JPH0246896B2 - Amiraazeomochiitakogenketsuteikigujubutsushitsunosokuteihoho - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、例えば血清、尿などに含まれる薬物
あるいは各種疾患に由来する微量成分などを測定
する方法に関するものである。

血清、尿などの体液に含まれる微量成分の分析
は病気の診断あるいは治療経過の判定などに非常
に有意義であり、日常の臨床検査に活用されてい
る。ところが、これらの体液には多種多様の成分
が含まれており、そのなかには、分子量の近似し
た物質、生理活性の似た物質あるいは構造の近似
した物質などを含まれていることも多い。そこ
で、この分析法は特異性が高く、かつ微小量まで
定量しうることが要求される。さらに、日常検査
として利用されるために、簡便かつルーチン化し
うることが望ましい。

このような条件を備えた分析法として免疫学的
測定法がある。この方法は、抗原−抗体間の高い
親和性と、抗体が抗原決定基を判別する高い特異
性を利用しており、ラジオイムノアツセイ、酵素
免疫測定法、血球等の凝集反応を利用した方法等
に大別される。

ラジオイムノアツセイは、感度はすぐれている
が、人体に有害である放射性物質を用いるところ
から使用場所や使用量が厳しく規制されており、
特殊な施設を必要とする。一方、酵素免疫法はこ
のような問題はないが、ラジオイムノアツセイも
そうであるが、遊離標識物と結合標識物の分離が
必要である。そして、この分離操作は、非常に繁
雑であり、操作及び測定誤差の両面で問題になつ
ていた。血球等の凝集反応を利用した方法の場合
にはこの分離操作は必要ないが、この方法は感度
が低く、数ｎｇ〜ｐｇのような極微量を測定する
ことは困難である。

本発明者らは上記のような欠点のない測定方法
を開発すべく種々検討の結果、水に不溶性の高分
子物質を基質とする酵素に抗原決定基具有物質を
結合させ、この抗原決定基具有物質と測定対象た
る抗原決定基具有物質とを抗体に対して競争反応
させ、その後この結合物の酵素活性を測定すると
測定対象たる抗原決定基具有物質の量に応じて酵
素活性が顕著に低下することを見出し、この方法
を用いれば抗原決定基具有物質を高感度で、かつ
前述の分離操作を行なわないで簡便に測定しうる
ことを見出して、この内容を特許出願（特願昭58
−217145号（特開昭60−108756号））した。そし
て、さらに検討を進め、酵素としてアミラーゼを
用いた場合に抗原決定基具有物質を最も高感度で
測定できることを見出したが、ヒト血清等の高等
動物由来の検体には通常アミラーゼが含まれてい
るため測定におけるブランク値が高くなつて測定
誤差が大きくなるという問題を生じた。そこで、
このブランク値を低下させるために検体中のアミ
ラーゼを予め失活させる方法及び検体を希釈する
方法を検討したが、前者の場合にはアミラーゼを
失活させるために検体を加熱処理、酸アルカリ処
理等する際に測定対象の抗原決定基具有物質も変
性あるいは分解されてしまうことがあり、後者の
場合には感度が低下してしまうためこれらの方法
はいずれも不適当であつた。さらに、これらの方
法は、操作が繁雑であるため、簡便な測定法の開
発を目指す本発明者らの意図にそぐわないもので
あつた。

そこで、本発明者らは、簡便さと高感度を損な
わずにこのブランク値を低下させる方法を開発す
べくさらに検討の結果、高等動物由来のアミラー
ゼを特異的に阻害するアミラーゼインヒビターを
使用することによつてこの目的を達成しうること
を見出し、本発明を完成するに至つた。

