JPS59178361A - 抗原決定基具有物質測定法 - Google Patents
抗原決定基具有物質測定法Info
- Publication number
- JPS59178361A JPS59178361A JP5149583A JP5149583A JPS59178361A JP S59178361 A JPS59178361 A JP S59178361A JP 5149583 A JP5149583 A JP 5149583A JP 5149583 A JP5149583 A JP 5149583A JP S59178361 A JPS59178361 A JP S59178361A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- enzyme
- ligand
- antibody
- high molecular
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
あるいは各種疾患に由来する微量成分などを測定する方
法に関するものである。
法に関するものである。
血清，尿方どの体液に含まれる微量成分の分析は病気の
診断あるいは治療経過の判定などに非常に有意義であり
、１潜の臨床検査に活用されている。ところが、これら
の体液には多種多様の成分が含まれており、そのなかに
は、分子量の近似した物質、生理活性の似た物質あるい
は構造の近似した物質なども含まれていることも多い。
診断あるいは治療経過の判定などに非常に有意義であり
、１潜の臨床検査に活用されている。ところが、これら
の体液には多種多様の成分が含まれており、そのなかに
は、分子量の近似した物質、生理活性の似た物質あるい
は構造の近似した物質なども含まれていることも多い。
そこで、この分析法は特異性が高く、かつ微少量まで定
量しうろことが要求される。さらに、日常検査として利
用されるために、簡便かつルーチン化しうることが望ま
しい。
量しうろことが要求される。さらに、日常検査として利
用されるために、簡便かつルーチン化しうることが望ま
しい。
このような条件を備えた分析法として免疫学的測定法が
ある。この方法は、抗原一抗体間の高い親和性と、抗体
が抗原決定基を判別する高い特異性を利用しており、ラ
・ソオイムノア，セイ、酵素免疫測定法、血球等の凝集
反応を利用した方法等に大別される。
ある。この方法は、抗原一抗体間の高い親和性と、抗体
が抗原決定基を判別する高い特異性を利用しており、ラ
・ソオイムノア，セイ、酵素免疫測定法、血球等の凝集
反応を利用した方法等に大別される。
ラジオイムノアノセイは、感度はすぐれているが、人体
に有害である放射性物質を用いるところから使用場所や
使用量が厳しく規制されており、特殊な施設を必要とす
る。一方、酵素免疫法はこのような問題はないが、ラジ
副イムノア，セイもそうであるが、遊離標識物と結合標
識物の分離が必要である。そして、この分離操作は、非
常に繁雑であり、操作及び測定誤差の両面で問題になっ
ている。血球等の凝集反応を利用した方法の場合にはこ
の分離操作は必要ないが、この方法は感度が低く、数ｎ
ｊｉ −ｆ ｇのような極微量を迎Ｉ定することは困
難である。
に有害である放射性物質を用いるところから使用場所や
使用量が厳しく規制されており、特殊な施設を必要とす
る。一方、酵素免疫法はこのような問題はないが、ラジ
副イムノア，セイもそうであるが、遊離標識物と結合標
識物の分離が必要である。そして、この分離操作は、非
常に繁雑であり、操作及び測定誤差の両面で問題になっ
ている。血球等の凝集反応を利用した方法の場合にはこ
の分離操作は必要ないが、この方法は感度が低く、数ｎ
ｊｉ −ｆ ｇのような極微量を迎Ｉ定することは困
難である。
本発明者らは上記のような欠点のない測定方法を開発す
べく種々検討の結果、測定目的物である抗原決定基具有
物質に対する抗体と酵素に対する抗体との結合物に、測
定目的物である抗原決定基具有物質と、該抗原決定基具
有物質と高分子化合物との結合物又は該抗原決定基具有
物質の重合物と、酵素とを接触はせると、酵素活性が目
的とする抗原決定基具有物質の量に応じて変化すること
を見出した。そして、この反応を利用して抗原決定基具
有物質を、高感度で、かつ前述の分離操作を行なわない
で簡便に測定しつる方法を案出し、これに基いて本発明
を完成するに至った。
べく種々検討の結果、測定目的物である抗原決定基具有
物質に対する抗体と酵素に対する抗体との結合物に、測
定目的物である抗原決定基具有物質と、該抗原決定基具
有物質と高分子化合物との結合物又は該抗原決定基具有
物質の重合物と、酵素とを接触はせると、酵素活性が目
的とする抗原決定基具有物質の量に応じて変化すること
を見出した。そして、この反応を利用して抗原決定基具
有物質を、高感度で、かつ前述の分離操作を行なわない
で簡便に測定しつる方法を案出し、これに基いて本発明
を完成するに至った。
すなわち本発明は、検体に含まれる抗原決定基具有物質
と、該抗原決定基具有物質と高分子化合物との結合物又
は該抗原決定基具有物質の重合物と、酵素又は酵素と高
分子化合物との結合物とを、溶液中で該抗原決定基具有
物質に対する抗体と該酵素に対する抗体との結合物又は
該抗原決定基具有物質に対する抗体と該酵素に対する抗
体と高分子化合物との結合物に接触せしめ、その後前記
酵素の活性を測定することを特徴とする抗原決定基具有
物質の測定方法に関するものである。
と、該抗原決定基具有物質と高分子化合物との結合物又
は該抗原決定基具有物質の重合物と、酵素又は酵素と高
分子化合物との結合物とを、溶液中で該抗原決定基具有
物質に対する抗体と該酵素に対する抗体との結合物又は
該抗原決定基具有物質に対する抗体と該酵素に対する抗
体と高分子化合物との結合物に接触せしめ、その後前記
酵素の活性を測定することを特徴とする抗原決定基具有
物質の測定方法に関するものである。
本発明方法における測定対象は検体に含まれる抗原決定
基具有物質である。検体の種類は限定されないが、例え
ば血清、尿などである。血清、尿などの場合は、通常は
特別な前処理を必要とせず、そのまま測定を行なうこと
ができる。
基具有物質である。検体の種類は限定されないが、例え
ば血清、尿などである。血清、尿などの場合は、通常は
特別な前処理を必要とせず、そのまま測定を行なうこと
ができる。
抗原決定基具有物質（以下、リガンドという。）は抗原
決定基を−又は二以上有しているものであり、例として
は、ノボキシン、テオフィリン、フェノパルビタール、
フェニトイン、ペニシリン、アミカシン等の薬物、プロ
スタグランノン、テストステロン、プログステロン、サ
イロキシン等のホルモン々どを挙げることができる。こ
れらは低分子ハシテンであるか、本発明の方法を適用し
うるリガンドは低分子ハプテンのみでなく、例えばイン
シーリン、ＴＳＨ，サイログロブリン等の蛋白ホルモン
類、ＩｇＧ、 ＩｇＥ、 ＩｇＡ等の免疫グロブリ
ン類、あるいはＨＡＸＨＢ等のウィルス抗原類であって
もよい。このほか、最近非常に重視されているガン関連
抗原も本発明の方法で測定しうる。
