JP3174573B2 - 試験方法およびその試薬キット - Google Patents

試験方法およびその試薬キット

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、水性媒体中における被検物質の存在の定性
的および定量的測定方法に関する。
イムノアッセイ法を用いた被検物質の検出および／ま
たはアッセイは、とくに蛋白質たとえば抗原および抗
体、ならびに糖、レクチンおよび核酸に関して、十分に
確立されてはいる。しかしながら、現在用いられている
多くの技術は、感度は高いものの、多数の工程が必要
で、その各工程には長い時間がかかり、労力を要するこ
とが多い。しかしまた、一部のこの種のアッセイは、ア
ッセイ系の一方の成分を固体支持体に固定化して過剰の
試薬の除去を容易にすることにより、簡易化できること
が証明されてきた。この種のアッセイには通常、被検物
質自体か被検物質に対する結合パートナーへの、適当な
標識たとえば放射性同位元素、発蛍光団、または特徴的
な反応を生じる酵素を担う標識マクロ分子の使用が包含
される。
提案されている簡易化の一例として、イムノアッセイ
反応物の一つに可視マーカーとして付着させる発色物質
の使用がある。しかしながら、十分強いシグナルを生成
できる発色物質は極めて稀である。Akzona Inc.の米国
特許第4,313,734号には、とくに、このような発色物質
としてコロイド金の使用が記載され、金の粒子の粒子径
は少なくとも５ナノメーター、好ましくは10〜100nmで
なければならないと特定されている。
WO 89/06801には、少なくとも75％の金粒子が５ナノ
メーター未満の平均直径をもつ改良イムノアッセイ系が
記載されている。これにより、金試薬と固定化反応物の
反応は迅速化され、同時に発色強度も増大するといわれ
ている。本発明者らは、WO 89/06801の微小金粒子を、
新規な凝集方法によって、より大きな粒子（超凝集金−
蛋白質コロイド）に形成すると、さらに発色強度の増大
が達成できることを発見した。超凝集粒子は、現在イム
ノアッセイに用いられている単一結晶金粒子とは著しく
異なり、既にWO 89/06801の系によって可能になった印
象的な低レベルよりもさらに低い濃度の物質の分析をも
可能にするものである。
小さな金粒子は、Janssen Pharmaceutical N.V.の米
国特許第4,775,636号に記載されているように、ブロッ
ティング系のマーカーとしても用いられている。しかし
ながら、この粒子が、可視化が望まれる成分に単に結合
されるのではなく凝集されることについては全く示唆が
ない。
本発明によれば、被検物質に特異的に結合できる物質
またはその特異的結合パートナーに結合した金ゾルから
なる標識試薬を固相に結合型ととして固定化させ、サン
プル中における被検物質の存在または存在量の指標を提
供させることによる試験サンプル中の被検物質の定性的
または定量的測定方法において、標識試薬は上記物質ま
たはその特異的結合パートナーと金ゾルの超凝集複合体
からなり、この場合金ゾルの金粒子の少なくとも75重量
％は平均直径20ナノメーター未満であることを特徴とす
る方法を提供するものである。
多くの種類の固相アッセイにおいて、固体支持体への
被検物質類縁体または上記被検物質に対する特異的結合
パートナーのカップリングにより、標識試薬を固定化さ
せる固相を提供するのが有利である。したがって、本発
明の他の態様によれば、液体サンプル中における被検物
質の定性的および定量的測定方法において、上記サンプ
ルを水性アッセイ媒体中、（ｉ）固体支持体上に固定化
された被検物質類縁体または上記被検物質に対する特異
的結合パートナー、および（ii）上記被検物質に特異的
に結合できる分子またはそれに対する特異的結合パート
ナーに付着した金ゾル、ならびに所望により、特徴的反
応を起こすことができる酵素と接触させ、この場合上記
固体支持体上に一定量の上記標識試薬を固定化させ、そ
の発色および／または上記酵素がその基質に暴露されて
生成した発色の検出または測定をサンプル中の上記被検
物質の存在または存在量の指標として使用し、この場
合、標識試薬は、上記物質またはそれに対する特異的結
合パートナーおよび所望により上記酵素と、金ゾルの金
粒子の少なくとも75重量％は平均直径20ナノメーター未
満である金ゾルとの超凝集複合体からなる方法を提供す
る。
標識試薬が固定化される固相はまた、不活性とし、標
識試薬の結合型をその物理的捕捉によって固定化し、た
とえば固相中の細孔は標識試薬の結合型を通過させず、
一方非結合標識試薬はこの細孔を通過させるようにする
こともできる。
本明細書で用いられる「被検物質類縁体」の語は、ア
ッセイ条件下に、被検物質に対する特異的結合パートナ
ーに特異的に結合できる任意の化合物種を指すものと理
解され、したがってその範囲には、さらにある量の被検
物質も包含される。
完全に球形でなくてもよい粒子の平均直径とはその粒
子の最大径と最小径の平均である。超凝集複合体を形成
する金粒子の少なくとも75重量％は平均直径5nm未満で
あることが好ましく、金粒子の少なくとも80％が上記限
界未満であることがとくに好ましい。粒子の平均直径の
下限は1nmとするのが便利である。Janssen Life Scienc
es Productから組織染料として市販されている製品Coll
oidal Gold Sol G5のあるバッチが有用なことが証明さ
れている。ある特定のバッチでは、粒子の85％が直径5n
m未満で、平均直径4.5nm、ガウスの分布は1.1〜7.6nmで
あった。平均直径２〜4nmの範囲の金ゾルはまた、既知
の技術のわずかな改良たとえば、Slot ＆ Geuze（Eur.