すなわち、本発明は、高等動物由来のアミラー
ゼを含有している検体の抗原決定基具有物質１を
測定する方法において、該抗原決定基具有物質１
と、この抗原決定基具有物質１と少なくとも一の
抗原決定基を共通にする抗原決定基具有物質２と
検体に実質的に含まれていないアミラーゼとの結
合物を、前記の共通の抗原決定基と反応する抗体
と接触せしめて反応させ、前記の高等動物由来の
アミラーゼには、このアミラーゼの活性を阻害す
る程度が前記の結合物に結合されているアミラー
ゼの活性を阻害する程度より大きいアミラーゼイ
ンヒビターを接触せしめて反応させ、さらに、前
記の結合物に結合されているアミラーゼが作用し
うる水に不溶性の高分子物質に前記の結合物を接
触せしめて酵素反応させ、アミラーゼ活性を測定
することを特徴とする、抗原決定基具有物質の測
定方法に関するものである。

本発明の方法で測定される検体は高等動物由来
のアミラーゼを含有するものである。高等動物由
来のアミラーゼとは例えば膵臓アミラーゼ、唾液
アミラーゼなどであり、このようなアミラーゼを
含有する検体も通常は高等動物由来のものであ
る。検体の種類は限定されないが、例えば血清、
尿などである。血清、尿などの場合には、通常は
特別な前処理を必要とせず、そのまま測定を行な
うことができる。

測定対象である抗原決定基具有物質１（以下リ
ガンド１という。）は抗原決定基を一又は二以上
有しているものであり、例えば、各種内分泌腺に
由来するホルモン類、免疫グロブリン、アルブミ
ン、フエリチン等の血漿蛋白質、HB抗原等のウ
イルス、バクテリア類、α−フエトプロテイン、
癌胎児性抗原等の各種臓器あるいは血中、尿中に
存在する抗原などである。このようなリガンド１
の種類は問わないが、本発明の方法は、特に高分
子のものに対して威力を発揮し、例えば分子量が
１万以上のものを高感度で測定することができ
る。

結合物を構成している抗原決定基具有物質２
（以下、リガンド２という。）はリガンド１と少な
くとも一の抗原決定基が共通していなければなら
ない。リガンド２の抗原決定基は１以上がリガン
ド１と共通であればよく、全てが共通であつても
よい。従つて、リガンド２はリガンド１と同一で
あつてもよい。

結合物を構成しているアミラーゼはα−アミラ
ーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼなどで
あり、検体中に実質的に含まれていないものであ
つて、かつ後述するアミラーゼインヒビターの阻
害活性が検体中のアミラーゼに対する阻害活性よ
りも低いものである。このようなアミラーゼは検
体の種類及びアミラーゼインヒビターの種類など
に応じて異なるが、例えば麦芽由来のジアスター
ゼ及びβ−アミラーゼ、糸状菌由来のタアジアス
ターゼ、バチルス層細菌由来のアミラーゼ、など
から適宜選択すればよい。

アミラーゼとリガンド２との結合方法は双方の
官能基を考慮して決定すればよい。官能基は、ア
ミノ基、カルボキシル基、水酸基、チオール基、
イミダゾール基、フエニル基などを利用すること
ができ、例えばアミノ基相互間を結合させる場合
には、ジイソシアネート法、グルタルアルデヒド
法、ジフルオロベンゼン法、ベンゾキノン法等数
多く知られている。また、アミノ基とカルボキシ
ル基との間を結合させる方法としては、カルボキ
シル基をサクシンイミドエステル化する方法のほ
かカルボジイミド法、ウツドワード試薬法等が知
られており、アミノ基と糖鎖を架橋する過ヨウ素
酸酸化法（Nakano法）もある。チオール基を利
用する場合には、例えばもう一方の側のカルボキ
シル基をサクシンイミドエステル化してこれにシ
ステインを反応させてチオール基を導入し、チオ
ール基反応二価架橋試薬を用いて双方を結合する
ことができる。フエニル基を利用する方法として
はジアゾ化法、アルキル化法などがある。結合方
法はこれらの例示に限られるものではなく、この
ほか例えば「Method in Immunology and
Immunochemistry」あるいは「酵素免疫測定法」
等の成書に記載されている方法のなかから適宜選
択して利用することができる。結合比は１：１に
限らず、目的に応じて任意の比率をとることがで
きることはいうまでもない。反応後は、ゲル過
法、イオン交換クロマトグラフイー、アフイニテ
イークロマトグラフイーなどを適宜組み合わせて
精製を行ない、必要により凍結乾燥法等で乾燥す
る。