決定基を−又は二以上有しているものであり、例として
は、ノボキシン、テオフィリン、フェノパルビタール、
フェニトイン、ペニシリン、アミカシン等の薬物、プロ
スタグランノン、テストステロン、プログステロン、サ
イロキシン等のホルモン々どを挙げることができる。こ
れらは低分子ハシテンであるか、本発明の方法を適用し
うるリガンドは低分子ハプテンのみでなく、例えばイン
シーリン、ＴＳＨ，サイログロブリン等の蛋白ホルモン
類、ＩｇＧ、 ＩｇＥ、 ＩｇＡ等の免疫グロブリ
ン類、あるいはＨＡＸＨＢ等のウィルス抗原類であって
もよい。このほか、最近非常に重視されているガン関連
抗原も本発明の方法で測定しうる。
しかしながら、本発明の方法は、特に低分子のもの、例
えば分子量２０万以下のものの測定に威力を発揮する。
えば分子量２０万以下のものの測定に威力を発揮する。
リガンドと結合している高分子化合物は、分子量が１０
万ダルトン以上でかつ水溶性のものが適当である。高分
子化合物の例としては、回置性デキストラン、カルブキ
ンメチル化デキストラン、アミン化デキストラン、アミ
ロース等の多Ｓａ 及びその誘導体、ゼラチン、ヘモシ
アニン、フェリチン等の蛋白質、？リエチレングリコー
ルなどを挙げることかでさる。これらは、酵素と結合さ
せた状態で所定の条件を具備していればよく、例えは牛
血清アルブミンのような比較的低分子のものであっても
、それを自家重合させるなどして高分子化したものであ
ってもよい。
万ダルトン以上でかつ水溶性のものが適当である。高分
子化合物の例としては、回置性デキストラン、カルブキ
ンメチル化デキストラン、アミン化デキストラン、アミ
ロース等の多Ｓａ 及びその誘導体、ゼラチン、ヘモシ
アニン、フェリチン等の蛋白質、？リエチレングリコー
ルなどを挙げることかでさる。これらは、酵素と結合さ
せた状態で所定の条件を具備していればよく、例えは牛
血清アルブミンのような比較的低分子のものであっても
、それを自家重合させるなどして高分子化したものであ
ってもよい。
リガンド自身を重合することによって高分子化してもよ
い。重合方法は、前記のりガントと高分子化合物との結
合方法のなかから適宜選択すればよく、例えば、カルボ
ッイミド、グルタルアルデヒド等の二価性架橋剤で高分
子化すればよい。
い。重合方法は、前記のりガントと高分子化合物との結
合方法のなかから適宜選択すればよく、例えば、カルボ
ッイミド、グルタルアルデヒド等の二価性架橋剤で高分
子化すればよい。
リガンドと高分子化合物との結合方法は双方の官能基を
考慮して決定すればよい。官能基は、アミン基、カルボ
キシル基、水酸基、チオール基、イミダゾール基、フェ
ニル基などを利用することができ、例えばアミン基相互
間を結合させる場合には、ジイソシアネート法、グルタ
ルアルデヒド法、ジフルオロベンゼン法、ベンゾキノン
法等数多く知られている。また、アミノ基とカルボキシ
ル基との間を結合させる方法としては、カルボキンルｉ
ｔサクシンイミドエステル化する方法のほかカルボジイ
ミド法、ウッドワードｇ薬法ｓが知られており、アミノ
基と循頚勿栄橋する過ヨウ索酸酸化法（Ｎａｋａｎｅ法
）もある。チオール基を利用する場合には、例えばもう
一方の側の２フルデキシル基をサクシンイミドエステル
化してこれにシスティンを反応させてチオール基を導入
し、チオール基反応性二価架橋試薬を用いて双方を結合
することができる。フェニル基を利用する方法としては
ジアゾ化法、アルキル化法などがある。結合方法はこれ
らの例示に限られるものでは々く、このほか例え（４「
Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｉｒｎｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ Ｊあるいは「酵素抗体側定法」等の放置に記載され
ている方法のなかから適宜選択して利用するすることが
できる。結合比は］：］に限らず、目的に応じて任意の
比率をとることができることはいうまでもない。反応後
は、ケ゛ルＦ、ＩＭ法、イオン交換クロマトグラフィー
、アフィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合
わせて精製を行ない、必要により凍結乾燥法等で乾燥す
る。
考慮して決定すればよい。官能基は、アミン基、カルボ
キシル基、水酸基、チオール基、イミダゾール基、フェ
ニル基などを利用することができ、例えばアミン基相互
間を結合させる場合には、ジイソシアネート法、グルタ
ルアルデヒド法、ジフルオロベンゼン法、ベンゾキノン
法等数多く知られている。また、アミノ基とカルボキシ
ル基との間を結合させる方法としては、カルボキンルｉ
ｔサクシンイミドエステル化する方法のほかカルボジイ
ミド法、ウッドワードｇ薬法ｓが知られており、アミノ
基と循頚勿栄橋する過ヨウ索酸酸化法（Ｎａｋａｎｅ法
）もある。チオール基を利用する場合には、例えばもう
一方の側の２フルデキシル基をサクシンイミドエステル
化してこれにシスティンを反応させてチオール基を導入
し、チオール基反応性二価架橋試薬を用いて双方を結合
することができる。フェニル基を利用する方法としては
ジアゾ化法、アルキル化法などがある。結合方法はこれ
らの例示に限られるものでは々く、このほか例え（４「
Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｉｒｎｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ Ｊあるいは「酵素抗体側定法」等の放置に記載され
ている方法のなかから適宜選択して利用するすることが
できる。結合比は］：］に限らず、目的に応じて任意の
比率をとることができることはいうまでもない。反応後
は、ケ゛ルＦ、ＩＭ法、イオン交換クロマトグラフィー
、アフィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合
わせて精製を行ない、必要により凍結乾燥法等で乾燥す
る。
酵素はその抗体が得られるものであればよい。
大部分の酵素は動物体に投与することによってその体内
に抗体を形成するから本発明の方法に使用できる。動物
由来の酵素であっても、異種動物に投与することによっ
て通常抗体を得ることが出来るから例外ではない。酵素
は、活性の測定方法が簡単なもののほうが好都合である
。酵素の例としては、グルコース−６−リン酸脱水素酵
素、ヘキソキナーゼ、α−アミラーゼ、マレートデヒド
ロケゝナーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ペルオキシ
ダーゼ、β−がラクトシダーゼ、タレアチンキナーゼ、
りぎタクレアーゼ、ぼニシリダーゼなどを挙げることが
できる。
に抗体を形成するから本発明の方法に使用できる。動物
由来の酵素であっても、異種動物に投与することによっ
て通常抗体を得ることが出来るから例外ではない。酵素
は、活性の測定方法が簡単なもののほうが好都合である
。酵素の例としては、グルコース−６−リン酸脱水素酵
素、ヘキソキナーゼ、α−アミラーゼ、マレートデヒド
ロケゝナーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ペルオキシ
ダーゼ、β−がラクトシダーゼ、タレアチンキナーゼ、
りぎタクレアーゼ、ぼニシリダーゼなどを挙げることが
できる。
酵素を後述する抗体結合物と反応させても活性があまり
変らないときは、酵素を予め高分子化合物と結合させて
高分子化してから用いるのがよい。
変らないときは、酵素を予め高分子化合物と結合させて
高分子化してから用いるのがよい。
その場合に、用いる高分子化合物及び酵素と高分子化合
物との結合方法は前記のりガントの場合のなかから適宜
選択すればよい。
物との結合方法は前記のりガントの場合のなかから適宜
選択すればよい。
リガ゛ンドに対する抗体（以下、抗リガンド抗体という
。）と酵素に対する抗体（以下、抗酵素抗体という。）
はいずれも抗体を取得する公知の方法に準じて取得する
ことができる。例えば兎、山羊、馬、モルモッ１、ニワ
トリなどの温血動物に、りがンド又はｒ４そ素を体重１
＜ｙ当り０３〜２ ｍ９程度１〜ｙり回付中皮下、フ
ット・やラド、大腿筋等にアノユバ／トとともに注射し
て当該ＩＪの物の体内に抗体を形成させればよい。この
抗体は一！！グンン等の蛋白分解酵素でＦ （ａ ｂ’
） ２、Ｆａｂ’、Ｆａｂなどに分解して用いてもよい
。抗酵素抗体は、酵素と反応することによって、酵素活
性を完全に阻害するもの、一部阻害するもの、あるいは
全く阻害しないものがあるがそのいずれであっても本発
明の方法に使用することができる。これらの抗体は、前
記のフラグメントであると否とを問わず、血清からＩｇ
Ｇを取得する公知の方法、例えば硫安沈四法、イオン交
換クロマトグラフィー、ケゝルＩＰ １ｌｔ６ 、アフ
ィニティークロマトグラフィー々どで適宜精製してから
用いる。
。）と酵素に対する抗体（以下、抗酵素抗体という。）
はいずれも抗体を取得する公知の方法に準じて取得する
ことができる。例えば兎、山羊、馬、モルモッ１、ニワ
トリなどの温血動物に、りがンド又はｒ４そ素を体重１
＜ｙ当り０３〜２ ｍ９程度１〜ｙり回付中皮下、フ
ット・やラド、大腿筋等にアノユバ／トとともに注射し
て当該ＩＪの物の体内に抗体を形成させればよい。この
抗体は一！！グンン等の蛋白分解酵素でＦ （ａ ｂ’
） ２、Ｆａｂ’、Ｆａｂなどに分解して用いてもよい
。抗酵素抗体は、酵素と反応することによって、酵素活
性を完全に阻害するもの、一部阻害するもの、あるいは
全く阻害しないものがあるがそのいずれであっても本発
明の方法に使用することができる。これらの抗体は、前
記のフラグメントであると否とを問わず、血清からＩｇ
Ｇを取得する公知の方法、例えば硫安沈四法、イオン交
換クロマトグラフィー、ケゝルＩＰ １ｌｔ６ 、アフ
ィニティークロマトグラフィー々どで適宜精製してから
用いる。
一方、これらの抗体はモノクローナル抗体として取得す
ることもできる。その場合には、マウスに前記のリガン
ドあるい（ｄ酵素をアジュ・ぐントとともに数回腹腔等
に注射し、牌臓細胞を取り出してポリエチレングリコー
ル等を用いてマウスミエローマ細胞と融合させる。そし
て、この融合細胞のなかから当該抗体を産生ずるものを
クローニングによってモノクローン細胞として増殖式せ
、得られたモノクローン細胞をマウス腹腔中で増殖させ
ることによってモノクローナル抗体を大量に製造するこ
とができる。
ることもできる。その場合には、マウスに前記のリガン
ドあるい（ｄ酵素をアジュ・ぐントとともに数回腹腔等
に注射し、牌臓細胞を取り出してポリエチレングリコー
ル等を用いてマウスミエローマ細胞と融合させる。そし
て、この融合細胞のなかから当該抗体を産生ずるものを
クローニングによってモノクローン細胞として増殖式せ
、得られたモノクローン細胞をマウス腹腔中で増殖させ
ることによってモノクローナル抗体を大量に製造するこ
とができる。
抗リガンド抗体と抗酵素抗体との結合方法は前述の酵素
と高分子化合物の結合方法のうち、蛋白質相互を結合さ
せる方法をすべて利用できる。例えば、グルタルアルデ
ヒド法、過ヨウ素酸酸化法、マレイミド法、ジイソシア
ネート法、ベンゾキノン法、カルボジイミド法などを利
用できる。このほか、ＮＨ２基七ＳＨ基を結合する５Ｐ
ＤＰ法、ＩｇＧの糖鎖と結合性をもつプロティンＡ等の
レクチンを使った方法、還元剤存在下における２種のＦ
（ａ ｂ’） ２のＳＨ基の組替方法々ども利用でき
る。結合物は抗リガンド抗体と抗酵素抗体各１単位のも
ののみに限らず、各々が数単位づつ結合したもの、ある
いはさらに結合して高分子化したものであってもよい。
と高分子化合物の結合方法のうち、蛋白質相互を結合さ
せる方法をすべて利用できる。例えば、グルタルアルデ
ヒド法、過ヨウ素酸酸化法、マレイミド法、ジイソシア
ネート法、ベンゾキノン法、カルボジイミド法などを利
用できる。このほか、ＮＨ２基七ＳＨ基を結合する５Ｐ
ＤＰ法、ＩｇＧの糖鎖と結合性をもつプロティンＡ等の
レクチンを使った方法、還元剤存在下における２種のＦ
（ａ ｂ’） ２のＳＨ基の組替方法々ども利用でき
る。結合物は抗リガンド抗体と抗酵素抗体各１単位のも
ののみに限らず、各々が数単位づつ結合したもの、ある
いはさらに結合して高分子化したものであってもよい。
この抗体結合物は、前述の酵素と同様、高分子化合物に
結合させて高分子化したほうがよい場合もある。その場
合は、高分子化合物にはリガンドの際に前述のもののな
かから適宜用いればよく、結合方法も前述と同様でよい
。この高分子化は抗体間の結合を行なう前に一方あるい
は両方の抗体に対して行なってもよく、また、抗体間の
結合を行なった後に行なってもよい。
結合させて高分子化したほうがよい場合もある。その場
合は、高分子化合物にはリガンドの際に前述のもののな
かから適宜用いればよく、結合方法も前述と同様でよい
。この高分子化は抗体間の結合を行なう前に一方あるい
は両方の抗体に対して行なってもよく、また、抗体間の
結合を行なった後に行なってもよい。
抗体結合物及びその高分子化物は、ケ８ル沢過、カチオ
ン交換樹脂、アニオン交換樹脂などを用いたイオン交換
クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ーなどを適宜組み合わせて精製を行ない、必要により凍
結乾燥する。
ン交換樹脂、アニオン交換樹脂などを用いたイオン交換
クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ーなどを適宜組み合わせて精製を行ない、必要により凍
結乾燥する。
検体に含まれるリガンドと、該りがンドの高分子化物又
は重合物と、酵素又はその高分子化物を、溶液中で前記
の抗体結合物又はその高分子化物と接触させる。その際
、溶液の温度は２０〜４５℃程度、そしてＰＨは通常４
〜８．５程度が適当である。
は重合物と、酵素又はその高分子化物を、溶液中で前記
の抗体結合物又はその高分子化物と接触させる。その際
、溶液の温度は２０〜４５℃程度、そしてＰＨは通常４
〜８．５程度が適当である。
ｐｈｉを一定に保つために、必要により、リン酸緩衝液
