JPS6162863A - 抗体を利用した抗原決定基具有物質測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、例えば血液に含まれる薬物あるいは各種疾患
に由来する微量成分などを測定する方法に関するもので
ある。

（従来の技術） 血清、尿等の体液成分の微量分析は、病気の診断や治療
経過の判定などの有力な手段となっている。そこで、体
液成分を分析する種々の方法が開発され、それらのなか
で免疫学的な分析法が感度及び特異性にすぐれていると
ころから日常の検査に多用されている。

抗原と抗体との間の非常に高い親和力を利用しく２） たこの免疫学的分析法には、標識物質として放射性同位
元素を用“たジノ１イ４″・ゞイ・酵素を用いた酵素免
疫測定法等がある。しかしながら、このうちラノオイム
ノアッセイは放射性同位元素を用いるところから、限ら
れた施設での使用、廃液の処理、短かい有効期間など様
々な問題を有している。そこで、酵素免疫測定法がこれ
らの問題のない簡便な方法として一般に利用されている
。

本発明者らは、この酵素免疫測定法を改良してさらに感
度を高めかつ繁雑な操作の少ない分析法を開発すべく種
々検討の結果、測定対象である抗原決定基具有物質に対
する抗体と酵素に対する抗体との結合物に、測定対象で
ある抗原決定基具有物質と、酵素とを接触させると、抗
原決定基具有物質の量に応じて酵素活性が変化すること
を見出し、この内容を既に特許出願（特願昭５８−３８
９７５号）した。そしてその際、該抗原決定基具有物質
と同じ抗原決定基具有物質もしくは該抗原決定基具有物
質の重合物又は前記の抗原決定基具有物質又は酵素に対
する抗体の第２抗体を前記の結合物にさらに接触させる
とさらに高感度で」１１定できるよう（なることを見出
し、この内容も特許出願（特願昭５８−５１４９４号及
び同５１４９５号）した。

（発明が解決しようとする問題点） 従来の酵素免疫測定法の場合はラノオイムノアッセイに
比し操作が煩雑であり、感度も劣っていた。

本発明者らの開発した上記の方法は操作が簡単であり、
感度もラノオイムノアッセイをむしろ上まわるものであ
ったが、２種の抗体の結合物を利用しているため、この
結合物の調製に手間を要するという問題があった。

（問題□点を解決するための手段） 本発明者らは、このような問題点を解決するべくさらに
検討を進め、前記の抗体の結合物のかわりに測定対象の
抗原決定基具有物質及び酵素の両者に結合性を有する抗
体を利用する方法を案出するに至り、この方法は前記の
問題をことごとく解決したものであることを見出して本
発明を完成した。

すなわち、本発明は、測定対象の抗原決定基具有物質と
、酵素又は酵素と高分子化合物との結合物とを、溶液中
で該抗原決定基具有物質及び該酵素の両者に結合性を有
する抗体又はこの抗体と°高分子化合物との結合物に接
触せしめ、その後前記酵素の活性を測定することを特徴
とする抗原決定基具有物質の測定方法に関するものであ
る。

本発明方法における測定対象は検体に含まれる抗原決定
基具有物質である。検体の種類は限定されないが、例え
ば血清、尿などである。血清、尿などの場合は、通常は
特別な前処理を必要とせず、その寸ま測定を行なうこと
ができる。

抗原決定基具有物質（以下、リガンドという）は抗原決
定基を−又は二以上有しているものであり、例えば、各
種内分泌腺に由来するホルモン類、免疫グロブリン、ア
ルブミン、フェリチン等の血漿蛋白質、ＨＢ抗原等のウ
ィルス、バクテリア類、α−フェトプロティン、癌胎児
性抗原等の各種臓器あるいは血中、尿中に存在する抗原
などである。

リガンドは、後述する抗体に結合したときにその後測定
する酵素活性に与える影響の大きなものがよく、その点
で分子量１万ダルトン以上のものが本発明の方法に特に
好適である。しかしながら、後述するリガンドと高分子
化合物との結合物あるいはリガンドの重合物を測定対象
のりガントとともに抗体に作用させることにより低分子
のリガンドも高感度で測定できる。このような低分子リ
ガンドの例としては、ジゴキシン、テオフィＩＪ　７、
フェノパルピタール、フェニトイン、ペニシリン、アミ
カシン等の薬物、プロスタグランノン、テストステロン
、プロゲステロン、サイロキシン等のホルモンなどを挙
げることができる。