抗体はリガンド１と反応するものでなければな
らず、リガンド２はこの抗体と反応するものでな
ければならない。すなわち、リガンド１とリガン
ド２とは少なくとも一の抗原決定基が共通してい
なければならず、抗体はこの共通の抗原決定基に
対するものでなければならない。この抗体にはＦ
（ab′）₂、Fab′、Fabなどのフラグメントも含まれ
る。

抗体の製造方法としては、リガンド１もしくは
リガンド２又はこれらのいずれかと蛋白との結合
物を兎、山羊、馬、モルモツト、ニワトリなどの
温血動物に体重１Kgあたり0.3〜２mgを１〜数回
背中皮下、フツトパツド、大腿筋等にアジユバン
トとともに注射して当該動物の体内に形成させ
る。この抗体は血清ををそのまま用いてもよく、
血清から抗体すなわち免疫グロブリンを採取する
公知の方法によつて精製してから用いてもよい。

一方、この抗体はモノクローナル抗体として取
得することもできる。その場合には、マウスに前
記のいずれかの抗原をアジユバントとともに数回
腹腔等に注射し、脾臓細胞を取り出してポリエチ
レングリコール等を用いてマウスミエローマ細胞
と融合させる。そして、この融合血胞のなかから
当該抗体を産生するものをクローリングによつて
モノクローン細胞として増殖させ、マウス腹腔中
で増殖させることによつて単一抗体、すなわちモ
ノクロナール抗体を大量に製造することができ
る。

抗体を結合物のリガンド２と反応させても高分
子物質に対するアミラーゼ活性の低下が不充分な
場合には抗体を予め高分子化しておいてもよい。
高分子化の方法としては分子量が10万ダルトン以
上でかつ水溶性の高分子化合物を結合させればよ
い。高分子化合物の例としては、可溶性デキスト
ラン、カルボキシメチル化デキストラン、アミノ
化デキストラン、アミロース等の多糖類及びその
誘導体、ゼラチン、ヘモシアニン、フエリチン等
の蛋白質、ポリエチレングリコールなどを挙げる
ことができる。結合方法は前述のアミラーゼとリ
ガンド２との結合方法のなかから適宜選択すれば
よい。

検体に含まれるリガンド１と、リガンド２と前
記のアミラーゼとの結合物を溶液中で前記の抗体
と接触させる。その際、溶液の温度は20〜45℃程
度、そしてPHは通常４〜8.5程度が適当である。
PHを一定に保つために、必要により、リン酸緩衝
液、酢酸緩衝液などの緩衝液を用いてもよい。そ
の際、結合物の適当な量は、その種類、リガンド
１の種類、あるいは接触時の条件などによつて異
なるので予め試験をして定めるのがよい。抗体と
リガンド１及び結合物との接触時間はいずれも、
通常は充分に反応しうる程度がよく、例えば37℃
の場合には20〜60分間程度が適当である。抗体に
対するリガンド１及び結合物の接触順序は問うと
ころではなく、いずれが先であつてもあるいは同
時であつてもよい。

抗体を結合物のリガンド２と反応させても高分
子物質に対するアミラーゼ活性の低下が不充分な
場合に、前述のように予め抗体を高分子化するか
わりに、抗体を結合物のリガンド２と反応させて
からさらに第２抗体と反応させて抗体を高分子化
してもよい。この場合、第２抗体はリガンド１及
び２の抗体に抗原として前述の抗体の取得方法に
準じて取得することができる。

一方、検体に含まれている高等動物由来のアミ
ラーゼには、このアミラーゼを阻害する程度が前
記の結合物に結合されているアミラーゼの活性を
阻害する程度より大きいアミラーゼインヒビター
を接触させる。