、酢酸緩衝液などの緩衝液を用いてもよい。酵素又はそ
の高分子化物、リガンドの高分子化物又は重合物、及び
抗体結合物又はその高分子化物の適当な量は、それらの
種類、リガンドの種類、あるいは接触時の条件などによ
って異なるので予め試験をして定めるのがよい。リガン
ドの高分子化物及び重合物は一方のみを添加してもよく
、また両方添加してもよい。添加量は酵素活性を適当に
変化させるのに必要な量であり、これも酵素、抗体結合
物、りがンドの種類、あるいは接触時の条件などによっ
て異なるので予め試験を行なって定めるのがよい。抗体
結合物とリガンド及び酵素との接触時間はいずれも、通
常は充分に反応しつる程度がよく、例えば３７℃の場合
には２０〜６０分間程度が適当である。抗体結合物に対
するリガンド、リガンドの高分子化物又は重合物及び酵
素の接触順序は問うところではなく、いずれが先であっ
てもあるいは同時であってもよい。
、酢酸緩衝液などの緩衝液を用いてもよい。酵素又はそ
の高分子化物、リガンドの高分子化物又は重合物、及び
抗体結合物又はその高分子化物の適当な量は、それらの
種類、リガンドの種類、あるいは接触時の条件などによ
って異なるので予め試験をして定めるのがよい。リガン
ドの高分子化物及び重合物は一方のみを添加してもよく
、また両方添加してもよい。添加量は酵素活性を適当に
変化させるのに必要な量であり、これも酵素、抗体結合
物、りがンドの種類、あるいは接触時の条件などによっ
て異なるので予め試験を行なって定めるのがよい。抗体
結合物とリガンド及び酵素との接触時間はいずれも、通
常は充分に反応しつる程度がよく、例えば３７℃の場合
には２０〜６０分間程度が適当である。抗体結合物に対
するリガンド、リガンドの高分子化物又は重合物及び酵
素の接触順序は問うところではなく、いずれが先であっ
てもあるいは同時であってもよい。
これらの接触を行なわせたのちには酵素活性を測定して
検体中のリガンドの量を算出する。酵素活性の測定方法
は公知の方法に従って行なえばよい。例えば、酵素にグ
ルコース−６−リン酸脱水素酵素を用いた場合には、上
記の接触を行なわせた反応系にグルコース−６−リン酸
及びＮＡＤ Ｐ＋を含む基質溶液を加えて反応させ、生
成するＮＡＤＰＩ（を波長３４０ ｎｍの吸光度の増加
から求めればよい。
検体中のリガンドの量を算出する。酵素活性の測定方法
は公知の方法に従って行なえばよい。例えば、酵素にグ
ルコース−６−リン酸脱水素酵素を用いた場合には、上
記の接触を行なわせた反応系にグルコース−６−リン酸
及びＮＡＤ Ｐ＋を含む基質溶液を加えて反応させ、生
成するＮＡＤＰＩ（を波長３４０ ｎｍの吸光度の増加
から求めればよい。
１だ、ヘキソキナーゼを用いた場合には、反応系にグル
コース、ＡＴＰ ％ ＮＡＤＰ＋及びグルコース−６−
ＩＪン酸脱水素酵素を含む基質溶液を加えて反応させ、
やはりＮＡＤＰＨの生成量を測定することによって求め
ればよい。
コース、ＡＴＰ ％ ＮＡＤＰ＋及びグルコース−６−
ＩＪン酸脱水素酵素を含む基質溶液を加えて反応させ、
やはりＮＡＤＰＨの生成量を測定することによって求め
ればよい。
本発明の方法においてｉｄ、ＩＪガントの高分子化物及
び重合物は抗体結合物に対して検体中のリガンドと競争
反応し、抗体結合物に結合したりガントの高分子化物及
び重合物の立体障害等によって酵素の抗体結合物への結
合が阻害されることを利用している。すなわち、抗体結
合物へのリガンドの高分子化物及び重合物の結合量が検
体中のリガンドの量に応じて変化し、この高分子化物及
び重合物の結合量に応じて酵素の抗体結合物への結合量
が変わる。そして、遊離の酵素の活性と、抗体結合物に
結合されている酵素の活性が異なることを利用して検体
量のりがンドの量を求めているのである。
び重合物は抗体結合物に対して検体中のリガンドと競争
反応し、抗体結合物に結合したりガントの高分子化物及
び重合物の立体障害等によって酵素の抗体結合物への結
合が阻害されることを利用している。すなわち、抗体結
合物へのリガンドの高分子化物及び重合物の結合量が検
体中のリガンドの量に応じて変化し、この高分子化物及
び重合物の結合量に応じて酵素の抗体結合物への結合量
が変わる。そして、遊離の酵素の活性と、抗体結合物に
結合されている酵素の活性が異なることを利用して検体
量のりがンドの量を求めているのである。
本発明の方法は、りがンドを特異性高くかつ極めて高感
度で測定できる。また、操作が簡単であり、安価かつ容
易にリガンドを定量することが可能である。本発明の方
法はリガンドの種類を問わず測定できるが特に低分子の
リガンドの測定に威力を発揮する。
度で測定できる。また、操作が簡単であり、安価かつ容
易にリガンドを定量することが可能である。本発明の方
法はリガンドの種類を問わず測定できるが特に低分子の
リガンドの測定に威力を発揮する。
以下、実施例を示す。
実施例１
１）デキストラン−テオフィリン結合物の調製分子量約
２００万のデキストラン１ｇをＩＮ水酸化ナトリウムの
９０係エタノール溶液５０属に懸濁し、この溶液にクロ
ル酢酸１ｇを加えて３７℃で１６時間攪拌した。反応後
、沈澱物を戸数し、エタノールで十分洗浄してから水に
溶かし、この水溶液をセファデックスＧ−２５を充填し
たカラムに流して未反応のクロル酢酸を除いた。流出し
てきブこ素通り分ｉＪｊであるカルボキシメチルデキス
トラと分画を集めて凍結乾・朦した。
２００万のデキストラン１ｇをＩＮ水酸化ナトリウムの
９０係エタノール溶液５０属に懸濁し、この溶液にクロ
ル酢酸１ｇを加えて３７℃で１６時間攪拌した。反応後
、沈澱物を戸数し、エタノールで十分洗浄してから水に
溶かし、この水溶液をセファデックスＧ−２５を充填し
たカラムに流して未反応のクロル酢酸を除いた。流出し
てきブこ素通り分ｉＪｊであるカルボキシメチルデキス
トラと分画を集めて凍結乾・朦した。
このカルボキシメチルデキストラン５ Ｑ Ｑ ７ｎ９
ｒｅジノオキサン中ｒ品濁させ、Ｎ−ヒドロキシサク
シンイミド５００ ｒｎｇ及び水溶性カルボソイミＦ５
００〃νを加えて室温で一夜攪拌した。沈べ物をグラス
フィルターを用いてＰ取し、ジオキサンで十分洗浄して
からエーテルで洗浄した。洗浄物を乾燥させてカルボキ
シメチルデキストランのサクシンイミドエステルを得た
。
ｒｅジノオキサン中ｒ品濁させ、Ｎ−ヒドロキシサク
シンイミド５００ ｒｎｇ及び水溶性カルボソイミＦ５
００〃νを加えて室温で一夜攪拌した。沈べ物をグラス
フィルターを用いてＰ取し、ジオキサンで十分洗浄して
からエーテルで洗浄した。洗浄物を乾燥させてカルボキ
シメチルデキストランのサクシンイミドエステルを得た
。
このカルボキシメチルデキストランのサクシンイミドエ
ステル２００ｍ！？’（ｒＯ，ＩＭへキサメチレンジア
ミン溶液（ｐＨ８，０）に加え、室温で２時間４に拌ｌ
−た。続いて、セファデックスＧ−２５０カラムを用い
てゲル濾過を行ない、素通り分ｉ厩を凍結乾燥してアミ
ン化デキストランの凍結乾燥品を得た。
ステル２００ｍ！？’（ｒＯ，ＩＭへキサメチレンジア
ミン溶液（ｐＨ８，０）に加え、室温で２時間４に拌ｌ
−た。続いて、セファデックスＧ−２５０カラムを用い
