JPH0317101B2 - - Google Patents
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-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、例えば血清、尿などに含まれる薬物
あるいは各種疾患に由来する微量成分などを測定
する方法に関するものである。
あるいは各種疾患に由来する微量成分などを測定
する方法に関するものである。
血清、尿などの体液に含まれる微量成分の分析
は病気の診断あるいは治療経過の判定などに非常
に有意義であり、日常の臨床検査に活用されてい
る。ところが、これらの体液には多種多様の成分
が含まれており、そのなかには、分子量の近似し
た物質、生理活性の似た物質あるいは構造の近似
した物質なども含まれていることも多い。そこ
で、この分析法は特異性が高く、かつ微少量まで
定量しうることが要求される。さらに、日常検査
として利用されるために、簡便かつルーチン化し
うることが望ましい。
は病気の診断あるいは治療経過の判定などに非常
に有意義であり、日常の臨床検査に活用されてい
る。ところが、これらの体液には多種多様の成分
が含まれており、そのなかには、分子量の近似し
た物質、生理活性の似た物質あるいは構造の近似
した物質なども含まれていることも多い。そこ
で、この分析法は特異性が高く、かつ微少量まで
定量しうることが要求される。さらに、日常検査
として利用されるために、簡便かつルーチン化し
うることが望ましい。
このような条件を備えた分析法として免疫学的
測定法がある。この方法は、抗原−抗体間の高い
親和性と、抗体が抗原決定基を判別する高い特異
性を利用しており、ラジオイムノアツセイ、酵素
免疫測定法、血球等の凝集反応を利用した方法等
に大別される。
測定法がある。この方法は、抗原−抗体間の高い
親和性と、抗体が抗原決定基を判別する高い特異
性を利用しており、ラジオイムノアツセイ、酵素
免疫測定法、血球等の凝集反応を利用した方法等
に大別される。
ラジオイムノアツセイは、感度はすぐれている
が、人体に有害である放射性物質を用いるところ
から使用場所や使用量が厳しく規制されており、
特殊な施設を必要とする。一方、酵素免疫法はこ
のような問題はないが、ラジオイムノアツセイも
そうであるが、遊離標識物と結合標識物の分離が
必要である。そして、この分離操作は、非常に繁
雑であり、操作及び測定誤差の両面で問題になつ
ている。血球等の凝集反応を利用した方法の場合
にはこの分離操作は必要ないが、この方法は感度
が低く、数ng〜fgのような極微量を測定するこ
とは困難である。
が、人体に有害である放射性物質を用いるところ
から使用場所や使用量が厳しく規制されており、
特殊な施設を必要とする。一方、酵素免疫法はこ
のような問題はないが、ラジオイムノアツセイも
そうであるが、遊離標識物と結合標識物の分離が
必要である。そして、この分離操作は、非常に繁
雑であり、操作及び測定誤差の両面で問題になつ
ている。血球等の凝集反応を利用した方法の場合
にはこの分離操作は必要ないが、この方法は感度
が低く、数ng〜fgのような極微量を測定するこ
とは困難である。
本発明者らは上記のような欠点のない測定方法
を開発すべく種々検討の結果、測定目的物である
抗原決定基具有物質に対する抗体と酵素に対する
抗体との結合物に、測定目的物である抗原決定基
具有物質と、該抗原決定基具有物質と高分子化合
物との結合物又は該抗原決定基具有物質の重合物
と、酵素とを接触させると、酵素活性が目的とす
る抗原決定基具有物質の量に応じて変化すること
を見出した。そして、この反応を利用して抗原決
定基具有物質を、高感度で、かつ前述の分離操作
を行なわないで簡便に測定しうる方法を案出し、
これに基いて本発明を完成するに至つた。
を開発すべく種々検討の結果、測定目的物である
抗原決定基具有物質に対する抗体と酵素に対する
抗体との結合物に、測定目的物である抗原決定基
具有物質と、該抗原決定基具有物質と高分子化合
物との結合物又は該抗原決定基具有物質の重合物
と、酵素とを接触させると、酵素活性が目的とす
る抗原決定基具有物質の量に応じて変化すること
を見出した。そして、この反応を利用して抗原決
定基具有物質を、高感度で、かつ前述の分離操作
を行なわないで簡便に測定しうる方法を案出し、
これに基いて本発明を完成するに至つた。
すなわち本発明は、検体に含まれる抗原決定基
具有物質と、該抗原決定基具有物質と高分子化合
物との結合物又は該抗原決定基具有物質の重合物
と、酵素又は酵素と高分子化合物との結合物と
を、溶液中で該抗原決定基具有物質に対する抗体
と該酵素に対する抗体との結合物又は該抗原決定
基具有物質に対する抗体と該酵素に対する抗体と
高分子化合物との結合物に接触せしめ、その後前
記酵素の活性を測定することを特徴とする抗原決
定基具有物質の測定方法に関するものである。
具有物質と、該抗原決定基具有物質と高分子化合
物との結合物又は該抗原決定基具有物質の重合物
と、酵素又は酵素と高分子化合物との結合物と
を、溶液中で該抗原決定基具有物質に対する抗体
と該酵素に対する抗体との結合物又は該抗原決定
基具有物質に対する抗体と該酵素に対する抗体と
高分子化合物との結合物に接触せしめ、その後前
記酵素の活性を測定することを特徴とする抗原決
定基具有物質の測定方法に関するものである。
本発明方法における測定対象は検体に含まれる
抗原決定基具有物質である。検体の種類は限定さ
れないが、例えば血清、尿などである。血清、尿
などの場合は、通常は特別な前処理を必要とせ
ず、そのまま測定を行なうことができる。
抗原決定基具有物質である。検体の種類は限定さ
れないが、例えば血清、尿などである。血清、尿
などの場合は、通常は特別な前処理を必要とせ
ず、そのまま測定を行なうことができる。
抗原決定基具有物質(以下、リガンドという。)
は抗原決定基を一又は二以上有しているものであ
り、例としては、ジゴキシン、テオフイリン、フ
エノバルビタール、フエニトイン、ペニシリン、
アミカシン等の薬物、プロスタグランジン、テス
トステロン、プロゲステロン、サイロキシン等の
ホルモンなどを挙げることができる。これらは低
分子ハプテンであるが、本発明の方法を適用しう
るリガンドは低分子ハプテンのみでなく、例えば
