JPH0737987B2 - 凝集性結合試薬を用いた不均一系特異的結合試験方法及び不均一系イムノアツセイ法並びにその試験キツト - Google Patents
凝集性結合試薬を用いた不均一系特異的結合試験方法及び不均一系イムノアツセイ法並びにその試験キツトInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 （発明の分野） 本発明は、液状試験媒体中の分析対象物の測定に有用な
特異的結合試験（例えばイムノアッセイ）に関する。特
に、本発明は、標識試薬の「結合体」及び「遊離体」を
生成させた後、それらを互いに物理的に分離して試験を
完了することを特徴とする、水性試験媒体中に存在する
可能性がある分析対象物の量を測定するための不均一系
特異的結合試験法に関する。
特異的結合試験（例えばイムノアッセイ）に関する。特
に、本発明は、標識試薬の「結合体」及び「遊離体」を
生成させた後、それらを互いに物理的に分離して試験を
完了することを特徴とする、水性試験媒体中に存在する
可能性がある分析対象物の量を測定するための不均一系
特異的結合試験法に関する。
（先行技術の説明） 結合試験反応において、結合に関与する物質の１つを直
接固定化するための固定化された又は固定化され得る材
料、例えば固定化抗原又は抗体を用いて、標識試薬の結
合体及び遊離体の所望の分離を行なう各種の結合試験法
が、今までに提案されている。特に、多数のそのような
結合試験法が述べられており、そこでは、検出される抗
原に対する抗体が試験管の内壁又はプラスチックビーズ
のような固定用材料に結合させている。
接固定化するための固定化された又は固定化され得る材
料、例えば固定化抗原又は抗体を用いて、標識試薬の結
合体及び遊離体の所望の分離を行なう各種の結合試験法
が、今までに提案されている。特に、多数のそのような
結合試験法が述べられており、そこでは、検出される抗
原に対する抗体が試験管の内壁又はプラスチックビーズ
のような固定用材料に結合させている。
例えば、米国特許第4,243,749号には競合的結合試験法
が開示されており、そこでは、測定すべきハプテンに対
する特異的抗体を管内壁に不溶化又は固定化されている
試験管内で反応を行なわせる。上記反応には標識化ハプ
テン複合体が関与する（ここにおいて試験管の壁に結合
する標識化ハプテン複合体の量が測定すべきハプテンの
量と反比例する）。
が開示されており、そこでは、測定すべきハプテンに対
する特異的抗体を管内壁に不溶化又は固定化されている
試験管内で反応を行なわせる。上記反応には標識化ハプ
テン複合体が関与する（ここにおいて試験管の壁に結合
する標識化ハプテン複合体の量が測定すべきハプテンの
量と反比例する）。
そのような結合試験は別に、米国特許第4,230,683号に
記載され、抗原又は抗体が結合している6mmのポリスチ
レンビーズを用いる方法を開示している。ここにおいて
は、抗原又は抗体を該抗原又は抗体に対するハプテン結
合抗体と反応させ、結合したハプテン結合抗体を、更に
標識された抗ハプテン抗体と反応させ、試験試料中の抗
原又は抗体の量を測定する。
記載され、抗原又は抗体が結合している6mmのポリスチ
レンビーズを用いる方法を開示している。ここにおいて
は、抗原又は抗体を該抗原又は抗体に対するハプテン結
合抗体と反応させ、結合したハプテン結合抗体を、更に
標識された抗ハプテン抗体と反応させ、試験試料中の抗
原又は抗体の量を測定する。
そのような結合試験はまた別に、米国特許第4,228,237
号に記載され、これは特異的結合工程に酵素標識アビジ
ン及びビオチン標識試薬を用いて、液体媒体中のリガン
ドの検出及び測定を行なうための方法を開示している。
この方法では、検出すべきリガンドが、そのリガンドに
対する特異的結合性物質を含有する不溶性の相と接触さ
せる。
号に記載され、これは特異的結合工程に酵素標識アビジ
ン及びビオチン標識試薬を用いて、液体媒体中のリガン
ドの検出及び測定を行なうための方法を開示している。
この方法では、検出すべきリガンドが、そのリガンドに
対する特異的結合性物質を含有する不溶性の相と接触さ
せる。
上記の直接固定化技術に加えて、結合試験反応に関与す
る固定化すべき物質を第１の結合性物質によってマーキ
ング又は標識し、次に固定化された第２の結合性物質を
加える間接固定化が提案されている。
る固定化すべき物質を第１の結合性物質によってマーキ
ング又は標識し、次に固定化された第２の結合性物質を
加える間接固定化が提案されている。
例えば、米国特許第4,298,685号は酵素イムノアッセイ
を開示しており、そこでは測定すべき生物学的物質を含
有する試料を、ビオチンで標識された該生物学的物質に
対する抗体、並びに測定すべき上記物質の酵素標識体を
混合する。次にアビジンの固定化体を添加し、そこでア
ビジンがビオチン標識抗体に結合して酵素標識体の抗体
結合フラクションを固定化する。同様に、英国特許願第
2,084,317号は固体材料に結合したアビジン及びビオチ
ン標識抗原を用いる抗原と連結した競合的酵素イムノア
ッセイを開示している。
を開示しており、そこでは測定すべき生物学的物質を含
有する試料を、ビオチンで標識された該生物学的物質に
対する抗体、並びに測定すべき上記物質の酵素標識体を
混合する。次にアビジンの固定化体を添加し、そこでア
ビジンがビオチン標識抗体に結合して酵素標識体の抗体
結合フラクションを固定化する。同様に、英国特許願第
2,084,317号は固体材料に結合したアビジン及びビオチ
ン標識抗原を用いる抗原と連結した競合的酵素イムノア
ッセイを開示している。
したがって、本発明の目的は、遠心工程や上記のような
分析対象物の量を測定する前に固定化複合体を反応溶液
から分離するための同様に複雑で煩雑な分離技術を必要
としない、液状試験媒体中の分析対象物を測定するため
の特異的結合試験法を提供することである。
分析対象物の量を測定する前に固定化複合体を反応溶液
から分離するための同様に複雑で煩雑な分離技術を必要
としない、液状試験媒体中の分析対象物を測定するため
の特異的結合試験法を提供することである。
更に、本発明の目的は、固定化され得る成分を析出させ
るのに必要な結合物質の量が最少となるように、測定す
べき結合相手の分子が２個以上それ自体に結合している
固定化され得る成分を提供することである。
るのに必要な結合物質の量が最少となるように、測定す
べき結合相手の分子が２個以上それ自体に結合している
固定化され得る成分を提供することである。
本発明の別の目的は、表面積が拡張されたすなわち結合
相手の結合可能性が増大された特異的結合試験反応用の
固定化され得る成分を提供することである。
相手の結合可能性が増大された特異的結合試験反応用の
固定化され得る成分を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、特異的結合反応が起きた
後、さらにすすぎ又は洗浄工程を必要としないで反応容
器内で行なうことができ、試験媒体中の分析対象物の量
の測定に、反応溶液の少量のアリコートしか必要としな
い、特異的結合試験法を提供することである。
後、さらにすすぎ又は洗浄工程を必要としないで反応容
器内で行なうことができ、試験媒体中の分析対象物の量
の測定に、反応溶液の少量のアリコートしか必要としな
い、特異的結合試験法を提供することである。
本発明は、水性試験媒体中の種々の生物学的物質の検出
に応用することができ、最少数の工程で行なうことがで
きる、簡易化された不均一系特異的結合試験法を提供す
る。本発明の試験法は、遠心工程又はそれと同様の複雑
な工程を必要とせず、単一の反応容器内で行なわれる。
反応混合物は試験媒体と本発明の試験試薬を一緒にする
ことにより形成されるが、本発明の試験試薬は、（ｉ）
試験媒体中の分析対象物の量の関数として遊離型標識体
（以下「遊離体」という）及び結合型標識体（以下「結
合体」という）を形成する、標識抗分析対象物のような
標識試薬、並びに（ii）遊離体又は結合体のどちらか一
方に結合することにより最終的に固定化標識体を形成
し、それによって固定化標識体を固定化されていない標
識体から分離することができる、固定化され得る成分を
含んでいる。
に応用することができ、最少数の工程で行なうことがで
きる、簡易化された不均一系特異的結合試験法を提供す
る。本発明の試験法は、遠心工程又はそれと同様の複雑
な工程を必要とせず、単一の反応容器内で行なわれる。
反応混合物は試験媒体と本発明の試験試薬を一緒にする
ことにより形成されるが、本発明の試験試薬は、（ｉ）
試験媒体中の分析対象物の量の関数として遊離型標識体
（以下「遊離体」という）及び結合型標識体（以下「結
合体」という）を形成する、標識抗分析対象物のような
標識試薬、並びに（ii）遊離体又は結合体のどちらか一
方に結合することにより最終的に固定化標識体を形成
し、それによって固定化標識体を固定化されていない標
識体から分離することができる、固定化され得る成分を
含んでいる。