てゲル濾過を行ない、素通り分ｉ厩を凍結乾燥してアミ
ン化デキストランの凍結乾燥品を得た。
３カルボキシテオフイリン１０■及び先に％ｉ４１製し
ておいたアミン化デキストラン１００Ｒ１９を水に心か
し、ｐｔｌ ６． Ｑに調整した。この溶液に水溶性カ
ルボソイミド２０ｍ９を加え、ｐＨ６，０に調節しつつ
１時間保持して反応苫せた。この反応液をＰ日７．０の
２０ ｒｎＭ ＩＪン酸緩衝生理食塩溶液で平衡化して
おいたセファデックスＧ−２５を用いてダル濾過し、素
通り分画を分取した。この素通り分画を凍結乾燥して目
的のテオフィリン−デキストラン結合物を得た。
ておいたアミン化デキストラン１００Ｒ１９を水に心か
し、ｐｔｌ ６． Ｑに調整した。この溶液に水溶性カ
ルボソイミド２０ｍ９を加え、ｐＨ６，０に調節しつつ
１時間保持して反応苫せた。この反応液をＰ日７．０の
２０ ｒｎＭ ＩＪン酸緩衝生理食塩溶液で平衡化して
おいたセファデックスＧ−２５を用いてダル濾過し、素
通り分画を分取した。この素通り分画を凍結乾燥して目
的のテオフィリン−デキストラン結合物を得た。
１１）抗テオフィリノウサギ抗体と抗グルコースー６−
リン酸脱水素酵素マウスモノクローナル抗体（抗Ｇ ６
ＰＤＨ抗体）との結合物の訓製抗テオフィリンウサギ
ＩｇＧ５ｍｇをｐＨ６，３の０．１λ・１リン酸緩衝液
１ｍｌに溶かし、こ几に２ ｍｇ ／ ｍｌの４−マレ
イミドメチルシクロヘキサン−１−カルボン酸すクンン
イミドエステル（ＣＨＭＳ ）のノオキサン溶液１００
μｌを加えて室温にて１時間放置した。この溶液をセフ
ァデックスＧ−２５のカラム（１ｃｒｎＸ ５０ ｃｍ
）に入れ、１ ｍＭ ｇＤＴＡを含む−６５の０．１
Ｍ ＩＪン酸緩衝液でデル濾過を行なって未反応のＣ
Ｉ（ＭＳを除き、得られた４−マレイミドメチルシクロ
ヘキサン−１−カルボン酸と抗テオフィリンウサギＩｇ
Ｇとの結合物（ＣＨＭ化抗テオフィリンウサギ抗体）の
溶液を１ｍ１Ｋ娘縮した・抗Ｇ ６ ＰＤＨ抗体５〜を
５ ｍＭ ｇＤＴＡを含むＰｉｉ ７．５のＯ，１，Ｍ
ＩＪン酸緩衝液に溶かし、これに９１ｐ９／ｄのＳ−
アセチルメルカゾトフハク酸無水物のジメチルスルホキ
シド溶液１００μｌを加えて３７℃で１時間加温した。
リン酸脱水素酵素マウスモノクローナル抗体（抗Ｇ ６
ＰＤＨ抗体）との結合物の訓製抗テオフィリンウサギ
ＩｇＧ５ｍｇをｐＨ６，３の０．１λ・１リン酸緩衝液
１ｍｌに溶かし、こ几に２ ｍｇ ／ ｍｌの４−マレ
イミドメチルシクロヘキサン−１−カルボン酸すクンン
イミドエステル（ＣＨＭＳ ）のノオキサン溶液１００
μｌを加えて室温にて１時間放置した。この溶液をセフ
ァデックスＧ−２５のカラム（１ｃｒｎＸ ５０ ｃｍ
）に入れ、１ ｍＭ ｇＤＴＡを含む−６５の０．１
Ｍ ＩＪン酸緩衝液でデル濾過を行なって未反応のＣ
Ｉ（ＭＳを除き、得られた４−マレイミドメチルシクロ
ヘキサン−１−カルボン酸と抗テオフィリンウサギＩｇ
Ｇとの結合物（ＣＨＭ化抗テオフィリンウサギ抗体）の
溶液を１ｍ１Ｋ娘縮した・抗Ｇ ６ ＰＤＨ抗体５〜を
５ ｍＭ ｇＤＴＡを含むＰｉｉ ７．５のＯ，１，Ｍ
ＩＪン酸緩衝液に溶かし、これに９１ｐ９／ｄのＳ−
アセチルメルカゾトフハク酸無水物のジメチルスルホキ
シド溶液１００μｌを加えて３７℃で１時間加温した。
続いて、ＰＨ７，５の１Ｍヒドロキシルアミン溶液１１
０μｌを加えて３７℃で３０分間放６して反応させた。
０μｌを加えて３７℃で３０分間放６して反応させた。
この反応液をセフアゾ。
クスＧ−２５を用い、］、 ｍＭ ｇＤＴＡを含むｐＨ
５，５の０、１． Ｍ ＋）ン酸緩衝液でケゝル濾過を
行なって未反応のＳ−アセチルメルカプトコハク酸を除
去した。
５，５の０、１． Ｍ ＋）ン酸緩衝液でケゝル濾過を
行なって未反応のＳ−アセチルメルカプトコハク酸を除
去した。
こうして’ｆ４ｊられたＳＴ（化抗Ｇ ６ ＰＤＨ抗体
をＬ ｍｌまで濃縮し、こ、！ｔに前記のＣＨＭ化抗テ
オフィリンウブギＩｇＧの濃縮液１ ｍｌを加えて４℃
で一夜放置して反応させた。この反応液をセフアクリル
ーＳ−３００（１ｃｍ Ｘ １２０ （７ｎ）でケ９ル
ン濾過し、抗テオフィリンウサギ抗体と抗Ｇ ６ ＰＤ
）Ｉ抗体との１：１の結合物を得る。
をＬ ｍｌまで濃縮し、こ、！ｔに前記のＣＨＭ化抗テ
オフィリンウブギＩｇＧの濃縮液１ ｍｌを加えて４℃
で一夜放置して反応させた。この反応液をセフアクリル
ーＳ−３００（１ｃｍ Ｘ １２０ （７ｎ）でケ９ル
ン濾過し、抗テオフィリンウサギ抗体と抗Ｇ ６ ＰＤ
）Ｉ抗体との１：１の結合物を得る。
１１１）テオフィリンの定量
テオフィリン−デキストラン結合物３０μＩ及び前記の
抗体結合物１００ ｌｔ、９を含む溶液５０μｌに各抑
濃度のテオフィリン溶液を加え、３７Ｃで３０分間加温
後、グルコース−６−リンに脱水素１孝素（Ｇ ６ Ｐ
ＤＴ（） １μｇ全含有する溶液５０μｌを加えた。
抗体結合物１００ ｌｔ、９を含む溶液５０μｌに各抑
濃度のテオフィリン溶液を加え、３７Ｃで３０分間加温
後、グルコース−６−リンに脱水素１孝素（Ｇ ６ Ｐ
ＤＴ（） １μｇ全含有する溶液５０μｌを加えた。
３０分後に、Ｏ，５ｍＭグルコース−６−リン酸、０、
５ ｒｒ＋Ｍ ＮＡＤＰ及び２０ ｍＭ ＭｇＣＩ−２
を含む０．１Ｍグリシルグリンン緩衝液（ＰＨｓ、ｓ
） １．０ｍ１ｋ加えて３０℃における波長３４０ ｎ
ｍの吸光度の増加速度を求めたところ下表に示す結果が
イシ＋られた。
５ ｒｒ＋Ｍ ＮＡＤＰ及び２０ ｍＭ ＭｇＣＩ−２
を含む０．１Ｍグリシルグリンン緩衝液（ＰＨｓ、ｓ
） １．０ｍ１ｋ加えて３０℃における波長３４０ ｎ
ｍの吸光度の増加速度を求めたところ下表に示す結果が
イシ＋られた。
０ μｇ ’ ０．０９１
２．０ ０．０！３１
５、Ｑ ０．０７２
］、 ０．０ ０．０５４２０
．０ ０．０３２ ３０．０ ０．０２６ ．４０．０ ０．０２４ヒト面
端５倹＋１幅（ついて、各５０ ／ｌｌを用いテ前記と
同Ｊ’、％ Ｋ ？１ｉｉｌ定を行ない、前人の結果を
検量線に用いてテオフィリンの濃ＬＥｊを求めた。一方
、これに、１９行して従来法であるＲＩＡ法で同じ血’
（ｆｆのテオフィリン（仏龜１！仁を倶見定した。
．０ ０．０３２ ３０．０ ０．０２６ ．４０．０ ０．０２４ヒト面
端５倹＋１幅（ついて、各５０ ／ｌｌを用いテ前記と
同Ｊ’、％ Ｋ ？１ｉｉｌ定を行ない、前人の結果を
検量線に用いてテオフィリンの濃ＬＥｊを求めた。一方
、これに、１９行して従来法であるＲＩＡ法で同じ血’
（ｆｆのテオフィリン（仏龜１！仁を倶見定した。
’ｒｌられな結果をＦ表に示す。
テオフィリン鋲度
Ａ ０．５ １１ｊｉ／ｍｌ！ ０．３
１ ｔｔ＆／ｍｌＢ ２．０ ２
．６Ｃ１５，０１４，６ Ｄ １３，１ １３．３Ｅ
１０．６ １．０．１実施例 １）抗グルコースー６−リン酸説水素１′＃素マウスＩ
ｇＧ（α−Ｇ ６ ＰＩ）Ｉ（ＩｇＧ ）の調製抗原と
して酵母由来のＧ ６ ＰＤＨ（オリエンタル酵母］二
＄（株）製〕を用いた。このＧ ６ ＰＤＨの１ｍ９／
ｍｌ！の溶液ｒフロイントの完全ア・ノー・々ン１と
等容混合してエマル・ソヨンとし、その０．１ ｒｎｌ