酵素はその抗体が得られるものであればよい。

大部分の酵素は動物体に投与することによってその体内
に抗体を形成するから本発明の方法に使用できる。動物
由来の酵素であっても、異種動物に投与することによっ
て通常抗体を得ることが出来るから例外ではない。酵素
は、活性の測定方法が簡単なもののほうが好都合である
。酵素の例としては、グルコース−６−リン酸脱水素酵
素、ヘキ／Ａ　） ソキナーゼ、α−アミラーゼ、マレートデヒドロケゞナ
ーゼ、アルカリ性ホスタファターゼ、ペルオキシダーゼ
、β−ガラクトンダーゼ、クレアチンキナーゼ、リボヌ
クレアーゼ、ペニシリナーゼ々とを挙げることができる
。

酵素を後述する抗体と反応させても活性があ捷り変らな
いときは、酵素を予め高分子化合物と結合させて高分子
化してから用いるのがよい。高分子化合物は、分子量が
１万ダルトン以上でかつ水溶性のものが適当である。高
分子化合物の例としては、可溶性デキストラン、カルボ
キシメチル化デキストラン、アミン化デキストラン、ア
ミロース等の多糖類及びその誘導体、ゼラチン、ヘモシ
アニン、フェリチン等の蛋白質、ポリエチレングリコー
ルなどを挙げることができる。これらは、酵素と結合さ
せた状態で所定の条件を具備していればよく、例えば牛
血清アルブミンのよう彦比較的低分子のものであっても
、それを自家重合させるなどして高分子化したものであ
ってもよい。

高分子化は、酵素以外に後述する抗体について行なって
もよく、また、酵素及び抗体の両方とも高分子化しても
よい。

酵素と高分子化合物との結合方法は双方の官能基を考慮
して決定すればよい。官能基は、アミン基、カルボキシ
ル基、水酸基、チオール基、イミダゾール基、フェニル
基などを利用することができ、例えばアミン基相互間を
結合させる場合には、ジイソシアネート法、グルタルア
ルデヒド法、ジフルオロベンゼン法、ベンゾキノン法等
数多く知られている。また、アミン基とカルボキシル基
との間を結合させる方法としては、カルボキシル基をサ
クシンイミドエステル化する方法のほかツノルポジイミ
ド法、ウッドワード試薬法等が知られており、アミン基
と糖鎖を架橋する過ヨウ素酸酸化法（Ｎａｋａｎｅ法）
もある。チオール基を利用する場合には、例えばもう一
方の側のカルボキシル基をサクシンイミドエステル化し
てこれにシスティンを反応させてチオール基を導入し、
チオール基反応性二価架橋試薬を用いて双方を結合する
ことができる。フェニル基を利用する方法としてはノア
ゾ化法、アルキル化法などがある。結合方法はこれらの
例示に限られるものではなく、このほか例えばｒ　Ｍｅ
ｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍ
ｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＪあるいは「酵素免疫測定
法」等の放置に記載されている方法のなかから適宜選択
して利用することができる。結合比は１：１に限らず、
目的に応じて任意の比率をとることができることはいう
捷でもない。反応後は、ケ゛ル涙過法、イオン交換クロ
マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーな
どを適宜組み合わせて精製を行ない必要により凍結乾燥
法等で乾燥する。

リガンド及び酵素の両者に結合性を有する抗体（抗リガ
ンド抗酵素抗体）は細胞融合法を利用して作製すること
ができる。この場合、まずマウスに酵素をアノユ・ぐン
トとともに数回腹腔等に注射し、牌臓細胞を取り出して
ポリエチレングリコール等を用いてマウスミエローマ細
胞と融合させる。

そして、この融合細胞のなかから酵素に対する抗体を産
生ずるものをクローニングによってモノクローン細胞と
して増殖させる。次に、この細胞をＨＡＴ感受性にする
ために８−アザグアニン含有培地で培養し、増殖した細
胞を下記の細胞融合に用いる。一方、リガンドをアノ−
バントとともに数回マウス腹腔等に注射し、牌臓細胞を
取り出す。