インシユリン、TSH、サイログロブリン等の蛋
白ホルモン類、IgG、IgE、IgA等の免疫グロブ
リン類、あるいはHA、HB等のウイルス抗原類
であつてもよい。このほか、最近非常に重視され
ているガン関連抗原も本発明の方法で測定しう
る。しかしながら、本発明の方法は、特に低分子
のもの、例えば分子量20万以下のものの測定に威
力を発揮する。
は抗原決定基を一又は二以上有しているものであ
り、例としては、ジゴキシン、テオフイリン、フ
エノバルビタール、フエニトイン、ペニシリン、
アミカシン等の薬物、プロスタグランジン、テス
トステロン、プロゲステロン、サイロキシン等の
ホルモンなどを挙げることができる。これらは低
分子ハプテンであるが、本発明の方法を適用しう
るリガンドは低分子ハプテンのみでなく、例えば
インシユリン、TSH、サイログロブリン等の蛋
白ホルモン類、IgG、IgE、IgA等の免疫グロブ
リン類、あるいはHA、HB等のウイルス抗原類
であつてもよい。このほか、最近非常に重視され
ているガン関連抗原も本発明の方法で測定しう
る。しかしながら、本発明の方法は、特に低分子
のもの、例えば分子量20万以下のものの測定に威
力を発揮する。
リガンドと結合している高分子化合物は、分子
量が10万ダルトン以上でかつ水溶性のものが適当
である。高分子化合物の例としては、可溶性デキ
ストラン、カルボキシメチル化デキストラン、ア
ミノ化デキストラン、アミロース等の多糖類及び
その誘導体、ゼラチン、ヘモシアニン、フエリチ
ン等の蛋白質、ポリエチレングリコールなどを挙
げることができる。これらは、酵素と結合させた
状態で所定の条件を具備していればよく、例えば
牛血清アルブミンのような比較的低分子のもので
あつても、それを自家重合させるなどして高分子
化したものであつてもよい。
量が10万ダルトン以上でかつ水溶性のものが適当
である。高分子化合物の例としては、可溶性デキ
ストラン、カルボキシメチル化デキストラン、ア
ミノ化デキストラン、アミロース等の多糖類及び
その誘導体、ゼラチン、ヘモシアニン、フエリチ
ン等の蛋白質、ポリエチレングリコールなどを挙
げることができる。これらは、酵素と結合させた
状態で所定の条件を具備していればよく、例えば
牛血清アルブミンのような比較的低分子のもので
あつても、それを自家重合させるなどして高分子
化したものであつてもよい。
リガンド自身を重合することによつて高分子化
してもよい。重合方法は、前記のリガンドと高分
子化合物との結合方法のなかから適宜選択すれば
よく、例えば、カルボジイミド、グルタルアルデ
ヒド等の二価性架橋剤で高分子化すればよい。
してもよい。重合方法は、前記のリガンドと高分
子化合物との結合方法のなかから適宜選択すれば
よく、例えば、カルボジイミド、グルタルアルデ
ヒド等の二価性架橋剤で高分子化すればよい。
リガンドと高分子化合物との結合方法は双方の
官能基を考慮して決定すればよい。官能基は、ア
ミノ基、カルボキシル基、水酸基、チオール基、
イミダゾール基、フエニル基などを利用すること
ができ、例えばアミノ基相互間を結合させる場合
には、ジイソシアネート法、グルタルアルデヒド
法、ジフルオロベンゼン法、ベンゾキノン法等数
多く知られている。また、アミノ基とカルボキシ
ル基との間を結合させる方法としては、カルボキ
シル基をサクシンイミドエステル化する方法のほ
かカルボジイミド法、ウツドワード試薬法等が知
られており、アミノ基と糖鎖を架橋する過ヨウ素
酸酸化法(Nakane法)もある。チオール基を利
用する場合には、例えばもう一方の側のカルボキ
シル基をサクシンイミドエステル化してこれにシ
ステインを反応させてチオール基を導入し、チオ
ール基反応性二価架橋試薬を用いて双方を結合す
ることができる。フエニル基を利用する方法とし
てはジアゾ化法、アルキル化法などがある。結合
方法はこれらの例示に限られるものではなく、こ
のほか例えば「Method in Immunochemistry」
あるいは「酵素抗体測定法」等の成書に記載され
ている法のなかから適宜選択して利用するするこ
とができる。結合比は1:1に限らず、目的に応
じて任意の比率をとることができることはいうま
でもない。反応後は、ゲル過法、イオン交換ク
ロマトグラフイー、アフイニテイークロマトグラ
フイーなどを適宜組み合わせて精製を行ない、必
要により凍結乾燥法等で乾燥する。
官能基を考慮して決定すればよい。官能基は、ア
ミノ基、カルボキシル基、水酸基、チオール基、
イミダゾール基、フエニル基などを利用すること
ができ、例えばアミノ基相互間を結合させる場合
には、ジイソシアネート法、グルタルアルデヒド
法、ジフルオロベンゼン法、ベンゾキノン法等数
多く知られている。また、アミノ基とカルボキシ
ル基との間を結合させる方法としては、カルボキ
シル基をサクシンイミドエステル化する方法のほ
かカルボジイミド法、ウツドワード試薬法等が知
られており、アミノ基と糖鎖を架橋する過ヨウ素
酸酸化法(Nakane法)もある。チオール基を利
用する場合には、例えばもう一方の側のカルボキ
シル基をサクシンイミドエステル化してこれにシ
ステインを反応させてチオール基を導入し、チオ
ール基反応性二価架橋試薬を用いて双方を結合す
ることができる。フエニル基を利用する方法とし
てはジアゾ化法、アルキル化法などがある。結合
方法はこれらの例示に限られるものではなく、こ
のほか例えば「Method in Immunochemistry」
あるいは「酵素抗体測定法」等の成書に記載され
ている法のなかから適宜選択して利用するするこ
とができる。結合比は1:1に限らず、目的に応
じて任意の比率をとることができることはいうま
でもない。反応後は、ゲル過法、イオン交換ク
ロマトグラフイー、アフイニテイークロマトグラ
フイーなどを適宜組み合わせて精製を行ない、必
要により凍結乾燥法等で乾燥する。
酵素はその抗体が得られるものであればよい。
大部分の酵素は動物体に投与することによつてそ
の体内に抗体を形成するから本発明の方法に使用
できる。動物由来の酵素であつても、異種動物に
投与することによつて通常抗体を得ることが出来
るから例外ではない。酵素は、活性の測定方法が
簡単なもののほうが好都合である。酵素の例とし
ては、グルコース−6−リン酸脱水素酵素、ヘキ
ソキナーゼ、α−アミラーゼ、マレートデヒドロ