を８週令のＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔に１週間おきに３
回注射した。それからさらに１週間後に尾静脈に５０
μＩ１０．１ ｍ１（７）０６ ＰＤＨ溶液を注射し、
３日後に１）１．〒）蔵をイ酌出した。
１ ｔｔ＆／ｍｌＢ ２．０ ２
．６Ｃ１５，０１４，６ Ｄ １３，１ １３．３Ｅ
１０．６ １．０．１実施例 １）抗グルコースー６−リン酸説水素１′＃素マウスＩ
ｇＧ（α−Ｇ ６ ＰＩ）Ｉ（ＩｇＧ ）の調製抗原と
して酵母由来のＧ ６ ＰＤＨ（オリエンタル酵母］二
＄（株）製〕を用いた。このＧ ６ ＰＤＨの１ｍ９／
ｍｌ！の溶液ｒフロイントの完全ア・ノー・々ン１と
等容混合してエマル・ソヨンとし、その０．１ ｒｎｌ
を８週令のＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔に１週間おきに３
回注射した。それからさらに１週間後に尾静脈に５０
μＩ１０．１ ｍ１（７）０６ ＰＤＨ溶液を注射し、
３日後に１）１．〒）蔵をイ酌出した。
この牌臓を中砕して牌１藏細胞を分離し、ポＩＪ ｘチ
レングリコール１５’Ｏｏｅ用いてマウスミエローマＰ
３ｔＪ１と細胞融合させた。
レングリコール１５’Ｏｏｅ用いてマウスミエローマＰ
３ｔＪ１と細胞融合させた。
得られた融合細胞を９６ウエルのプレートに分注し、Ｈ
ＡＴ培地で培養した。各ウェルの細胞をＧ ６ ＰＤＨ
全固相に固定化したプレートを用いたＥＬＩＳλ法で調
べて、Ｇ ６ ＰＤＩ（に反応性を有するマウスＩｇＧ
１含なと思われる５ウエルを見出した。
ＡＴ培地で培養した。各ウェルの細胞をＧ ６ ＰＤＨ
全固相に固定化したプレートを用いたＥＬＩＳλ法で調
べて、Ｇ ６ ＰＤＩ（に反応性を有するマウスＩｇＧ
１含なと思われる５ウエルを見出した。
この５ウエルの細胞を限界希釈法で希釈してクローニン
グし、ＥＬＩＳＡ法を応用した阻害測定法で調べて、Ｇ
６ ＰＤＨの異なる抗原決定基を認識していると思わ
れる２つの細胞株を得た。
グし、ＥＬＩＳＡ法を応用した阻害測定法で調べて、Ｇ
６ ＰＤＨの異なる抗原決定基を認識していると思わ
れる２つの細胞株を得た。
この細胞株をそれぞれ１０φＦＣ８−ＲＰＭＩ培地で増
殖させ、この増殖細胞を予めプリスタンを注射したＢＡ
ＬＢ／Ｃマウスの腹腔へ１０’個づつ注入して、２＋！
、ｌ’４ 間抜にｌ１９−水約１０ｒｎｌを採取し７ヒ
。
殖させ、この増殖細胞を予めプリスタンを注射したＢＡ
ＬＢ／Ｃマウスの腹腔へ１０’個づつ注入して、２＋！
、ｌ’４ 間抜にｌ１９−水約１０ｒｎｌを採取し７ヒ
。
この腹水ｋ ４５ ’＄ｆｊ’ａ和の個３安で塩析し、
生成しブこ沈滲物を分し、１ト１−だ。この沈汚物を少
計のリン酸緩衝液ｐＨ７，０で浴解し、同緩衝゛敵でＸ
ｌｌｌｌ上たセファクリルｓ −３ｏ ｏカラムでケ８
ル’ｌ？ ｉ／ＭしてＩｇＧ分画を分取した。
生成しブこ沈滲物を分し、１ト１−だ。この沈汚物を少
計のリン酸緩衝液ｐＨ７，０で浴解し、同緩衝゛敵でＸ
ｌｌｌｌ上たセファクリルｓ −３ｏ ｏカラムでケ８
ル’ｌ？ ｉ／ＭしてＩｇＧ分画を分取した。
こうしてイ身られた、異なる抗原決定基を認識している
２細胞株から得た各ＩｇＧを等Ｈｚづつ混合して、α−
Ｇ ６ ＰＤＨＩｇＧとした。
２細胞株から得た各ＩｇＧを等Ｈｚづつ混合して、α−
Ｇ ６ ＰＤＨＩｇＧとした。
１１）抗ヒトＩｇＧヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂつ、の調製抗
ヒトＩｇＧヤギｉｇＧ １０１ψをｏ、 Ｉ Ｍ酢１駿
ナトリウム（、ｐ’ ４２） ２７＋、ｌ Ｋ溶かし、
これにベゾシン１００μＩを加えて３７Ｃで一夜「Ｗ拌
した。この反応＠１１グをＰＩ−１７，５に調型し、セ
ファデックスＧ −］、 ＯＣでケ゛ルン濾過した。分
子丁ｔＲＩ Ｑ万付近の分画ｔ 集めて、ポリエチレン
グリコールを用いて濃縮し、抗ヒＩ−ＩｇＧヤギＩｇＧ
Ｆ（ａｂ′）２ｋ Ｈａ ｆｃ （ｍ白として６ｍ２
含有）。
ヒトＩｇＧヤギｉｇＧ １０１ψをｏ、 Ｉ Ｍ酢１駿
ナトリウム（、ｐ’ ４２） ２７＋、ｌ Ｋ溶かし、
これにベゾシン１００μＩを加えて３７Ｃで一夜「Ｗ拌
した。この反応＠１１グをＰＩ−１７，５に調型し、セ
ファデックスＧ −］、 ＯＣでケ゛ルン濾過した。分
子丁ｔＲＩ Ｑ万付近の分画ｔ 集めて、ポリエチレン
グリコールを用いて濃縮し、抗ヒＩ−ＩｇＧヤギＩｇＧ
Ｆ（ａｂ′）２ｋ Ｈａ ｆｃ （ｍ白として６ｍ２
含有）。
１１１）抗Ｇ ６ ＰＤＩ（マウスＩｇ（ン１ｉ”ａｂ
のＷｎ３ ＜ｇマウスＩｇＧ １ （１■を上記と同様
に処理したところ、抗Ｇ ６ ＰＤＩ（マウスＩｇＧは
Ｆａｂに切断され、その収量は３６泌であった。
のＷｎ３ ＜ｇマウスＩｇＧ １ （１■を上記と同様
に処理したところ、抗Ｇ ６ ＰＤＩ（マウスＩｇＧは
Ｆａｂに切断され、その収量は３６泌であった。
１）高分子化ヒト■ｇＧの調製
ヒ トＩｇＧ ５ ’％’ ｋ １０ ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ６，０）］、 ｍ、ｌに溶解し、これに水溶性
カルデジイミド１０ηを加えて、０．１ ＮＮａＯＨ及
び０．１ ＮＨ，Ｃ，ａを用いてＰＩ−１６０に保った
。溶液が幾分白濁してきたら２０ ｍＭリン酸緩衝液（
ｐＨ７，０）で平衡化しておいたセフアゾ、クスＧ−２
５０カラムに流して脱塩し、素通り分画をプールした。
液（ｐＨ６，０）］、 ｍ、ｌに溶解し、これに水溶性
カルデジイミド１０ηを加えて、０．１ ＮＮａＯＨ及
び０．１ ＮＨ，Ｃ，ａを用いてＰＩ−１６０に保った
。溶液が幾分白濁してきたら２０ ｍＭリン酸緩衝液（
ｐＨ７，０）で平衡化しておいたセフアゾ、クスＧ−２
５０カラムに流して脱塩し、素通り分画をプールした。
この素通り分画をセファロース４Ｂでさらにグル濾過し
て累通り分画を集め、高分子化と）ＩｇＧを得た。
て累通り分画を集め、高分子化と）ＩｇＧを得た。
ｖ）仇ヒトＩｇＧヤギＩｇＧ Ｆａｂ−抗Ｇ ６ ＰＤ
ｉ（？ウスＩｇＧ Ｆａｂ ８合物の調製 抗Ｇ ６ＰＤＨマウスＩｇＧ Ｆａｂ ２ ”？ ｋ
０．１ Ｍリン酸緩Ｙ、％液（ｐＨ６，０） １． ｍ
ｌ！に溶かし、ζ、れ（／ＣＣＨＭＳのアセトン溶液（
２，０ｍ９／ｍｌ ） １００ ｔｔｌを加えて３０℃
で９０分間反応させた。この反応液を予めＯＩＭリン酸
緩衝液ｃ ｐｉ’（６，３＞で平衡化しておいなセファ
デックスＧ−２５のカラムに流してグル濾過し、素通り
分ＩＩＩＩｉを集めて１ ｍｌまで濃縮した。これによ
り、ＣＨＭ化抗Ｇ ６ ＰＤＨマウスＩｇＧ Ｆａｂを
２Ｔｎ９得た。
ｉ（？ウスＩｇＧ Ｆａｂ ８合物の調製 抗Ｇ ６ＰＤＨマウスＩｇＧ Ｆａｂ ２ ”？ ｋ
０．１ Ｍリン酸緩Ｙ、％液（ｐＨ６，０） １． ｍ
ｌ！に溶かし、ζ、れ（／ＣＣＨＭＳのアセトン溶液（
２，０ｍ９／ｍｌ ） １００ ｔｔｌを加えて３０℃
で９０分間反応させた。この反応液を予めＯＩＭリン酸
緩衝液ｃ ｐｉ’（６，３＞で平衡化しておいなセファ
デックスＧ−２５のカラムに流してグル濾過し、素通り
分ＩＩＩＩｉを集めて１ ｍｌまで濃縮した。これによ
