvossa 6,5, joka on lähellä TllG8:n pl-ar- voa. Tämä konjugaatti läpäisi helposti 50 nm:n suodatti- ·»· •mmt· men, mikä osoitti, ettei aggregaatteja ollut muodostunut.

* ϊ Tämä saatiin varmistettua elektronimikroskopialla, jolla ^ ; osoitettiin vain vähäistä kultakolloidien ryhmittymistä ! 35 lopullisessa valmisteessa.

• » » 1 • · : i >i » · 24 106984 Nämä kaksi konjugaattia tutkittiin esimerkissä 1 kuvattua välinettä muistuttavalla välineellä. Membraani aktivoitiin lisäämällä 2 μΐ C-reaktiivista proteiinia vastaan suunnatun monoklonaalisen vasta-aineen G405 liuosta, 5 jonka pitoisuus oli 3,0 mg/ml, ja membraani kuivattiin ennen käyttöä. Kullekin membraanipala.il e lisättiin muovi-suojuksen aukon kautta 25 μΐ laimennettuja plasmanäyttei-tä, joiden tiedettiin sisältävän C-reaktiivista proteiinia, jonka jälkeen lisättiin 25 μΐ jompaan kumpaan kahdes-10 ta muodosta valmistettua konjugaattiliuosta, ja taustavärin poistamiseksi lisättiin vielä yksi tippa 0,15-molaa-rista NaCl-liuosta.

Kuviossa 4 on esitetty koetulokset, jotka saatiin 32 mg/1 CRP:tä sisältävän plasman sarjalaimennoksista, 15 jotka oli valmistettu suhteissa 1 : 50 - 1 : 800. Laimen-nin oli 0,15-molaarinen NaCl. Kuten kuvasta käy ilmi, näiden kahden konjugaatin värjäytymisen voimakkuudet membraa-nilla osoittautuivat huomattavan erilaisiksi aggregoidun konjugaatin saadessa aikaan yli kymmenkertaisesti lisään-20 tyneitä signaaleja.

Kumpaakin konjugaattia pidettiin 4 °C-.n lämpöti lassa yhdeksän kuukauden ajan ja ne tutkittiin säännölli-sesti. Yhdenkään konjugaatin ominaisuudet eivät muuttuneet tämän säilytysajan jälkeen, mikä osoittaa, että aggregoi-25 dut konjugaatit ovat erittäin stabiileja.

!a . Esimerkki 6 .1 Edellä kuvattu koe toistettiin korvaamalla vasta- • · · aine T11G8 puhdistetulla ihmisen seerumin albumiinia vas-’·1 ' taan suunnatulla kaniinin antiseerumilla (anti-HSA) . Tu- 30 lokseksi saadut konjugaatit tutkittiin sellaisia membraa- • · · neja sisältävässä välineessä, jotka oli päällystetty mono-* l klonaalisella anti-HSA-vasta-aineella esimerkeissä 1 ja 5 : kuvattua menetelmää käyttäen. Tulokset osoittivat, että 1 lisättäessä laimennettua virtsaa, jonka tiedettiin sisäl- . 35 tävän albumiinia, sai aggregoitu konjugaatti aikaan noin 25 106984 kahdeksankertaisesti lisääntyneen värisignaalin verrattuna tavanomaiseen aggregoitumattomaan konjugaattiin.

Esimerkki 7

Aggregoituja konjugaatteja voidaan myös muodostaa 5 käyttäen muita proteiineja kuin vasta-aineita. Esimerkin 1 mukainen menetelmä kultakolloidien ja aggregoitujen konju-gaattien valmistamiseksi toistettiin siten, että tällä kertaa vasta-aine korvattiin naudan seerumin albumiinilla. Käytetty albumiinikonsentraatio oli 1,5 mg/ml, kuten oli 10 asianlaita vasta-aineidenkin yhteydessä. Muodostui aggregaatteja, joiden ominaisuudet suodattimissa olivat samanlaisia kuin vasta-aineaggregaattien ominaisuudet. Albumii-niaggregoitu kolloidikulta tutkittiin elektronimikroskopian avulla ja ryhmittyneiden kolloidien jakautuminen 15 osoittautui siinä samalla tavalla sattumanvaraiseksi kuin esimerkissä 1 muodostuneilla aggregaateilla.

