JPH03170865A - 乾式免疫分析法の増感方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、抗原一抗体反応を利用する酵素免疫分析法に
有用な乾式免疫分析法の増感方法に関する。

〔従来の技術〕

体液などに含有されている生化学物質を定量する方法と
して種々の方法が知られているが、比較的感度よく測れ
る方法として酵素免疫分析法が知られている。一方、簡
便さ、迅速性の観点から乾式分析要素を用いる方法が開
発されている（例えば、特開昭４９−５３８８８．特開
昭５５−１６４３５６，特開昭５９−１０２３８８）。

更に両技術を結合させるために、高分子物質を使用した
乾式免疫分析要素（例えば、特開昭６４−８８１５６．
特開平１−１）２１５９）が開発された。

〔発明が解決しようとする問題点〕

前記の方法は、酵素免疫分析法と乾式分析要素の長所を
合わせ持つことを特徴としているが、バックグラウンド
であるブランク値が特にリガンドが低濃度域で、高く、
満足できる測定感度が得られないという問題があった。

すなわち、従来法の基本的な反応原理は酵素抗体結合物
に対して高分子化抗原と検体中のりガンドと競争反応さ
せ、前記酵素抗体結合物の酵素に対する基質を用いて高
分子化抗原によって阻害を受けなかった酵素活性を測定
することにより、リガンドを測定するものである。ここ
でリガンドが無い場合、つまり高分子化抗原のみを反応
させたときの酵素活性がブランクとなる。従来の乾式免
疫分析法では高分子化抗原による酵素活性の阻害が充分
に行なえず、ブランク値が高く満足できる測定感度が得
られなかった。

〔問題を解決するための手段〕

本発明では前記方法に加えて高分子化抗原又は高分子化
抗原を構或する高分子物質と特異的に結合し得る架橋剤
を反応させることにより、ブランクの上昇が抑えられる
ことを見い出し、乾式免疫分析要素を用いて感度よく生
化学物質の定量を行うことができるようになり、本発明
を完威した。

本発明の目的は、少なくとも１つの水浸透性層を有する
、検体中のリガンドの測定のための酵素免疫分析法によ
る乾式免疫分析要素であって、前記水浸透性層中に、 （Ａ）リガンド又はその誘導体と高分子化合物との結合
吻であるところの高分子化抗原、（Ｂ）高分子物質、及
び、 （Ｃ）前記リガンドと反応する抗体と前記高分子物質に
作用し得る酵素との結合物であるところの酵素抗体結合
物 を含有する乾式免疫分析要素を用い、更に高分子化抗原
又は高分子化症原を構成する高分子物質と特異的に結合
し得る架橋剤を酵素抗体結合物、高分子化抗原、リガン
ドを免疫反応系の中に添加することにより乾式免疫分析
要素の増感法を達或することができたものである。

ブランク値の上昇を抑え、乾式免疫分析要素を用いて感
度よく生化学物質を測定するにあたって最も効果的な架
橋剤の添加方法は、酵素抗体結合物、高分子化抗原、リ
ガンドの免疫反応が充分に平衡に達した後であるが、実
質的にはこれら３者の免疫反応が架橋反応に先行してい
れば良い。

本発明を実施するにあたって使用できる架橋剤としては
、例えば、高分子化抗原または高分子化抗原を構或する
高分子物質に対する抗体や二架橋性試薬、重合剤などが
挙げられる。

前記抗体としては高分子化抗原または高分子化抗原を構
或する高分子物質に対するモノクローナル抗体・ポリク
ローナル抗体が望ましいが、そのほかにこれらの抗体の
断片や抗体の認識部位を化学的に合或したべブチドなど
、高分子化抗原または高分子化抗原を構或する高分子物
質を特異的に結合できるものであれば良い。