本発明では、固定化され得る試薬を使用したことが改良
点であり、上記試薬は固定化される標識体の遊離体又は
結合体のどちらか一方の結合相手と第１の結合性物質と
がカップリングして結合した水分散性の凝集性支持体物
質からなる。固定化標識体は、反応混合物に第２の結合
性物質を添加することにより形成される（ここにおい
て、第２の結合性物質は第１の結合性物質に対し結合性
親和力を有する）。このようにして第２の結合性物質
は、第１の結合性物質と第２の結合性物質との結合の結
果として支持体物質を凝集させ、それによって支持体物
質の沈殿複合体を含む１つのフラクション、及び固定化
されていない標識体を含む別のフラクションが生じる。
どちらかのフラクションの標識体における標識の量を測
定し、試験媒体中の分析対象物の量に関係づけることが
できる。
点であり、上記試薬は固定化される標識体の遊離体又は
結合体のどちらか一方の結合相手と第１の結合性物質と
がカップリングして結合した水分散性の凝集性支持体物
質からなる。固定化標識体は、反応混合物に第２の結合
性物質を添加することにより形成される（ここにおい
て、第２の結合性物質は第１の結合性物質に対し結合性
親和力を有する）。このようにして第２の結合性物質
は、第１の結合性物質と第２の結合性物質との結合の結
果として支持体物質を凝集させ、それによって支持体物
質の沈殿複合体を含む１つのフラクション、及び固定化
されていない標識体を含む別のフラクションが生じる。
どちらかのフラクションの標識体における標識の量を測
定し、試験媒体中の分析対象物の量に関係づけることが
できる。
本発明はまた、過剰の標識試薬、固定化され得る試薬、
固定化され得る試薬に対する特異的結合性物質、及び必
要に応じて試験媒体中の分析対象物の量に比例して検知
可能な信号を与える指示薬を含む試験キットを提供す
る。
固定化され得る試薬に対する特異的結合性物質、及び必
要に応じて試験媒体中の分析対象物の量に比例して検知
可能な信号を与える指示薬を含む試験キットを提供す
る。
本発明の特異的結合試験方法は、ラジオイムノアッセイ
及び不均一系酵素イムノアッセイのような従来の不均一
系特異的結合試験法に適用される。そのような試験を行
なうための試験試薬は種々の異なる形態を取ることがで
きるが、（１）検出される分析対象物、（２）標識分析
対象物又は標識抗分析対象物からなる標識試薬、及び
（３）分析対象物の結合相手と第１の結合性物質とがカ
ップリングして結合した水分散性の支持体物質からなっ
ている。一般に試験試薬は、同時に又は逐次混合される
が、ここにおいて結合度が、存在する分析対象物の量の
関数であるように、標識試薬がそれに対応する結合相手
に結合する。通常、結合体と遊離体が互いに物理的に分
離され、そのいずれかのフラクションに存在する標識の
量は、使用された特定の標識の活性を測定することによ
り決定される。
及び不均一系酵素イムノアッセイのような従来の不均一
系特異的結合試験法に適用される。そのような試験を行
なうための試験試薬は種々の異なる形態を取ることがで
きるが、（１）検出される分析対象物、（２）標識分析
対象物又は標識抗分析対象物からなる標識試薬、及び
（３）分析対象物の結合相手と第１の結合性物質とがカ
ップリングして結合した水分散性の支持体物質からなっ
ている。一般に試験試薬は、同時に又は逐次混合される
が、ここにおいて結合度が、存在する分析対象物の量の
関数であるように、標識試薬がそれに対応する結合相手
に結合する。通常、結合体と遊離体が互いに物理的に分
離され、そのいずれかのフラクションに存在する標識の
量は、使用された特定の標識の活性を測定することによ
り決定される。
結合反応系を形成する当業界で利用できる種々の方法に
従って、本発明の方法を実施することができる。そのよ
うな方法としては「競合的結合技法」、「サンドイッチ
技法」及び「イムノアッセイ法（免疫学的測定方法）」
として知られているものが挙げられる。これらすべての
不均一系によるイムノアッセイ法において、標識本の遊
離体及び結合体の分離は、通常そのような種のどちらか
一方を第２の結合性物質で固定化することにより行なわ
れる。したがって、本発明の改善された固定化工程をそ
のような公知方法に有利に適用することができる。
従って、本発明の方法を実施することができる。そのよ
うな方法としては「競合的結合技法」、「サンドイッチ
技法」及び「イムノアッセイ法（免疫学的測定方法）」
として知られているものが挙げられる。これらすべての
不均一系によるイムノアッセイ法において、標識本の遊
離体及び結合体の分離は、通常そのような種のどちらか
一方を第２の結合性物質で固定化することにより行なわ
れる。したがって、本発明の改善された固定化工程をそ
のような公知方法に有利に適用することができる。
本発明が適用される際、第１図の「競合的結合技法」の
反応混合物を形成する試験試薬は、（１）検出すべき分
析対象物、（２）通常、検出すべき分析対象物又はその
特異的結合性類縁体の標識体である標識試薬及び（３）
検出すべき分析対象物が固定化され得る「凝集性結合相
手」を含む。特に、第１図によると、検出すべき分析対
象物（「An」として示す）と標識試薬（「An＊」で示
す）は、凝集性結合相手（「Ab−B1（aggr.）」として
示す）との結合において競合し、ここにおいて凝集性結
合相手に結合しない標識試薬はいずれも「遊離体」であ
り、凝集性結合相手に結合した標識試薬は「結合体」
〔「An＊:Ab−B1（aggr.）」として示す〕である。以下
で更に詳しく説明するように、凝集性結合相手を、第１
の結合性物質（「B1」として示す）に結合性親和力を有
する第２の結合性物質（「B2」として示す）と結合させ
るため、第２の結合性物質を反応混合物に添加した時
に、第１の結合性物質と第２の結合性物質との結合の結
果「結合体」が凝集することにより、「遊離体」より容
易に分離できる固定化沈殿物（「An＊:Ab−B1（agg
r.）:B2」として示す）が形成されるようにする。
反応混合物を形成する試験試薬は、（１）検出すべき分
析対象物、（２）通常、検出すべき分析対象物又はその
特異的結合性類縁体の標識体である標識試薬及び（３）
検出すべき分析対象物が固定化され得る「凝集性結合相
手」を含む。特に、第１図によると、検出すべき分析対
象物（「An」として示す）と標識試薬（「An＊」で示
す）は、凝集性結合相手（「Ab−B1（aggr.）」として
示す）との結合において競合し、ここにおいて凝集性結
合相手に結合しない標識試薬はいずれも「遊離体」であ
り、凝集性結合相手に結合した標識試薬は「結合体」
〔「An＊:Ab−B1（aggr.）」として示す〕である。以下
で更に詳しく説明するように、凝集性結合相手を、第１
の結合性物質（「B1」として示す）に結合性親和力を有
する第２の結合性物質（「B2」として示す）と結合させ
るため、第２の結合性物質を反応混合物に添加した時
に、第１の結合性物質と第２の結合性物質との結合の結
果「結合体」が凝集することにより、「遊離体」より容
易に分離できる固定化沈殿物（「An＊:Ab−B1（agg
r.）:B2」として示す）が形成されるようにする。
第２図の「サンドイッチ技法」に用いられる試験試薬
は、標識試薬の性質を除いては、競合的結合技法に用い
る試薬と同様のものである。特に、ここで第２図による
と、標識試薬は検出される分析対象物の結合相手の遊離
型標識体（「Ab＊」として表わす）であり、この方法に
おいては、固定化され得る凝集性結合相手〔「Ab−B
1（aggr.）」として示す〕と標識体（Ab＊）と、その間
にサンドイッチ状に挟まれた検出すべき分析対象物
（「An」として示す）とからなる複合体〔「Ab＊:An:Ab
−B1（aggr.）として示す〕が形成される。この複合体
は結合型標識体と呼ばれ、このサンドイッチ状の複合体
の一部を構成しない標識体（Ab＊）は、「遊離型標識
体」である。第２の結合性物質（「B2」として示す）を
反応混合物に加えると、「結合型標識体」が凝集し、そ
れによって沈殿複合体である固定化結合型標識体（「Ab
＊:An:Ab−B1−（aggr.）:B2」として示す）となった
後、「遊離型標識体」より分離される。
は、標識試薬の性質を除いては、競合的結合技法に用い
る試薬と同様のものである。特に、ここで第２図による
と、標識試薬は検出される分析対象物の結合相手の遊離
型標識体（「Ab＊」として表わす）であり、この方法に
おいては、固定化され得る凝集性結合相手〔「Ab−B
1（aggr.）」として示す〕と標識体（Ab＊）と、その間
にサンドイッチ状に挟まれた検出すべき分析対象物
（「An」として示す）とからなる複合体〔「Ab＊:An:Ab
−B1（aggr.）として示す〕が形成される。この複合体
は結合型標識体と呼ばれ、このサンドイッチ状の複合体
の一部を構成しない標識体（Ab＊）は、「遊離型標識
体」である。第２の結合性物質（「B2」として示す）を
反応混合物に加えると、「結合型標識体」が凝集し、そ