このアミラーゼインヒビターは検体に含まれて
いるすべてのアミラーゼを失活させかつ結合物に
結合されているアミラーゼを全く阻害しないもの
が最も望ましいことはいうまでもないが、実用上
は検体中の主たるアミラーゼを失活させうるもの
であれば足りる場合が多い。この失活な要は測定
時においてブランク値を上昇させなければよく、
測定後にアミラーゼインヒビターが失活するなど
してこのアミラーゼ活性が回復してもよい。この
アミラーゼインヒビターの作用が問題になるもう
一方の、検体に実質的に含まれていないアミラー
ゼはリガンド２に結合されている状態のものであ
り、遊離状態ではアミラーゼインヒビターによつ
て失活するものであつてもよい。このようなアミ
ラーゼインヒビターの例としては唾液アミラーゼ
及び膵臓アミラーゼの両方を阻害する小麦由来の
アミラーゼインヒビター（M.D.O′Donnell et
al.、Biochim.Biophys.Acta、Vol.422、pp159−
169（1976））、唾液アミラーゼを優先的に阻害する
小麦由来のアミラーゼインヒビターSain（特開昭
58−85899号公報）及び膵臓アミラーゼを優先的
に阻害するストレプトミセス属の放線菌が産生す
るアミラーゼインヒビターAI−Ｂ（特開昭57−
2684号公報）などがある。そのほか、検体に含ま
れている高等動物由来のアミラーゼを異種動物に
投与してその抗体を取得し、これをアミラーゼイ
ンヒビターとして用いることもできる。抗体の取
得方法は前述のリガンド１及びリガンド２に対す
る抗体の取得方法と同様にして取得することがで
きる。これらは単独で用いてもよく、併用しても
よい。

検体中のアミラーゼにこのようなアミラーゼイ
ンヒビターを接触させる際の溶液の温度及びPHは
通常の前述のリガンド１と結合物を抗体に接触さ
せる条件と同一でよい。また、アミラーゼインヒ
ビターの添加量もその種類、検体中のアミラーゼ
の種類と量、結合物の構成しているアミラーゼの
種類、あるいは接触させる条件などによつて異な
るので予め試験をして定めるのがよい。アミラー
ゼインヒビターの添加時期は、検体中のアミラー
ゼによる後述する水に不溶性の高分子物質の分解
を実質的に防止できればよく、通常はこの高分子
物質の添加前に添加すればよい。しかしながら、
一般にアミラーゼインヒビターによるアミラーゼ
阻害作用はアミラーゼによる基質の分解速度より
もはるかにはやいのでアミラーゼインヒビターを
高分子物質と同時あるいは多少遅れて添加しても
よい。

抗体と反応させた結合物は高分子物質に接触さ
せて反応させる。

高分子物質と接触させる結合物は反応物から分
離したものでもよいが、通常は反応物に含まれて
いる状態のままでよい。

この高分子物質は結合物のアミラーゼが反応し
うるものであり、通常はアミラーゼの基質である
が、水に不溶性であるところに特徴がある。すな
わち、高分子物質が不溶性であるために結合物の
アミラーゼ部分との接触の大部分が固−液間にな
り、その結果、アミラーゼの高分子化による立体
障害が大きく現われる。本発明者らはこのことを
確認するためにペンタオースを用いて測定を行な
い、不溶性デンプンを用いた場合と比較したとこ
ろ、前者の場合にはアミラーゼ活性の低下がほと
んど認められなかつたのに対し、後者の場合には
アミラーゼ活性が顕著に低下した。高分子物質の
例としては、不溶性デンプンなどがある。この高
分子物質はそれ自身が可溶性であつても、不溶性
の担体に固定化するとか重合させるなどして不溶
化して用いることもできる。この方法の例として
は、アガロースゲルに包活させる方法がある。