Esimerkki 8

Toinen kolloidikultaan konjugoitavissa oleva muun tyyppinen proteiini kuin vasta-aineproteiini on proteiini-20 A. Menetelmä oli sama kuin esimerkissä 1 käytetty menetelmä ja siinä käytettiin proteiini A:n pitoisuutta 1,5 mg/ml kuten muidenkin proteiinien yhteydessä meneteltäessä. Tu-·, ; loksena oleva aggregoitunut konjugaatti sekä tavanomainen, ' aggregoitumaton konjugaatti tutkittiin samanlaisella väli- ,,, 25 neellä kuin esimerkissä 1 kuvattu väline. Membraani pääl- • « k * . lystettiin ihmisen seerumin albumiinia vastaan suunnatulla • · ·

*· monoklonaalisella IgG-vasta-aineella. Koska proteiini A

: reagoi suoraan immunoglobuliinien kanssa, osoitti kahden · konjugaatin eri laimennosten lisääminen, että lisättäessä 30 yhtä suuri määrä konjugoitua proteiini-A:ta sai aggregoitu konjugaatti aikaan noin kaksitoista kertaa voimakkaamman • · · signaalin kuin tavanomaisen konjugaatin kanssa aikaansaa- • · · . tava signaali.

« · · 1 · 26 106984

Esimerkki 9 Tässä esimerkissä osoitettiin sellaisen hybridi -aggregaatin muodostuminen, joka sisälsi kahta eri proteiinia, joista toista voidaan käyttää sitoutumiseen ja toista 5 signaalin muodostamiseen. Alkalinen fosfataasi (ALP) -entsyymi ja kaniinin hiirtä vastaan suunnattu IgG konjugoi-tiin yhdessä kultahiukkasiin. Tällainen konjugaatti mahdollistaa hiiren IgG-molekyylien havaitsemisen joko suoraan kultavärjäytymää tarkastelemalla tai käyttämällä ent-10 syymiä ELISA-määrityksen tapaan.

Entsyymistä (ALP) ja vasta-aineesta poistettiin suola suorittamalla geelisuodatus PD-10-pylväällä, joka oli tasapainotettu 10-millimolaarisella etikkahapolla, jonka jälkeen ne sekoitettiin keskenään massasuhteessa 15 1,5 : 1 (entsyymi : vasta-aine) . Tämän jälkeen proteiini- seos konjugoitiin kultakolloideihin 10-millimolaarisessa etikkahappoliuoksessa menetellen niin, että näiden kahden proteiinien yhteenlasketut massat kävivät yksiin esimerkissä 1 kuvatun proteiinin ja kullan välisen suhteen kans-20 sa. Superaggregoitujen saostuneiden konjugaattien annet tiin sedimentoitua passiivisesti, jonka jälkeen ne käsiteltiin ultraäänellä ja reaktion jatkuminen estettiin nau-·. : dan seerumin albumiinilla, ja suoritus, jonka kaikkiin ! vaiheisiin kului aikaa noin yksi tunti, lopetettiin ste- ,,, 25 riilisuodattamalla.

·* Kuvio 5 osoittaa, millaiset mahdollisuudet tulok- • · · ’· seksi saatu hybridikonjugaatti antaa havaitsemiselle. Kon- • * * • · « : .* jugaatista tehtyjä laimennoksia lisättiin suoraan täpliksi • · :.· · nitroselluloosalle siten, että ne jakautuivat tasaisesti 30 ympyröiden sisään, joiden halkaisija oli 3,5 mm. Kultavär-jäytymät mitattiin ref lektometrin avulla. Tämän jälkeen • · t ·***; nitroselluloosa siirrettiin alkalisen fosfataasin subst- « · · . raattiliuokseen, joka sisälsi bromikloori-indolyylifos- • · < ; faattia (BCIP). Varovasti ravistellen suoritetun 30 minuu- 35 tin pituisen inkuboinnin jälkeen saostui nitroselluloosal-’:·· le tumma purppuranvärinen tuote, joka oli peräisin ALP:n 27 106984 vaikutuksesta BCIP:hen. Kuvasta 5 käy ilmi, että tätä vaihtoehtoista entsyymiaktiivisuutta hyväksi käyttämällä saatiin vielä kymmenkertainen herkkyyden lisääntyminen kultavärjäytymään verrattuna.