れによって沈殿複合体である固定化結合型標識体（「Ab
＊:An:Ab−B1−（aggr.）:B2」として示す）となった
後、「遊離型標識体」より分離される。
第３図による特に好ましい免疫学的測定技法では、標識
試薬（「Ab＊」として示す）は、抗分析対象物（例えば
検出すべき分析対象物に対する抗体又はそのフラグメン
ト）の標識抗体であり、検出される分析対象物と共に、
検出すべき分析対象物の固定化可能体〔「An−B1（agg
r.）」として示す〕が結合反応系に加えられる。一般
に、標識抗体（Ab＊）は検出すべき分析対象物又は検出
すべき分析対象物の固定化可能体のいずれか一方に結合
し、固定化され得る遊離型標識体〔「Ab＊:An−B1（agg
r.）」として示す〕を形成する。ここで分析対象物が結
合した標識抗体（Ab＊:An）を「結合型標識体」と呼
ぶ。第２の結合性物質（「B2」として示す）を添加する
と、「遊離型標識体」が凝集し、それによって固定化遊
離型沈殿複合体（「Ab＊:An−B1（aggr.）:B2」として
示す）となった後、「結合型標識体」から容易に分離さ
れる。
試薬（「Ab＊」として示す）は、抗分析対象物（例えば
検出すべき分析対象物に対する抗体又はそのフラグメン
ト）の標識抗体であり、検出される分析対象物と共に、
検出すべき分析対象物の固定化可能体〔「An−B1（agg
r.）」として示す〕が結合反応系に加えられる。一般
に、標識抗体（Ab＊）は検出すべき分析対象物又は検出
すべき分析対象物の固定化可能体のいずれか一方に結合
し、固定化され得る遊離型標識体〔「Ab＊:An−B1（agg
r.）」として示す〕を形成する。ここで分析対象物が結
合した標識抗体（Ab＊:An）を「結合型標識体」と呼
ぶ。第２の結合性物質（「B2」として示す）を添加する
と、「遊離型標識体」が凝集し、それによって固定化遊
離型沈殿複合体（「Ab＊:An−B1（aggr.）:B2」として
示す）となった後、「結合型標識体」から容易に分離さ
れる。
免疫学的測定技法では、本発明に適用する際、標識抗分
析対象物（標識試薬）を、試験媒体中に存在すると思わ
れる分析対象物の推定量又は推定濃度に対し過剰量を反
応混合物中に存在させる。標識試薬は試験媒体中に存在
すると思われる分析対象物に結合するので、過剰量の標
識試薬が、試験媒体中に存在すると思われる分析対象物
に充分な数の結合相手を用意し、そのため存在すると思
われる実質的にすべての分析対象物に標識試薬が結合す
る、即ち「結合型標識体」となる。過剰の標識試薬が結
合することにより、試験媒体中に存在すると思われる実
質的にすべての分析対象物を検出可能にするので、正確
で、感度の高い、分析対象物の測定が行なわれることが
わかる。
析対象物（標識試薬）を、試験媒体中に存在すると思わ
れる分析対象物の推定量又は推定濃度に対し過剰量を反
応混合物中に存在させる。標識試薬は試験媒体中に存在
すると思われる分析対象物に結合するので、過剰量の標
識試薬が、試験媒体中に存在すると思われる分析対象物
に充分な数の結合相手を用意し、そのため存在すると思
われる実質的にすべての分析対象物に標識試薬が結合す
る、即ち「結合型標識体」となる。過剰の標識試薬が結
合することにより、試験媒体中に存在すると思われる実
質的にすべての分析対象物を検出可能にするので、正確
で、感度の高い、分析対象物の測定が行なわれることが
わかる。
同様に、検出される分析対象物の固定化可能体（An−
B1）は、標識試薬が結合しておらず、反応混合物中に残
存する標識抗分析対象物（Ab＊）の量に対し過剰量、反
応混合物中に存在する。したがって、分析対象物の固定
化可能体の過剰量は、最終的に固定化し及び「結合型標
識体」から実質的にすべての「遊離型標識体」を分離す
るために、標識抗分析対象物の実質的にすべての「遊離
体」（Ab＊）と結合するのに十分な量が存在することで
ある。因に、固定化を行なうことにより実質的にすべて
の「遊離型標識体」を「結合型標識体」から分離するた
めに、十分な量の第２の結合性物質を存在させて、実質
的にすべての「遊離型標識体」の凝集された固定化体が
形成されるように、第２の結合性物質を反応混合物に加
える。
B1）は、標識試薬が結合しておらず、反応混合物中に残
存する標識抗分析対象物（Ab＊）の量に対し過剰量、反
応混合物中に存在する。したがって、分析対象物の固定
化可能体の過剰量は、最終的に固定化し及び「結合型標
識体」から実質的にすべての「遊離型標識体」を分離す
るために、標識抗分析対象物の実質的にすべての「遊離
体」（Ab＊）と結合するのに十分な量が存在することで
ある。因に、固定化を行なうことにより実質的にすべて
の「遊離型標識体」を「結合型標識体」から分離するた
めに、十分な量の第２の結合性物質を存在させて、実質
的にすべての「遊離型標識体」の凝集された固定化体が
形成されるように、第２の結合性物質を反応混合物に加
える。
過剰量の試薬の使用により、動力学的及び平衡状態にお
ける利点が良好に得られる。特に過剰量の試薬が結合反
応の動力学を促進し、それによって反応の平衡が移動し
て、分析対象物の温度が低くても結合種の形成を助け
る。対照的に、競合的試験の方法は特定の試薬抗体（An
＊）を必要とする。一方免疫学的測定方法では、試験の
ための特定の試薬は抗原（又はハプテン）それ自体にな
る。したがって、試験試薬が過剰量であるため、試験性
能についてのその濃度変化による影響は、従来の競合的
試験の方法で見られるものと比較して小さく、それによ
って試験添加の誤差限界は、少なくとも過剰量で添加さ
れた場合には許容される。
ける利点が良好に得られる。特に過剰量の試薬が結合反
応の動力学を促進し、それによって反応の平衡が移動し
て、分析対象物の温度が低くても結合種の形成を助け
る。対照的に、競合的試験の方法は特定の試薬抗体（An
＊）を必要とする。一方免疫学的測定方法では、試験の
ための特定の試薬は抗原（又はハプテン）それ自体にな
る。したがって、試験試薬が過剰量であるため、試験性
能についてのその濃度変化による影響は、従来の競合的
試験の方法で見られるものと比較して小さく、それによ
って試験添加の誤差限界は、少なくとも過剰量で添加さ
れた場合には許容される。
上記のように平衡を移動させることにより、背景信号、
そして更には試験の感度に影響を与える非結合標識の量
を低減させることもできる。同様に、単一抗体の免疫学
的測定方法を用いる場合、非特異的結合の存在により、
２つの抗体結合反応が伴い、固定化相に結合した標識を
測定するサンドイッチ型イムノアッセイで見られるよう
な試験の感度を低下させる背景信号が生じない。単一抗
体の免疫学的測定方法は、サンドイッチ型試験では実用
不可能な単一エピトープ（epitope）を有する分析対象
物の検出に用いることも可能である。更にまた、過剰量
の一価のモノクローナル抗体を過剰量のその他の試験試
薬とともに試験に使用する場合、そのような試験方法を
好都合な検量過程への適用を容易にする用量応答直線が
得られる。
そして更には試験の感度に影響を与える非結合標識の量
を低減させることもできる。同様に、単一抗体の免疫学
的測定方法を用いる場合、非特異的結合の存在により、
２つの抗体結合反応が伴い、固定化相に結合した標識を
測定するサンドイッチ型イムノアッセイで見られるよう
な試験の感度を低下させる背景信号が生じない。単一抗
体の免疫学的測定方法は、サンドイッチ型試験では実用
不可能な単一エピトープ（epitope）を有する分析対象
物の検出に用いることも可能である。更にまた、過剰量
の一価のモノクローナル抗体を過剰量のその他の試験試
薬とともに試験に使用する場合、そのような試験方法を
好都合な検量過程への適用を容易にする用量応答直線が
得られる。
本発明の教示により、以下に更に詳細に述べるように、
添加の順序が異なり又は結合反応方法が異なる操作技法
も、本発明の教示から逸脱しない範囲で不均一系による
特異的結合試験を行なうために開発し得ることがわか
る。
添加の順序が異なり又は結合反応方法が異なる操作技法
も、本発明の教示から逸脱しない範囲で不均一系による
特異的結合試験を行なうために開発し得ることがわか
る。
更にまた、本発明は特異的結合相手が存在するいかなる
分析対象物の検出に適用でき、また逆に液状媒体の分析
対象物の結合能（通常媒体中の分析対象物の結合相手の
存在によって）の測定にも適用できる。分析対象物は通
常ペプチド、ポリペプチド、蛋白質、炭水化物、糖蛋白
質、ステロイド、核酸又はその他の有機分子であり、そ
れらの特異的結合相手は生物系に存在するか又は結合す
ることができる。相関的に言うと、分析対象物は通常、
抗原とそれに対する抗体；ハプテンとそれに対する抗
体；並びにホルモン、ビタミン、代謝物質及び薬剤とそ
れらの受容体及び結合性物質からなる群より選ばれる。
特異的結合相手が存在するその他の分析対象物及び／又
は結合対成分としては、炭水化物とレクチン；金属とキ
レート化剤；プロテインＡに対し無損傷結合部位を有す
る抗体又はそのフラグメントとプロテインA:相補的な一
