JP4302798B2 - リガンド結合表面の調製方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、リガンド結合性表面の調製方法に関する。本発明はまた、本発明の方法により調製されたリガンド結合性表面及びそのリガンド結合性表面を検定において使用することにも関する。
【０００２】
【従来の技術】
抗体その他のリガンド結合体を各種支持体に受動吸着させる方法は、検定用の官能表面を作り出すために最も広く用いられている固定化法の一つである。この方法により得られる官能価のレベルは、吸着時にリガンド結合体の立体配座が変化するために変動する(Kochwa ら, 1967; Suter 及びButler, 1986; Dierksら, 1986; Butlerら, 1992; 及び Davies ら, 1995) 。バイオ活性表面の官能価レベルは、ビオチン／アビジン結合を利用して改良されてきた。これらの改良については十分に文献化されている(Butler ら, 1992; Daviesら, 1993; Daviesら, 1994) 。
【０００３】
ストレプトアビジンとアビジンはどちらもビオチンに対する結合親和力が非常に高い（１０15Ｍ-1）。この結合親和力は、ビオチン及びその誘導体を各種生物学的材料中に取り込むことができることと相まって、ストレプトアビジン／ビオチン系に顕著な多用性を付与している。
【０００４】
アビジンは、卵白や鳥類、爬虫類及び両生類の組織に含まれる糖タンパク質である。ストレプトアビジンはストレプトマイシス・アビジニ(Streptomyces avidini)により産生される。これら双方のビオチン結合性タンパク質は、四つの同一サブユニットを有する四量体タンパク質として存在する。
【０００５】
ビオチンは、ビタミンＨ又はシス−ヘキサヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−チエノ−（３，４）−イミダゾル−４−ペンタン酸としても知られている必須ビタミンである。哺乳類におけるビオチン含有量の最も高い組織は肝臓、腎臓及び膵臓である。
【０００６】
リガンド結合性表面の調製は、特異的バインディングパートナー（例、ビオチン）が表面に固定化されている表面に結合剤（例、ストレプトアビジン又はアビジン）を添加するか、当該表面に当該結合剤を化学的に又は第二の運搬体分子を介してカップリングさせる工程、結合しなかったすべての成分を除去する工程、リガンドレセプターが付着されているバインディングパートナー（例、ビオチン化リガンドレセプター）を添加して、リガンドレセプターが付着されているバインディングパートナーと結合剤とを含んでなる複合体を当該表面上で形成させる工程、及び結合しなかったすべての成分を除去する工程によって可能である。図１に、バインディングパートナーにビオチンを、そして結合剤にストレプトアビジンを使用したこのようなリガンド結合性表面の調製方法の概略図を示す。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
検定用の官能性表面を調製することは複雑な多段プロセスであることがわかる。その最終工程は、一般に、アナライト特異的表面を得るため、リガンドレセプターが付着されているバインディングパートナーの添加工程である。目的の検定の性能にとって、リガンドレセプターが付着されているバインディングパートナーの量を制御することは重要であるが、特に、競争的免疫検定方式の場合のようにリガンドレセプターの濃度を制限することが必要な場合に、コーティング量のばらつきを抑えることが困難である。
【０００８】
従って、一層容易に制御できる方法であって必要なコーティング量を有する官能性表面がばらつきなく得られる官能性表面の調製方法が求められている。本発明によると、液体を取り扱う工程の複雑さが減少し且つ、表面にコーティングされるリガンドレセプターの量の制御が改良される。リガンドレセプターの量を一層高度に制御することは、免疫検定性能の精度、感度及び範囲を向上させることにもなる。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、（１）リガンドレセプターが付着されているバインディングパートナーと当該バインディングパートナーに特異的な結合剤とを、形成される複合体を表面に固定化されたバインディングパートナーに結合せしめるに十分な遊離結合部位を当該結合剤の表面に有する複合体が形成されるように特定のモル比において混合する工程；
（２）当該複合体をバインディングパートナーが固定化されている表面に接触せしめて当該複合体を当該表面に付着させる工程；及び
（３）結合していないすべての成分を除去する工程
を含んでなる、リガンド結合性表面の調製方法を提供するものである。
【００１０】
本明細書中の用語「結合剤」は、バインディングパートナーに特異的に結合することができるすべての化合物、タンパク質又は剤を意味するものとする。当該結合剤は、バインディングパートナーに結合することができるＳＡＶ又はＡＶ、抗体又は抗体フラグメント、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）2 であることが好ましい。バインディングパートナーが上記のような抗体又は抗体フラグメントである場合には、結合剤は当該バインディングパートナーに結合され得る抗原又はそのフラグメントであることが好ましい。
【００１１】
本発明の好ましい実施態様における結合剤は、ビオチンに結合する任意の化合物、タンパク質又は剤である。当該結合剤はビオチンに親和性を示す抗体又はそのフラグメントであることが一層好ましい。最も好ましくは、当該結合剤は、ストレプトアビジン及び官能性相同体アビジン並びに国際特許出願ＷＯ９７／１１１８３号に記載されているもののようなビオチンに結合する組換えストレプトアビジン又はアビジンタンパク質である。
【００１２】
本明細書中の用語「バインディングパートナー」は、当該結合剤に特異的に結合することができるすべての化合物、タンパク質又は剤を意味するものとする。当該結合剤が抗体又はそのフラグメントである場合には、バインディングパートナーは当該結合剤に結合することができる抗原又はそのフラグメントであることが好ましい。当該結合剤が抗原又はそのフラグメントである場合には、バインディングパートナーは当該結合剤に結合することができる抗体又はそのフラグメント、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）2 であることが好ましい。
【００１３】
好ましい実施態様におけるバインディングパートナーはビオチン又はその誘導体もしくは官能性相同体であって、当該結合剤はビオチンに結合する任意の化合物、タンパク質又は剤である。当業者であれば、ストレプトアビジン、アビジン又はその官能性相同体に強く結合するためにはビオチンの二環式環が損なわれていないことのみが必要であることを認識している。当該相互作用にビオチンのペンタン酸側鎖のカルボキシル基はほとんど関与しない。従って、このペンタン酸のカルボキシル基を修飾することによりビオチン誘導体を調製しても、当該誘導体のストレプトアビジン、アビジン又はそれらの官能性相同体に対する結合能を著しく変化させることがない。このようなビオチン誘導体については、Biomethods, 7, (1996), "A laboratory guide to biotin labelling in biomolecule analysis", T.M. Cier and F. Fahrenholz Eds., Birkhauser Verlag, Switzerland に記載されている。