この細胞をポリエチレングリコール等を用いて」二記の
酵素に対する抗体を産生する細胞と融合させる。そして
、この融合細胞をＨＡＴ培地等で選別し、当該抗酵素抗
リガンド抗体を産生ずるものをクローニングによりモノ
クローン細胞として増殖させ、得られたモノクローン細
胞をマウス腹腔内で増殖させることにより目的とする抗
体を大損に製造することができる。上記の方法において
酵素とりガントを入れ替えてもよいことはいう寸でもな
い。

この抗リガンド抗酵素抗体は、前述の酵素と同様、高分
子化合物に結合させて高分子化したほうがよい場合もあ
る。その場合は、高分子化合物には前述のもののなかか
ら適宜用いればよく、結合方法も前述と同様でよい。

抗リガンド抗酵素抗体あるいはその高分子化物は、ケ゛
ル沖過、カチオン交換樹脂、アニオン交換樹脂などを用
いたイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティーク
ロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて精製を行ない
、必要により凍結乾燥する。

測定対象のリガンドと、酵素又はその高分子化物を、溶
液中で前記の抗リガンド抗酵素抗体又はその高分子化物
と接触させる。その際、溶液の温度は２０〜４５℃程度
、そしてＰＨは通常４〜９．５程度が適当である。ＰＨ
を一定に保つために、必要により、リン酸緩衝液、酢酸
緩衝液などの緩衝液を用いてもよい。酵素又はその高分
子化物及び抗リガンド抗酵素抗体又はその高分子化物の
適当な量は、それらの種類、リガンドの種類、あるいは
接触時の条件などによって異なるので予め試験をして定
めるのがよい。抗リガンド抗酵素抗体に対するすがンド
及び酵素の接触順序は問うところではなく、いずれが先
にあってもあるいは同時であってもよい。

抗リガンド抗酵素抗体に、測定対象のリガンドとともに
、同じリガンドと高分子化合物との結合物あるいはりガ
ントの重合物を作用させることにより、特に低分子リガ
ンドも高感度で測定することができる。高分子化合物は
前述の酵素の高分子化において述べたもののなかから適
宜選択すればよく、結合方法も同様でよい。

一方、抗リガンド抗酵素抗体とともに、測定対象のりガ
ントに対して結合性を有しかつ酵素に対して結合性を有
しない抗体（抗リガンド抗体）を測定対象のリガンドに
作用させることによってさらに測定感度を高めることが
できる。そのほか、酵素に対して結合性を有しかつ検体
のりガントに結合性を有しない抗体（抗酵素抗体）を抗
リガンド抗酵素抗体とともに酵素に作用させても同様で
ある。

これらの抗体はいずれも一般の抗体を取得する公知の方
法に準じて取得することができる。例えば兎、山羊、馬
、モルモット、ニワトリなどの温血動物に、リガンド又
は酵素を体重１　ｋｇ当り０．３〜２ｍ９程度１〜数回
背中皮下、フットパッド、大腿筋等にアジュバントとと
もに注射して当該動物の体内に抗体を形成させればよい
。この抗体はベン０シン等の蛋白分解酵素でＦ（ａｂ’
）２　＋　Ｆａｂ’　ｇ　Ｆａｂ々どに分解して用いて
もよい。これらの抗体は、前記のフラグメントであると
否とを問わず、血清からＴｇＧを取得する公知の方法、
例えば硫安沈澱法、イオン交換クロマトグラフィー、ケ
８ル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどで適
宜精製してから用いる。

一方、こわ、らの抗体はモノクローナル抗体として取得
することもできる。その場合には、マウスに前記のりガ
ントあるいは酵素をアジュバントとともに数回腹腔等に
注射し、牌臓細胞を取り出してポリエチレングリコール
等を用いてマウスミエローマ細胞と融合させる。そして
、この融合細胞のなかから当該抗体を産生ずるものをク
ローニングによってモノクローン細胞として増殖させ、
得られたモノクローン細胞をマウス腹腔中で増殖させる
ことによってモノクローナル抗体を大量に製造すること
ができる。

これらの抗体を高分子化合物と結合させて使用すること
によって測定感度がさらに向」ニする場合がある。高分
子化合物は前述の酵素の高分子化において述べたものの
なかから適宜選択すればよく、結合方法も同様でよい。

リガンドと高分子化合物との結合物、リガンドの重合物
、抗リガンド抗体、抗酵素抗体あるいはこれらの抗体と
高分子化合物との結合物と、りがンド、酵素、抗リガン
ド抗酵素抗体との添加順序は問うところではなく、いず
れが先であってもあるいは全部を一時に加えてもよい。