J.Cell.Biol.38:87−93,1985）の操作におけるタンニン
酸濃度の変化により、作成するのが便利である。本発明
者らによれば、平均直径４〜4.5nmの粒子が好ましいこ
とが見出されている。
超凝集複合体は、金ゾルと標識すべき試薬（蛋白質）
から、両者の所望の量を溶液中で混合し、酸たとえば酢
酸を最終濃度約10mmol/になるように添加してpHを１
〜５、好ましくは３〜４、さらに好ましくは3.5に調整
し、生成した肉眼で見える凝集体を濾過と洗浄、または
別法として遠心分離と再懸濁の反復によって集めること
により、形成される。肉眼で見える凝集体を、pH中性の
たとえば２重量％ウシ血清アルブミン（BSA）含有媒体
に、所望により超音波処理して、再懸濁させる。この肉
眼で見える凝集体は、驚くべきことに、直ちに消失し、
安定な超凝集金−蛋白質複合体を生じる。
超凝集コロイドはまた、一部の蛋白質とは、コロイド
が蛋白質に対してモル過剰であることおよび用いた蛋白
質が現実に使用されたpHにおいて陽性に荷電した基をあ
る数（＞２）示すことを条件に、中性pHでも形成され
る。しかしながら、通常は酸性のpHが最良の結果を与え
る。
本発明の方法で使用される超凝集複合体のサイズは、
50〜5000nmであることが好都合であり、好ましくは50〜
500nm、最も好ましくは100〜200nmである。複合体あた
りの金ゾル粒子の数はその粒子径および複合体サイズに
依存することが明らかであるが、一例を示せば、5nmの
粒子が介在する蛋白質によって10nmの間隔で配置され
る。この場合、50nmの複合体は約15個の粒子を、5000nm
の複合体は約2000万個の粒子を含有することになる。20
0nmの複合体は約1000個の粒子を含有することが観察さ
れ、これは粒子間隔10nmの配置に相当する。
上述の方法で得ることができる超凝集金複合体、およ
びその形成方法は新規であり、これらは本発明のさらに
他の態様を作成する。
上述の方法とは異なり、蛋白質と金の接合を行う通常
の方法では、蛋白質は、その蛋白質のpIに近接するpHの
低塩媒体に移される。通常、pHはpIより1pH単位高くす
ることが推奨される。この状態では、蛋白質は最小の陽
性に荷電した化学基を有する。この溶液を、大量の電子
の表面局在化があると考えられる金コロイドと一緒に混
合しても、蛋白質とコロイドの間にはわずか数個の結合
が確立されるにすぎない。この場合、多重の蛋白質とコ
ロイドの間のブリッジの形成は回避され、コロイドは蛋
白質分子に被覆された単一粒子として溶液中に保持され
ることになる。
蛋白質溶液中のpHを低下させると、各蛋白質分子上の
正荷電基の数が増大する。すなわち、蛋白質とコロイド
の間に可能なイオン結合の数が増大し、多重ブリッジの
形成および肉眼で見える凝集体の形成を招来する。これ
は通常、避けねばならない極めて好ましくない状態と考
えられていた。しかしかながら、本発明においては、こ
の効果が利用される。さらに蛋白質の添加を行うと、肉
眼で見える凝集体は驚くべきことに溶消し、蛋白質と金
コロイドの均一なサイズの超凝集体の溶液が残るのであ
る。コロイドは蛋白質分子によって間隔を置いて配置さ
れるので、各凝集体中で表面は著しく増大していると考
えられる。金属コロイドによって形成される発色はコロ
イドの表面に関連した物理現象と考えられるから、シグ
ナルの大量の増大は多分、超凝集複合体あたりの総面積
の相当する大量の増大によって引き起こされるものであ
ろう。
本発明によって実現される改良を例示すれば、固体マ
トリックス上に固定化された被検物質に対する結合パー
トナーを含有する超凝集複合体を用いた場合の発色強度
はWO 89/06801による4nm金−抗体接合体を用いた場合に
認められる発色に比し、使用した特定の系に応じて５〜
30倍に増大させることができる。
２種以上の蛋白質分子を含有する超凝集金複合体を形
成させることも可能で、したがって、本発明のアッセイ
法の融通性および感度を増大させるためには多くの選択
が可能である。一つの可能性には、被検物質を結合でき
る物質（またはその特異的結合パートナー）と特徴的な
反応を起こすことができる酵素を超凝集複合体に凝集さ
せることがある。これは、金ゾルの発色を検出もしくは
測定することにより、および／または酵素を基質に暴露
し、酵素によって生じた発色を検出もしくは測定するこ
とにより、被検物質の存在または存在量を決定する可能
性を与える。金ゾルの発色が測定可能な検出限界以下の
場合には、酵素により適当な基質との延長インキュベー
ションで測定可能な発色を得ることができる。適当な酵
素の例には、アルカリホスファターゼおよびペルオキシ
ダーゼたとえば西洋ワサビペルオキシダーゼがある。金
ゾルの発色が被検物質測定の検出限界以下の場合には、
金ゾル超凝集体は、とくに緩和な型の蛋白質−蛋白質架
橋として作用し、これは、ある環境においては、慣用の
共有結合架橋に比較して有利である。
また、異なる標的分子に結合できる２つの物質を含む
超凝集複合体を形成させることもできる。たとえば、一
方は被検物質に対する抗体（Ab1）、他方は異なる抗原
に対する抗体（Ab2）である。複合体がAb1を介して、そ
れ自体直接または間接的に固体支持体に結合した被検物
質に結合させ、ついで全体を、抗体Ab2に対する抗原（A
g2）を含む別の超凝集複合体に暴露すると、第一の複合
体の周囲に第二の複合体のクラスターを生じ、総金ゾル
発色が増大することになる。この過程は所望により次の