ゲナーゼ、アルカリ性ホスフアターゼ、ペルオキ
シダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、クレアチンキ
ナーゼ、リボタクレアーゼ、ペニシリダ−ゼなど
を挙げることができる。
大部分の酵素は動物体に投与することによつてそ
の体内に抗体を形成するから本発明の方法に使用
できる。動物由来の酵素であつても、異種動物に
投与することによつて通常抗体を得ることが出来
るから例外ではない。酵素は、活性の測定方法が
簡単なもののほうが好都合である。酵素の例とし
ては、グルコース−6−リン酸脱水素酵素、ヘキ
ソキナーゼ、α−アミラーゼ、マレートデヒドロ
ゲナーゼ、アルカリ性ホスフアターゼ、ペルオキ
シダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、クレアチンキ
ナーゼ、リボタクレアーゼ、ペニシリダ−ゼなど
を挙げることができる。
酵素を後述する抗体結合物と反応させても活性
があまり変らないときは、酵素を予め高分子化合
物と結合させて高分子化してから用いるのがよ
い。その場合に、用いる高分子化合物及び酵素と
高分子化合物との結合方法は前記のリガンドの場
合のなかから適宜選択すればよい。
があまり変らないときは、酵素を予め高分子化合
物と結合させて高分子化してから用いるのがよ
い。その場合に、用いる高分子化合物及び酵素と
高分子化合物との結合方法は前記のリガンドの場
合のなかから適宜選択すればよい。
リガンドに対する抗体(以下、抗リガンド抗体
という。)と酵素に対する抗体(以下、抗酵素抗
体という。)はいずれも抗体を取得する公知の方
法に準じて取得することができる。例えば兎、山
羊、馬、モルモツト、ニワトリなどの温血動物
に、リガンド又は酵素を体重1Kg当り0.3〜2mg
程度1〜数回背中皮下、フツトパツド、大腿筋等
にアジユバントとともに注射して当該動物の体内
に抗体を形成させればよい。この抗体はペプシン
等の蛋白分解酵素でF(ab′)2、Fab′、Fabなどに
分解して用いてもよい。抗酵素抗体は、酵素と反
応することによつて、酵素活性を完全に阻害する
もの、一部阻害するもの、あるいは全く阻害しな
いものがあるがそのいずれであつても本発明の方
法に使用することができる。これらの抗体は、前
記のフラグメントであると否とを問わず、血清か
らIgGを取得する公知の方法、例えば硫安沈澱
法、イオン交換クロマトグラフイー、ゲル過、
アフイニテイークロマトグラフイーなどで適宜精
製してから用いる。
という。)と酵素に対する抗体(以下、抗酵素抗
体という。)はいずれも抗体を取得する公知の方
法に準じて取得することができる。例えば兎、山
羊、馬、モルモツト、ニワトリなどの温血動物
に、リガンド又は酵素を体重1Kg当り0.3〜2mg
程度1〜数回背中皮下、フツトパツド、大腿筋等
にアジユバントとともに注射して当該動物の体内
に抗体を形成させればよい。この抗体はペプシン
等の蛋白分解酵素でF(ab′)2、Fab′、Fabなどに
分解して用いてもよい。抗酵素抗体は、酵素と反
応することによつて、酵素活性を完全に阻害する
もの、一部阻害するもの、あるいは全く阻害しな
いものがあるがそのいずれであつても本発明の方
法に使用することができる。これらの抗体は、前
記のフラグメントであると否とを問わず、血清か
らIgGを取得する公知の方法、例えば硫安沈澱
法、イオン交換クロマトグラフイー、ゲル過、
アフイニテイークロマトグラフイーなどで適宜精
製してから用いる。
一方、これらの抗体はモノクローナル抗体とし
て取得することもできる。その場合には、マウス
に前記のリガンドあるいは酵素をアジユバントと
ともに数回腹腔等に注射し、脾臓細胞を取り出し
てポリエチレングリコール等を用いてマウスミエ
ローマ細胞と融合させる。そして、この融合細胞
のなかから当該抗体を産生するものをクローニン
グによつてモノクローン細胞として増殖させ、得
られたモノクローン細胞をマウス腹腔中で増殖さ
せることによつてモノクローナル抗体を大量に製
造することができる。
て取得することもできる。その場合には、マウス
に前記のリガンドあるいは酵素をアジユバントと
ともに数回腹腔等に注射し、脾臓細胞を取り出し
てポリエチレングリコール等を用いてマウスミエ
ローマ細胞と融合させる。そして、この融合細胞
のなかから当該抗体を産生するものをクローニン
グによつてモノクローン細胞として増殖させ、得
られたモノクローン細胞をマウス腹腔中で増殖さ
せることによつてモノクローナル抗体を大量に製
造することができる。
抗リガンド抗体と抗酵素抗体との結合方法は前
述の酵素と高分子化合物の結合方法のうち、蛋白
質相互を結合させる方法をすべて利用できる。例
えば、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸酸化
法、マレイミド法、ジイソシアネート法、ベンゾ
キノン法、カルボジイミド法などを利用できる。
このほか、NH2基とSH基を結合するSPDP法、
IgGの糖鎖と結合性をもつプロテインA等のレク
チンを使つた方法、還元剤存在下における2種の
F(ab′)2のSH基の組替方法なども利用できる。
結合物は抗リガンド抗体と抗酵素抗体各1単位の
もののみに限らず、各々が数単位づつ結合したも
の、あるいはさらに結合して高分子化したもので
あつてもよい。
述の酵素と高分子化合物の結合方法のうち、蛋白
質相互を結合させる方法をすべて利用できる。例
えば、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸酸化
法、マレイミド法、ジイソシアネート法、ベンゾ
キノン法、カルボジイミド法などを利用できる。
このほか、NH2基とSH基を結合するSPDP法、
IgGの糖鎖と結合性をもつプロテインA等のレク
チンを使つた方法、還元剤存在下における2種の
F(ab′)2のSH基の組替方法なども利用できる。
結合物は抗リガンド抗体と抗酵素抗体各1単位の
もののみに限らず、各々が数単位づつ結合したも
の、あるいはさらに結合して高分子化したもので
あつてもよい。
この抗体結合物は、前述の酵素と同様、高分子
化合物に結合させて高分子化したほうがよい場合
もある。その場合は、高分子化合物にはリガンド
の際に前述のもののなかから適宜用いればよく、
結合方法も前述と同様でよい。この高分子化は抗