【００１４】
本明細書中の用語「リガンドレセプター」は、リガンドに対して結合能を有するすべての実在物を意味するものとし、この場合のリガンドは所望のいかなる化合物又は分子であってもよい。好適なリガンドバインダーとして、抗原（この場合、当該リガンドは抗体又はその抗原結合性フラグメントである）、リガンドに結合することができる抗体又はその官能性フラグメント、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）2 フラグメント、内因性因子、葉酸塩結合性タンパク質並びに細胞レセプターが挙げられる。
【００１５】
本発明の表面は、検定の実施に適したものであればいずれの固体支持体であってもよい。好適な表面として、マイクロウェル（特にポリスチレンマイクロウェル）、ビーズ（特にラテックス／磁性ビーズ）又はディップスティックの表面が挙げられる。
【００１６】
バインディングパートナーの表面への固定化は、当業者であれば知っているいずれの標準的方法によっても可能である。例えば、バインディングパートナーの表面への固定化は、バインディングパートナー自体の、又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）もしくはポリリジンのようなポリアミン、等の運搬体に連結されたバインディングパートナーの、受動吸着によって可能である。バインディングパートナーを固定化するための好適な技法については、Immunoassays (Diamandis, E.P. and Christopoulos T.K., Eds., Academic Press, London (1996))、特に第 216〜222 頁及び第 229頁、に記載されている。表面のビオチン化（すなわち、ビオチンの表面への固定化）については Bayer and Wilcheek, 1990 に記載されている。
【００１７】
本発明のリガンドレセプターのバインディングパートナーへの付着は、当業者であれば知っているいずれの標準的方法によっても可能である。好適な方法として、架橋剤を使用する化学的カップリング及び活性化バインディングパートナー（例、ビオチン活性エステル）の使用が挙げられる。リガンドレセプターを Bayer and Wilcheek, 1990 に記載されている方法によりビオチン化する（すなわち、ビオチンに付着させる）ことが好ましい。さらに、リガンドレセプターのバインディングパートナーへの付着は、当該リガンドレセプターの活性が遊離のリガンドレセプターに比べて顕著に低下しないように行うことが好ましい。
【００１８】
本発明においては、当該結合剤とリガンドレセプターが付着されているバインディングパートナーとを、形成される複合体を表面に固定化されたバインディングパートナーに結合せしめるに十分な遊離結合部位を当該結合剤の表面に有する複合体が形成されるように特定のモル比において混合する。従って、結合剤の使用量は、バインディングパートナーが固定化された表面の結合能によって支配される。リガンドレセプターが付着されているバインディングパートナーの結合剤と複合化すべき量は、リガンド結合性表面の所望の全官能価によって決まる。これはもちろん、実施すべき検定の種類（競争的又はイムノメトリック）やバインディングパートナーに付着したリガンドレセプターの比率によって変動する。
【００１９】
本発明によると、結合剤とリガンドレセプターが付着されているバインディングパートナーとを、当該バインディングパートナーが固定化されている表面と接触せしめる前に、それらの最終濃度において混合させることができる。このため、リガンド結合性表面の官能価をより高度に制御することができ、リガンド結合性表面の調製における精度を高めることができ、そしてその後の検定性能を向上させることができる。
【００２０】
当該結合剤とリガンドレセプターが付着されているバインディングパートナーとを、複合体が形成されるように混合することが好ましい。これには最長で１８時間かかる場合もあり、また成分の使用濃度によっても変動する。当該バインディングパートナーが固定化されている表面に当該複合体を接触させて当該複合体を付着させる。これには最長で１６時間かかる場合もあり、また当該複合体における当該結合剤表面の遊離の結合部位の濃度によっても変動する。
【００２１】
本発明の好ましい実施態様では、リガンド結合性表面の調製において異なるリガンドレセプターが付着されているバインディングパートナーの組合せを使用することにより、二種以上のリガンドと結合し得る多官能性リガンド結合性表面を生ぜしめる。このような多官能性リガンド結合性表面は、特に、異なるリガンド結合体を検出するために異なるレポーター種（例、酵素、放射性マーカー、等）を使用する場合に、独立したいくつかの検定に、又は組み合わされた検定に、使用することができる。本発明は、リガンドレセプターとしてビオチン化内因性因子及びビオチン化葉酸塩結合性タンパク質を含む多官能性リガンド結合性表面を調製するための方法を提供することが好ましい。
【００２２】
さらに本発明は、本発明の方法により得られるリガンド結合性表面を提供する。
本発明のリガンド結合性表面は、サンドイッチアッセイ、競争的アッセイ、イムノメトリックアッセイ、感染性疾患を表示する抗原及び抗体のためのアッセイ並びに抗体クラス捕捉アッセイをはじめとする多種多様な検定法に使用することができる。このような検定法についてはImmunoassays (Diamandis, E.P. and Christopoulos T.K., Eds., Academic Press, London (1996))に記載されている。本発明のリガンド結合性表面は、アフィニティクロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー手法において使用することもできる。さらに本発明のリガンド結合性表面は、例えば表面プラスモン共鳴血液バンク試験又は妊娠試験を使用する免疫センサーとして使用することもできる。
【００２３】
以下、添付の図面を参照しながら本発明をさらに説明する。
図１は、リガンド結合性表面を調製するための従来法を示すものである。第１工程において、ビオチン化運搬体（バインディングパートナー）を表面に添加する。第２工程において、運搬体の過剰分を洗い流す。第３工程において、その表面にストレプトアビジン（結合剤）を添加する。第４工程において、ストレプトアビジンの過剰分を洗い流す。第５工程において、その表面にビオチン化リガンドレセプター（リガンドレセプターが付着されているバインディングパートナー）を添加する。第６工程において、ビオチン化リガンドレセプターの過剰分を洗い流す。
図２は、本発明の方法を示すものである。第１工程において、ビオチン化運搬体（バインディングパートナー）を表面に添加する。第２工程において、運搬体の過剰分を洗い流す。第３工程において、ストレプトアビジン（結合剤）とビオチン化リガンドレセプター（リガンドレセプターが付着されているバインディングパートナー）とを混合する。第４工程において、ストレプトアビジン／ビオチン化リガンドレセプター複合体を表面に添加する。