本鎖オリゴヌクレオチド配列とポリヌクレオチド配列；
補因子又は補欠分子族とアポプロテイン（apoprotei
n）；エフェクター分子（effector molecule）／受容体
対；疎水性の相互作用性物質の対；酵素補因子と酵素；
高分子酸と塩基；染料と蛋白質結合剤；ペプチドと特異
的蛋白質結合剤；（例えばリボヌクレアーゼ、Ｓ−ペプ
チド及びボヌクレアーゼＳ蛋白質）；酵素抑制剤（可逆
性及び不可逆性）と酵素等が挙げられる。分析対象物は
通常、抗体、抗原性ポリペプチドもしくは蛋白質のよう
な、分子量が1,000から10,000,000の免疫学的に活性な
ポリペプチド、蛋白質、炭水化物もしくは核酸、又は分
子量が100から1,500のパプテンである。
分析対象物の検出に適用でき、また逆に液状媒体の分析
対象物の結合能（通常媒体中の分析対象物の結合相手の
存在によって）の測定にも適用できる。分析対象物は通
常ペプチド、ポリペプチド、蛋白質、炭水化物、糖蛋白
質、ステロイド、核酸又はその他の有機分子であり、そ
れらの特異的結合相手は生物系に存在するか又は結合す
ることができる。相関的に言うと、分析対象物は通常、
抗原とそれに対する抗体；ハプテンとそれに対する抗
体；並びにホルモン、ビタミン、代謝物質及び薬剤とそ
れらの受容体及び結合性物質からなる群より選ばれる。
特異的結合相手が存在するその他の分析対象物及び／又
は結合対成分としては、炭水化物とレクチン；金属とキ
レート化剤；プロテインＡに対し無損傷結合部位を有す
る抗体又はそのフラグメントとプロテインA:相補的な一
本鎖オリゴヌクレオチド配列とポリヌクレオチド配列；
補因子又は補欠分子族とアポプロテイン（apoprotei
n）；エフェクター分子（effector molecule）／受容体
対；疎水性の相互作用性物質の対；酵素補因子と酵素；
高分子酸と塩基；染料と蛋白質結合剤；ペプチドと特異
的蛋白質結合剤；（例えばリボヌクレアーゼ、Ｓ−ペプ
チド及びボヌクレアーゼＳ蛋白質）；酵素抑制剤（可逆
性及び不可逆性）と酵素等が挙げられる。分析対象物は
通常、抗体、抗原性ポリペプチドもしくは蛋白質のよう
な、分子量が1,000から10,000,000の免疫学的に活性な
ポリペプチド、蛋白質、炭水化物もしくは核酸、又は分
子量が100から1,500のパプテンである。
更にまた、標識試薬としては従来の検出可能な化学基が
挙げられる、そのような検出可能な化学基は、検知可能
な物理的又は化学的性質を有していればいかなる材料で
もよい。そのような材料はイムノアッセイの分野では十
分開発されており、一般にそのような方法に有用であれ
ばいかなる標識も本発明に適用することができる。酵素
〔臨床化学（Clin.Chem.）（1976）22:1243参照〕、酵
素基質（米国特許第4,492,751号参照）、補欠分子群又
は補酵素（米国特許第4,230,797号及び4,238,565号参
照）、及び酵素抑制剤（米国特許第4,134,792号参
照）；スピン標識；蛍光体（臨床化学（1979）25:353参
照）；発色団；化学発光体及び生物発光体のような発光
体（米国特許第4,380,580号参照）；特異的結合性リガ
ンド（例えば、ビオチン及びハプテン）；電子活性種；
並びに3H、35S、32P、125I及び14Cのようなラジオアイ
ソトープのような酵素的に活性な基が特に有用である。
そのような標識及び標識対は、それら自体の物理的性質
（例えば、蛍光体、発色団及びラジオアイソトープの）
又はそれらの反応性又は結合性（例えば、酵素、基質、
補酵素及び抑制剤の）に基づいて検知される。
挙げられる、そのような検出可能な化学基は、検知可能
な物理的又は化学的性質を有していればいかなる材料で
もよい。そのような材料はイムノアッセイの分野では十
分開発されており、一般にそのような方法に有用であれ
ばいかなる標識も本発明に適用することができる。酵素
〔臨床化学（Clin.Chem.）（1976）22:1243参照〕、酵
素基質（米国特許第4,492,751号参照）、補欠分子群又
は補酵素（米国特許第4,230,797号及び4,238,565号参
照）、及び酵素抑制剤（米国特許第4,134,792号参
照）；スピン標識；蛍光体（臨床化学（1979）25:353参
照）；発色団；化学発光体及び生物発光体のような発光
体（米国特許第4,380,580号参照）；特異的結合性リガ
ンド（例えば、ビオチン及びハプテン）；電子活性種；
並びに3H、35S、32P、125I及び14Cのようなラジオアイ
ソトープのような酵素的に活性な基が特に有用である。
そのような標識及び標識対は、それら自体の物理的性質
（例えば、蛍光体、発色団及びラジオアイソトープの）
又はそれらの反応性又は結合性（例えば、酵素、基質、
補酵素及び抑制剤の）に基づいて検知される。
本発明の教示によると、結合試験の反応混合物は試験媒
体と、標識試薬及び固定化され得る試薬を含む試験試薬
とを合わせることにより形成される。標識試薬、好まし
くは標識抗分析対象物、又は更に具体的には検出される
分析対象物の抗体の標識された一価の抗体フラグメント
は、試験媒体中の分析対象物の量の関数として遊離体及
び結合体を形成する。
体と、標識試薬及び固定化され得る試薬を含む試験試薬
とを合わせることにより形成される。標識試薬、好まし
くは標識抗分析対象物、又は更に具体的には検出される
分析対象物の抗体の標識された一価の抗体フラグメント
は、試験媒体中の分析対象物の量の関数として遊離体及
び結合体を形成する。
更に具体的には、固定化され得る試薬としては、固定化
される標識試薬の遊離体及び結合体のどちらか一方の結
合相手と、固定化され得る試薬がそれによって標識試薬
の遊離体及び結合体のどちらか一方に結合する第１の結
合性物質の両者が挙げられる。このようにして、以下で
更に詳しく述べるように、固定化され得る標識体が形成
され、これは固定化されなかった標識体から最終的に分
離される。
される標識試薬の遊離体及び結合体のどちらか一方の結
合相手と、固定化され得る試薬がそれによって標識試薬
の遊離体及び結合体のどちらか一方に結合する第１の結
合性物質の両者が挙げられる。このようにして、以下で
更に詳しく述べるように、固定化され得る標識体が形成
され、これは固定化されなかった標識体から最終的に分
離される。
固定化標識体は、第２の、二価又は多価の結合性物質を
反応混合物に加えることにより形成され、ここにおい
て、第２の結合性物質は第１の結合性物質に対する結合
性親和力を有する。したがって、第２の結合性物質は、
第１の結合性物質と第２の結合性物質との分子間又は粒
子間の結合の結果として支持体物質を凝集させ、ここに
おいて、非固定化標識体を含むフラクションと固定化標
識体からなる、沈殿した支持体物質複合体を含むフラク
ションが形成される。
反応混合物に加えることにより形成され、ここにおい
て、第２の結合性物質は第１の結合性物質に対する結合
性親和力を有する。したがって、第２の結合性物質は、
第１の結合性物質と第２の結合性物質との分子間又は粒
子間の結合の結果として支持体物質を凝集させ、ここに
おいて、非固定化標識体を含むフラクションと固定化標
識体からなる、沈殿した支持体物質複合体を含むフラク
ションが形成される。
固定化され得る支持体物質 本発明の固定化され得る成分又は試薬は、水分散性で凝
集性の支持体物質であり、反応溶液中で凝集又は沈殿す
るようになっており、それによって標識試薬の結合体及
び遊離体の所望のどちらか一方を分離する役割を果たし
ている。支持体物質は水溶性物質でも水懸濁性の不溶性
の物質であってもよい。
集性の支持体物質であり、反応溶液中で凝集又は沈殿す
るようになっており、それによって標識試薬の結合体及
び遊離体の所望のどちらか一方を分離する役割を果たし
ている。支持体物質は水溶性物質でも水懸濁性の不溶性
の物質であってもよい。
水懸濁性の不溶性物質の場合、高分子微粒子、好ましく
はプラスチックビーズを使用する。本発明者らは、米国
特許第4,230,683号に開示されている6mmビーズのような
巨大粒子を使用すると、混合が必要となる可能性と同様
に表面積が限られるという問題が生じることを見出し
た。一方では、表面積の増大及び支持体物質との相互作
用の増強は、小型の、即ち直径50ミクロン未満のビーズ
により達成されるが、依然として、特に直径３ミクロン
未満の粒子では、凝集を生ぜしめるために遠心工程を必
要とする分離工程が必要である。同様に、ラテックス凝
集試験において、従来の分析対象物／抗体結合反応で
は、分離を行なうために凝集させることが必要である。
したがって、本発明は、好ましい実施態様において、遠
心又は同様に複雑な分離技法の必要がなく結合体と遊離
体とが分離されるように、適切な第２の結合性物質の添
加時にビーズの沈殿性を増強する、本発明の第１の結合
性物質が結合する、直径が50ミクロン未満のプラスチッ
クビーズ又は微小球を提供することにより、この問題を
解消する。
はプラスチックビーズを使用する。本発明者らは、米国