5 Kuviossa 6 on esitetty nitroselluloosalle täpliksi lisätyn hiiren monoklonaalisen IgG:n havaitseminen käyttäen kahta vaihtoehtoista hybridikonjugaattileimaa. Nitro-selluloosalle lisättiin täpliksi yhteensä 0,1 - 100 ng vasta-ainetta laimennettuna BSA-liuokseen, jonka pitoisuus 10 oli 100 μg/ml, kahtena rinnakkaisena lisäyksenä. Nitrosel-luloosa kuivattiin, reaktion eteneminen pysäytettiin BSA:11a ja membraania inkuboitiin konjugaatin kanssa 0,l-%:isessa Tween 20 -liuoksessa 20 minuutin ajan. Toinen bloteista siirrettiin entsyymisubstraatti (BCIP-) -liuok-15 seen ja sitä inkuboitiin edellä kuvatulla tavalla. Kehitetyistä bloteista käy ilmi, että kultavärjäyksellä oli mahdollista havaita 1 ng vasta-ainetta, kun taas entsyymiä käyttäen havaittiin 0,1 ng. Entsyymivärjäys vaikuttaa lisäävän herkkyyttä yhteensä noin 15-kertaisesti kultavär-20 jäykseen verrattuna.

Esimerkki 10 Tällä esimerkillä on osoitettu kolloidikultaa ja : kahta sellaista erilaista proteiinia sisältävän hybridi- superaggregaatin muodostuminen, joista toinen proteiini on 25 analysoitavan aineen spesifisesssa sitoutumisessa toimiva ! . toinen osapuoli ja toinen proteiini sellainen, ettei se » · · ,1 osallistu reaktioon, sitä ei ole näytteessä eikä se esiin- • · · : ·* ny millään muulla tavalla reagensseissa. Tätä hybridisu- • · « *·1 * peraggregaattia voidaan käyttää määrityksen herkkyyden 30 lisäämiseksi edelleen lisäämällä toista superaggregaattia, • · · joka sisältää kolloidikultaa ja mainitun toisen proteiinin ·***: spesifisesssä sitoutumisessa toimivaa toista osapuolta.

• ♦ · y . Nitroselluloosamembraanit päällystettiin monoklo- ! naalisella vasta-aineella S4H9 (1 mg/ml), joka on spesifi- . 35 nen D-dimeerille, fibriinin hajoamistuotteelle, ja nitro- 28 1 0 6 9 8 4 selluloosa sijoitettiin esimerkissä 1 esitetyn kuvauksen mukaiseen testivälineeseen. Niihin lisättiin (50 /xl) valmisteita, jotka sisälsivät D-dimeeriä konsentraatioina 0 -8 mg/1 liuotettuna 0,1-molaariseen Tris-HCl-puskuriliuok-5 seen (pH 7,4), joka sisälsi BSA:ta, jonka pitoisuus oli 50 mg/ml, ja niiden annettiin imeytyä membraanin läpi. Tämän jälkeen immobilisoidun vasta-aineen pidättämät D-di-meerimolekyylit visualisoitiin lisäämällä 50 /xl liuosta, joka sisälsi 4 nm kolloidikullan, S4H9:n ja ihmisen seeru-10 min albumiinin (HSA) muodostamaa superaggregaattia. Tämä superaggregaatti valmistettiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla käyttäen S4H9:n ja HSA:n painosuhteena suhdetta 1:1. Membraani pestiin ja membraanille jääneen kolloidi-kullan aiheuttaman signaalin voimakkuus määritettiin ref-15 lektometriä käyttäen. Esimerkissä 4 kuvatulla tavalla valmistettiin toinen kolloidikullan ja monoklonaalisen vasta-aineen 2D2 muodostama superaggregoitu kompleksi. Tämä toinen superaggregaatti lisättiin nitroselluloosalle ja aggregaatti immobilisoitui ensimmäisessä superaggregaatissa 20 olevan HSA:n ja toisessa aggregaatissa olevan vasta-aineen 2D2 välisten sidosten vaikutuksesta. Membraani pestiin 3a tuloksena oleva signaali mitattiin reflektometrin avulla.