図３は、二重官能性ウェル上でのビタミンＢ１２の標準曲線である。
図４は、二重官能性ウェル上での葉酸塩の標準曲線である。
図５は、本発明の方法及び従来法により調製されたリガンド結合性表面を使用して得られたシグナルレベルを示すブロック図である。
【００２４】
【実施例】
実施例１
葉酸塩の検定に使用するためのマイクロウェル表面の調製
１．公開されている方法（Bayer and Wilchek (1990), 本明細書の一部とする) に従いＢＳＡをビオチン化した。
２．ポリスチレンマイクロウェル（PCMD Kodakから入手）にビオチン化ＢＳＡを受動吸着法でコーティングした。
３．公開されている方法（Bayer and Wilchek (1990)) に従い調製したビオチン化葉酸塩結合性タンパク質（Ｂ−ＦＢＰ）とストレプトアビジンとを、Ｂ−ＦＢＰが１．０×１０-8モル、ストレプトアビジンが１．０×１０-8モルのモル比においてｐＨ９．３０の０．０７５Ｍホウ酸塩緩衝液中で混合した。これを１８〜２８℃で１８時間以上放置して平衡化させた。
４．この溶液の２００μｌを、コーティング後の各マイクロウェルに添加した。
５．このマイクロウェルを室温で１６時間以上インキュベートした。
６．このマイクロウェルを５％のショ糖を含有するTris緩衝液（ｐＨ８．５、０．１Ｍ）で洗浄し、空にし、そして乾燥した。
【００２５】
葉酸塩の検定プロトコル
試験管に、
１．１５０μｌの試料を添加し、
２．５０μｌの安定剤（０．８％ジチオトレイトールと２％アスコルビン酸）を添加し、
３．混合して室温で１５分間インキュベートし、
４．１００μｌの変性剤（０．８５Ｍ ＮａＯＨ、０．１５Ｍ四ホウ酸二ナトリウム、０．０１％媒染オレンジ色素）を添加し、
５．混合して室温で１５分間インキュベートし、
６．１００μｌの中和剤（０．６Ｍホウ酸、３０ｍＭヨウ酸カリウム、２．５％Triton X-100、０．０１％医療用消泡剤Ｃ（Dow Corning Franceより入手）を添加し、
７．混合し、
８．コーティング後のウェルへ８０μｌを移し、
９．ＥＤＡＣカップリングにより調製された１００μｌの葉酸塩／西洋ワサビペルオキシダーゼのコンジュゲート試薬（ＨＲＰ濃度が０．１６μｇ／ｍＬになるような量の葉酸塩／ＨＲＰコンジュゲート、０．５％ヒト血清アルブミン、０．５％bronidox-L、０．２９％塩化ナトリウム、０．０１％フェリシアン化カリウム及び５％ショ糖を含有するｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液）を添加し、
10．振盪しながら３７℃で４５分間インキュベートし、
11．洗浄して、Ortho Clinical Diagnostics (O.C.D.) Amersham UK から市販されているVitros Eci試薬を使用してシグナル試薬を添加し、そして
12．５分経過後２０分経過前にルミネセンスを測定する。
パーセントはすべて体積基準であり、また溶液はすべて水溶性をさすことに留意されたい。
【００２６】
葉酸塩の検定結果
本発明の方法を使用した葉酸塩検定のための検量線
【００２７】
従来法を使用した葉酸塩検定のための検量線
【００２８】
３ｎｇ／ｍＬの葉酸塩を含有するプラズマプールの精度（ｎ＝１２レプリカ）（すなわち、同一試料（この場合には３ｎｇ／ｍＬの葉酸塩を含有するプラズマ試料）の濃度を繰り返し測定することによる葉酸塩検定の再現性の測定）
本発明の方法による結果
従来法による結果
本発明の方法によると検定精度が顕著に良くなる。
【００２９】
実施例２
ビタミンＢ１２の検定に使用するためのマイクロウェル表面の調製
１．実施例１と同様にポリスチレンマイクロウェルにビオチン化ＢＳＡをコーティングした。
２．ビオチン化内因性因子（Ｂ−ＩＦ）とストレプトアビジンとを、Ｂ−ＩＦが７×１０-10 モル、ストレプトアビジンが１４×１０-10 モルのモル比においてｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸塩緩衝液中で混合した。これを２０〜２８℃で１８時間以上放置して平衡化させた。
３．２８×１０-10 モルのビオチン化ＢＳＡ（Ｂ−ＢＳＡ）を添加してＢ−ＩＦ／ストレプトアビジン複合体に結合させた。すべてのＩＦを確実に結合させるために比率１：２：４のＢ−ＩＦ：ストレプトアビジン：Ｂ−ＢＳＡが必要である。
４．この溶液の２１０μｌを、コーティング後の各マイクロウェルに添加した。
５．このマイクロウェルを室温で１６時間以上インキュベートした。
６．このマイクロウェルをTris緩衝液で２回、５％のショ糖を含有するTris緩衝液で１回洗浄し、空にし、そして乾燥した。
【００３０】
ビタミンＢ１２の検定プロトコル
試験管に、
１．１５０μｌの試料を添加し、
２．５０μｌの安定剤（０．８％ジチオトレイトールと２％アスコルビン酸）を添加し、
３．１００μｌの変性剤（０．８５Ｍ ＮａＯＨ、０．０１％ＫＣＮ、０．１５Ｍ四ホウ酸二ナトリウム、０．０１％媒染オレンジ色素）を添加し、
４．混合して室温で１５分間インキュベートし、
５．１００μｌの中和剤（０．６Ｍホウ酸、３０ｍＭヨウ酸カリウム、２．５％Triton X-100、０．０１％医療用消泡剤Ｃ）を添加し、
６．混合し、
７．コーティング後のウェルへ６０μｌを移し、
８．３７℃で１５分間インキュベートし、
９．ＥＤＡＣカップリングにより調製された１００μｌのＢ１２／西洋ワサビペルオキシダーゼのコンジュゲート試薬（ＨＲＰ濃度が０．１６μｇ／ｍＬになるような量の葉酸塩／ＨＲＰコンジュゲート、０．５％ヒト血清アルブミン、０．５％bronidox-L、０．２９％塩化ナトリウム、０．０１％フェリシアン化カリウム及び５％ショ糖を含有するｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液）を添加し、
10．振盪しながら３７℃で３０分間インキュベートし、
11．洗浄して、実施例１に記載した試薬を使用してシグナル試薬を添加し、そして
12．５分経過後２０分経過前にルミネセンスを測定する。
【００３１】
ビタミンＢ１２の検定結果
試料 ビタミンＢ１２予測値 ビタミンＢ１２ ビタミンＢ１２
番号 pg/mL (RIA法) pg/mL (従来法) pg/mL (本法)
3153 １４９ １４８ １８９
2993 １３４ １７４ １３１
2986 ４０３ ３８６ ４００
3019 ２０４ ２９４ ２５４
3133 １６４４ ８５７ １１６１
3230 １１１４ ７４９ １１６９
【００３２】
本発明の方法によりコーティングしたマイクロウェル表面で実施した検定結果は、ＲＩＡ法で得られた予測値との一致性が高くなり、しかも検定のダイナミックレンジが拡張した。
【００３３】
実施例３
同時又は別個のＢ１２検定及び葉酸塩検定に使用するための二重官能性マイクロウェルの調製
１．ポリスチレンマイクロウェルにビオチン化運搬体（この場合にはビオチン化ＢＳＡ）をコーティングした。
２．ビオチン化葉酸塩結合性タンパク質（Ｂ−ＦＢＰ）と、ビオチン化内因性因子（Ｂ−ＩＦ）と、ストレプトアビジンとを、Ｂ−ＦＢＰが１．０×１０-8モル、Ｂ−ＩＦが６．０×１０-10 モル、そしてストレプトアビジンが２．０×１０-8モルのモル比においてｐＨ９．３０の０．０７５Ｍホウ酸塩緩衝液中で混合した。これを１８〜２８℃で１８時間以上放置して平衡化させた。