段階に継続することも可能で、たとえば第二の複合体に
２つの抗原Ag2およびAg3を含有させれば、後者はそれに
対する抗体（Ab3）を含むさらに別の複合体の付着点と
して働くことになる。
他の受容体−リガンド対、たとえば（ストレプト）ア
ビジンとビオチン、酵素と酵素インヒビター、レクチン
と糖蛋白質、プロテインＡと免疫グロブリン等も、もち
ろん、このような増幅系として想定することができる。
この系はまた、一方は固定化された被検物質受容体に
結合可能で、両者ともそれぞれ少なくとも２種類の一方
が他方の凝集体と相互作用する多重反応基をもつ２つの
ハイブリド凝集体を同時に添加することにより、凝集体
の成長する複合体を形成させることもできる。この結果
は、物質が固定化された被検物質を有する流出系に添加
されれば、用量依存性に形成できる凝集体のネットワー
クが生成することになる。
被検物質抗原と反応する抗体で凝集する金コロイド
は、被検物質の添加によって凝集させることができる。
この反応は遅いかもしれない。増幅は、金コロイドおよ
び被検物質抗原Ag1に対して反応する第一の抗体Ab1、な
らびに第二の抗体Ab2に基づく第一のハイブリド凝集体
の形成によって達成できる。Ab2と反応する多重抗原Ag2
をもつ第二の凝集体が添加され、凝集反応が加速される
ことになる。
本発明の方法は、被検物質の検出またはアッセイのた
めの任意の固相系に適用することができる。代表的なも
のとして、以下の種類のアッセイを挙げることができ
る。
1. 成分Ａが固体支持体に結合されているサンドイッチ
アッセイ。被検物質Ｂを含む試験溶液を添加すると、Ｂ
はＡに結合する。金標識成分Ｃを加えると、ＣはＢに結
合するから、コロイド金は固定化され、固体支持体が発
色する。
成分Ａ、ＢおよびＣはすべて、受容体−リガンド型で
あり、ＡとＣはいずれもＢと相互作用するが、ＡとＣは
互いに直接は結合しない。
2. 被検物質Ｂを含む試験溶液を金標識成分Ｃと混合
し、成分Ａが結合した固体支持体に添加するほかは、１
と同じサンドイッチアッセイ。
3. 成分Ａが固体支持体に結合されている競合的アッセ
イ。被検物質Ｂを含む試験溶液は既知量の金標識被検物
質Ｂと混合し、固体支持体に加える。Ｂと金標識ＢはＡ
との結合において競合し、固体支持体上でのコロイド金
の発色の低下は試験溶液中の被検物質Ｂ量の増加を指示
する。
4. 試験溶液と金標識Ｂを順次添加するほかは、３と同
じ競合的アッセイ。
5. 過剰の成分Ａをコロイド金で標識し、未知量の被検
物質Ｂを含む試験溶液と混合する。するとＡとＢがカッ
プリングする。混合物を成分Ｂが固定化されている多孔
性指示体上に加える。残った非結合標識Ａは固体支持体
上に固定化されたＢにカップリングする。
6. 被検物質Ｂを金標識成分Ｃと、所望により１種以上
の被検物質Ｂに対する他の結合パートナーとともに反応
させ、複合凝集体を形成させる。反応混合物を不活性濾
過媒体を通して拡散させる。この濾過媒体の孔部は複合
凝集体の通過には小さすぎるが過剰の金標識成分Ｃの通
過には十分大きい。
標識試薬を固定化させる固相または固体支持体は、多
くの形態とすることができる。以下はその例示である。
−任意の多孔性パッドで被覆されていてもよいプラスチ
ックスチック、スチックは、アッセイの様々な工程を実
施するために反応溶液に浸漬することができる。
−試験管の壁部、ミクロタイタープレートのウエルまた
は他の任意の適当な反応チャンバーの壁部。
−多孔性材料、好ましくは反応溶液が両方向または一方
向に通過して拡散できる膜。濾過原理を使用する場合に
は、この種の材料は過剰の試薬の通過を有利に許容し、
このような過剰の液体の吸収剤と組合せるのが便利であ
る。
−遠心分離、濾過または、ビーズが強磁性化合物を含有
する場合には、磁性で単離できるビーズ（ミクロスフェ
アを包含する）。
被検物質類縁体またはアッセイされる被検物質に対す
る特異的結合パートナーの支持体へのカップリングは、
共有結合、静電力もしくは疎水結合またはそれらの方法
の組合せによることができる。このような方法は本技術
分野においては、十分に確立されている。
本発明の方法は、たとえば、以下のリガンド−受容体
対から選択できる広範囲の被検物質の検出またはアッセ
イに使用できる。すなわち、抗原／抗体、ハプテン／抗
体、ホルモン／ホルモン受容体、糖／レクチン、ビオチ
ン／アビジン（ストレプトアビジン）、プロテインA/免
疫グロブリン、酵素／酵素補因子、酵素／酵素インヒビ
ターおよび核酸対（DNA−DNA、DNA−RNAまたはRNA−DN
A）である。このような反応パートナーの少なくとも１
つを他の分子と結合または複合体化させる。ビオチンも
しくはアビジンまたは広範囲の抗体を他の分子にカップ
リングさせ、後者のアッセイ手段が提供される。たとえ
ば、特異的核酸プローブはビオチン化ヌクレオシド三リ
ン酸の導入を介して標識できる。このようなプローブ
は、被検物質DNAまたはRNAに結合後、ついで金ゾルで標
識されたアビジンまたはストレプトアビジンの使用によ
り検出またはアッセイすることができる。
一般に、被検物質が上に掲げられたものの一つである
場合には、本発明の方法に使用される結合パートナー
は、その対の他の成分とする。被検物質が固定化結合パ
ートナーおよび金ゾルで標識された結合パートナーの両
者に結合するサンドイッチ系においては、結合パートナ
ーは同種でも異種でもよい。結合パートナーはそれぞ
れ、被検物質の、異なる十分間隔を置いて配置された決