体間の結合を行なう前に一方あるいは両方の抗体
に対して行なつてもよく、また、抗体間の結合を
行なつた後に行なつてもよい。
化合物に結合させて高分子化したほうがよい場合
もある。その場合は、高分子化合物にはリガンド
の際に前述のもののなかから適宜用いればよく、
結合方法も前述と同様でよい。この高分子化は抗
体間の結合を行なう前に一方あるいは両方の抗体
に対して行なつてもよく、また、抗体間の結合を
行なつた後に行なつてもよい。
抗体結合物及びその高分子化物は、ゲル過、
カチオン交換樹脂、アニオン交換樹脂などを用い
たイオン交換クロマトグラフイー、アフイニテイ
−クロマトグラフイーなどを適宜組み合わせて精
製を行ない、必要により凍結乾燥する。
カチオン交換樹脂、アニオン交換樹脂などを用い
たイオン交換クロマトグラフイー、アフイニテイ
−クロマトグラフイーなどを適宜組み合わせて精
製を行ない、必要により凍結乾燥する。
検体に含まれるリガンドと、該リガンドの高分
子化物又は重合物と、酵素又はその高分子化物
を、溶液中で前記の抗体結合物又はその高分子化
物と接触させる。その際、溶液の温度は20〜45℃
程度、そしてPHは通常4〜8.5程度が適当である。
PHを一定に保つために、必要により、リン酸緩衝
液、酢酸緩衝液などの緩衝液を用いてもよい。酵
素又はその高分子化物、リガンドの高分子化物又
は重合物、及び抗体結合物又はその高分子化物の
適当な量は、それらの種類、リガンドの種類、あ
るいは接触時の条件などによつて異なるので予め
試験をして定めるのがよい。リガンドの高分子化
物及び重合物は一方のみを添加してもよく、また
両方添加してもよい。添加量は酵素活性を適当に
変化させるのに必要な量であり、これも酵素、抗
体結合物、リガンドの種類、あるいは接触時の条
件などによつて異なるので予め試験を行なつて定
めるのがよい。抗体結合物とリガンド及び酵素と
の接触時間はいずれも、通常は充分に反応しうる
程度がよく、例えば37℃の場合には20〜60分間程
度が適当である。抗体結合物に対するリガンド、
リガンドの高分子化物又は重合物及び酵素の接触
順序は問うところではなく、いずれが先であつて
もあるいは同時であつてもよい。
子化物又は重合物と、酵素又はその高分子化物
を、溶液中で前記の抗体結合物又はその高分子化
物と接触させる。その際、溶液の温度は20〜45℃
程度、そしてPHは通常4〜8.5程度が適当である。
PHを一定に保つために、必要により、リン酸緩衝
液、酢酸緩衝液などの緩衝液を用いてもよい。酵
素又はその高分子化物、リガンドの高分子化物又
は重合物、及び抗体結合物又はその高分子化物の
適当な量は、それらの種類、リガンドの種類、あ
るいは接触時の条件などによつて異なるので予め
試験をして定めるのがよい。リガンドの高分子化
物及び重合物は一方のみを添加してもよく、また
両方添加してもよい。添加量は酵素活性を適当に
変化させるのに必要な量であり、これも酵素、抗
体結合物、リガンドの種類、あるいは接触時の条
件などによつて異なるので予め試験を行なつて定
めるのがよい。抗体結合物とリガンド及び酵素と
の接触時間はいずれも、通常は充分に反応しうる
程度がよく、例えば37℃の場合には20〜60分間程
度が適当である。抗体結合物に対するリガンド、
リガンドの高分子化物又は重合物及び酵素の接触
順序は問うところではなく、いずれが先であつて
もあるいは同時であつてもよい。
これらの接触を行なわせたのちには酵素活性を
測定して検体中のリガンドの量を算出する。酵素
活性の測定方法は公知の方法に従つて行なえばよ
い。例えば、酵素にグルコース−6−リン酸脱水
素酵素を用いた場合には、上記の接触を行なわせ
た反応系にグルコース−6−リン酸及びNADP+
を含む基質溶液を加えて反応させ、生成する
NADPHを波長340nmの吸光度の増加から求めれ
ばよい。また、ヘキソキナーゼを用いた場合に
は、反応系にグルコース、ATP、NADP+及びグ
ルコース−6−リン酸脱水素酵素を含む基質溶液
を加えて反応させ、やはりNADPHの生成量を
測定することによつて求めればよい。
測定して検体中のリガンドの量を算出する。酵素
活性の測定方法は公知の方法に従つて行なえばよ
い。例えば、酵素にグルコース−6−リン酸脱水
素酵素を用いた場合には、上記の接触を行なわせ
た反応系にグルコース−6−リン酸及びNADP+
を含む基質溶液を加えて反応させ、生成する
NADPHを波長340nmの吸光度の増加から求めれ
ばよい。また、ヘキソキナーゼを用いた場合に
は、反応系にグルコース、ATP、NADP+及びグ
ルコース−6−リン酸脱水素酵素を含む基質溶液
を加えて反応させ、やはりNADPHの生成量を
測定することによつて求めればよい。
本発明の方法においては、リガンドの高分子化
物及び重合物は抗体結合物に対して検体中のリガ
ンドと競争反応し、抗体結合物に結合したリガン
ドの高分子化物及び重合物の立体障害等によつて
酵素の抗体結合物への結合が阻害されることを利
用している。すなわち、抗体結合物へのリガンド
の高分子化物及び重合物の結合量が検体中のリガ
ンドの量に応じて変化し、この高分子化物及び重
合物の結合量に応じて酵素の抗体結合物への結合
量が変わる。そして、遊離の酵素の活性と、抗体
結合物に結合されている酵素の活性が異なること
を利用して検体量のリガンドの量を求めているの
である。
物及び重合物は抗体結合物に対して検体中のリガ
ンドと競争反応し、抗体結合物に結合したリガン
ドの高分子化物及び重合物の立体障害等によつて
酵素の抗体結合物への結合が阻害されることを利
用している。すなわち、抗体結合物へのリガンド
の高分子化物及び重合物の結合量が検体中のリガ
ンドの量に応じて変化し、この高分子化物及び重
合物の結合量に応じて酵素の抗体結合物への結合
量が変わる。そして、遊離の酵素の活性と、抗体
結合物に結合されている酵素の活性が異なること
を利用して検体量のリガンドの量を求めているの
である。
本発明の方法は、リガンドを特異性高くかつ極
めて高感度で測定できる。また、操作が簡単であ
り、安価かつ容易にリガンドを定量することが可
能である。本発明の方法はリガンドの種類を問わ
ず測定できるが特に低分子のリガンドの測定に威
力を発揮する。
めて高感度で測定できる。また、操作が簡単であ
り、安価かつ容易にリガンドを定量することが可