３．この溶液の２００μｌを、コーティング後の各マイクロウェルに添加した。
４．このマイクロウェルを室温で１６時間以上インキュベートした。
５．このマイクロウェルを５％のショ糖を含有するTris緩衝液で洗浄し、空にし、そして乾燥した。
ビタミンＢ１２及び葉酸塩の検定プロトコルは実施例１及び実施例２に記載した通りである。これらのマイクロウェルを使用して得られた標準曲線を図３及び図４に示す。
【００３４】
実施例４
ＮＴｘ（タイプ１の架橋Ｎ−テロペプチド）コラーゲンの検定に使用するためのマイクロウェルの調製
１．ポリスチレンマイクロウェルにビオチン化運搬体（この場合にはビオチン化ＢＳＡ）をコーティングした。
２．ビオチン化ＮＴｘペプチドとストレプトアビジンとを、ペプチドが５．１３×１０-8モル、ストレプトアビジンが１．３３×１０-8モルのモル比又はペプチドが１．００×１０-7モル、ストレプトアビジンが１．６６×１０-8モルのモル比においてｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸塩緩衝液中で混合した。
３．この溶液の２００μｌを、コーティング後の各マイクロウェルに添加した。
４．このマイクロウェルを室温で１６時間以上インキュベートした。
５．このマイクロウェルを５％のショ糖を含有するTris緩衝液（ｐＨ８．４、０．１Ｍ）で洗浄し、空にし、そして乾燥した。
【００３５】
ＮＴｘウェルの評価
１．上記のように調製したウェルと、従来法で得られたウェルとに、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識化抗ＮＴｘ抗体コンジュゲート溶液２００μｌを添加し、（従来法では、１００ｎｇ／ｍＬのビオチン化ＮＴｘペプチドと１００ｎｇ／ｍＬの遊離ビオチンとをビオチン化リガンドバインダー溶液として使用し、これを図１に示した従来法の工程５においてウェルに添加する。）
２．振盪しながら３７℃で３０分間インキュベートし、
３．洗浄して、O.C.D. Amersham UKから市販されているVitros Eci試薬を使用してシグナル試薬を添加し、そして
４．５分経過後にルミネセンスを測定する。
結果を図５に示す。結果は、本発明の方法によるとリガンド結合能が一段と高いリガンド結合性表面が得られることを示している。
【００３６】
当業者にとってはその他の実施態様も明白である。上記実施例は明瞭化のために提供したものにすぎず、また単なる例示にすぎない。本発明の精神及び範囲は上記実施例に限定されることはなく、特許請求の範囲によって画定される。
【００３７】
文献
１．Kochwa, S., Bronwell, M. Rosenfield, R.E. and Wasserman, L.R. (1967) Adsorption of proteins by polystyrene particles. I. Molecular unfolding and acquired immunogenicity of IgG. J. Immunol. 99.981
２．Suter, M. and Butler, J.E. (1986) The immunochemistry of sandwich ELISAs. II. A novel system prevents denaturation of capture antibodies. Immunol. Lett. 14 313
３．Dierks S.E., Butler, J.E. and Richardson, H.B. (1986) Altered recognition of surface-absorbed compared to antigen bound antibodies in the ELISA. Mol. Immunol. 23. 927
４．Butler, J.E., Ni, L., Nessler, R., Joshi, K.S., Suter, M., Rosenberg, B., Chang, J., Brown, W.R. and Cantarero, L.A. (1992) The physical and functional behavior of capture antibodies adsorbed on polystyrene. J. Immunol. Methods 150, 77-90
５．Davies, J., Dawkes, A.C., Haymes, A.G., Sunderland, R.F. and Edwards, J.C. (1995) Scanning tunnelling microscopy and dynamic contact angle studies of the effects of partial denaturatioon on immunoassay solid phase antibody, J. Immunol. Methods 186 111-123
６．Davies, J., Dawkes, A.C., Haymes, A.G., Roberts, C.J. Sunderland, R.F., Wilkins, M.J., Davies, M.c., Tendler, S.J.B., and Edwards, J.C. (1994), A scanning tunnelling microscopy comparison of passive antibody adsorption and biotinylated antibody linkage to streptavidin on microtitre wells, J. Immunol. Methods, 167, 263-269
７．Davies, J., Roberts, C.J. Dawkes. A.C. Sefton, J., Edwards, J.C., Claseby, T.O., Haymes, A.G., Davies, M.C., Jackson D.E., Lomas, M., Shakeshift, K.M., Tendler, S.J.B., Wilkins, M.J. and Williams, P.M. (1994) Use of scanning probe microscopy and surface plasmon resonance as analytical tools in the study of antibody coated microtitre wells, Langmuir 10(8)2654-2661
８．Bayer, E.A. and Wilchek, M. (1990) Protein biotinylation. In: M. Wilchek and E.A. Bayer (Eds.), Methods in Enzymology, Vol. 184, Academic Press, New York, pp. 138
【図面の簡単な説明】
【図１】リガンド結合性表面を調製するための従来法を示すものである。
【図２】本発明の方法を示すものである。
【図３】二重官能性ウェル上でのビタミンＢ１２の標準曲線である。
【図４】二重官能性ウェル上での葉酸塩の標準曲線である。