定基に対する抗体試薬であることが好ましい。
本明細書で用いられる「抗体」の語は、その範囲内
に、 （ａ）慣用の任意の動物に由来する任意の様々なクラス
またはサブクラスの免疫グロブリン、たとえばIgG、Ig
M; （ｂ）モノクローナル抗体；ならびに （ｃ）抗原結合部位を残しているモノクローナルまたは
ポリクローナル抗体のフラグメント、すなわちFc部分を
欠くフラグメント〔たとえばFab、Fab′、Ｆ（a
b′）２〕または完全な抗体のＨ鎖成分を連結するジス
ルフィド結合の還元的切断によって得られるいわゆる
「半分子」フラグメント を包含するものと理解すべきである。
以下は、本発明の方法によって検出または定量できる
免疫原の種類の、非限定的な一覧表である。
本発明の方法によるアッセイに特に興味ある被検物質
は、免疫グロブリンたとえばIgGによって結合されるフ
ィブリン分解生成物例えばD2のような血液蛋白質、ヒト
Ｃ−反応性プロテイン、クレアチンキナーゼアイソザイ
ムおよびミオグロビンである。
被検物質溶液は、そのまま使用しても、また適当な緩
衝溶液で希釈してもよい。金ゾルプレパレーションも適
当な緩衝溶液を用い、様々に希釈して調製できる。希釈
度は、アッセイ操作の完了時に、所望の強度（すなわ
ち、光学密でまたは反射）の発色を与えるように選択さ
れる。アッセイに先立って、過剰の試薬を除去するため
に例えば緩衝液で支持体を洗浄し、バックグランドの発
色を低下させることが望ましい。
アッセイが固定化支持体上に保持された金ゾルの総量
に基づく場合には、発色はリフレクトメーター、デンシ
オメーターまたは類似の装置で評価できる。
アッセイにおける結合パートナーの一つまたは被検物
質類縁体を固定化するために使用される支持体は、たと
えばシアノゲンブロミドのような試薬で活性化されたニ
トロセルロース、濾紙もしくはセルロースアセテート、
および三級アミノ基の導入により修飾されたナイロンで
ある。このような支持体は多孔性膜の形態で使用するの
が便利である。
本発明のとくに好ましい方法においては、不活性支持
体はたとえば、容易に蛋白質を吸収し、液体の通過を許
容する孔部を有するHybond N（Amersham International
から市販されている）のようなナイロン膜である。セル
ロースの吸収紙のような吸収パッドを膜の一方の側に置
くのが有利であり、好ましくは白い、液体非透過性シー
トをパッド上に置く。類似の液体非透過性シートを膜の
他の側に置き、このシートにはたとえば幅約3.5mmの孔
をあけ、膜への被検物質溶液およびアッセイ液の適用を
可能にする。まず、膜に被検物質に対する結合パートナ
ーの既知量を含む水性溶液の少量たとえば約２μを適
用し、ついでたとえば室温で放置して乾燥させて、膜を
活性化する。被検物質を含む水性溶液の既知容量たとえ
ば約25μをついで膜に適用し、下部の吸収パッドに通
過させる。ついで、最初に膜に適用した結合パートナー
と同種でも異種でもよい被検物質に対する結合パートナ
ーで標識されたコロイド金ゾル粒子の既知量を含む水性
溶液、たとえば25μを適用し、膜を通過させる。
金ゾル試薬を洗い流してバックグランドの発色を最小
限にするために、所望により、小容量の水または緩衝液
を適用することもできる。膜上に固定化された金ゾルの
量を、ついでレフレクトメーターによりまたはカラース
ケールとの比較により肉眼で測定する。
上に掲げた操作方法（６）においては、膜は、その唯
一の機能はフィルターとして働くことである限りにおい
て不活性である、所望の多孔性を有するシート材料とす
る。被検物質の成分Ｃとの凝集は、架橋をもたらす被検
物質への２種以上の結合パートナーの包含によって増強
され、さらに大きな凝集体を招来する。また、成分Ｃ
は、ビーズたとえばDynospheres（Dynal A/S,Oslo,Norw
ay）のような単一分散ビーズ上に固定化された被検物質
に対する結合パートナーとすることもできる。
本発明はまた、（ａ）サンプル中の被検物質の存在ま
たは存在量の指標を与える標識試薬の固定化を生じる固
相、および（ｂ）標識試薬からなり、標識試薬は被検物
質に特異的に結合できる物質またはその特異的結合パー
トナーと、金ゾルの金粒子の少なくとも75重量％は平均
直径20ナノメーター未満である金ゾルとの超凝集複合体
から構成されることを特徴とする、本発明の方法を実施
するためのキットを包含する。好ましい形態のキット
は、（ａ）被検物質類縁体もしくは被検物質に対する特
異的結合パートナーまたは被検物質と１種以上の他の試
薬の固定化のための固体支持体、（ｂ）上記非比検物質
類縁体または結合パートナー、および（ｃ）被検物質に
特異的に結合できる分子またはそれに対する特異的結合
パートナーと、金ゾルの粒子の少なくとも75重量％は平
均直径20ナノメーター未満である金ゾルとの超凝集複合
体から構成される試薬からなる。特徴的反応を起こすこ
とができる酸素が超凝集複合体中に包含される場合に
は、キット中に酵素基質の供給も含まれる。
キットに含有される固相は、所望により、あらかじめ
被検物質類縁体または被検物質に対する特徴的結合パー
トナーを支持体にカップリングさせることにより、使用
者がそのまま被検物質と接触させることができる固体支
持体とすることができる。一部のアッセイには、このよ
うなキットに標準量の標準物質、標準量のそれに対する
特異的結合パートナー、および金ゾル試薬を包含させる
ことができる。標準量の被検物質もしくは特異的結合パ