特許第4,230,683号に開示されている6mmビーズのような
巨大粒子を使用すると、混合が必要となる可能性と同様
に表面積が限られるという問題が生じることを見出し
た。一方では、表面積の増大及び支持体物質との相互作
用の増強は、小型の、即ち直径50ミクロン未満のビーズ
により達成されるが、依然として、特に直径３ミクロン
未満の粒子では、凝集を生ぜしめるために遠心工程を必
要とする分離工程が必要である。同様に、ラテックス凝
集試験において、従来の分析対象物／抗体結合反応で
は、分離を行なうために凝集させることが必要である。
したがって、本発明は、好ましい実施態様において、遠
心又は同様に複雑な分離技法の必要がなく結合体と遊離
体とが分離されるように、適切な第２の結合性物質の添
加時にビーズの沈殿性を増強する、本発明の第１の結合
性物質が結合する、直径が50ミクロン未満のプラスチッ
クビーズ又は微小球を提供することにより、この問題を
解消する。
好ましくは、本発明に従って用いられるビーズの性質
は、乳化重合又は懸濁重合により製造される、各粒子の
大きさがそれぞれ直径が５ミクロン未満又は直径が５ミ
クロンより大きい均一なラテックス粒子である。また、
直径２−20ミクロンの粒径は「膨潤乳化重合」〔L.バン
グス（Bangs）著、「均一ラテックス粒子（Uniformlate
x Particles）、セラゲン社（Seragen Inc）,1984年〕
により効果的に得られる。
は、乳化重合又は懸濁重合により製造される、各粒子の
大きさがそれぞれ直径が５ミクロン未満又は直径が５ミ
クロンより大きい均一なラテックス粒子である。また、
直径２−20ミクロンの粒径は「膨潤乳化重合」〔L.バン
グス（Bangs）著、「均一ラテックス粒子（Uniformlate
x Particles）、セラゲン社（Seragen Inc）,1984年〕
により効果的に得られる。
また、その他の粒子材料を凝集性支持体物質として使用
することができ、例えば架橋デキストラン又はアガロー
スのような多糖類、ゴム、ガラス、ナイロン及びポリア
クリレートで作られた粒子材料が挙げられる。同様に、
カルボキシル化されたポリスチレン、ポリビニルトルエ
ン又はスチレンブタジアミンの共重合体、ポリアクロレ
イン微小球、ポリウレタン、ポリ（メタクリル酸メチ
ル）粒子、花粉粒子、及びメタクリル酸ポリグリシジ
ル、微結晶質セルロース又はそれらの混合物の皮殻で囲
まれたポリアクリルアミド、スポロポレニン、ポリスチ
レン又はポリビニルナフタレン等の核から粒子を製造す
ることができる。
することができ、例えば架橋デキストラン又はアガロー
スのような多糖類、ゴム、ガラス、ナイロン及びポリア
クリレートで作られた粒子材料が挙げられる。同様に、
カルボキシル化されたポリスチレン、ポリビニルトルエ
ン又はスチレンブタジアミンの共重合体、ポリアクロレ
イン微小球、ポリウレタン、ポリ（メタクリル酸メチ
ル）粒子、花粉粒子、及びメタクリル酸ポリグリシジ
ル、微結晶質セルロース又はそれらの混合物の皮殻で囲
まれたポリアクリルアミド、スポロポレニン、ポリスチ
レン又はポリビニルナフタレン等の核から粒子を製造す
ることができる。
本発明に従って使用されるビーズ又は微小球は上記のよ
うに製造することができるが、直径0.38〜20ミクロンの
広範囲な微小球が市販されており、それらは微小球の表
面に試薬を共有結合させるための多数の官能基、例えば
アミノ、カルボキシ、イミノ等を有している。
うに製造することができるが、直径0.38〜20ミクロンの
広範囲な微小球が市販されており、それらは微小球の表
面に試薬を共有結合させるための多数の官能基、例えば
アミノ、カルボキシ、イミノ等を有している。
水溶性物質の場合には、適切な重合体が使用される。同
様に、上記重合体は遠心又は同様に複雑な分離技法の必
要がなく結合体と遊離体とが分離されるように、適切な
第２の結合性物質の添加時に重合体の沈殿性を増強す
る、本発明の第１の結合性物質をそれ自体に結合せしめ
て有する。
様に、上記重合体は遠心又は同様に複雑な分離技法の必
要がなく結合体と遊離体とが分離されるように、適切な
第２の結合性物質の添加時に重合体の沈殿性を増強す
る、本発明の第１の結合性物質をそれ自体に結合せしめ
て有する。
好ましくは、そのような重合体材料はポリアラニン、ポ
リリシン等のようなポリアミノ酸の共重合体である。そ
の他の重合体としては、デキストラン及びその他の多糖
類、蛋白質、ポリ核酸（一本鎖のRNA又はDNA）、二本鎖
のDNA及びポリエチレンアミンが挙げられる。更に誘導
体化可能な重合体としては、ポリビニルアルコール、ポ
リアリルアルコール、ヒドロキシエチルセルロース、ヒ
ドロキシプロピルセルロース及びその他の天然及び合成
の水溶性重合体が挙げられる。
リリシン等のようなポリアミノ酸の共重合体である。そ
の他の重合体としては、デキストラン及びその他の多糖
類、蛋白質、ポリ核酸（一本鎖のRNA又はDNA）、二本鎖
のDNA及びポリエチレンアミンが挙げられる。更に誘導
体化可能な重合体としては、ポリビニルアルコール、ポ
リアリルアルコール、ヒドロキシエチルセルロース、ヒ
ドロキシプロピルセルロース及びその他の天然及び合成
の水溶性重合体が挙げられる。
アガロース及びポリアクリルアミド類へのハプテン及び
その他の生物分子のカップリングの具体例は、クアトレ
カサス（Cuatrecasas）による、“J.Biol.Chem.,"245
巻、3059−3065頁（1970）；並びにW.B.ヤコビー（Jaco
by）及びM.ウィルチェック（Wilchek）による、“Metho
ds in Enzymology"、34巻、Academic Press、ニューヨ
ーク、1974に記載されている。これらの方法を用いて、
分析対象物（ハプテン）又は結合相手を重合体又はビー
ズの試薬に共有結合させることができる。更に、例えば
ガラス及びプラスチックのビーズによる不溶性キャリア
への物理的吸着を用いることができる。
その他の生物分子のカップリングの具体例は、クアトレ
カサス（Cuatrecasas）による、“J.Biol.Chem.,"245
巻、3059−3065頁（1970）；並びにW.B.ヤコビー（Jaco
by）及びM.ウィルチェック（Wilchek）による、“Metho
ds in Enzymology"、34巻、Academic Press、ニューヨ
ーク、1974に記載されている。これらの方法を用いて、
分析対象物（ハプテン）又は結合相手を重合体又はビー
ズの試薬に共有結合させることができる。更に、例えば
ガラス及びプラスチックのビーズによる不溶性キャリア
への物理的吸着を用いることができる。
固定化され得る成分に結合した、標識試薬の遊離体及び
結合体のどちらか一方の結合相手は、好ましくは検出さ
れる分析対象物又はその結合性類縁体又はその結合相手
であることがわかる。したがって、固定化され得る結合
相手は標識体に対し結合性親和力を有し、それにより、
結合相手への標識体の結合の結果、標識試薬の遊離体及
び結合体の所望のどちらか一方の固定化可能体が生じ
る。このようにして、固定化され得る成分の沈殿時に、
所望の種がその結合相手を介して固定化され得る成分に
結合した結果として、遊離体及び結合体の所望のどちら
か一方が他方の種から分離される。
結合体のどちらか一方の結合相手は、好ましくは検出さ
れる分析対象物又はその結合性類縁体又はその結合相手
であることがわかる。したがって、固定化され得る結合
相手は標識体に対し結合性親和力を有し、それにより、
結合相手への標識体の結合の結果、標識試薬の遊離体及
び結合体の所望のどちらか一方の固定化可能体が生じ
る。このようにして、固定化され得る成分の沈殿時に、
所望の種がその結合相手を介して固定化され得る成分に
結合した結果として、遊離体及び結合体の所望のどちら
か一方が他方の種から分離される。
更にまた、固定化され得る支持体物質の利点の１つは、
第１の結合性物質の複数の分子と同様に複数の結合相手
の分子がそれに結合することができることであることが
わかる。その結果、標識試薬の遊離体及び結合体の所望
のどちらか一方の種の複数の分子を固定化して大量処理
効果の結果、結合反応を促進することができる。同様
に、支持体物質に結合した第１の結合性物質の複数の分
子は、反応溶液への第２の結合性物質の添加時に１つの
支持体物質が多数の支持体物質と結合することを可能に
することによって、支持体物質複合体の凝集及び沈殿を
促進する。
第１の結合性物質の複数の分子と同様に複数の結合相手
の分子がそれに結合することができることであることが
わかる。その結果、標識試薬の遊離体及び結合体の所望
のどちらか一方の種の複数の分子を固定化して大量処理
効果の結果、結合反応を促進することができる。同様
に、支持体物質に結合した第１の結合性物質の複数の分
子は、反応溶液への第２の結合性物質の添加時に１つの
支持体物質が多数の支持体物質と結合することを可能に
することによって、支持体物質複合体の凝集及び沈殿を