: Voitiin osoittaa, että toisen vaihee;n jälkeen saatu sig- i(ii; naali oli neljä kertaa voimakkaampi kuin ensimmäisen vai- 25 heen jälkeen aikaansaatu signaali.

• · · ; . Kuviossa 7 on esitetty annos-vastekäyrät, jotka I « t *· '· saatiin käyttäen näytteessä kasvavia määriä D-dimeeriä.

iti • » • · « · · • I I I I I 1

III

· ♦ • · • · ♦ · · III ♦ ♦

Claims (14)

29 1 0 6 9 8 4

1. Menetelmä tutkittavassa näytteessä olevan analysoitavan aineen kvalitatiiviseksi tai kvantitatiiviseksi 5 määrittämiseksi, jossa leimalla varustettu reagenssi, joka käsittää sellaiseen aineeseen sitoutuneen kultasoolin, joka kykenee sitomaan spesifisesti mainittua analysoitavaa ainetta tai tämän spesifisessä sitoutumisessa toimivaa toista osapuolta, saatetaan immobilisoitumaan sitoutunees-10 sa muodossa kiinteään faasiin osoittamaan analysoitavan aineen esiintymistä tai sen määrää näytteessä, tunnettu siitä, että käytetään leimalla varustettua rea-genssia, joka käsittää mainitun aineen tai tämän spesifisessä sitoutumisessa toimivan toisen osapuolen ja kul-15 tasoolin muodostaman superaggregoidun kompleksin, jossa ainakin 75 paino-% kultasoolin kultahiukkasista on keski-läpimitaltaan alle 20 nanometriä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu näyte saatetaan kos- 20 ketukseen vesipitoisessa määritysmediumissa (i) kiinteään kantajaan immobilisoidun analysoitavan aineen analogin tai mainittun analysoitavan aineen spesifisessä sitoutumisessa *. : toimivan toisen osapuolen ja (ii) leimalla varustetun rea- €iii; genssin kanssa, joka käsittää patenttivaatimuksessa 1 mää- ... 25 ritellyn superaggregoidun kompleksin, minkä avulla tietty « « 1 * . määrä mainittua leimalla varustettua reagenssia saatetaan • · · *· " immobilisoitumaan kantajaan, jotta se saisi suoraan tai • · · • ·* epäsuorasti aikaan värinmuutoksen, joka viittaa analysoi- • · · *.· 1 tavan aineen esiintymiseen tai osoittaa tämän määrän näyt- 30 teessä.

: ’ : 3. Minkä tahansa edellisistä patenttivaatimuksista ·***; mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ainakin • · · .1 . 75 paino-% kultasoolin sisältämistä kultahiukkasista on 1 keskiläpimitaltaan alle 5 nanometriä. 106984

4. Minkä tahansa edellisistä patenttivaatimuksista mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että siinä suoritetaan kompetitiivinen määritys.,

5. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-3 mukai-5 nen menetelmä, tunnettu siitä, että siinä suoritetaan kerrosmääritys.