二価性架橋剤としては架橋するための２つの官能基が同
一であるホモの二価性試薬と２つの官能基が異なるヘテ
ロの二価性架橋剤が挙げられる。

ホモの二価性架橋剤としてはイミドエステルを利用した
試薬、具体的にはジメチルアジピ逅デート（ＤＭＡ），
　ジメチルピメリミデート　（ＤＭＰ）．　ジメチルス
ベリξデート　（ロＭＳ）や、Ｎ−ヒドロキシサクシン
イミドを利用したジサクシξジルスベレート（ＤＳＳ）
　．　ジチオビス（サクシミジルブロピオネー｝）　（
ＤＳＰ）　，エチレングリコールビス（サクシミジルサ
クシネート）　（ＥＧＳ）などが挙げられる。又その他
のホモの二価性架橋剤としてはビスマレイξドヘキサン
（ＢＭＨ），　１　．　５−ジフルオロ−２，４ジニト
ロベンゼン（ＤＦＤＮＢ）などが挙げられる。ヘテロの
二価性架橋剤としては２つの官能基が各々Ｎ−ヒドロサ
クシンイミドとマレイくドである架［’Ｊ、具体的には
Ｎ−（ｒ−マレイミドブチリルオキシ）サクシンイξド
エステル（ＧＭＢＳ），　　４−（Ｎ−マレイξドメチ
ルシク口ヘキサンカルポネー｝）　（ＣＨＭＳ），　　
ｍ−マレイξドベンゾイルーＮ−ヒドロキシスルホサク
シンイξドエステル（ＭＢＳ）などが挙げられる。又そ
の他のへテロニ価性架橋剤としてはＮ−サクシミジル３
−（２−ピリジルジチオ）プロピオネー｝（ＳＰＤＰ）
，　Ｎ−サクシミジル（４−ヨードアセチル）アミノベ
ンゾエート（ＳＩＡＢ）などが挙げられる。さらに光反
応を利用した二価性架橋剤として、Ｎ−ヒドロキシサク
シミジル−４−アジドサリシリック酸（ＮＩＩＳ−＾Ｓ
Ａ）やＮ一サクシ亀ジル（４−アジドフエニル０．３　
”−ジチオブロピオネー｝　（ＳＡＤＰ）などが挙げら
れる。

これらの架橋物質と反応する高分子化抗原側の官能基は
本来高分子化抗原が持つ官能基の他に、事前の反応によ
り高分子化抗原に導入した官能基でも良い。

架橋方法としては、グルグルアルデヒド法、ナカネ法、
ビリジル・ジスルフイド法、カルボジイξド法、アビジ
ン・ビオチン法などを挙げることができ、その他にも例
えばｒＭｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙａｎ
ｄ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｔｓｔｒｙ　Ｊあるいは石川
．河合，宮井編「酵素免疫測定法」　（医学書院、１９
７８年発行）などの戊書に記載されている方法の中から
適宜選択して利用することもできる。

以下実施例により本発明をさらに詳細に説明する。

参考例Ｉ Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔ＋１）ｉｓのα−アξラー
ゼ５■をｐＨ７の０．１Ｍグリセロリン酸と５ｍＭのＥ
ＤＴＡ　／　Ｃａの溶液、０．５ｎｌに溶かしＧＭＢＳ
　１００ｎｖ　／　ｍ　ＩＩのジメチルホルムアミド（
ＤＭＦ）溶液１００μｌを加えて室温で２時間放置して
反応させた。この反応液をセファデックスＧ−２５のカ
ラムに通し、ｐＥＩ７の０．　１　Ｍグリセロリン酸、
５ｎ＋ＭのＥＤＴＡ／Ｃａを流してゲルろ過を行い、素
通り分画を回収した。

参考例２ 抗テオフィリンマウスＩｇＧ１０■（０．１Ｍ酢酸緩衝
液ｐＨ５．５）２ｍｆにババイン３００　ｐ　ｇを加え
３７℃で１時間攪拌した。０．１月ＮａＯＨを加えたｐ
Ｈを６．０に調節した。この反応液をあらかじめＯ．ｉ
Ｍリン酸緩衝液１　ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液（ｐＦＩ６．３
）で緩衝化したＡｃＡ　　４４ゲルカラムに入れ、上記
リン酸緩衝液で溶出した。分子量約１０万付近に溶出さ
れたピーク部分を集めて１ｍｌに濃縮し、目的の抗テオ
フィリンマウスＴｇＧ　Ｆ（ａｈ　’　）ｚを得た。