能である。本発明の方法はリガンドの種類を問わ
ず測定できるが特に低分子のリガンドの測定に威
力を発揮する。
以下、実施例を示す。
実施例 1
) デキストラン−テオフイリン結合物の調製
分子量約200万のデキストラン1gを1N水酸化
ナトリウムの90%エタノール溶液50mlに懸濁
し、この溶液にクロル酢酸1gを加えて37℃で
16時間撹拌した。反応後、沈澱物を取し、エ
タノールで十分洗浄してから水に溶かし、この
水溶液をセフアデツクスG−25を充填したカラ
ムに流して未反応のクロル酢酸を除いた。流出
してきた素通り分画であるカルボキシメチルデ
キストランと分画を集めて凍結乾燥した。
ナトリウムの90%エタノール溶液50mlに懸濁
し、この溶液にクロル酢酸1gを加えて37℃で
16時間撹拌した。反応後、沈澱物を取し、エ
タノールで十分洗浄してから水に溶かし、この
水溶液をセフアデツクスG−25を充填したカラ
ムに流して未反応のクロル酢酸を除いた。流出
してきた素通り分画であるカルボキシメチルデ
キストランと分画を集めて凍結乾燥した。
このカルボキシメチルデキストラン500mgを
ジオキサン中に懸濁させ、N−ヒドロキシサク
シンイミド500mg及び1−エチル−3−(ジメチ
ルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩
(EDC)500mgを加えて室温で一夜撹拌した。
沈澱物をグラスフイルターを用いて取し、ジ
オキサンで十分洗浄してからエーテルで洗浄し
た。洗浄物を乾燥させてカルボキシメチルデキ
ストランのサクシンイミドエステルを得た。
ジオキサン中に懸濁させ、N−ヒドロキシサク
シンイミド500mg及び1−エチル−3−(ジメチ
ルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩
(EDC)500mgを加えて室温で一夜撹拌した。
沈澱物をグラスフイルターを用いて取し、ジ
オキサンで十分洗浄してからエーテルで洗浄し
た。洗浄物を乾燥させてカルボキシメチルデキ
ストランのサクシンイミドエステルを得た。
このカルボキシメチルデキストランのサクシ
ンイミドエステル200mgを0.1Mヘキサメチレン
ジアミン溶液(PH8.0)に加え、室温で2時間
撹拌した。続いて、セフアデツクスG−25のカ
ラムを用いてゲル過を行ない、素通り分画を
凍結乾燥してアミノ化デキストランの凍結乾燥
品を得た。
ンイミドエステル200mgを0.1Mヘキサメチレン
ジアミン溶液(PH8.0)に加え、室温で2時間
撹拌した。続いて、セフアデツクスG−25のカ
ラムを用いてゲル過を行ない、素通り分画を
凍結乾燥してアミノ化デキストランの凍結乾燥
品を得た。
3−カルボキシテオフイリン10mg及び先に調
製しておいたアミノ化デキストラン100mgを水
に溶かし、PH6.0に調整した。この溶液に
EDC20mgを加え、PH6.0に調節しつつ1時間保
持して反応させた。この反応液をPH7.0の
20mMリン酸緩衝生理食塩溶液で平衡化してお
いたセフアデツクスG−25を用いてゲル過
し、素通り分画を分取した。この素通り分画を
凍結乾燥して目的のテオフイリン−デキストラ
ン結合物を得た。
製しておいたアミノ化デキストラン100mgを水
に溶かし、PH6.0に調整した。この溶液に
EDC20mgを加え、PH6.0に調節しつつ1時間保
持して反応させた。この反応液をPH7.0の
20mMリン酸緩衝生理食塩溶液で平衡化してお
いたセフアデツクスG−25を用いてゲル過
し、素通り分画を分取した。この素通り分画を
凍結乾燥して目的のテオフイリン−デキストラ
ン結合物を得た。
) 抗テオフイリンウサギ抗体と抗グルコース
−6−リン酸脱水素酵素マウスモノクローナル
抗体(抗G 6 PDH抗体)との結合物の調
製 抗テオフイリンウサギIgG5mgをPH6.3の0.1M
リン酸緩衝液1mlに溶かし、これに2mg/mlの
4−マレイミドメチルシクロヘキサン−1−カ
ルボン酸サクシンイミドエステル(CHMS)
のジオキサン溶液100μを加えて室温にて1
時間放置した。この溶液をセフアデツクスG−
25のカラム(1cm×50cm)に入れ、1mM
EDTAを含むPH6.5の0.1Mリン酸緩衝液でゲル
過を行なつて未反応のCHMSを除き、得ら
れた4−マレイミドメチルシクロヘキサン−1
−カルボン酸と抗テオフイリンウサギIgGとの
結合物(CHM化抗テオフイリンウサギ抗体)
の溶液を1mlに濃縮した。
−6−リン酸脱水素酵素マウスモノクローナル
抗体(抗G 6 PDH抗体)との結合物の調
製 抗テオフイリンウサギIgG5mgをPH6.3の0.1M
リン酸緩衝液1mlに溶かし、これに2mg/mlの
4−マレイミドメチルシクロヘキサン−1−カ
ルボン酸サクシンイミドエステル(CHMS)
のジオキサン溶液100μを加えて室温にて1
時間放置した。この溶液をセフアデツクスG−
25のカラム(1cm×50cm)に入れ、1mM
EDTAを含むPH6.5の0.1Mリン酸緩衝液でゲル
過を行なつて未反応のCHMSを除き、得ら
れた4−マレイミドメチルシクロヘキサン−1
−カルボン酸と抗テオフイリンウサギIgGとの
結合物(CHM化抗テオフイリンウサギ抗体)
の溶液を1mlに濃縮した。
抗G 6 PDH抗体5mgを5mM EDTAを
含むPH7.5の0.1Mリン酸緩衝液に溶かし、これ
に9mg/mlのS−アセチルメルカプトコハク酸
無水物のジメチルスルホキシド溶液100μを
加えて37℃で1時間加温した。続いて、PH7.5
の1Mヒドロキシルアミン溶液110μを加えて
37℃で30分間放置して反応させた。この反応液
をセフアデツクスG−25を用い、1mM EDTA
を含むPH6.5の0.1Mリン酸緩衝液でゲル過を
行なつて未反応のS−アセチルメルカプトコハ
ク酸を除去した。
含むPH7.5の0.1Mリン酸緩衝液に溶かし、これ
に9mg/mlのS−アセチルメルカプトコハク酸
無水物のジメチルスルホキシド溶液100μを
加えて37℃で1時間加温した。続いて、PH7.5
の1Mヒドロキシルアミン溶液110μを加えて
37℃で30分間放置して反応させた。この反応液
をセフアデツクスG−25を用い、1mM EDTA
を含むPH6.5の0.1Mリン酸緩衝液でゲル過を
行なつて未反応のS−アセチルメルカプトコハ
ク酸を除去した。