【図５】本発明の方法及び従来法により調製されたリガンド結合性表面を使用して得られたシグナルレベルを示すブロック図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、リガンド結合性表面の調製方法に関する。本発明はまた、本発明の方法により調製されたリガンド結合性表面及びそのリガンド結合性表面を検定において使用することにも関する。
【０００２】
【従来の技術】
抗体その他のリガンド結合体を各種支持体に受動吸着させる方法は、検定用の官能表面を作り出すために最も広く用いられている固定化法の一つである。この方法により得られる官能価のレベルは、吸着時にリガンド結合体の立体配座が変化するために変動する(Kochwa ら, 1967; Suter 及びButler, 1986; Dierksら, 1986; Butlerら, 1992; 及び Davies ら, 1995) 。バイオ活性表面の官能価レベルは、ビオチン／アビジン結合を利用して改良されてきた。これらの改良については十分に文献化されている(Butler ら, 1992; Daviesら, 1993; Daviesら, 1994) 。
【０００３】
ストレプトアビジンとアビジンはどちらもビオチンに対する結合親和力が非常に高い（１０15Ｍ-1）。この結合親和力は、ビオチン及びその誘導体を各種生物学的材料中に取り込むことができることと相まって、ストレプトアビジン／ビオチン系に顕著な多用性を付与している。
【０００４】
アビジンは、卵白や鳥類、爬虫類及び両生類の組織に含まれる糖タンパク質である。ストレプトアビジンはストレプトマイシス・アビジニ(Streptomyces avidini)により産生される。これら双方のビオチン結合性タンパク質は、四つの同一サブユニットを有する四量体タンパク質として存在する。
【０００５】
ビオチンは、ビタミンＨ又はシス−ヘキサヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−チエノ−（３，４）−イミダゾル−４−ペンタン酸としても知られている必須ビタミンである。哺乳類におけるビオチン含有量の最も高い組織は肝臓、腎臓及び膵臓である。
【０００６】
リガンド結合性表面の調製は、特異的バインディングパートナー（例、ビオチン）が表面に固定化されている表面に結合剤（例、ストレプトアビジン又はアビジン）を添加するか、当該表面に当該結合剤を化学的に又は第二の運搬体分子を介してカップリングさせる工程、結合しなかったすべての成分を除去する工程、リガンドレセプターが付着されているバインディングパートナー（例、ビオチン化リガンドレセプター）を添加して、リガンドレセプターが付着されているバインディングパートナーと結合剤とを含んでなる複合体を当該表面上で形成させる工程、及び結合しなかったすべての成分を除去する工程によって可能である。図１に、バインディングパートナーにビオチンを、そして結合剤にストレプトアビジンを使用したこのようなリガンド結合性表面の調製方法の概略図を示す。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
検定用の官能性表面を調製することは複雑な多段プロセスであることがわかる。その最終工程は、一般に、アナライト特異的表面を得るため、リガンドレセプターが付着されているバインディングパートナーの添加工程である。目的の検定の性能にとって、リガンドレセプターが付着されているバインディングパートナーの量を制御することは重要であるが、特に、競争的免疫検定方式の場合のようにリガンドレセプターの濃度を制限することが必要な場合に、コーティング量のばらつきを抑えることが困難である。
【０００８】
従って、一層容易に制御できる方法であって必要なコーティング量を有する官能性表面がばらつきなく得られる官能性表面の調製方法が求められている。本発明によると、液体を取り扱う工程の複雑さが減少し且つ、表面にコーティングされるリガンドレセプターの量の制御が改良される。リガンドレセプターの量を一層高度に制御することは、免疫検定性能の精度、感度及び範囲を向上させることにもなる。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、（１）リガンドレセプターが付着されているバインディングパートナーと当該バインディングパートナーに特異的な結合剤とを、形成される複合体を表面に固定化されたバインディングパートナーに結合せしめるに十分な遊離結合部位を当該結合剤の表面に有する複合体が形成されるように特定のモル比において混合する工程；
（２）当該複合体をバインディングパートナーが固定化されている表面に接触せしめて当該複合体を当該表面に付着させる工程；及び
（３）結合していないすべての成分を除去する工程
を含んでなる、リガンド結合性表面の調製方法を提供するものである。
【００１０】
本明細書中の用語「結合剤」は、バインディングパートナーに特異的に結合することができるすべての化合物、タンパク質又は剤を意味するものとする。当該結合剤は、バインディングパートナーに結合することができるＳＡＶ又はＡＶ、抗体又は抗体フラグメント、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）2 であることが好ましい。バインディングパートナーが上記のような抗体又は抗体フラグメントである場合には、結合剤は当該バインディングパートナーに結合され得る抗原又はそのフラグメントであることが好ましい。
【００１１】
本発明の好ましい実施態様における結合剤は、ビオチンに結合する任意の化合物、タンパク質又は剤である。当該結合剤はビオチンに親和性を示す抗体又はそのフラグメントであることが一層好ましい。最も好ましくは、当該結合剤は、ストレプトアビジン及び官能性相同体アビジン並びに国際特許出願ＷＯ９７／１１１８３号に記載されているもののようなビオチンに結合する組換えストレプトアビジン又はアビジンタンパク質である。
【００１２】
本明細書中の用語「バインディングパートナー」は、当該結合剤に特異的に結合することができるすべての化合物、タンパク質又は剤を意味するものとする。当該結合剤が抗体又はそのフラグメントである場合には、バインディングパートナーは当該結合剤に結合することができる抗原又はそのフラグメントであることが好ましい。当該結合剤が抗原又はそのフラグメントである場合には、バインディングパートナーは当該結合剤に結合することができる抗体又はそのフラグメント、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）2 であることが好ましい。
【００１３】
好ましい実施態様におけるバインディングパートナーはビオチン又はその誘導体もしくは官能性相同体であって、当該結合剤はビオチンに結合する任意の化合物、タンパク質又は剤である。当業者であれば、ストレプトアビジン、アビジン又はその官能性相同体に強く結合するためにはビオチンの二環式環が損なわれていないことのみが必要であることを認識している。当該相互作用にビオチンのペンタン酸側鎖のカルボキシル基はほとんど関与しない。従って、このペンタン酸のカルボキシル基を修飾することによりビオチン誘導体を調製しても、当該誘導体のストレプトアビジン、アビジン又はそれらの官能性相同体に対する結合能を著しく変化させることがない。このようなビオチン誘導体については、Biomethods, 7, (1996), "A laboratory guide to biotin labelling in biomolecule analysis", T.M. Cier and F. Fahrenholz Eds., Birkhauser Verlag, Switzerland に記載されている。