高分子物質に結合物のアミラーゼを作用させる
条件はこのアミラーゼの理化学的性質などに応じ
て適当になるように定めればよい。

アミラーゼを作用させたのちはアミラーゼの活
性を求める。この活性は、この酵素反応による分
解物の増加、原料である高分子物質の減少、その
他、この酵素反応による系の変化を追跡すればよ
い。

本発明の方法は、リガンド１を特異性高くかつ
極めて高感度で測定できる。また、操作が簡単で
あり、安価かつ容易にリガンド１を定量すること
が可能である。本発明の方法はリガンド１の種類
を問わず測定できるが比較的高分子の測定に威力
を発揮する。

これまでジゴキシンやテオフイリン等の低分子
パプテンを酵素に結合させてその変化を測定する
方法は報告されているが、分子量が１万以上の抗
原についてｎｇ単位あるいはそれ以下の極微量を
測定する方法は全く報告されておらず、極めて困
難であると考えられていた。しかるに、本発明者
らはアミラーゼの利用と固−液反応の導入によつ
て立体障害を活用して高分子の抗原を高感度で測
定することに成功したものであり、従来、μｇ／
mlのレベルまでしか測定しえなかつた高分子抗原
を本発明の方法によつてｎｇ〜ｐｇ／ml程度にま
で測定できるようになつた。

以下、実施例を示す。

実施例 １ CHMアミラーゼの調製 バチルス・ズブチリスアミラーゼ１mgを10ｍ
Ｍ ｏ−フエナントロリンを含有するPH6.3の
0.1Mリン酸緩衝液１mlに溶かし、４−（マレイ
ミドメチルシクロヘキサン−１−カルボン酸）
サクシンイミドエステル（CHMS）２mg／ml
のジメチルホルムアミド（DMF）溶液100μ
を加えて室温で１時間放置して反応させた。こ
の反応液をセフアデツクスＧ−25のカラムに入
れ、PH6.3の0.1Mリン酸緩衝液を流してゲル
過を行ない、素通り分画を分取した。

SH化α−フエトプロテインの調製 α−フエトプロテイン５mgを５ｍＭ
EDTAを含むPH7.5の0.1Mリン酸緩衝液に溶か
し、これにＳ−アセチルメルカプトコハク酸無
水物９mg／mlのDMF溶液100μを加えて37℃
で１時間反応させた。この反応液に1Mヒドロ
キシルアミン水溶液（PH7.5）110μを加え、
37℃で30分間加温した。続いて、セフアデツク
スＧ−25を用いてゲル過し、素通り分画を分
取した。

アミラーゼ−α−フエトプロテイン結合物の
調製 前記のCHM化アミラーゼ溶液とSH化α−
フエトプロテイン溶液を混合し、１mlまで濃縮
後４℃で一夜放置して反応させた。反応液をセ
フアクリルＳ−300を充填したカラムに入れ、
PH7.0の20ｍＭリン酸緩衝生理食塩溶液を流し
てゲル過を行ない、１：３に結合した結合物
の分画を分取した。

ヒトα−フエトプロテインの測定 濃度０〜2000nｇのα−フエトプロテイン溶
液50μに、で調製した結合物溶液にポリエ
チレングリコール6000を５％含有せしめた溶液
50μ並びに小麦由来のアミラーゼインヒビタ
ー混合物100μｇ／ml及び抗ヒトα−フエトプ
ロテインヤギIgG8μｇ／mlを含有する溶液50μ
を加えて20分間反応させた。反応液にブルー
スターチ懸濁液1.0mlを加えて37℃で20分間さ
らに反応させ、0.5NNaOH1mlを加えて反応を
停止させた。これを撹拌後、3500rpmで２分間
遠心し、得られた上清の620nｍにおける吸光
度を測定した。