こうして得られたSH化抗G 6 PDH抗体
を1mlまで濃縮し、これに前記のCHM化抗テ
オフイリンウサギIgGの濃縮液1mlを加えて4
℃で一夜放置して反応させた。この反応液をセ
フアクリル−S−300(1cm×120cm)でゲル
過し、抗テオフイリンウサギ抗体と抗G 6
PDH抗体との1:1の結合物を得る。
を1mlまで濃縮し、これに前記のCHM化抗テ
オフイリンウサギIgGの濃縮液1mlを加えて4
℃で一夜放置して反応させた。この反応液をセ
フアクリル−S−300(1cm×120cm)でゲル
過し、抗テオフイリンウサギ抗体と抗G 6
PDH抗体との1:1の結合物を得る。
) テオフイリンの定量
テオフイリン−デキストラン結合物30μg及
び前記の抗体結合物100μgを含む溶液50μに
各種濃度のテオフイリン溶液を加え、37℃で30
分間加温後、グルコース−6−リン酸脱水素酵
素(G 6 PDH)1μgを含有する溶液50μ
を加えた。30分後に、0.5mMグルコース−6
−リン酸、0.5mM NADP及び20mM MgCl2
を含む0.1Mグリシルグリシン緩衝液(PH8.5)
1.0mlを加えて30℃における波長340nmの吸光
度の増加速度を求めたところ下表に示す結果が
得られた。
び前記の抗体結合物100μgを含む溶液50μに
各種濃度のテオフイリン溶液を加え、37℃で30
分間加温後、グルコース−6−リン酸脱水素酵
素(G 6 PDH)1μgを含有する溶液50μ
を加えた。30分後に、0.5mMグルコース−6
−リン酸、0.5mM NADP及び20mM MgCl2
を含む0.1Mグリシルグリシン緩衝液(PH8.5)
1.0mlを加えて30℃における波長340nmの吸光
度の増加速度を求めたところ下表に示す結果が
得られた。
テオフイリン量 ΔA340on/min
0μg 0.091
2.0 0.081
5.0 0.072
10.0 0.054
20.0 0.032
30.0 0.026
40.0 0.024
ヒト血清5検体について、各50μを用いて前
記と同様に測定を行ない、前表の結果を検量線に
用いてテオフイリンの濃度を求めた。一方、これ
に並行して従来法であるRIA法で同じ血清のテオ
フイリン濃度を測定した。
記と同様に測定を行ない、前表の結果を検量線に
用いてテオフイリンの濃度を求めた。一方、これ
に並行して従来法であるRIA法で同じ血清のテオ
フイリン濃度を測定した。
得られた結果を下表に示す。
テオフイリン濃度
血 清 本発明法 RIA法
A 0.5μg/ml 0.31μg/ml
B 2.0 2.6
C 15.0 14.6
D 13.1 13.3
E 10.6 10.1
実施例 2
) 抗グルコース−6−リン酸脱水素酵素マウ
スIgG(α−G 6 PDH IgG)の調製 抗原として酵母由来のG 6 PDH(オリエ
ンタル酵母工業(株)製)を用いた。このG 6
PDHの1mg/mlの溶液をフロイントの完全ア
ジユバントと等容混合してエマルジヨンとし、
その0.1mlを8週令のBALB/Cマウスの腹腔
に1週間おきに3回注射した。それからさらに
1週間後に尾静脈に50μg/0.1mlのG 6
PDH溶液を注射し、3日後に脾臓を摘出した。
スIgG(α−G 6 PDH IgG)の調製 抗原として酵母由来のG 6 PDH(オリエ
ンタル酵母工業(株)製)を用いた。このG 6
PDHの1mg/mlの溶液をフロイントの完全ア
ジユバントと等容混合してエマルジヨンとし、
その0.1mlを8週令のBALB/Cマウスの腹腔
に1週間おきに3回注射した。それからさらに
1週間後に尾静脈に50μg/0.1mlのG 6
PDH溶液を注射し、3日後に脾臓を摘出した。
この脾臓を摩砕して脾臓細胞を分離し、ポリ
エチレングリコール1500を用いてマウスミエロ
ーマP3U1と細胞融合させた。
エチレングリコール1500を用いてマウスミエロ
ーマP3U1と細胞融合させた。
得られた融合細胞を96ウエルのプレートに分
注し、HAT培地で培養した。各ウエルの細胞
をG 6 PDHを固相に固定化したプレート
を用いたELISA法で調べて、G 6 PDHに
反応性を有するマウスIgGを含むと思われる5
ウエルを見出した。この5ウエルの細胞を限界
希釈法で希釈してクローニングし、ELISA法
を応用した阻害測定法で調べて、G 6
PDHの異なる抗原決定基を認識していると思
われる2つの細胞株を得た。
注し、HAT培地で培養した。各ウエルの細胞
をG 6 PDHを固相に固定化したプレート
を用いたELISA法で調べて、G 6 PDHに
反応性を有するマウスIgGを含むと思われる5
ウエルを見出した。この5ウエルの細胞を限界
希釈法で希釈してクローニングし、ELISA法
を応用した阻害測定法で調べて、G 6
PDHの異なる抗原決定基を認識していると思
われる2つの細胞株を得た。
この細胞株をそれぞれ10%FCS−RPMI培地
で増殖させ、この増殖細胞を予めプリスタンを
注射したBALB/Cマウスの腹腔へ107個づつ
注入して、2週間後に腹水約10mlを採取した。
で増殖させ、この増殖細胞を予めプリスタンを
注射したBALB/Cマウスの腹腔へ107個づつ
注入して、2週間後に腹水約10mlを採取した。
この腹水を45%飽和の硫安で塩析し、生成し
た沈澱物を分離した。この沈澱物を少量のリン
酸緩衝液PH7.0で溶解し、同緩衝液で平衡化し
たセフアクリルS−300カラムでゲル過して
IgG分画を分取した。
た沈澱物を分離した。この沈澱物を少量のリン
酸緩衝液PH7.0で溶解し、同緩衝液で平衡化し
たセフアクリルS−300カラムでゲル過して
IgG分画を分取した。
こうして得られた、異なる抗原決定基を認識
している2細胞株から得た各IgGを等量づつ混
合して、α−G 6 PDH IgGとした。
している2細胞株から得た各IgGを等量づつ混
合して、α−G 6 PDH IgGとした。
) 抗ヒトIgGヤギIgG F(ab′)2の調製
抗ヒトIgGヤギIgG10mgを0.1M酢酸ナトリウ
ム(PH4.2)2mlに溶かし、これにペプシン
100μgを加えて37℃で一夜撹拌した。この反応
溶液をPH7.5に調整し、セフアデツクスG−100
でゲル過した。分子量10万付近の分画を集め
て、ポリエチレングリコールを用いて濃縮し、
抗ヒトIgGヤギIgG F(ab′)2を得た(蛋白とし
て6mg含有)。