【００１４】
本明細書中の用語「リガンドレセプター」は、リガンドに対して結合能を有するすべての実在物を意味するものとし、この場合のリガンドは所望のいかなる化合物又は分子であってもよい。好適なリガンドバインダーとして、抗原（この場合、当該リガンドは抗体又はその抗原結合性フラグメントである）、リガンドに結合することができる抗体又はその官能性フラグメント、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）2 フラグメント、内因性因子、葉酸塩結合性タンパク質並びに細胞レセプターが挙げられる。
【００１５】
本発明の表面は、検定の実施に適したものであればいずれの固体支持体であってもよい。好適な表面として、マイクロウェル（特にポリスチレンマイクロウェル）、ビーズ（特にラテックス／磁性ビーズ）又はディップスティックの表面が挙げられる。
【００１６】
バインディングパートナーの表面への固定化は、当業者であれば知っているいずれの標準的方法によっても可能である。例えば、バインディングパートナーの表面への固定化は、バインディングパートナー自体の、又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）もしくはポリリジンのようなポリアミン、等の運搬体に連結されたバインディングパートナーの、受動吸着によって可能である。バインディングパートナーを固定化するための好適な技法については、Immunoassays (Diamandis, E.P. and Christopoulos T.K., Eds., Academic Press, London (1996))、特に第 216〜222 頁及び第 229頁、に記載されている。表面のビオチン化（すなわち、ビオチンの表面への固定化）については Bayer and Wilcheek, 1990 に記載されている。
【００１７】
本発明のリガンドレセプターのバインディングパートナーへの付着は、当業者であれば知っているいずれの標準的方法によっても可能である。好適な方法として、架橋剤を使用する化学的カップリング及び活性化バインディングパートナー（例、ビオチン活性エステル）の使用が挙げられる。リガンドレセプターを Bayer and Wilcheek, 1990 に記載されている方法によりビオチン化する（すなわち、ビオチンに付着させる）ことが好ましい。さらに、リガンドレセプターのバインディングパートナーへの付着は、当該リガンドレセプターの活性が遊離のリガンドレセプターに比べて顕著に低下しないように行うことが好ましい。
【００１８】
本発明においては、当該結合剤とリガンドレセプターが付着されているバインディングパートナーとを、形成される複合体を表面に固定化されたバインディングパートナーに結合せしめるに十分な遊離結合部位を当該結合剤の表面に有する複合体が形成されるように特定のモル比において混合する。従って、結合剤の使用量は、バインディングパートナーが固定化された表面の結合能によって支配される。リガンドレセプターが付着されているバインディングパートナーの結合剤と複合化すべき量は、リガンド結合性表面の所望の全官能価によって決まる。これはもちろん、実施すべき検定の種類（競争的又はイムノメトリック）やバインディングパートナーに付着したリガンドレセプターの比率によって変動する。
【００１９】
本発明によると、結合剤とリガンドレセプターが付着されているバインディングパートナーとを、当該バインディングパートナーが固定化されている表面と接触せしめる前に、それらの最終濃度において混合させることができる。このため、リガンド結合性表面の官能価をより高度に制御することができ、リガンド結合性表面の調製における精度を高めることができ、そしてその後の検定性能を向上させることができる。
【００２０】
当該結合剤とリガンドレセプターが付着されているバインディングパートナーとを、複合体が形成されるように混合することが好ましい。これには最長で１８時間かかる場合もあり、また成分の使用濃度によっても変動する。当該バインディングパートナーが固定化されている表面に当該複合体を接触させて当該複合体を付着させる。これには最長で１６時間かかる場合もあり、また当該複合体における当該結合剤表面の遊離の結合部位の濃度によっても変動する。
【００２１】
本発明の好ましい実施態様では、リガンド結合性表面の調製において異なるリガンドレセプターが付着されているバインディングパートナーの組合せを使用することにより、二種以上のリガンドと結合し得る多官能性リガンド結合性表面を生ぜしめる。このような多官能性リガンド結合性表面は、特に、異なるリガンド結合体を検出するために異なるレポーター種（例、酵素、放射性マーカー、等）を使用する場合に、独立したいくつかの検定に、又は組み合わされた検定に、使用することができる。本発明は、リガンドレセプターとしてビオチン化内因性因子及びビオチン化葉酸塩結合性タンパク質を含む多官能性リガンド結合性表面を調製するための方法を提供することが好ましい。
【００２２】
さらに本発明は、本発明の方法により得られるリガンド結合性表面を提供する。
本発明のリガンド結合性表面は、サンドイッチアッセイ、競争的アッセイ、イムノメトリックアッセイ、感染性疾患を表示する抗原及び抗体のためのアッセイ並びに抗体クラス捕捉アッセイをはじめとする多種多様な検定法に使用することができる。このような検定法についてはImmunoassays (Diamandis, E.P. and Christopoulos T.K., Eds., Academic Press, London (1996))に記載されている。本発明のリガンド結合性表面は、アフィニティクロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー手法において使用することもできる。さらに本発明のリガンド結合性表面は、例えば表面プラスモン共鳴血液バンク試験又は妊娠試験を使用する免疫センサーとして使用することもできる。
【００２３】
以下、添付の図面を参照しながら本発明をさらに説明する。
図１は、リガンド結合性表面を調製するための従来法を示すものである。第１工程において、ビオチン化運搬体（バインディングパートナー）を表面に添加する。第２工程において、運搬体の過剰分を洗い流す。第３工程において、その表面にストレプトアビジン（結合剤）を添加する。第４工程において、ストレプトアビジンの過剰分を洗い流す。第５工程において、その表面にビオチン化リガンドレセプター（リガンドレセプターが付着されているバインディングパートナー）を添加する。第６工程において、ビオチン化リガンドレセプターの過剰分を洗い流す。
図２は、本発明の方法を示すものである。第１工程において、ビオチン化運搬体（バインディングパートナー）を表面に添加する。第２工程において、運搬体の過剰分を洗い流す。第３工程において、ストレプトアビジン（結合剤）とビオチン化リガンドレセプター（リガンドレセプターが付着されているバインディングパートナー）とを混合する。第４工程において、ストレプトアビジン／ビオチン化リガンドレセプター複合体を表面に添加する。
図３は、二重官能性ウェル上でのビタミンＢ１２の標準曲線である。