ートナーまたは試薬は、水溶液の形態にできるが、使用
時に溶解するようにした凍結乾燥プレパレーションの形
態にする方が通常である。アッセイの一形態では、上記
（６）の方法の場合のように、固体支持体は不活性な多
孔性膜とし、これは被検物質と結合パートナーの凝集型
の複合体を保持するが、金ゾル試薬は拡散させる働きを
する。このような系においては、被検物質複合体のサイ
ズは、上述の結合パートナーまたは被検物質類縁体を上
述のようよ比較的大きい粒子たとえばDynospheresに付
着させて提供することによって増大させることができ
る。
以上の説明および以下の例はもっぱら受容体−リガン
ドアッセイに集中して述べるが、この新規な超凝集複合
体は、金コロイドの適用が見出されている領域での広範
囲の他の使用が可能であることを理解すべきである。す
なわち、サンプル中の存在が疑われる化合物に対する抗
体または他の結合物質に連結する場合には凝集体はブロ
ッティング技術に使用できるし、それらは光学もしくは
電子顕微鏡用の組織片の染色または他の染色技術に有用
であり、遠心分離においてはマーカーとして有用であ
り、凝集アッセイにおいては現在用いられているラテッ
クス粒子の代わりに使用できる。超凝集複合体が現在使
用されている他の種類の粒子を置換できる他の応用例
は、本技術分野の熟練者には、容易に想定できよう。
以下の実施例は本発明を単に例示するものである。
例１ 平均直径4nmのコロイド金は、Mulphfordt（1982）,Ex
perientia 38,pp 1127−1128の記載と同様に製造した。
フィブリン分解生成物Ｄ−ダイマーに対して作られる
マウスモノクローナル抗体S4H9は通常のハイブリドーマ
技術により開発し、抗体はマウス腹水中で産生させて、
最終的に精製した。使用前に、精製抗体を蒸留水に対し
透析し、濃度1.5mg/mlに調整した。
540nmにおける光学密度40（コロイド懸濁液の希釈に
より評価）の金コロイドの懸濁液を使用した。懸濁液
は、使用前に、遠心分離、上清の90〜95％の除去、およ
び蒸留水中への再懸濁によって調製した。この溶液25ml
に酢酸を最終濃度10mmol/になるように加えてpHを約
3.5とし、ついで直ちに抗体S4H9の透析溶液15mlを添加
した。混合物を20分間撹拌した。肉眼で見える凝集体が
直ちに出現した。20分後に懸濁液を5000×ｇで10分間遠
心分離した。上清を除去し、沈降した凝集体を蒸留水に
再懸濁し、最終容量を40mlとした。10％ウシ血清アルブ
ミン（BSA）溶液10mlを加えた。懸濁液を氷上で冷却
し、ついで約15秒間穏やかな超音波処理を行った。大容
量の場合は流動系で超音波処理を行うのが好ましい。懸
濁液を４倍に希釈して最終容量200mlとし、0.22μｍの
フィルターで滅菌濾過し最終的に20mmol/ NaClに調整
した。電子顕微鏡により、コロイドは直径100〜200nmの
クラスターとして存在することが明らかにされた（図
１）。
懸濁液は0.22μｍのフィルターを通過したが（＝220n
m）、着色コロイドは直径100nmおよび50nmのフィルター
では完全に捕捉された。
標準接合体は、Slot ＆ Geuze（Eur.J.Cell.Biol.38:
87−93,1985）の記載に従い、抗体に対する標準標識方
法を用いて作成した。この操作では、pHは接合条件下に
抗体のpI近くに保持されていたので、凝集体は形成しな
かった。生成した接合体における金と抗体の比は1:1と
測定され、金粒子は溶液中にランダムに分布しているこ
とが、電子顕微鏡によって確証された（図２）。
接合体は以下の試験デバイスで試験した。
すなわち、孔径0.6μｍのニトロセルロース膜の１×1
cm片を、0.28mmの厚の白色ポリ塩化ビニル（PVC）片の
下に置き、膜の上方のポリ塩化ビニルの中央に3.5mmの
孔を開けた。膜は両面テープを用いてプラスチックに付
着させた。付着した膜とともにPVC片をついで、セルロ
ースペーパーの1mm厚のパッドに、膜によって覆われて
いないテープ領域で付着させた。このデバイスの下部
を、両面テープを用いてパッドに固定された0.40mm厚の
PVC片によって密閉した。この構造体により、液体が上
部PVC片の孔部を通過し、膜を通過し、パッドに蓄積す
ることが可能になる。抗体S4H9の3.0mg/ml溶液２μを
加えて膜を活性化し、膜を乾燥させたのちさらに使用す
る。
Ｄ−ダイマーを含有することがわかっている血漿サン
プル25μを、試験デバイス中の平行孔部の膜表面に適
用した。約20秒後に、血漿は膜を通過し、パッドに到達
した。凝集型金接合体25μおよび非凝集型金接合体25
μを２列の平行孔部のそれぞれに添加した。この液体
が膜を通過したならば、0.15mmol/ NaClを加えて過剰
の接合体を洗い流した。対照として、正常の低レベルの
Ｄ−ダイマーを含むことがわかってする血漿を、２種の
接合体を用いて操作に付した。結果は、IBM PCに接続
し、Macbethのソフトウエアプログラムを使用したレフ
レクトメーター（Color Eye,Macbeth）により機械的に
読み取った。
得られた結果は、Ｄ−ダイマーが低レベルの正常血漿
で生成した発色が540nmで＜0.18の等しい低反射を生じ
ることを示した。非凝集接合体で生成した発色は一般に
弱く、一方、凝集接合体で生成した発色は反射値から判
断して約10倍強力であった。結果は、新規な型の接合体
は通常の接合体に比べて著しく強い最終結果を生じるこ