ム(PH4.2)2mlに溶かし、これにペプシン
100μgを加えて37℃で一夜撹拌した。この反応
溶液をPH7.5に調整し、セフアデツクスG−100
でゲル過した。分子量10万付近の分画を集め
て、ポリエチレングリコールを用いて濃縮し、
抗ヒトIgGヤギIgG F(ab′)2を得た(蛋白とし
て6mg含有)。
) 抗G 6 PDHマウスIgG Fabの調製
マウスIgG10mgを上記と同様に処理したとこ
ろ、抗G 6 PDHマウスIgGはFabに切断さ
れ、その収量は3.6mgであつた。
ろ、抗G 6 PDHマウスIgGはFabに切断さ
れ、その収量は3.6mgであつた。
) 高分子化ヒトIgGの調製
ヒトIgG5mgを10mMリン酸緩衝液(PH6.0)
1mlに溶解し、これにEDC10mgを加えて、
0.1NNaOH及び0.1NHClを用いてPH6.0に保つ
た。溶液が幾分白濁してきたら20mMリン酸緩
衝液(PH7.0)で平衡化しておいたセフアデツ
クスG−25のカラムに流して脱塩し、素通り分
画をプールした。この素通り分画をセフアロー
ス4Bでさらにゲル過して素通り分画を集め、
高分子化ヒトIgGを得た。
1mlに溶解し、これにEDC10mgを加えて、
0.1NNaOH及び0.1NHClを用いてPH6.0に保つ
た。溶液が幾分白濁してきたら20mMリン酸緩
衝液(PH7.0)で平衡化しておいたセフアデツ
クスG−25のカラムに流して脱塩し、素通り分
画をプールした。この素通り分画をセフアロー
ス4Bでさらにゲル過して素通り分画を集め、
高分子化ヒトIgGを得た。
) 抗ヒトIgGヤギIgG Fab−抗G 6
PDHマウスIgG Fab結合物の調製 抗G 6 PDHマウスIgG Fab2mgを0.1M
リン酸緩衝液(PH6.0)1mlに溶かし、これに
CHMSのアセトン溶液(2.0mg/ml)100μを
加えて30℃で90分間反応させた。この反応液を
予め0.1Mリン酸緩衝液(PH6.3)で平衡化して
おいたセフアデツクスG−25のカラムに流して
ゲル過し、素通り分画を集めて1mlまで濃縮
した。これにより、CHM化抗G 6 PDHマ
ウスIgG Fabを2mg得た。
PDHマウスIgG Fab結合物の調製 抗G 6 PDHマウスIgG Fab2mgを0.1M
リン酸緩衝液(PH6.0)1mlに溶かし、これに
CHMSのアセトン溶液(2.0mg/ml)100μを
加えて30℃で90分間反応させた。この反応液を
予め0.1Mリン酸緩衝液(PH6.3)で平衡化して
おいたセフアデツクスG−25のカラムに流して
ゲル過し、素通り分画を集めて1mlまで濃縮
した。これにより、CHM化抗G 6 PDHマ
ウスIgG Fabを2mg得た。
次に、抗ヒトIgGヤギIgG F(ab′)21mgを
0.1Mリン酸緩衝液(PH6.0)に溶かし、これに
2−メルカプトエチルアミン溶液(56mg/ml蒸
溜水)100μを加えて37℃で1.5時間反応させ
た。この反応液を予め1mM EDTAを含有する
0.1Mリン酸緩衝液(PH6.3)で平衡化しておい
たセフアデツクスG−25でゲル過した。素通
り分画を集め、ポリエチレングリコールを用い
て1mlまで濃縮した。
0.1Mリン酸緩衝液(PH6.0)に溶かし、これに
2−メルカプトエチルアミン溶液(56mg/ml蒸
溜水)100μを加えて37℃で1.5時間反応させ
た。この反応液を予め1mM EDTAを含有する
0.1Mリン酸緩衝液(PH6.3)で平衡化しておい
たセフアデツクスG−25でゲル過した。素通
り分画を集め、ポリエチレングリコールを用い
て1mlまで濃縮した。
この濃縮物を前述のCHM化抗G 6 PDH
マウスIgG Fab溶液と混合し、4℃で一夜放置
した。続いて、予め20mMリン酸緩衝生理食塩
溶液(PH7.0)で平衡化しておいたセフアデツ
クスG−150を用いてゲル過し、分子量10万
付近の分画を分取して2mlまで濃縮し、目的の
結合物を得た。
マウスIgG Fab溶液と混合し、4℃で一夜放置
した。続いて、予め20mMリン酸緩衝生理食塩
溶液(PH7.0)で平衡化しておいたセフアデツ
クスG−150を用いてゲル過し、分子量10万
付近の分画を分取して2mlまで濃縮し、目的の
結合物を得た。
) ヒトIgGの測定
高分子化ヒトIgG1.0mgを含む50μの溶液を
小試験管にとり、ヒトIgGを下表に示す濃度で
含有する溶液50μ及び前述の抗G 6 PDH
マウスIgG Fab−抗ヒトIgGヤギIgG Fab結合
物濃縮液50μを加えて37℃で30分間放置し
た。これにG 6 PDH 1μgを含有する溶液
50μを加えて37℃で30分間放置し、次に、
0.5mMグルコース−6−リン酸、0.15mM
NADP+、20mM MgCl2及び0.1Mグリシルグ
リシンを含むPH8.5の基質溶液1.0mlを加えて、
37℃で波長340nmにおける吸光度の上昇を測定
した。
小試験管にとり、ヒトIgGを下表に示す濃度で
含有する溶液50μ及び前述の抗G 6 PDH
マウスIgG Fab−抗ヒトIgGヤギIgG Fab結合
物濃縮液50μを加えて37℃で30分間放置し
た。これにG 6 PDH 1μgを含有する溶液
50μを加えて37℃で30分間放置し、次に、
0.5mMグルコース−6−リン酸、0.15mM
NADP+、20mM MgCl2及び0.1Mグリシルグ
リシンを含むPH8.5の基質溶液1.0mlを加えて、
37℃で波長340nmにおける吸光度の上昇を測定
した。
得られた結果を下表に示す。
ヒトIgG ΔA340on/min
0μg 0.090
100 0.080
300 0.062
600 0.041
1200 0.032
2500 0.025
ヒト血清5検体について、各50μを用いて前
記と同様に測定を行ない、前表の結果を検量線に
用いてIgGの濃度を求めた。一方、これに並行し
て従来法であるSRID法で同じ血清のIgG濃度を
測定した。
記と同様に測定を行ない、前表の結果を検量線に
用いてIgGの濃度を求めた。一方、これに並行し
て従来法であるSRID法で同じ血清のIgG濃度を
測定した。
得られた結果を下表に示す。
血 清 本発明法 SRID法
A 11.2mg/ml 10.9mg/ml
B 8.6 9.1
C 13.5 12.1
D 13.7 13.6
E 12.2 11.8
Claims (1)