これらの接触を行なわせたのちには酵素活性を測定して
検体中のリガンドの量を算出する。酵素活性の測定方法
は公知の方法に従って行なえばよい。例えば、酵素にグ
ルコース−６−リン酸脱水素酵素を用いた場合には、上
記の接触を行なわせた反応系にグルコース−６−リン酸
及びＮＡＤＰ　　を含む基質溶液を加えて反応させ、生
成するＮＡＤＰＨを波長３４０　ｎｍの吸光度の増加か
ら求めればよい。

また、ヘキソキナーゼを用いた場合には、反応系にグル
コース、ＡＴＰ　、　ＮＡＤＰ　及びグルコース−６Ｃ
１４） −リン酸脱水素酵素を含む基質溶液を加えて反応させ、
やばりＮＡＤＰＨの生成量を測定することによって求め
ればよい。

（作用） 本発明の方法においては、抗リガンド抗酵素抗体に対し
てリガンド及び酵素を競争反応させ、リガンドが結合す
るとその立体障害により酵素の抗リガンド抗酵素抗体へ
の結合が制限されることを利用している。そして、この
作用を増幅するために、抗リガンド抗酵素抗体あるいは
酵素の高分子化、さらにはりがンドの高分子化物あるい
は抗リガンド抗体、抗酵素抗体などの導入を行なってい
る。

（実施例） 実施例１ １）抗グリコースー６−リン酸脱水素酵素マウス■ｇＧ
（α−Ｃ６ＰＤＨＩｇＧ　）の作製抗原として酵母由来
のＧ６ＰＤＨ（オリエンタル酵母工業■製）を用いた。

このＧ６ＰＤＨのｌ　ｍｇ　／　ｍｌ！の溶液をフロイ
ントの完全アジ−パントと等容混合してエマルジョンと
し、そのＯ，ｌ　ｍｌ：を８週令のＢＡＬＢ／Ｃマウス
の腹腔に１週問おきに３回注射した。

それからさらに１週間後に尾静脈に５０　ｔｒ９１０゜
１ｍ／！のＧ６ＰＤＨ溶液を注入し、３日後に肺臓を摘
出した。

この肺臓を摩砕して肺臓細胞を分離し、ポリエチレング
リコール１５００ヲ用いてマウスミエローマＮＳＩと細
胞融合させた。

得られた融合細胞を９６ウエルのプレートに分注し、Ｈ
ＡＴ培地で培養した。各ウェルの細胞をＧ　６　ＰＤＨ
を固相に固定化したプレートを用いたＥＬＩＳＡ法で調
べて、Ｇ６ＰＤＨに反応性を有するマウスＩｇＧを含む
と思われる５ウエルを見出した。この５ウエルの細胞を
限界希釈法で希釈してクローニングし、ＥＬＩＳＡ法を
応用した阻害測定法で調べて、Ｇ６ＰＤＨの異なる抗原
決定基を認識していると思われる２つの細胞株を得た。

この細胞の産生ずる抗体は阻害抗体であった。

ｉｉ）　　Ｇ６ＰＤＨ及びヒｌ−ＩｇＧの両方に結合性
を有する抗体（抗ヒ）ＩｇＧ抗Ｇ６ＰＤＨ抗体）の作製
１）項で得られた抗Ｇ６ＰＤＨマウスモノクローン細胞
をｉｏ＝Ｍ８−アザグアニン及び１０係ウシ胎児血清を
含有するＲＰＭＩ培地で培養した。３日ごとに培地を交
換し、生存した細胞を上記培地を入れた９６ウエルプレ
ートを用いてクローニングした。

そのなかで抗Ｇ６ＰＤＨ抗体を産生ずる細胞をモノクロ
ーンとして培養を続け、目的のＨＡＴ感受性抗Ｇ６ＰＤ
Ｈ抗体産生マウスモノクローン細胞を得た。

次に、１■／　ｍｌヒトＩｇＧ　ＰＢＳ溶液をフロイン
トの完全アジュバントと等容混合してエマルジョンとし
、そのＱ、　］　ｍｌ！を８週令のＢＡＬＢ／Ｃマウス
の腹腔に１週問おきに３回注射した。それからさらに１
週間後に尾静脈に５０　ｔｔｆｉ／　ｏ、　１ｍｌのヒ
トＩｇＧ　ＰＢＳ溶液を注射し、３日後に肺臓を摘出し
た。