とを示している。バックグランドシグナルは凝集によっ
て影響されなかった。
さらに、濾過試験は、凝集金コロイドのサイズは100
〜200nmの範囲であったことを示した。これは電子顕微
鏡によって確証された。
例２ この例では、凝集接合体が超音波を用いないさらに簡
単な方法でも形成されることを明らかにする。
金コロイド、試験デバイスおよび抗体は、例１の記載
と同様にして作成した。金コロイド懸濁液は、記述のよ
うに、酢酸を用いて、pH3.5に調整されたレベルに調製
した。pH調整コロイド懸濁液25mlを、S4H9の1.5mg/ml溶
液12.5mlに加えた。20℃に25分間置いたのち、懸濁液を
pH9.0に調整した10％BSAの溶液に加えた。BSAの最終濃
度は0.2％であった。懸濁液をついで40mmol/トリス塩
酸塩（pH7.3）に調整した。懸濁液を一夜撹拌放置する
と、肉眼で見える凝集体は消失し、懸濁液は0.22μｍサ
イズの孔部をもつ滅菌フィルターを通過したが、100nm
のフィルターは通過しなかった。電子顕微鏡により凝集
体の形成は明らかにされたが、例１に記載の操作による
ほど緊密にはパックされていなかった。例１のスキーム
に従った試験により、シグナルは通常の非凝集接合体に
比較して約５倍増大したことが明らかにされた。
例３ 金コロイド懸濁液をNaClに5mmol/になるうに加え、
使用前に４℃において14日間保存したほかは、例１の操
作を反復した。この操作では、金コロイドは、さらに顕
著な形式の凝集体を形成させる。接合体を例１のスキー
ムに従った試験したところ、発色シグナルは、非凝集金
を用いて得られたシグナルに比べて約30倍強力であっ
た。バックグランドシグナルはわずかに上昇し、形成し
た凝集体はより大きな直径を有することが指示された。
例４ この例では、ある種の抗体が金コロイドと中性に近い
pHで凝集体を形成できることを示す。このような凝集体
の使用で得られるサイズおよびシグナル強度は、接合操
作における蛋白質と金の比率を変動させることによって
調整できる。
ヒト血清アルブミンに特異的な、2D2と命名されたマ
ウスモノクローナル抗体は、よく知られたハイブリドー
マ技術を用いて開発された。この抗体の産生はマウス腹
水法を用いて高め、抗体を精製し、2mmol/のリン酸ナ
トリウム緩衝液（pH6.8）に対して透析した。抗体の最
終濃度は1.0mg/mlであった。
金コロイドは例１の記載のようにして作成した。コロ
イド懸濁液は540nmにおける光学密度40に調整した。
抗体溶液および金コロイド懸濁液を次の割合、すなわ
ち１＋２、１＋2.2、１＋2.5、１＋３、１＋3.5で混合
した。
20℃に25分間置いたのち、溶液に等容量の１％BSA溶
液を加えた。
接合体は例１に記載のデバイスで試験した。膜は、ヒ
ト血清アルブミンに対する別のマウスモノクローナル抗
体（2D3）の3.0mg/ml溶液２μの添加によって活性化
した。膜は使用前に乾燥させた。
アルブミンをそれぞれ、０（対照）、10、25、50、10
0および200mg/を添加したヒト尿サンプルを、0.15mol
/のNaCl中に１＋20の比率で希釈した。各希釈液25μ
を試験デバイス中の５つの平行孔部に加えた。希釈サ
ンプルが膜に吸収されたならば、それぞれの接合体１滴
を各平行シリーズの各孔部に加えた。最後に、0.15mol/
のNaClを１滴加えて膜を洗浄し、各孔部につき、例１
に記載のようにレフレクトメーターによって測定した。
結果は図３に示す。図３は、抗体の量が増加すると、
得られるシグナルが著しく増大することを示している。
いずれの場合も、溶液中に遊離の（金粒子に接合してい
ない）抗体は認められなかった。これから、また反射値
の相対的増加から、シグナルの増大は反応する抗体の数
だけの増大では説明できない。50nmフィルターでの実験
でも、１＋２の比での接合体はほとんどフィルターによ
って捕捉されたが、１＋3.5の比での接合体は自由に通
過した。すなわち、シグナルを作る能力が増大した凝集
体は中性に近いpHで抗体2D2によって形成されていたの
である。
例５ 抗体を、Ｃ−反応性蛋白質に対するモノクローナル抗
体T11G8で置換したほかは、例１の操作を反復した。抗
体の濃度、抗体に対する溶媒、コロイド金、および全操
作は、例１と同じである。濾過試験では200nmフィルタ
ーを通過したが、50nmまたは100nmのフィルターは通過
しなかった。
比較のために、標準接合体を、T11G8のpIに近いpH6.5
に保持して作成した。この接合体は50nmのフィルターを
容易に通過し、凝集体は形成されていなかったことを示
した。これは電子顕微鏡でも確証され、最終精製物中に
はわずかな金コロイドのクラスターを認めるのみであっ
た。
２種の接合体を、例１に記載のものと類似のデバイス
で試験した。Ｃ−反応性蛋白質に対するモノクローナル
抗体G405の3.0mg/ml溶液２μを加えて膜を活性化し、
使用前に膜を乾燥させた。Ｃ−反応性蛋白質を含有する
ことがわかっている希釈血漿サンプル25μを、プラス
チックのカバー中の開口部を通して膜の各片に適用し、
ついで２つのいずれかの型に調製された接合体の溶液25
μ、さらにバックグランド発色を除去するため１滴の
0.15mol/ NaClを加えた。
図４は32mg/mlのCRPを含む血漿の1:50〜1:800希釈系
列によって得られた結果を示す。希釈液は0.15mol/ N
aClとした。図から明らかなように、２種の接合体は膜