得られた吸光度とヒトα−フエトプロテイン
の濃度との関係を示す検量線を第１図に示す。

次に、ヒト血清をリン酸緩衝化生理食塩水
（PBS）で希釈して2ⁿ希釈例をつくり、各50μ
づつを小試験管に入れた。これにで調製した
結合物溶液にポリエチレングリコール6000を10
％含有せしめた液50μ並びに小麦由来のアミ
ラーゼインヒビター混合物100μｇ／mlを含有
しあるいは含有しない8μｇ／mlの抗ヒトα−
フエトプロテインヤギIgG溶液50μを加え、
37℃で20分間反応させた。この反応液のブルー
スターチ懸濁液1.0mlを加えて37℃で20分間さ
らに反応させ、0.5N NaOH1mlを加えて反応
を停止させた。これを撹拌後3500rpmで２分間
遠心し、上清液の620nｍの吸光度を測定した。

得られた結果を第２図に示す。尚、図中黒丸
はアミラーゼインヒビターを添加した場合を表
わし、白丸は添加しなかつた場合を表わしてい
る。図に示すようにインヒビターを添加しなか
つた場合には血清自体に含まれるアミラーゼ活
性分だけ吸光度が高くなつており、32倍に希釈
してもまだ幾分高くなつている。これに対して
インヒビターを添加した本発明法においてはそ
のようなことがなく、希釈やブランクなしに正
確な値を得ることができた。

実施例 ２ CHM化アミラーゼの調製 バチルス・ズブチリスアミラーゼ５mgをPH
6.3の0.1Mリン酸緩衝液１mlに溶かし、
CHMS2mg／mlのDMF溶液100μを加えて室
温で１時間放置して反応させた。この反応液を
セフアデツクスＧ−25のカラムに入れ、PH6.3
の0.1Mリン酸緩衝液を流してゲル過を行な
い、素通り分画を分取した。

ヒトIgG Ｆ（ab′）₂の調製 ヒトIgG10mgを0.1酢酸緩衝液（PH4.0）２ml
にペプシン300μｇを加え、37℃で18時間撹拌
した。0.1NNaOHを加えてPHを6.0に調節しこ
の反応液を予め0.1Mリン酸緩衝１ｍＭ
EDTA溶液（PH6.3）で緩衝化したセフアクリ
ルＳ−300ゲルカラムに入れ、上記のリン酸緩
衝液で溶出した。分子量約10万付近に溶出され
たピーク部分を集めて１mlに濃縮し、目的のヒ
トIgG Ｆ（ab′）₂を得た。

α−アミラーゼヒトIgG Fab′結合物の調製 で調製したヒトIgG Ｆ（ab′）₂6mgを含む
0.1Mリン酸緩衝１ｍＭ EDTA溶液（PH6.0）
１mlに10mg／mlの２−メルカプトエチルアミン
塩酸塩水溶液100μを加え、37℃で90分間撹
拌した。この反応液を予め0.1Mリン酸緩衝液
（PH6.3）で緩衝化したセフアデツクスＧ−25カ
ラムでゲル過して未反応の２−メルカプトメ
チルアミンを除去し、HS−Fab′を得た。これ
にで調製したCHM化α−アミラーゼ２mgを
加え、37℃で90分間反応させた。次にこの反応
液を0.1M酢酸緩衝５ｍＭ塩化カルシウム溶液
（PH6.0）で緩衝化したセフアクリルＳ−300カ
ラムでゲル過して分子量20万以上の分画を集
め、これを濃縮して目的の結合物を得た。

ヒトIgGの測定 濃度０〜3125μｇ／mlのヒトIgG溶液50μに
で調製した結合物溶液にポリエチレングリコ
ール6000を10％含有せしめた溶液50μ並びに
ストレプトミセス・ビリドスポラスNo.297−
A2FERM−P5405の産生するアミラーゼイン
ヒビター100μｇ／ml及び抗ヒトIgGヤギ
IgG100μｇ／mlを含有する溶液50μを加えて
20分間反応させた。反応液にブルースターチ懸
濁液1.0mlを加えて37℃で10分間さらに反応さ
せ、0.5NNaOH1mlを加えて反応を停止させ
た。これを撹拌後、3500rpmで２分間遠心し、
得られた上清の620nｍにおける吸光度を測定
した。