との肺臓を摩砕して肺臓細胞を分離し、ポリエチレング
リコール１５００を用いて上記のＨＡＴ感受性抗Ｇ６Ｐ
ＤＨ抗体産生マウスモノクローン細胞と細胞融合させた
。

得られた融合細胞を９６ウエルプレートに分注してＨＡ
Ｔ培地で培養した。各ウェルの培養液をＧ６ＰＤＩ（あ
るいはヒ）ＩｇＧを固相に固定化したプレ一トを用いて
ＥＬＩＳＡ法により調べてＧ６ＰＤ）Ｔ及びヒ）ＩｇＧ
の両方に反応性を有するマウスＩｇＧを含むと思われる
１０ウエルを見出した。この１０ウエルを限界希釈法で
希釈してクローニングし、ＥＬＩＳＡ法により両者に結
合性を有する抗体を産生ずるクローンを取り出した。

この細胞株をそれぞれ１０　％　Ｆｅ２−　ＲＰＭＩ培
地で増殖させ、この増殖細胞を予めプリスタンを注射し
たＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔へ１０　　個つつ注入して
、２週間後に腹水約１０ｍ１を採取した。

この腹水を４５係飽和の硫安で塩析し、生成した沈澱物
を分離した。この沈澱物を少量のリン酸緩衝液ＰＨ７，
０で溶解し、同緩衝液で平衡化した十フアクリルＳ　−
３００カラムでグル沖過してＩｇＧ分画を分取した。

１１１）　　高分子化抗ヒトＩｇＧ抗Ｇ６ＰＤＨマウス
ＩｇＧの作製 デキストランＴ５００　（ファルマシア社製、イ均分子
量５０万）５０ｍ、９を１　ｍｌの水に溶解し、この溶
液に０．１Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム水溶液０．２ｍｌ！
を加えて４℃で一夜反応させた。これに０．１５ｍｇの
エチレングリコールを加えて５分間反応させた後１ｍＭ
酢酸ナトリウム緩衝液（、ｐＨ５，０）で平衡化したセ
ファデックスＧ−２５カラムでケ８ル瀘過し、素通り分
画を集めた。この分画に前項で作製した抗ヒトＩｇＧ抗
ＧｆｉＰＤ’Ｈ抗体２０ｍ！７を１．０ｍＭ炭酸緩衝液
（ＰＨ９，５）に溶解した溶液を加え、ＰＨを９．５に
調整してから室温で２時間反応させた。０．４係水素化
ホウ素ナトリウム水溶液０．５　ｍｌ！を加えてさらに
４℃で２時間反応させ、この反応物を２０’ｍＭＩＪン
酸緩衝液ｐｌ−１７．０に対して透析した。透析物を七
フアクリルＳ　−３００カラムでケ゛ルｐ過して高分子
部分を分画し、デキストランと抗ヒトＩｇＧ抗Ｇ６ＰＤ
Ｈ抗体との結合物分画を得た。

ｉｖ）　　ヒトＩｇＧの測定 前項で得られた抗体−デキストラン結合物３０１１Ｏに
各種濃度のヒトＩｇＧ溶液を加え、３７℃で３０分間加
温後、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＴ
−Ｔ　）　１μｇを含有する溶液５０μＣを加えた。３
０分後に、０．５ｍＭグルコース−６−リン酸、０．５
　ｍＭ　ＮＡＤＰ及び２０ｍＭＭｇＣ４２を含む０．１
Ｍグリシルグリシン緩衝液（ＰＨ８，５）　１．０　ｍ
ｌ加えて３０℃における波長３４０　ｎｍの吸光度の増
加速度を求めたところ第１図に示す結果が得られた。

実施例２ １）Ｇ６ＰＤＨ及−びテオフィリンの両方に結合性を有
する抗体の作製 実施例１の１）項で作製した抗Ｇ６ＰＤＴ（マウスモノ
クローン細胞を実施例１の１１）項の前段と同様に処理
してＴ（ＡＴ感受性抗Ｇ　６　ＰＤＨ抗体産生マウスモ
ノクローン細胞を得た。

次に、１　ｍ９／　ｍｌのヒトＩｇＧ　ＰＲ８溶液のか
わりに１　ｍ９７　ｍｌのヘモシアニンに結合させたテ
オフィリン溶液を用いたほかは実施例１１１）項中段〜
後段と同様にして、Ｇ６ＰＤＨ及びテオフィリンの両者
に結合性を有する抗体を産生ずるクローンを得、さらに
ＩｇＧ分画を分取した。