6. Minkä tahansa edellisistä patenttivaatimuksista mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kiinteä faasi on inertti membraani, joka adsorboi helposti pro- 10 teiinia ja jossa on huokosia, joiden läpi nesteen on mahdollista kulkeutua.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n ne t t u siitä, että superaggregoitu kompleksi on kahden tai useamman proteiinin muodostama hybridikomplek- 15 si, johon sisältyy entsyymi, joka kykenee saamaan aikaan luonteenomaisen reaktion, kun tätä vastaava substraatti on saatettu sen vaikutukselle alttiiksi.,

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että superaggregoitu kompleksi on 20 kahden tai useamman proteiinin muodostama hybridikompleksi ja värin voimistuminen saadaan aikaan lisäämällä yksi tai useampi uusi superaggregoitu kompleksi, joka kykenee si-toutumaan mainittuun ensimmäiseen hybridikompleksiin. « «

9. Reagenssipakkaus tutkittavassa näytteessä olevan ·<· 25 tutkittavan aineen kvalitatiiviseksi tai kvantitatiivisek- • « « • · « . si määrittämiseksi, joka käsittää ia) kiinteän faasin, • · · • · · .1 .1 johon leimalla varustettu reagenssi saatetaan immobilisoi- • · · • ·1 tumaan osoittamaan analysoitavan aineen esiintymistä tai • · · *·1 määrää näytteestä ja (b) leimalla varustetun reagenssin, 30 tunnettu siitä, että leimalla varustettu reagenssi • · · käsittää superaggregoidun kompleksin, joka muodostuu ai-* : neesta, joka kykenee spesifisesti sitoutumaan mainittuun . analysoitavaan aineeseen tai tämän spesifisesssä sitoutu- ! misessa toimivaan toiseen osapuoleen, ja kultasoolista, · 31 106984 jossa ainakin 75 paino-% kultasoolin kultahiukkasista on keskiläpimitaltaan alle 20 nanometriä.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen reagenssipak-kaus, tunnettu siitä, että superaggregoitu komp- 5 leksi lisäksi sisältää entsyymin, joka kykenee saamaan aikaan luonteenomaisen reaktion ja, että reagenssipakkaus lisäksi käsittää mainitun entsyymin substraatin.

11. Patenttivaatimuksen 9 mukainen reagenssipakkaus, tunnettu siitä, että kiinteä faasi on mem- 10 braani, mainitulla membraanilla sijaitsee absorboiva tyyny, mainitun absorboivan tyynyn membraanista poispäin sijaitsevalla puolella sijaitsee nesteelle läpäisemätön liuska ja membraanin absorboitavasta tyynystä poispäin sijaitsevalla puolella sijaitsee nesteelle läpäisemätön 15 liuska, jossa on yksi tai useampia reikiä, ja absorboiva tyyny pystyy aikaansaamaan näytteen tai leimatun reagens-sin poikittaisen diffuusion mainitun membraanin läpi, kun näyte asetetaan johonkin mainituista reijistä.

12. Menetelmä proteiinin ja kultasoolin superaggre-20 goidun kompleksin muodostamiseksi, jossa ainakin 75 paino-% kultahiukkasista on keskiläpimitaltaan alle 20 nanometriä, tunnettu siitä, että | (i) sekoitetaan proteiini ja kultasooli keskenään sellaisessa pH-arvossa, että proteiinimolekyylissä on ai- « · 25 nakin kaksi positiivisesti varautunutta ryhmää; • · · l . (ii) kerätään näin muodostuneet makroskooppiset • · · ' / aggregaatit talteen; • · · • ·' (iii) suspendoidaan makroskooppiset aggregaatit ··« • · · *.* * uudelleen liuokseen, jonka pH on neutraali, käyttäen va- 30 linnaisesti ultraäänikäsittelyä, stabiileja super- aggregoituja kulta-proteiini-komplekseja sisältävän sus- ·*": pension muodostamiseksi.

« · · . 13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, • « * ‘ * tunnettu siitä, että pH vaiheessa (i) on alueella 35 1-5. 32 1 0 6 9 8 4

14. Proteiinin ja kultasoolin muodostama superagg-regoitu kompleksi, tunnettu siitä, että ainakin 75 paino-% kultahiukkasista on keskiläpimitaltaan alle 20 nanometriä ja että se kyetään saamaan aikaan patentti-5 vaatimuksen 12 tai patenttivaatimuksen 13 mukaisella menetelmällä . ( « | « | • < *99 *99 * 1 1 • · I · I * · · • · • · · • · · • · • · · • I « * · · »1« • t • · * · · • · · • · · • · • · · • · · * « # 1 · * ' ( k • « « « » I 106984