得られた吸光度とヒトIgGの濃度との関係を
示す検量線を第３図に示す。

実施例 ３ CHM化アミラーゼの調製 バチルス・ズブチリスアミラーゼ１mgをPH
6.3の0.1Mリン酸緩衝液１mlに溶かし、
CHMS2mg／mlのDMF溶液100μを加えて室
温で１時間放置して反応させた。この反応液を
セフアデツクスＧ−25のカラムに入れ、PH6.3
の0.1Mリン酸緩衝液を流してゲル過を行な
い、素通り分画を分取した。

SH化IgEの調製 ヒトIgE5mgを5m MEDTAを含むPH7.5の
0.1Mリン酸緩衝液に溶かし、これにＳ−アセ
チルメルカプトコハク酸無水物９mg／mlの
DMF溶液100μを加えて37℃で１時間反応さ
せた。この反応液に1Mヒドロキシルアミン水
溶液（PH7.5）110μを加え、37℃で30分間加
温した。続いて、セフアデツクスＧ−25を用い
てゲル過し、素通り分画を分取した。

アミラーゼ−IgE結合物の調製 前記のCHM化アミラーゼ溶液とSH化ヒト
IgE溶液を混合し、１mlまで濃縮後４℃で一夜
放置して反応させた。反応液をセフアクリルＳ
−300を充填したカラムに入れ、PH7.0の20ｍＭ
リン酸緩衝生理食塩溶液を流してゲル過を行
ない、１：２に結合した結合物の分画を分取し
た。

ヒトIgEの測定 10μｇ／mlのこの結合α−アミラーゼ溶液
50μにPBSで2ⁿ希釈したヒト血清50μを加
え、ヒト血清アミラーゼの酵素作用を阻害させ
るため、500μｇ／mlの抗ヒトアミラーゼヤギ
IgG50μを加え、さらに10μ／ml抗ヒトIgE
ヤギIgG50μを加えて37℃で30分間反応させ
た。この反応液100μを、ポリスチレンフイ
ルム１上に陽イオン交換樹脂２、反射層３、ブ
ルースターチ４の順に積層した第４図に示す多
層フイルム上に滴下し、室温20分後のアミラー
ゼ活性をリフラクトメーターで測定した。

得られた反射強度とヒトIgE濃度との関係を
第５図に示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法で測定して得られたα−
フエトプロテインの検量線であり、第２図はヒト
血清の希釈率と吸光度の関係をアミラーゼインヒ
ビターを添加した場合（黒丸）と添加しなかつた
場合（白丸）について測定した結果を示すもので
ある。第３図は本発明の方法で測定して得られた
ヒトIgGについての検量線である。第４図は測定
の一例で使用した多層フイルムの構成を示すもの
であり、第５図はこの多層フイルムを用いて測定
したヒト血清の希釈率と相対反射強度との関係を
示すものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 高等動物由来のアミラーゼを含有している検
   体の抗原決定基具有物質１を測定する方法におい
   て、 該抗原決定基具有物質１と、この抗原決定基具
   有物質１と少なくとも一の抗原決定基を共通にす
   る抗原決定基具有物質２と検体に実質的に含まれ
   ていないアミラーゼとの結合物を、前記の共通の
   抗原決定基と反応する抗体と接触せしめて反応さ
   せ、 前記の高等動物由来のアミラーゼには、このア
   ミラーゼの活性を阻害する程度が前記の結合物に
   結合されているアミラーゼの活性を阻害する程度
   より大きいアミラーゼインヒビターを接触せしめ
   て反応させ、 さらに、前記の結合物に結合されているアミラ
   ーゼが作用しうる水に不溶性の高分子物質に前記
   の結合物を接触せしめて酵素反応させ、アミラー
   ゼ活性を測定することを特徴とする、 抗原決定基具有物質の測定方法。