図４は、二重官能性ウェル上での葉酸塩の標準曲線である。
図５は、本発明の方法及び従来法により調製されたリガンド結合性表面を使用して得られたシグナルレベルを示すブロック図である。
【００２４】
【実施例】
実施例１
葉酸塩の検定に使用するためのマイクロウェル表面の調製
１．公開されている方法（Bayer and Wilchek (1990), 本明細書の一部とする) に従いＢＳＡをビオチン化した。
２．ポリスチレンマイクロウェル（PCMD Kodakから入手）にビオチン化ＢＳＡを受動吸着法でコーティングした。
３．公開されている方法（Bayer and Wilchek (1990)) に従い調製したビオチン化葉酸塩結合性タンパク質（Ｂ−ＦＢＰ）とストレプトアビジンとを、Ｂ−ＦＢＰが１．０×１０-8モル、ストレプトアビジンが１．０×１０-8モルのモル比においてｐＨ９．３０の０．０７５Ｍホウ酸塩緩衝液中で混合した。これを１８〜２８℃で１８時間以上放置して平衡化させた。
４．この溶液の２００μｌを、コーティング後の各マイクロウェルに添加した。
５．このマイクロウェルを室温で１６時間以上インキュベートした。
６．このマイクロウェルを５％のショ糖を含有するTris緩衝液（ｐＨ８．５、０．１Ｍ）で洗浄し、空にし、そして乾燥した。
【００２５】
葉酸塩の検定プロトコル
試験管に、
１．１５０μｌの試料を添加し、
２．５０μｌの安定剤（０．８％ジチオトレイトールと２％アスコルビン酸）を添加し、
３．混合して室温で１５分間インキュベートし、
４．１００μｌの変性剤（０．８５Ｍ ＮａＯＨ、０．１５Ｍ四ホウ酸二ナトリウム、０．０１％媒染オレンジ色素）を添加し、
５．混合して室温で１５分間インキュベートし、
６．１００μｌの中和剤（０．６Ｍホウ酸、３０ｍＭヨウ酸カリウム、２．５％Triton X-100、０．０１％医療用消泡剤Ｃ（Dow Corning Franceより入手）を添加し、
７．混合し、
８．コーティング後のウェルへ８０μｌを移し、
９．ＥＤＡＣカップリングにより調製された１００μｌの葉酸塩／西洋ワサビペルオキシダーゼのコンジュゲート試薬（ＨＲＰ濃度が０．１６μｇ／ｍＬになるような量の葉酸塩／ＨＲＰコンジュゲート、０．５％ヒト血清アルブミン、０．５％bronidox-L、０．２９％塩化ナトリウム、０．０１％フェリシアン化カリウム及び５％ショ糖を含有するｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液）を添加し、
10．振盪しながら３７℃で４５分間インキュベートし、
11．洗浄して、Ortho Clinical Diagnostics (O.C.D.) Amersham UK から市販されているVitros Eci試薬を使用してシグナル試薬を添加し、そして
12．５分経過後２０分経過前にルミネセンスを測定する。
パーセントはすべて体積基準であり、また溶液はすべて水溶性をさすことに留意されたい。
【００２６】
葉酸塩の検定結果
本発明の方法を使用した葉酸塩検定のための検量線
従来法を使用した葉酸塩検定のための検量線
３ｎｇ／ｍＬの葉酸塩を含有するプラズマプールの精度（ｎ＝１２レプリカ）（すなわち、同一試料（この場合には３ｎｇ／ｍＬの葉酸塩を含有するプラズマ試料）の濃度を繰り返し測定することによる葉酸塩検定の再現性の測定）
本発明の方法による結果
【００２９】
実施例２
ビタミンＢ１２の検定に使用するためのマイクロウェル表面の調製
１．実施例１と同様にポリスチレンマイクロウェルにビオチン化ＢＳＡをコーティングした。
２．ビオチン化内因性因子（Ｂ−ＩＦ）とストレプトアビジンとを、Ｂ−ＩＦが７×１０-10 モル、ストレプトアビジンが１４×１０-10 モルのモル比においてｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸塩緩衝液中で混合した。これを２０〜２８℃で１８時間以上放置して平衡化させた。
３．２８×１０-10 モルのビオチン化ＢＳＡ（Ｂ−ＢＳＡ）を添加してＢ−ＩＦ／ストレプトアビジン複合体に結合させた。すべてのＩＦを確実に結合させるために比率１：２：４のＢ−ＩＦ：ストレプトアビジン：Ｂ−ＢＳＡが必要である。
４．この溶液の２１０μｌを、コーティング後の各マイクロウェルに添加した。
５．このマイクロウェルを室温で１６時間以上インキュベートした。
６．このマイクロウェルをTris緩衝液で２回、５％のショ糖を含有するTris緩衝液で１回洗浄し、空にし、そして乾燥した。
【００３０】
ビタミンＢ１２の検定プロトコル
試験管に、
１．１５０μｌの試料を添加し、
２．５０μｌの安定剤（０．８％ジチオトレイトールと２％アスコルビン酸）を添加し、
３．１００μｌの変性剤（０．８５Ｍ ＮａＯＨ、０．０１％ＫＣＮ、０．１５Ｍ四ホウ酸二ナトリウム、０．０１％媒染オレンジ色素）を添加し、
４．混合して室温で１５分間インキュベートし、
５．１００μｌの中和剤（０．６Ｍホウ酸、３０ｍＭヨウ酸カリウム、２．５％Triton X-100、０．０１％医療用消泡剤Ｃ）を添加し、
６．混合し、
７．コーティング後のウェルへ６０μｌを移し、
８．３７℃で１５分間インキュベートし、
９．ＥＤＡＣカップリングにより調製された１００μｌのＢ１２／西洋ワサビペルオキシダーゼのコンジュゲート試薬（ＨＲＰ濃度が０．１６μｇ／ｍＬになるような量の葉酸塩／ＨＲＰコンジュゲート、０．５％ヒト血清アルブミン、０．５％bronidox-L、０．２９％塩化ナトリウム、０．０１％フェリシアン化カリウム及び５％ショ糖を含有するｐＨ６．４の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液）を添加し、
10．振盪しながら３７℃で３０分間インキュベートし、
11．洗浄して、実施例１に記載した試薬を使用してシグナル試薬を添加し、そして
12．５分経過後２０分経過前にルミネセンスを測定する。
【００３１】
ビタミンＢ１２の検定結果
試料 ビタミンＢ１２予測値 ビタミンＢ１２ ビタミンＢ１２
番号 pg/mL (RIA法) pg/mL (従来法) pg/mL (本法)
3153 １４９ １４８ １８９
2993 １３４ １７４ １３１
2986 ４０３ ３８６ ４００
3019 ２０４ ２９４ ２５４
3133 １６４４ ８５７ １１６１
3230 １１１４ ７４９ １１６９
【００３２】
本発明の方法によりコーティングしたマイクロウェル表面で実施した検定結果は、ＲＩＡ法で得られた予測値との一致性が高くなり、しかも検定のダイナミックレンジが拡張した。
【００３３】
実施例３
同時又は別個のＢ１２検定及び葉酸塩検定に使用するための二重官能性マイクロウェルの調製
１．ポリスチレンマイクロウェルにビオチン化運搬体（この場合にはビオチン化ＢＳＡ）をコーティングした。
２．ビオチン化葉酸塩結合性タンパク質（Ｂ−ＦＢＰ）と、ビオチン化内因性因子（Ｂ−ＩＦ）と、ストレプトアビジンとを、Ｂ−ＦＢＰが１．０×１０-8モル、Ｂ−ＩＦが６．０×１０-10 モル、そしてストレプトアビジンが２．０×１０-8モルのモル比においてｐＨ９．３０の０．０７５Ｍホウ酸塩緩衝液中で混合した。これを１８〜２８℃で１８時間以上放置して平衡化させた。
３．この溶液の２００μｌを、コーティング後の各マイクロウェルに添加した。
４．このマイクロウェルを室温で１６時間以上インキュベートした。