- 1 検体に含まれる抗原決定基具有物質と、該抗
原決定基具有物質と高分子化合物との結合物又は
該抗原決定基具有物質の重合物と、酵素又は酵素
と高分子化合物との結合物とを、溶液中で該抗原
決定基具有物質に対する抗体と該酵素に対する抗
体との結合物又は該抗原決定基具有物質に対する
抗体と該酵素に対する抗体と高分子化合物との結
合物に接触せしめ、その後前記酵素の活性を測定
することを特徴とする抗原決定基具有物質の測定
方法。
Priority Applications (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP5149583A JPS59178361A (ja) | 1983-03-29 | 1983-03-29 | 抗原決定基具有物質測定法 |
DE8484301154T DE3483620D1 (de) | 1983-03-11 | 1984-02-22 | Verfahren zur bestimmung von liganden. |
EP84301154A EP0119767B1 (en) | 1983-03-11 | 1984-02-22 | Method of measuring ligands |
ES530439A ES8605098A1 (es) | 1983-03-11 | 1984-03-09 | Metodo de medir ligandos del tipo de substancias medicinales y constituyentes trazos derivados de diversas enfermedades en fluidos corporales tales como suero sanguineo y orina. |
US06/588,682 US4621048A (en) | 1983-03-11 | 1984-03-12 | Reagents containing an anti-ligand bound to an anti-enzyme and methods for employing said reagents in an immunoassy |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP5149583A JPS59178361A (ja) | 1983-03-29 | 1983-03-29 | 抗原決定基具有物質測定法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS59178361A JPS59178361A (ja) | 1984-10-09 |
JPH0317101B2 true JPH0317101B2 (ja) | 1991-03-07 |
Family
ID=12888549
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP5149583A Granted JPS59178361A (ja) | 1983-03-11 | 1983-03-29 | 抗原決定基具有物質測定法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS59178361A (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0308236B1 (en) * | 1987-09-18 | 1994-11-23 | Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. | Dye-providing composition, diagnostic test kit and their use in method for ligand determination using peroxidase labeled-receptor |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS56133661A (en) * | 1980-02-22 | 1981-10-19 | Aa Tooma Hansu | Competing uniform determination of ligand |
JPS587561A (ja) * | 1981-06-30 | 1983-01-17 | ザ・ウエルカム・フアウンデ−シヨン・リミテツド | 酵素免疫分析法 |
-
1983
- 1983-03-29 JP JP5149583A patent/JPS59178361A/ja active Granted
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS56133661A (en) * | 1980-02-22 | 1981-10-19 | Aa Tooma Hansu | Competing uniform determination of ligand |
JPS587561A (ja) * | 1981-06-30 | 1983-01-17 | ザ・ウエルカム・フアウンデ−シヨン・リミテツド | 酵素免疫分析法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS59178361A (ja) | 1984-10-09 |
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Legal Events
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---|---|---|---|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees | ||
S199 | Written request for registration of transfer of right |
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R370 | Written measure of declining of transfer procedure |
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