り、ＣＨＭ化抗Ｇ ６ ＰＤＨマウスＩｇＧ Ｆａｂを
２Ｔｎ９得た。
次に、抗ヒトＩｇＧヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２１ ｍ
９ｔ Ｏ，Ｉ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）に溶かし
、これに２−メルカグトエチルアミン溶液（５６η”
Ｍｍ 水）】００μｌ ｔ ’ｌＩＪ［］えて３７℃で
１５時間反応させた。
９ｔ Ｏ，Ｉ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）に溶かし
、これに２−メルカグトエチルアミン溶液（５６η”
Ｍｍ 水）】００μｌ ｔ ’ｌＩＪ［］えて３７℃で
１５時間反応させた。
この反応液を予めｌ ｍＭ ＥＤＴＡ ｆ含有する０、
１ Ｍ ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ６，３）で平衡化して
おいたセファデックスＧ−２５でケ゛ル濾過した。素通
り分画を集め、ぼりエチレングリコールを用いて１ ｍ
ｌまで濃縮した。
１ Ｍ ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ６，３）で平衡化して
おいたセファデックスＧ−２５でケ゛ル濾過した。素通
り分画を集め、ぼりエチレングリコールを用いて１ ｍ
ｌまで濃縮した。
この濃縮物ｆｃ＠述のＣＨＭ化抗Ｇ ６ ＰＤＨマウス
ＩｇＧ Ｆａｌ） 浴液と混合し、４℃で一夜放置した
。続いて、予め２０ ｒｎＭ’Ｊン酸緩衝生理食塩溶液
（Ｐ１１７．０）で平衡化しておいたセフアゾ、クスＧ
−１５０を用いてゲル濾過し、分子量１ｏ万付近の分画
全分取して２ ｍ１２まで濃縮し、目的の結合物を得た
。
ＩｇＧ Ｆａｌ） 浴液と混合し、４℃で一夜放置した
。続いて、予め２０ ｒｎＭ’Ｊン酸緩衝生理食塩溶液
（Ｐ１１７．０）で平衡化しておいたセフアゾ、クスＧ
−１５０を用いてゲル濾過し、分子量１ｏ万付近の分画
全分取して２ ｍ１２まで濃縮し、目的の結合物を得た
。
ｖ１〕 ヒトＩｇＣの測定
高分子化ヒ） ＩｇＧ １． Ｏｍ９を含む５０ ＃ｌ
の溶液を小試験管にとり、ヒトＩｇＧを下表に示す濃度
で含有する溶液５０μｌ及び前述の抗Ｇ ６ ＰＤＨマ
ウスＩｇＧＦａｂ−抗ヒトＩｇＧヤギＩｇＧ Ｆａｂ結
合結合線濃縮液５０μｌえて３７℃で３０分間放置した
。これにＧ ６ ＰＤＨ１μｇを含有する溶液５０μｌ
を加えて３７℃で３０分間放置し、次に、０．５ ｍＭ
グルコース−６−リン酸、０．１５ ｍ＋ＶＩ ＮＡＤ
Ｐ”、２０ ｍＭＭｇＣＬ２及び０．１ Ｍグリシルグ
リシンを含むｐＨ８，５の基質溶液１．、 □ ｍｌを
加えて、３７℃で波長３４０ ｎｍ Ｋ ＪＢける吸光
度の上昇を測定した。
の溶液を小試験管にとり、ヒトＩｇＧを下表に示す濃度
で含有する溶液５０μｌ及び前述の抗Ｇ ６ ＰＤＨマ
ウスＩｇＧＦａｂ−抗ヒトＩｇＧヤギＩｇＧ Ｆａｂ結
合結合線濃縮液５０μｌえて３７℃で３０分間放置した
。これにＧ ６ ＰＤＨ１μｇを含有する溶液５０μｌ
を加えて３７℃で３０分間放置し、次に、０．５ ｍＭ
グルコース−６−リン酸、０．１５ ｍ＋ＶＩ ＮＡＤ
Ｐ”、２０ ｍＭＭｇＣＬ２及び０．１ Ｍグリシルグ
リシンを含むｐＨ８，５の基質溶液１．、 □ ｍｌを
加えて、３７℃で波長３４０ ｎｍ Ｋ ＪＢける吸光
度の上昇を測定した。
得られた結果を下表に示す。
０７ｘ３ ０．０９０
ｉｏｏ ｏ、ｏｓ。
３００ ０．０６２
６００ ０．０４１
１２００ ０．０３２
２５００ ０．０２５
ヒト血清５検体について、各５０μｌを用いて前記と同
様に測定を行ない、前人の結果を検量線に用いてＩｇＧ
の濃度°を求めた。−万、Ｃれに並行して従来法である
５ＲＩＤ法で同じ血清のＩｇＧ濃度を測定した。
様に測定を行ない、前人の結果を検量線に用いてＩｇＧ
の濃度°を求めた。−万、Ｃれに並行して従来法である
５ＲＩＤ法で同じ血清のＩｇＧ濃度を測定した。
得られた結果を下表に示す。
ＩｇＧ濃度
血清 本発明法 ５ＲＩＤ法
Ａ １１．２ ｍｇ／ｍ１ １０．９ ｍ９
／ｒａｌＢ ８．６ ９．１Ｃ１
３，５１２，１ Ｄ １３，７ １３．６Ｅ
１２．２ １１．８特許出願人 富士臓器製薬
株式会社 代理人 弁理士田中政浩
／ｒａｌＢ ８．６ ９．１Ｃ１
３，５１２，１ Ｄ １３，７ １３．６Ｅ
１２．２ １１．８特許出願人 富士臓器製薬
株式会社 代理人 弁理士田中政浩
Claims (1)
- 検体に含まれる抗原決定基具有物質と、該抗原決定基具
有物質と高分子化合物との結合物又は該抗原決定基具有
物質の重合物と、酵素又は酵素と高分子化合物との結合
物とを、溶液中で該抗原決定基具有物質に対する抗体と
該酵素に対する抗体上の結合物又は該抗原決定基具有物
質に対する抗体と該酵素に対する抗体と高分子化合物と
の結合物に接触せしめ、その後前記酵素の活性を測定す
ることを特徴とする抗原決定基具有物質の測定方法
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5149583A JPS59178361A (ja) | 1983-03-29 | 1983-03-29 | 抗原決定基具有物質測定法 |
| EP84301154A EP0119767B1 (en) | 1983-03-11 | 1984-02-22 | Method of measuring ligands |
| DE8484301154T DE3483620D1 (de) | 1983-03-11 | 1984-02-22 | Verfahren zur bestimmung von liganden. |
| ES530439A ES8605098A1 (es) | 1983-03-11 | 1984-03-09 | Metodo de medir ligandos del tipo de substancias medicinales y constituyentes trazos derivados de diversas enfermedades en fluidos corporales tales como suero sanguineo y orina. |
| US06/588,682 US4621048A (en) | 1983-03-11 | 1984-03-12 | Reagents containing an anti-ligand bound to an anti-enzyme and methods for employing said reagents in an immunoassy |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5149583A JPS59178361A (ja) | 1983-03-29 | 1983-03-29 | 抗原決定基具有物質測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59178361A true JPS59178361A (ja) | 1984-10-09 |