参考例３ 参考例２で調製した抗テオフィリンマウスＩｇＧＦ（ａ
ｂ　′）２．　　６　ｍｇを含む０．１Ｍリン酸緩衝液
１ｍＭＥＤＴＡ溶液（ｐＨ６．０）１ｍＡに１０ｍｇ／
ｍｊ２の２−メルカブトエチルアミン塩酸塩水溶液１０
０μ２を加え、３７℃で９０分間攪拌した。この反応液
をあらかじめ０．１杓グリセロリン酸緩衝液（ｐ｝ｌ　
７．　Ｏ　）で緩衝化したセファデンクスＧ−２５カラ
ムでゲルろ過して未反応の２−メルカブトエチルアミン
を除去し、Ｉｓ−Ｆａｂ　’を得た。

これに参考例ｌで調製したＧＭＢ化α−ア嵩ラーゼｌ■
を加え、３７℃で９０分間反応させた。次にこの反応液
を２０ｍＭグリセロリン酸緩衝液５ｍＭ塩化カルシウム
溶液（ｐＨ７．０）で緩衝化したＡｃＡ−３４ゲルカラ
ムでゲルろ過して分子量２０万以上の分画を集め、これ
を濃縮して目的の酵素抗体結合物を得た。

参考例４ ８−プロビル力ルポキシテオフィリン５■を１０ＩＩｌ
ＤＭＦ溶液に溶かし、これにＮ−ヒドロキシサクシンイ
ミド３■、水溶性カルボジイごド５■を加えて室温にて
２時間攬拌し、活性化テオフィリンを調製した．ウシア
ルブ粟ン（ＢＳＡ）　１　０■を０．ＩＨ炭酸水素ナト
リウム水溶液１ｍｌに溶かし、上記活性化テオフィリン
を０．５ａ＋１加え室温にてｌ時間放置し、あらかじめ
リン酸緩衝化生理食塩水ｐＨ７．０で平衡化したセファ
デックスＧ−２５ゲルカラムにて未反応物を除去し目的
の高分子化抗原（ＢＳＡ−テオフィリン結合物）を得た
。

実施例１ 参考例３で調製したα−アξラーゼー抗テオフィリンマ
ウスＩｇＧ　Ｆａｂ　”結合物と参考例４で調製したＢ
Ｓ＾−テオフィリン結合物を含む前記テオフィリン分析
用多層免疫スライドに５０ｍＭグリセロリン酸緩衝液ｌ
Ｏμｌを乾式免疫分析要素の展開層に滴下したのち、続
いてＯ−１■／　ｍ　ｌの抗ＢＳＡポリクローナル抗体
ｌＯμｌを滴下した。３７℃で２０分間反応後、乾式免
疫測定要素の支持体側より６４０ｎｍの反射光学濃度を
測定した。得られた結果を表１および図１に示す。

表１ 乾式免疫分析要素になにも滴下しない場合の６４０ｎｌ
Ｉの反射光学濃度は０．　１であった。

実施例２ 参考例３で調製したα−アミラーゼー抗テオフィリンマ
ウスＩｇＧ　Ｆａｂ　’結合物と参考例４で調製したＢ
ＳＡ−テオフィリン結合物を含む前記テオフィリン分析
用多層免疫スライドにＯ−１００μｇ　／　ｍ　ｌのテ
オフィリン溶液１０μｌを乾式免疫分析要素の展開層に
滴下したのち、続いて１■／　ｍ　４２の抗ＢＳＡポリ
クローナル抗体１０μＥを滴下した。３７℃で２０分間
反応後、スライドの支持体側より６４０ｎｍの反射光学
濃度を測定した。

２および図２に示す。

表２ 得られた結果を表 抗ＢＳＡ抗体く一）は抗ＢＳＡ抗体を添加しない場合を
示し、抗ＢＳＡ抗体（＋〉は抗ＢＳＡ抗体を添加した場
合を示す。また、各々の欄の数字は６４０帥の反射光学
濃度を示す。

〔発明の効果〕

本発明の架橋剤を使用することによって従来の乾式免疫
分析要素において問題であった高ブランク値を解消する
ことができ、感度良く生化学物質図１は抗ＢＳＡ抗体の
添加量とブランク値の関係を示した図であり、図２は抗
ＢＳＡ抗体を添加したときのテオフィリン測定の検量線
を示した図である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）高分子化抗原を用いる乾式免疫分析法において、
   高分子化抗原を架橋し得る架橋剤を加えることを特徴と
   する該分析法の増感方法。
2. （２）架橋剤が前記高分子化抗原又は高分子化抗原を構
   成する高分子物質と結合し得る抗体である特許請求の範
   囲第（１）項に記載の方法。