に対してかなり異なる染色強度を示し、凝集した接合体
ではシグナルは10倍以上の増大を生じた。
両接合体を４℃に９カ月保持して、定期的に試験し
た。この期間の保存後に性質の変化した接合体はなく、
凝集接合体が極めて安定であることを示した。
例６ 抗体T11G8を精製ウサギ抗−ヒト血清アルブミン（抗
−HSA）で置換して、上記実験を反復した。得られた接
合体は、モノクローナル抗−HSA抗体でコートした膜を
含むデバイスで、例１および５と同じ操作を用いて試験
した。結果は、アルブミンを含むことがわかっている希
釈尿を適用した場合、凝集接合体では慣用の非凝集接合
体に比較して発色シグナルが約８倍の増大を生じたこと
を示した。
例７ 凝集接合体は抗体以外の蛋白質を用いても形成でき
る。この場合は、抗体をウシ血清アルブミンで置換し、
例１の金コロイドおよび凝集接合体の製造操作を反復し
た。使用したアルブミン濃度は、抗体の場合と同じ1.5m
g/mlとした。抗体凝集体と同じ様な性質を有する凝集体
がフィルターに形成した。アルブミン凝集コロイド金を
電子顕微鏡で調べたところ、例１で形成したのと同じク
ラスター化コロイドのランダムな分布が認められた。
例８ コロイド金に凝集型に接合できる他の抗体以外の蛋白
質はプロテインＡである。他の蛋白質の場合と同じ1.5m
g/ml濃度のプロテインＡを用い、例１と同様に操作し
た。得られる凝集接合体、ならびに慣用の非凝集体を、
例１に記載したと同じデバイスで試験した。膜は、ヒト
血清アルブミンに対するモノクローナルIgG抗体でコー
トした。プロテインＡは免疫グロブリンと直接反応する
ので、２種の接合体の様々な希釈液の添加は、接合プロ
テインＡの等量の添加時に慣用の接合体で得られたシグ
ナルより約12倍強いシグナルを生成した。
例９ 本例では、結合およびシグナル形成にそれぞれ使用で
きる２種の異なる蛋白質を含有するハイブリド凝集体の
形成を示す。金粒子に酵素アルカリホスファターゼ（AL
P）をウサギ抗−マウスIgGとともに共接合させる。この
ような接合体は、金染色を直接観察するかまたはELISA
様式で酵素を利用するかいずれかでの、マウスIgGの検
出を可能にする。
酵素（ALP）および抗体は、10mmol/酢酸で平衡化し
たPD−10カラム上ゲル濾過して脱塩し、ついで重量比1.
5:1（酵素：抗体）で混合した。ついで蛋白質混合物を1
0mmol/酢酸中金コロイドに接合し、２種の蛋白質の重
量の合計を例１に記載の蛋白質：金比にした。超凝集し
て沈降した接合体はそのまま沈降させ、超音波処理し、
ウシ血清アルブミン（BSA）でブロックし、最後に滅菌
濾過した。全操作は約１時間を要した。
図５は、得られたハイブリド接合体の検出限界（dete
ction potential）を示す。接合体の希釈液を直径3.5mm
の円形に均一に分布させたニトロセルロース上に直接ド
ットした。金染色はレフレクトメーターを用いて測定し
た。ニトロセルロースをついでブロモクロロインドリル
ホスフェート（BCIP）を含有するアルカリホスファター
ゼ基質溶液に移した。穏やかに振盪しながら30分間イン
キュベート後、BCIPへのALPの作用による暗紫色の生成
物がニトロセルロース上に沈殿した。図５は、金染色で
得られたよりもさらに10倍への感度の上昇が、この酵素
活性の任意の使用によって達成されたことを示してい
る。
図６はニトロセルロース上にドットしたマウスモノク
ローナルIgGの、ハイブリド接合体の２つの任意の標識
を用いた検出を示す。100μg/ml BSA中に希釈した総計
0.1〜100ngの抗体をニトロセルロース上に重複してドッ
トした。ニトロセルロースを乾燥させ、BSAでブロック
し、0.1％ツイーン20の存在下に接合体と20分間インキ
ュベートした。一方のブロットは酵素基質（BCIP）溶液
に移し、上述のようにインキュベートした。発色させた
ブロットは、金染色を用いれば1ngの抗体が検出できる
こと、一方、酵素を用いれば0.1ngが検出できることを
示した。酵素染色は、金染色に比較して、全体的に感度
の約15倍の上昇を与えると考えられる。
例10 この例では、コロイド金と２種の異なる蛋白質を含有
するハイブリド超凝集体の形成を例示する。一方の蛋白
質は被検物質に対する特異的結合パートナーであり、第
二の蛋白質は反応に関与しないか、またはサンプルもし
くは試薬中には他の場合存在しない。このハイブリド超
凝集体は、コロイド金と上記第二の蛋白質に対する特異
的結合パートナーを含有する第二の超凝集体の添加によ
り、アッセイの感度をさらに上昇させるために使用でき
る。
フィブリン分解生成物Ｄ−ダイマーに特異的な、モノ
クローナル抗体S4H9（1mg/ml）でニトロセルロース膜を
コートし、ニトロセルロースを例１に記載した試験デバ
イス中に置いた。50mg/ml BSAを含む0.1mol/トリス塩
酸塩緩衝液（pH7.4）に溶解した、Ｄ−ダイマーを０〜8
mg/の濃度範囲で含有するプレパレーションを適用し
（50μ）、膜を通して浸み込ませた。固体化抗体によ
って捕捉されたＤ−ダイマー分子をついで、4nmコロイ
ド金、S4H9、およびヒト血清アルブミン（HSA）の超凝
集体を含有する溶液50μを適用して可視化した。この
超凝集体は1:1（w/w）比のS4H9とHSAを用い例１と同様
にして調製した。膜を洗浄し、膜上に残ったコロイド金
のシグナル強度をレフレクトメーターを用いて測定し
た。コロイド金とモノクローナル抗体2D2の第二の超凝