| JPH0317101B2 JPH0317101B2 (ja) | 1991-03-07 |
Family
ID=12888549
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5149583A Granted JPS59178361A (ja) | 1983-03-11 | 1983-03-29 | 抗原決定基具有物質測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59178361A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01100453A (ja) * | 1987-09-18 | 1989-04-18 | Eastman Kodak Co | 染料供給性組成物、診断試験キットおよびペルオキシダーゼ標識レセプターを用いるリガンドの測定方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56133661A (en) * | 1980-02-22 | 1981-10-19 | Aa Tooma Hansu | Competing uniform determination of ligand |
| JPS587561A (ja) * | 1981-06-30 | 1983-01-17 | ザ・ウエルカム・フアウンデ−シヨン・リミテツド | 酵素免疫分析法 |
-
1983
- 1983-03-29 JP JP5149583A patent/JPS59178361A/ja active Granted
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56133661A (en) * | 1980-02-22 | 1981-10-19 | Aa Tooma Hansu | Competing uniform determination of ligand |
| JPS587561A (ja) * | 1981-06-30 | 1983-01-17 | ザ・ウエルカム・フアウンデ−シヨン・リミテツド | 酵素免疫分析法 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01100453A (ja) * | 1987-09-18 | 1989-04-18 | Eastman Kodak Co | 染料供給性組成物、診断試験キットおよびペルオキシダーゼ標識レセプターを用いるリガンドの測定方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0317101B2 (ja) | 1991-03-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0111211B1 (en) | Immunoassay for nonenzymatically glucosylated proteins and protein fragments - an index of glycemia | |
| Landry et al. | Systemic lupus erythematosus. Studies of the antibodies bound to skin | |
| US6949524B2 (en) | Polysaccharide conjugates of biomolecules | |
| US4621048A (en) | Reagents containing an anti-ligand bound to an anti-enzyme and methods for employing said reagents in an immunoassy | |
| JP4182269B2 (ja) | 生体分子のポリサッカライド接合体 | |
| EP0124366B1 (en) | Method of measuring biological ligands | |
| JPH02501410A (ja) | 二座共役体及びその使用方法 | |
| US4692404A (en) | Method of measuring biological ligand by the use of enzymes | |
| US4757001A (en) | Method of measuring biological ligand by utilizing amylase | |
| JPS59178361A (ja) | 抗原決定基具有物質測定法 | |
| JPS607362A (ja) | 酵素を用いた抗原決定基具有物質の測定法 | |
| JPS6180049A (ja) | 酵素を利用した抗原決定基具有物質測定法 | |
| JPH0727763A (ja) | １α，２５（ＯＨ）２ビタミンＤ３に対する抗体及びその用途 | |
| JPH0246896B2 (ja) | Amiraazeomochiitakogenketsuteikigujubutsushitsunosokuteihoho | |
| JPH0377462B2 (ja) | ||
| JPH0246897B2 (ja) | Amiraazeomochiitakogenketsuteikigujubutsushitsusokuteiho | |
| JPH0245152B2 (ja) | Kosoomochiitakogenketsuteikigujubutsushitsunosokuteihoho | |
| JPS59164960A (ja) | 抗原決定基具有物質の測定法 | |
| JPS6162863A (ja) | 抗体を利用した抗原決定基具有物質測定法 | |
| JPH0340832B2 (ja) | ||
| JPH02264864A (ja) | Ｇｓａ―２結合性蛋白質の免疫学的測定試薬及びそれを用いた免疫学測定用キット | |
| JPH02176465A (ja) | リガンドの測定法 | |
| SU1573427A1 (ru) | Способ определени теофиллина в сыворотке крови | |
| JPS6123970A (ja) | アミラ−ゼを利用した抗原決定基具有物質測定法 | |
| JPH0340831B2 (ja) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees | ||
| S199 | Written request for registration of transfer of right |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313199 |
|
| R370 | Written measure of declining of transfer procedure |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R370 |