促進する。
特異的結合物質 上記のように、本発明の固定化され得る成分又は支持体
物質は、反応溶液への第２の結合性物質の添加後の支持
体物質複合体の凝集及びそれに続く沈殿にとって必須で
ある第１の結合性物質を含む。第１の結合性物質に対し
二価又は多価の結合性親和力を有する第２の結合性物質
は、第１及び第２の結合性物質の間の相互作用の結果と
して、複数の支持体物質を互いに結合させ、それによっ
て支持体物質の沈殿可能な複合体を形成する。
物質は、反応溶液への第２の結合性物質の添加後の支持
体物質複合体の凝集及びそれに続く沈殿にとって必須で
ある第１の結合性物質を含む。第１の結合性物質に対し
二価又は多価の結合性親和力を有する第２の結合性物質
は、第１及び第２の結合性物質の間の相互作用の結果と
して、複数の支持体物質を互いに結合させ、それによっ
て支持体物質の沈殿可能な複合体を形成する。
本発明の教示によると、第１及び第２の結合性物質の性
質は結合性物質のいかなる特定の対にも限定されないこ
とがわかる。因に、多数の結合性物質の対を支持体物質
の凝集に使用することができる。そのような結合性物質
対としては、ビオチンとアビジン、ハプテン又は抗原と
抗体の対、レクチンと炭水化物の対、一本鎖ポリヌクレ
オチドの相補鎖多酸及び多塩基の対等が挙げられる。適
切な対の選択により、支持体物質に結合した結合相手に
結合する標識体の凝集反応に対する特異的結合（例えば
免疫化学的）反応の割合を部分的に制御することができ
る。
質は結合性物質のいかなる特定の対にも限定されないこ
とがわかる。因に、多数の結合性物質の対を支持体物質
の凝集に使用することができる。そのような結合性物質
対としては、ビオチンとアビジン、ハプテン又は抗原と
抗体の対、レクチンと炭水化物の対、一本鎖ポリヌクレ
オチドの相補鎖多酸及び多塩基の対等が挙げられる。適
切な対の選択により、支持体物質に結合した結合相手に
結合する標識体の凝集反応に対する特異的結合（例えば
免疫化学的）反応の割合を部分的に制御することができ
る。
本発明の第２の結合性物質は、可溶体でも不溶体であっ
てもよい。第２の結合性物質が不溶体である場合、第２
の結合性物質は、プラスチックビーズ又はポリスチレ試
験管の内壁のような固体支持構造上に不溶化又は固定化
される。このようにして、反応混合物からの凝集性支持
体物質の除去が増強される。
てもよい。第２の結合性物質が不溶体である場合、第２
の結合性物質は、プラスチックビーズ又はポリスチレ試
験管の内壁のような固体支持構造上に不溶化又は固定化
される。このようにして、反応混合物からの凝集性支持
体物質の除去が増強される。
試験キット 本発明の試験試薬は市販用に包装された形で、試験具の
構成中の、試薬としての相溶性の許す範囲の組成物もし
くは添加物として、又は試験キット、即ち必要な試薬を
入れた１つ以上の容器を組み合わせた包装品として供さ
れる。試験試薬には所望の結合反応系に適する試薬が含
まれる。試験試薬としては更に、緩衝剤、稀釈剤、標準
物質等のような、使用者の見地から試験に有用であるこ
とが知られているその他の物質が挙げられる。特に好ま
しいものは、（１）標識抗分析対象物、（２）プラスチ
ックビーズ又は水溶性重合体のような支持体物質に第１
の結合性物質及び分析対象物又はその結合性類縁体とが
カップリングして結合した水分散性の凝集性試薬、及び
（３）該第１の結合性物質に特異的に結合して該支持体
物質を凝集させて該支持体物質の沈殿複合体を形成させ
ることができる第２の結合性物質からなる、本発明の不
均一系イムノアッセイ用の試験キットである。好ましい
試験キットで使用される特異的標識は上記で述べたよう
に、用いる方法により決定される。好ましい実施態様に
おいて、標識は酵素であり、試験キットは更にそのよう
な酵素の活性に応答して色変化を示す指示薬を含む。そ
のような指示薬は、試験片（試験片を反応混合物の上澄
に浸漬するか又は試験片に上澄のアリコートを施すこと
ができる）の形における固体キャリアマトリックスに包
含させることにより標識体の非固定化体の検出に好都合
な手段を提供することができる。
構成中の、試薬としての相溶性の許す範囲の組成物もし
くは添加物として、又は試験キット、即ち必要な試薬を
入れた１つ以上の容器を組み合わせた包装品として供さ
れる。試験試薬には所望の結合反応系に適する試薬が含
まれる。試験試薬としては更に、緩衝剤、稀釈剤、標準
物質等のような、使用者の見地から試験に有用であるこ
とが知られているその他の物質が挙げられる。特に好ま
しいものは、（１）標識抗分析対象物、（２）プラスチ
ックビーズ又は水溶性重合体のような支持体物質に第１
の結合性物質及び分析対象物又はその結合性類縁体とが
カップリングして結合した水分散性の凝集性試薬、及び
（３）該第１の結合性物質に特異的に結合して該支持体
物質を凝集させて該支持体物質の沈殿複合体を形成させ
ることができる第２の結合性物質からなる、本発明の不
均一系イムノアッセイ用の試験キットである。好ましい
試験キットで使用される特異的標識は上記で述べたよう
に、用いる方法により決定される。好ましい実施態様に
おいて、標識は酵素であり、試験キットは更にそのよう
な酵素の活性に応答して色変化を示す指示薬を含む。そ
のような指示薬は、試験片（試験片を反応混合物の上澄
に浸漬するか又は試験片に上澄のアリコートを施すこと
ができる）の形における固体キャリアマトリックスに包
含させることにより標識体の非固定化体の検出に好都合
な手段を提供することができる。
ここで、次の実施例により本発明を説明するが、本発明
はそれらにより制限されるものではない。
はそれらにより制限されるものではない。
実施例１ 酵素標識抗体の調製 抗ジゴキシン抗体（約6mg/ml）を含有する腹水症液を0.
1Mクエン酸緩衝液（pH3.5）で５倍に希釈し、1:50（w/
w）のペプシン／抗体溶液により37℃で48時間インキュ
ベートした。アミコン（Amicon）PM30膜〔米国、マサチ
ューセッツ州、ダンバースのアミコン社（Amicon Cor
p.）〕を用いた限外過により約5mlに濃縮後、試料を
セファクリル（Sephacryl）Ｓ−300〔米国、ニュージャ
ージー州、ピスキャタウェイのファルマシア社（Pharma
cia Inc.）〕カラム（2.4×90cm）上でゲル過し、10m
Mリン酸ナトリウムと0.15M塩化ナトリウム（pH7.2）で
平衡化させ、抗体のＦ（ab′）２フラグメントを単離し
た。抗体を10mMのジチオトレイトールで還元し、G6PDポ
リアクリルアミドゲル上で脱塩した後、活性化されたβ
−ガラクトシダーゼとの反応の直前に蛋白質ピークをプ
ールした。β−ガラクトシダーゼ〔IX型、米国、ミズー
リ州、セントルイスのシグマケミカル社（Sigma Chemic
al Co.）〕を50mMのリン酸ナトリウム（pH7.4）に対し
透析した。10mg/mlの溶液を、複素二官能性架橋剤、４
−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カル
ボン酸スクシンイミジルと室温で２時間反応させ、１×
60cmのG6PDカラムにこの材料を通過させた。活性化され
たβ−ガラクトシダーゼを抗体と1:1の比で混合し、４
℃で20時間反応させた。この材料をアミコンPM30膜を用
いた限外過で濃度が約10倍となるように濃縮した。こ
の濃縮物を1.5×110cmのACA22樹脂〔米国、メリーラン
ド州、ガイサースバーグのLKBインスツルメンツ社（LKB
Instruments Inc.）］を通過させ、遊離抗体フラグメン
ト（Fab）、及びFabとβ−ガラクトシダーゼとの高置換
オリゴマーからFa−ｂ−β−ガラクトシダーゼを分離し
た。主要な酵素／抗体フラクションをプールし、固定化
されたウアバインを含有するアフイニティーカラム上を
通過させた。固定化ウアバインカラムを調製するため
に、スミス（Smith）等〔Biochem.9:331−337（197
0）］によって記載されている方法と同様にして、ウア
バインを牛血清アルブミンに連結させた。先に述べた方
法〔N.ウィルソン（Wilson）及びナカネ、P.J.of Immno
l.Methods12,171−181,（1976）〕による過ヨウ素酸酸
化後、ウアバイン−BSAをセファデックス（Sephade
x ）Ｇ−25〔米国、ニュージャージー州、ピスキャタ
ウェイのファルマシア社〕に連結させた。親和性樹脂の
１×10cmカラムにFab−β−ガラクトシダーゼを含有す
る試料を通過させた。遊離β−ガラクトシダーゼをカラ
ムから溶離し、次に20mMのウアバインを含有する溶離溶
液によりカラムより抗体−酵素複合体を放出させた。５
本のカラム内容物を洗浄し、プールした。プールを2ml
に濃縮し、リン酸塩食塩緩衝液（50mMリン酸ナトリウ
ム、0.1M塩化ナトリウム、pH7.4）を10回交換しながら2
0時間浸透した。
1Mクエン酸緩衝液（pH3.5）で５倍に希釈し、1:50（w/