集複合体は例４の記載と同様にして調製した。第二の超
凝集体をニトロセルロースに適用し、凝集体は、第一の
超凝集体中に存在するHSAと第二の凝集体中の抗体2D2の
間の結合によって固定化された。膜を洗浄し、得られた
シグナルはレフレクトメーターを用いて測定した。第二
工程後に得られたシグナルは第一工程後に得られたシグ
ナルの４倍の強度を示すことが明らかにされた。
図７は、サンプル中のＤ−ダイマーを増量して得られ
た用量−反応曲線を例示する。
フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/543 G01N 33/532 G01N 33/553

Claims (16)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】蛋白質と金粒子の少なくとも75重量％は平
    均直径20ナノメーター未満である金ゾルとの超凝集複合
    体を製造するにあたり、（ｉ）蛋白質と金ゾルを、蛋白
    質分子が少なくとも２個の陽性に荷電した基を示すpHで
    混合し、（ii）形成した肉眼で見える凝集体を集め、
    （iii）肉眼で見える凝集体をpH中性の媒体中に、所望
    により超音波処理して、再懸濁して安定な超凝集複合体
    の懸濁液を形成させる各工程からなる方法。
  2. 【請求項２】工程（ｉ）のpHが１〜５である請求項１記
    載の方法。
  3. 【請求項３】請求項１または２記載の方法で得られる、
    蛋白質と金粒子の少なくとも75重量％が平均直径20ナノ
    メーター未満である金ゾルとの超凝集複合体。
  4. 【請求項４】被検物質に特異的に結合できる物質または
    その特異的結合パートナーに結合した金ゾルからなる標
    識試薬を固相に結合型として固定化させ、サンプル中に
    おける被検物質の存在または存在量の指標を提供させる
    ことによる試験サンプル中の被検物質の定性的または定
    量的測定方法において、標識試薬は請求項３記載の金ゾ
    ルの超凝集複合体からなることを特徴とする方法。
  5. 【請求項５】超凝集複合体のサイズが50〜5000nmである
    請求項４記載の方法。
  6. 【請求項６】上記サンプルは水性アッセイ媒体中、
    （ｉ）固体支持体上に固定化された被検物質類縁体また
    は被検物質に対する特異的結合パートナー、および（i
    i）請求項４に定義した超凝集複合体からなる標識試薬
    と接触させ、この場合上記支持体上に、サンプル中の上
    記被検物質の存在または存在量を指示する発色変化を直
    接的または間接的に提供する量の上記標識試薬が固定化
    される請求項４記載の方法。
  7. 【請求項７】金ゾルの金粒子の少なくとも75重量％は平
    均直径５ナノメーター未満である請求項４〜６のいずれ
    か一項記載の方法。
  8. 【請求項８】競合的アッセイを実施する請求項４〜７の
    いずれか一項記載の方法。
  9. 【請求項９】サンドイッチアッセイを実施する請求項４
    〜７のいずれか一項記載の方法。
  10. 【請求項１０】固相は蛋白質を容易に吸着し、液体の通
    過を許容する孔部を有する不活性膜である請求項４〜９
    のいずれか一項記載の方法。
  11. 【請求項１１】超凝集複合体が、基質に暴露した場合特
    徴的な反応を生じる酵素を含めた２種またはそれ以上の
    蛋白質のハイブリド複合体である請求項４記載の方法。
  12. 【請求項１２】超凝集複合体が２種またはそれ以上の蛋
    白質のハイブリド複合体であり、発色の増幅が上記第一
    のハイブリド複合体に結合できる１種またはそれ以上の
    別の超凝集複合体の添加によって達成される請求項４記
    載の方法。
  13. 【請求項１３】固相が膜であり、その膜上に吸収パッド
    を置き、膜から離れて吸収パッドの表面に液体非透過性
    シートを置きそして吸収パッドから離れた膜の表面にそ
    の中に１個以上の孔を有する液体非透過性シートを置
    き、そこで試験サンプルおよび試薬を上記孔の１つに順
    次適用し次いでそれらを膜を介して吸収により吸収パッ
    ド中に両方向に拡散させる請求項４記載の方法。
  14. 【請求項１４】（ａ）サンプル中の被検物質の存在また
    は存在量の指標を与える標識試薬の固定化を生じる固相
    および（ｂ）標識試薬からなる、試験サンプル中の被検
    物質の定性的または定量的測定用キットにおいて、標識
    試薬は請求項３記載の金ゾルの超凝集複合体であるキッ
    ト。
  15. 【請求項１５】超凝集複合体はさらに特徴的な反応を生
    じることができる酵素を含有し、キットはさらに上記酵
    素の基質を包含する請求項14記載のキット。
  16. 【請求項１６】固相が膜であり、その膜上に吸収パッド
    を置き、膜から離れて吸収パッドの表面に液体非透過性
    シートを置きそして吸収パッドから離れた膜の表面にそ
    の中に１個以上の孔を有する液体非透過性シートを置
    き、ここで吸収パッドは、孔の１つに適用すると試験サ
    ンプルまたは標識試薬が膜を通過して両方向に拡散しう
    るのに有効なものである請求項14記載のキット。
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