５．このマイクロウェルを５％のショ糖を含有するTris緩衝液で洗浄し、空にし、そして乾燥した。
ビタミンＢ１２及び葉酸塩の検定プロトコルは実施例１及び実施例２に記載した通りである。これらのマイクロウェルを使用して得られた標準曲線を図３及び図４に示す。
【００３４】
実施例４
ＮＴｘ（タイプ１の架橋Ｎ−テロペプチド）コラーゲンの検定に使用するためのマイクロウェルの調製
１．ポリスチレンマイクロウェルにビオチン化運搬体（この場合にはビオチン化ＢＳＡ）をコーティングした。
２．ビオチン化ＮＴｘペプチドとストレプトアビジンとを、ペプチドが５．１３×１０-8モル、ストレプトアビジンが１．３３×１０-8モルのモル比又はペプチドが１．００×１０-7モル、ストレプトアビジンが１．６６×１０-8モルのモル比においてｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸塩緩衝液中で混合した。
３．この溶液の２００μｌを、コーティング後の各マイクロウェルに添加した。
４．このマイクロウェルを室温で１６時間以上インキュベートした。
５．このマイクロウェルを５％のショ糖を含有するTris緩衝液（ｐＨ８．４、０．１Ｍ）で洗浄し、空にし、そして乾燥した。
【００３５】
ＮＴｘウェルの評価
１．上記のように調製したウェルと、従来法で得られたウェルとに、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識化抗ＮＴｘ抗体コンジュゲート溶液２００μｌを添加し、（従来法では、１００ｎｇ／ｍＬのビオチン化ＮＴｘペプチドと１００ｎｇ／ｍＬの遊離ビオチンとをビオチン化リガンドバインダー溶液として使用し、これを図１に示した従来法の工程５においてウェルに添加する。）
２．振盪しながら３７℃で３０分間インキュベートし、
３．洗浄して、O.C.D. Amersham UKから市販されているVitros Eci試薬を使用してシグナル試薬を添加し、そして
４．５分経過後にルミネセンスを測定する。
結果を図５に示す。結果は、本発明の方法によるとリガンド結合能が一段と高いリガンド結合性表面が得られることを示している。
【００３６】
当業者にとってはその他の実施態様も明白である。上記実施例は明瞭化のために提供したものにすぎず、また単なる例示にすぎない。本発明の精神及び範囲は上記実施例に限定されることはなく、特許請求の範囲によって画定される。
【００３７】
文献
１．Kochwa, S., Bronwell, M. Rosenfield, R.E. and Wasserman, L.R. (1967) Adsorption of proteins by polystyrene particles. I. Molecular unfolding and acquired immunogenicity of IgG. J. Immunol. 99.981
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６．Davies, J., Dawkes, A.C., Haymes, A.G., Roberts, C.J. Sunderland, R.F., Wilkins, M.J., Davies, M.c., Tendler, S.J.B., and Edwards, J.C. (1994), A scanning tunnelling microscopy comparison of passive antibody adsorption and biotinylated antibody linkage to streptavidin on microtitre wells, J. Immunol. Methods, 167, 263-269
７．Davies, J., Roberts, C.J. Dawkes. A.C. Sefton, J., Edwards, J.C., Claseby, T.O., Haymes, A.G., Davies, M.C., Jackson D.E., Lomas, M., Shakeshift, K.M., Tendler, S.J.B., Wilkins, M.J. and Williams, P.M. (1994) Use of scanning probe microscopy and surface plasmon resonance as analytical tools in the study of antibody coated microtitre wells, Langmuir 10(8)2654-2661
８．Bayer, E.A. and Wilchek, M. (1990) Protein biotinylation. In: M. Wilchek and E.A. Bayer (Eds.), Methods in Enzymology, Vol. 184, Academic Press, New York, pp. 138
【図面の簡単な説明】
【図１】リガンド結合性表面を調製するための従来法を示すものである。
【図２】本発明の方法を示すものである。
【図３】二重官能性ウェル上でのビタミンＢ１２の標準曲線である。
【図４】二重官能性ウェル上での葉酸塩の標準曲線である。
【図５】本発明の方法及び従来法により調製されたリガンド結合性表面を使用して得られたシグナルレベルを示すブロック図である。
Claims (9)
- （１）リガンドレセプターが付着されているバインディングパートナーと当該バインディングパートナーに特異的な結合剤とを、形成される複合体を表面に固定化されたバインディングパートナーに結合せしめるに十分な遊離結合部位を当該結合剤の表面に有する複合体が形成されるように特定のモル比において混合する工程；
（２）当該複合体をバインディングパートナーが固定化されている表面に接触せしめて当該複合体を当該表面に付着させる工程；及び
（３）結合していないすべての成分を除去する工程
を含んでなる、リガンド結合性表面の調製方法。 - 前記結合剤が、ビオチンと結合する化合物、タンパク質又は剤である、請求項１に記載の方法。
- 前記結合剤がストレプトアビジンである、請求項２に記載の方法。
- 前記バインディングパートナーがビオチン又はその誘導体もしくは官能性相同体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リガンドレセプターが抗体又はその官能性フラグメントである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リガンドレセプターが内因性因子又は葉酸塩結合性タンパク質である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記表面がマイクロウェル、ビーズ又はディップスティックである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
- 異なる二種以上のリガンドレセプターを使用して多官能性リガンド結合性表面を調製する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記異なるリガンドレセプターが内因性因子又は葉酸塩結合性タンパク質である、請求項８に記載の方法。
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