w）のペプシン／抗体溶液により37℃で48時間インキュ
ベートした。アミコン（Amicon）PM30膜〔米国、マサチ
ューセッツ州、ダンバースのアミコン社（Amicon Cor
p.）〕を用いた限外過により約5mlに濃縮後、試料を
セファクリル（Sephacryl）Ｓ−300〔米国、ニュージャ
ージー州、ピスキャタウェイのファルマシア社（Pharma
cia Inc.）〕カラム（2.4×90cm）上でゲル過し、10m
Mリン酸ナトリウムと0.15M塩化ナトリウム（pH7.2）で
平衡化させ、抗体のＦ（ab′）２フラグメントを単離し
た。抗体を10mMのジチオトレイトールで還元し、G6PDポ
リアクリルアミドゲル上で脱塩した後、活性化されたβ
−ガラクトシダーゼとの反応の直前に蛋白質ピークをプ
ールした。β−ガラクトシダーゼ〔IX型、米国、ミズー
リ州、セントルイスのシグマケミカル社（Sigma Chemic
al Co.）〕を50mMのリン酸ナトリウム（pH7.4）に対し
透析した。10mg/mlの溶液を、複素二官能性架橋剤、４
−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カル
ボン酸スクシンイミジルと室温で２時間反応させ、１×
60cmのG6PDカラムにこの材料を通過させた。活性化され
たβ−ガラクトシダーゼを抗体と1:1の比で混合し、４
℃で20時間反応させた。この材料をアミコンPM30膜を用
いた限外過で濃度が約10倍となるように濃縮した。こ
の濃縮物を1.5×110cmのACA22樹脂〔米国、メリーラン
ド州、ガイサースバーグのLKBインスツルメンツ社（LKB
Instruments Inc.）］を通過させ、遊離抗体フラグメン
ト（Fab）、及びFabとβ−ガラクトシダーゼとの高置換
オリゴマーからFa−ｂ−β−ガラクトシダーゼを分離し
た。主要な酵素／抗体フラクションをプールし、固定化
されたウアバインを含有するアフイニティーカラム上を
通過させた。固定化ウアバインカラムを調製するため
に、スミス（Smith）等〔Biochem.9:331−337（197
0）］によって記載されている方法と同様にして、ウア
バインを牛血清アルブミンに連結させた。先に述べた方
法〔N.ウィルソン（Wilson）及びナカネ、P.J.of Immno
l.Methods12,171−181,（1976）〕による過ヨウ素酸酸
化後、ウアバイン−BSAをセファデックス（Sephade
x ）Ｇ−25〔米国、ニュージャージー州、ピスキャタ
ウェイのファルマシア社〕に連結させた。親和性樹脂の
１×10cmカラムにFab−β−ガラクトシダーゼを含有す
る試料を通過させた。遊離β−ガラクトシダーゼをカラ
ムから溶離し、次に20mMのウアバインを含有する溶離溶
液によりカラムより抗体−酵素複合体を放出させた。５
本のカラム内容物を洗浄し、プールした。プールを2ml
に濃縮し、リン酸塩食塩緩衝液（50mMリン酸ナトリウ
ム、0.1M塩化ナトリウム、pH7.4）を10回交換しながら2
0時間浸透した。
実施例２ ビオチニル化された（ジゴキシン）ｎ−ポリスチレン微
小球の製造 （ａ）アミノ誘導体化されたポリスチレンビーズ〔0.5
μのポリビーズ−アミノ微小球、米国、ペンシルバニア
州、ウァーリントンのポリサイエンシス社（Polyscienc
es Inc.）〕の懸濁液（2.5％固体）と0.2Mリン酸ナトリ
ウム（pH7.4）中の６−（ビオチンアミド）ヘキサン酸
スルホスクシンイミジル〔米国、イリノイ州、ロックフ
ォードのピアスケミカル社（Pierce Chemical Co.）〕
とを２−３℃で２時間反応させて、ビーズ１個につき約
10個のビオチンを結合させた。0.2Mのリン酸ナトリウム
（pH7.4）を含有する透析物緩衝液を５回交換してポリ
スチレンビーズを透析した。
小球の製造 （ａ）アミノ誘導体化されたポリスチレンビーズ〔0.5
μのポリビーズ−アミノ微小球、米国、ペンシルバニア
州、ウァーリントンのポリサイエンシス社（Polyscienc
es Inc.）〕の懸濁液（2.5％固体）と0.2Mリン酸ナトリ
ウム（pH7.4）中の６−（ビオチンアミド）ヘキサン酸
スルホスクシンイミジル〔米国、イリノイ州、ロックフ
ォードのピアスケミカル社（Pierce Chemical Co.）〕
とを２−３℃で２時間反応させて、ビーズ１個につき約
10個のビオチンを結合させた。0.2Mのリン酸ナトリウム
（pH7.4）を含有する透析物緩衝液を５回交換してポリ
スチレンビーズを透析した。
（ｂ）共有結合したジゴキシン誘導体を製造するにあた
っては、100mgのジゴキシンをモル当量1:1にて10mMのメ
タ過ヨウ素酸ナトリウム中で30分反応させた。次にこの
試薬の１部分を（ａ）で得られたビオチニル化されたビ
ーズに加え、室温で２時間反応させた。次にこの反応の
シッフ塩基生成物を２倍の過剰量のシアノボロハイドラ
イドで還元し、得られた生成物を0.05Mリン酸ナトリウ
ム及び0.1M塩化ナトリウム（pH7.4）で緩衝液を変えな
がら12時間かけて透析した。
っては、100mgのジゴキシンをモル当量1:1にて10mMのメ
タ過ヨウ素酸ナトリウム中で30分反応させた。次にこの
試薬の１部分を（ａ）で得られたビオチニル化されたビ
ーズに加え、室温で２時間反応させた。次にこの反応の
シッフ塩基生成物を２倍の過剰量のシアノボロハイドラ
イドで還元し、得られた生成物を0.05Mリン酸ナトリウ
ム及び0.1M塩化ナトリウム（pH7.4）で緩衝液を変えな
がら12時間かけて透析した。
実施例３ 酵素検出試薬片の製造及び試験具の組立 ホワットマン（Whatman）54紙〔米国、ニュージャー
ジー州、クリフトンのホワットマン社（Whatman C
o.）〕を15mMの基質、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガ
ラクトースを含有する溶液に短時間浸した後、5mMのMgC
l2を含有する0.3Mビシン（bicine）緩衝液（pH7.8）中
に浸漬し、50℃で15分間乾燥した。基質を包含する乾燥
した紙を両面接着テープ〔米国、ミネソタ州、セント
ポールのスリーエム社（3MCompany）〕上に積層し、幅1
cm、長さ12.7cmのリボン状に裁断した。リボンを、次
に、幅8.3cm長さ12.7cmの透明なポリスチレン支持体
〔トリサイト（Trycite ），米国、ミシガン州、ミッ
ドランドのダウケミカル社（Dow Chemical Co.）製〕の
片面の長手方向に沿って端部より1/4インチ（0.635cm）
のところに積層し、検出層をその端部に固定されて有す
る幅0.5cm長さ8.3cmの試薬片に切断した。
ジー州、クリフトンのホワットマン社（Whatman C
o.）〕を15mMの基質、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガ
ラクトースを含有する溶液に短時間浸した後、5mMのMgC
l2を含有する0.3Mビシン（bicine）緩衝液（pH7.8）中
に浸漬し、50℃で15分間乾燥した。基質を包含する乾燥
した紙を両面接着テープ〔米国、ミネソタ州、セント
ポールのスリーエム社（3MCompany）〕上に積層し、幅1
cm、長さ12.7cmのリボン状に裁断した。リボンを、次
に、幅8.3cm長さ12.7cmの透明なポリスチレン支持体
〔トリサイト（Trycite ），米国、ミシガン州、ミッ
ドランドのダウケミカル社（Dow Chemical Co.）製〕の
片面の長手方向に沿って端部より1/4インチ（0.635cm）
のところに積層し、検出層をその端部に固定されて有す
る幅0.5cm長さ8.3cmの試薬片に切断した。
実施例４ 試験の性能及び試験具の操作 （ａ）試験を開始するにあたっては、0.05Mビシン（pH
7.6）中の抗−ジゴキシン（Fab）−β−ガラクトシダー
ゼ複合体（0.5nM）のアリコート0.25mlを未知量のジゴ
キシンを含有する血清試料0.05mlに加えて、混合し、23
℃で５分間インキュベートした。次に、0.1Mビシン及び
0.1MNaCl（pH7.6）中のビオチニル化された（ジゴキシ
ン）−ポリスチレン（10％固体）の0.2mlのアリコート
を加え、混合し、23℃で７分間インキュベートした。0.
1Mビシン及び0.1MのNaCl（pH7.8）中の30mg/Lのアビジ
ン（卵白より入手、米国、ミズーリ州、セントルイスの
シグマケミカル社製）からなるアビジン溶液の0.2mlの
アリコートを添加した後５分間インキュベートした。
7.6）中の抗−ジゴキシン（Fab）−β−ガラクトシダー
ゼ複合体（0.5nM）のアリコート0.25mlを未知量のジゴ
キシンを含有する血清試料0.05mlに加えて、混合し、23
℃で５分間インキュベートした。次に、0.1Mビシン及び
0.1MNaCl（pH7.6）中のビオチニル化された（ジゴキシ
ン）−ポリスチレン（10％固体）の0.2mlのアリコート
を加え、混合し、23℃で７分間インキュベートした。0.
1Mビシン及び0.1MのNaCl（pH7.8）中の30mg/Lのアビジ
ン（卵白より入手、米国、ミズーリ州、セントルイスの
シグマケミカル社製）からなるアビジン溶液の0.2mlの
アリコートを添加した後５分間インキュベートした。
（ｂ）（ａ）で得られた上澄の30μのアリコートを上
記実施例３で述べた試験具の試薬片に施し、試験具を42
0nm干渉フィルターを用いて反射光度計〔セラライザー
（SERALYZER ）、米国、インヂアナ州、エルクハート
のエイムズ部（Ames Division）製〕に載置して、37℃
の反射率の変化を測定した（ここにおいて変化の割合は
血清試料中のジゴキシンの濃度に関連していた）。
記実施例３で述べた試験具の試薬片に施し、試験具を42
0nm干渉フィルターを用いて反射光度計〔セラライザー
（SERALYZER ）、米国、インヂアナ州、エルクハート
のエイムズ部（Ames Division）製〕に載置して、37℃
の反射率の変化を測定した（ここにおいて変化の割合は
血清試料中のジゴキシンの濃度に関連していた）。
第１図は、本発明の特異的結合試験方法に適用される、
競合的結合反応系の概略図である。 第２図は、本発明の特異的結合試験方法に適用される、
サンドイッチ状結合反応系の概略図である。 第３図は、本発明のイムノアッセイ方法に適用される、
免疫学的結合反応系の概略図である。
競合的結合反応系の概略図である。 第２図は、本発明の特異的結合試験方法に適用される、
サンドイッチ状結合反応系の概略図である。 第３図は、本発明のイムノアッセイ方法に適用される、
免疫学的結合反応系の概略図である。
Claims (38)
- 【請求項１】水性試験媒体中に存在する可能性がある分
析対象物の量を測定するための不均一系特異的結合試験
法であって、 （１）水性試験媒体に、標識分析対象物又は標識抗分析
対象物からなる標識試薬及び分析対象物又はその結合性
類縁体の結合相手と第一の結合性物質とがカップリング
して結合した水分散性の支持体物質からなる固定化され
得る成分を混合して、反応混合物中に遊離型標識体及び
結合型標識体を形成させ、 （２）次に第一の結合性物質に特異的に結合して該支持
体物質を凝集させそれにより該支持体物質の沈澱複合体
を形成しうる第二の結合性物質を添加して、結合型標識
体を固定化させ、 （３）固定化された標識体と固定化されなかった標識体
を分離し、 （４）分離されたフラクションのどちらか一方の標識量
を測定して、試験媒体中の分析対象物の量と相関させる
方法。 - 【請求項２】該固定化され得る成分が、該結合相手と該
第一の結合性物質とがカップリングして結合した水溶性
重合体からなる特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項３】該第二の結合性物質が、水溶性物質である
特許請求の範囲第２項記載の方法。 - 【請求項４】該第二の結合性物質が、水不溶性物質であ
る特許請求の範囲第２項記載の方法。 - 【請求項５】該固定化され得る成分が、該結合相手と該
第一の結合性物質とがカップリングして結合した水懸濁
性の不溶性支持体物質からなる特許請求の範囲第１項記
載の方法。 - 【請求項６】該第二の結合性物質が、水溶性物質である
特許請求の範囲第５項記載の方法。 - 【請求項７】該第二の結合性物質が、水不溶性物質であ
る特許請求の範囲第５項記載の方法。 - 【請求項８】該水懸濁性の不溶性支持体物質が、重合体
の微粒子である特許請求の範囲第５項記載の方法。 - 【請求項９】該重合体の微粒子が、プラスチック製の微
小球である特許請求の範囲第８項記載の方法。 - 【請求項１０】該第一の結合性物質がビオチンの場合
は、該第二の結合性物質がアビジンであり、該第一の結
合性物質がハプテンの場合は、該第二の結合性物質が抗
体である特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項１１】水性試験媒体中に存在する可能性がある
分析対象物の量を測定するための不均一系イムノアッセ
イ法であって、 （ａ）該水性試験媒体に、 （ｉ）存在する可能性がある該分析対象物より過剰に該
反応混合物中に存在させることにより、標識抗分析対象
物の遊離型標識体及び結合型標識体を形成しうる標識抗
分析対象物からなる標識試薬： （ii）該分析対象物又はその結合性類縁体と第一の結合
性物質とがカップリングして結合した支持体物質からな
り、該支持体物質に結合した該分析対象物又はその結合
性類縁体が該標識抗分析対象物の遊離型標識体より過剰
に反応混合物中に存在する水分散性の凝集性試薬、並び
に （iii）該第一の結合性物質に特異的に結合して該支持
体物質を凝集させて該支持体物質の沈殿複合体を形成す
る第二の結合性物質、 を一緒にすることにより水性反応混合物を形成し； （ｂ）沈殿複合体又は上澄中の標識抗分析対象物を測定
して、該試薬媒体中に存在する可能性がある該分析対象
物の量と相関させる方法。 - 【請求項１２】該支持体物質が、該分析対象物又はその
結合性類縁体と該第一の結合性物質とがカップリングし
て結合した水溶性重合体からなる特許請求の範囲第11項
記載の方法。 - 【請求項１３】該第二の結合性物質が、水溶性物質であ
る特許請求の範囲第12項記載の方法。 - 【請求項１４】該第二の結合性物質が、不水溶性物質で
ある特許請求の範囲第12項記載の方法。 - 【請求項１５】該支持体物質が、該分析対象物又はその
結合性類縁体と該第一の結合性物質とがカップリングし
て結合した水懸濁性の不溶性支持体物質からなる特許請
求の範囲第11項記載の方法。 - 【請求項１６】該第二の結合性物質が、水溶性物質であ
る特許請求の範囲第15項記載の方法。 - 【請求項１７】該第二の結合性物質が、水不溶性物質で
ある特許請求の範囲第15項記載の方法。 - 【請求項１８】該水懸濁性の不溶性支持体物質が、重合
体の微粒子である特許請求の範囲第15項記載の方法。 - 【請求項１９】該重合体微粒子が、プラスチック製の微
小球である特許請求の範囲第18項記載の方法。 - 【請求項２０】該水性試験媒体と該標識抗分析対象物か
らなる第一の混合物を形成し、所定のインキュベーショ
ン期間の後に、該第一の混合物と該水分散性の凝集性試
薬からなる第二の混合物を形成し、所定のインキュベー
ション期間の後に、該第二の混合物と該第二の結合性物
質からなる第三の混合物を形成することにより、該反応
混合物を形成する特許請求の範囲第11項記載の方法。 - 【請求項２１】上澄のアリコートを、遠心を行うことな
く該水性反応混合物から取り出し、その中に存在する該
標識抗分析対象物を測定する特許請求の範囲第11項記載
の方法。 - 【請求項２２】該標識抗分析対象物が、標識された一価
の抗体フラグメントである特許請求の範囲第11項記載の
方法。 - 【請求項２３】該標識抗分析対象物が酵素で標識されて
おり、沈殿複合体又は上澄の該酵素標識抗分析対象物の
酵素活性が、該水性試験媒体中の分析対象物の量に比例
する特許請求の範囲第11項記載の方法。 - 【請求項２４】該第一の結合性物質がビオチンの場合
は、該第二の結合性物質がアビジンであり、該第一の結
合性物質がハプテンの場合は、該第二の結合性物質が抗
体である特許請求の範囲第11項記載の方法。 - 【請求項２５】水性試験媒体中に存在する可能性がある
分析対象物の量を測定するための不均一系イムノアッセ
イ用の試験キットであって、 （ａ）標識抗分析対象物、 （ｂ）該分析対象物又はその結合性類縁体と第一の結合
性物質とがカップリングして結合した支持体物質からな
る水分散性の凝集性試薬、及び （ｃ）該第一の結合性物質に特異的に結合して該支持体
物質を凝集させて該支持体物質の沈殿複合体を形成させ
ることができる第二の結合性物質 からなる試験キット。 - 【請求項２６】該支持体物質が、該分析対象物又はその
結合性類縁体と該第一の結合性物質とがカップリングし
て結合した水溶性重合体からなる特許請求の範囲第25項
記載の試験キット。 - 【請求項２７】該第二の結合性物質が、水溶性物質であ
る特許請求の範囲第26項記載の試験キット。 - 【請求項２８】該第二の結合性物質が、水不溶性物質で
ある特許請求の範囲第26項記載の試験キット。 - 【請求項２９】該支持体物質が、該分析対象物又はその
結合性類縁体と第一の結合性物質とがカップリングして
結合した水懸濁性の不溶性支持体物質からなる特許請求
の範囲第25項記載の試験キット。 - 【請求項３０】該第二の結合性物質が、水溶性物質であ
る特許請求の範囲第29項記載の試験キット。 - 【請求項３１】該第二の結合性物質が、水不溶性物質で
ある特許請求の範囲第29項記載の試験キット。 - 【請求項３２】該水懸濁性の不溶性支持体物質が、重合
体の微粒子である特許請求の範囲第29項記載の試験キッ
ト。 - 【請求項３３】該重合体の微粒子が、プラスチック製の
微小球である特許請求の範囲第32項記載の試験キット。 - 【請求項３４】該標識抗分析対象物が、標識された一価
の抗体フラグメントである特許請求の範囲第25項記載の
試験キット。 - 【請求項３５】該標識抗分析対象物が、酵素で標識され
ている特許請求の範囲第25項記載の試験キット。 - 【請求項３６】該酵素の活性に応答して色変化する指示
薬をさらに含む特許請求の範囲第35項記載の試験キッ
ト。 - 【請求項３７】該指示薬が、試験片の形状の固体キャリ
アマトリックスに包含されている特許請求の範囲第36項
記載の試験キット。 - 【請求項３８】該第一の結合性物質がビオチンの場合
は、該第二の結合性物質がアビジンであり、該第一の結
合性物質がハプテンの場合は、該第二の結合性物質が抗
体である特許請求の範囲第25項記載の試験キット。
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