１１１）　　デキストラン−テオフィリン結合物の調製
分子量約２００万のデキストランＩＩを１Ｎ水酸化ナト
リウムの９０係工タノール溶液５０ｍ／に懸濁し、この
溶液にクロル酢酸１ｇを加えて３７℃で１６時間攪拌し
た。反応後、沈澱物を沢取し、エタノールで十分洗浄し
てから水に溶かし、この水溶液をセファデックスＧ−２
５を充填したカラムに流して未反応のクロル酢酸を除い
た。流出しこのカルボキシメチルデキストラン５００ｍ
９を、ジオキサン中ニ懸濁させ、Ｎ−ヒドロキシサクシ
ンイミド５００ｍ！７及び水溶性カルボジイミド５００
ｍ９を加えて室温で一夜攪拌した。沈澱物をグラスフィ
ルターを用いて沖取し、ジオキサンで十分洗浄シてから
エーテルで洗浄した。洗浄物を乾燥させてカルボキンメ
チルデキストランのサクシンイミドエステルを得た。

このカルボキシメチルデキストランのサクシンイミドエ
ステル２０（ｌ１９ｉ０．１Ｍへキサメチレンジアミン
溶液（ｐ１］８−０）に加え、室温で２時間攪拌した。

続いて、セファデックスＧ−２５のカラムを用いてケ゛
ル濾過を行々い、素通り分画を凍結乾燥してアミン化デ
キストランの凍結乾燥品を得た。

３力ルボキシテオフイリン１０ｍ９及び先に調製してお
いたアミン化デキストラン１００ｍ９を水に溶かし、Ｐ
Ｈ６，０に調整した。この溶液に水溶性カルボジイミド
２０ｍ９を加え、ＰＨ６，０に調節しつつ１時間保持し
て反応させた。この反応液をＰＨ７，０の２０　ｍＭ　
ＩＪン酸緩衝生理食塩溶液で平衡化しておいたセファデ
ックスＧ−２５を用いてグル濾過Ｌ、素通シ分画を分取
した。この素通り分画を凍結乾燥して目的のテオフィリ
ン−デキストラン結合物を得た。

ｉｖ）　　テオフィリンの測定 テオフィリン−デキストラン結合物３０μｇ及び前記の
抗体１００μｇを含む溶液５０μ！に各種濃度のテオフ
ィリン溶液を加え、３７℃で３０分間加温後、グルコー
ス−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）　１μＩを含
有する溶液５０μ！を加えた。

３０分後に０．５ｍＭグルコース−６−リン酸、０，５
ｍＭ　ＮＡＤｆ’及び２０ｍＭＭｇＣ４２を含む０．１
Ｍグリシルグリシン緩衝液（ＰＨ８，５）　■、ｏｍｌ
を加えて３０℃における波長３４０　ｎｍの吸光度の増
加速度を求めたところ下表に示す結果が得られた。

。　Ｂｊｌ　　　　　　０．０８０ ２、０　　　　　　　０．０７５ ５、０　　　　　　　０．０６４ １０．０　　　　　　　０．０４５ ２０、０　　　　　　　０．０３０ ３０゜００゜０２０ ４０゜００゜０１８ 実施例３ Ｉ）　抗β−がラクトシダーゼマウスＩ　ｇＧ　（７）
　作製抗原として大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ（
ワイルドタイプ）を用いたほかは実施例１１）項と同様
にして、β−ガラクトシダーゼの異なる抗原決定基を認
識していると思われる３つの細胞株を得た。この細胞の
産生ずる抗体は活性化抗体であった。

１１）　　ヒトα−フェトプロティン及びβ−がラクト
シダーゼの両方に結合性を有する抗体の作製抗Ｇ　６　
ＰＤ）Ｔマウスモノクローン細胞のかわりに前項で得ら
れた細胞を用い、そして１ｍり７ｍｌのヒトＩｇＧ　Ｐ
ＢＳ溶液のかわりにｌ　ｍ９７　ｍｌのヒトα−フェト
プロティン（ＡＦＰ　）溶液を用いたほかは実施例１１
１）項と同様に行ない、■ｇＧ分画を得た。

！！り　　ＡＦｐ測定 前項で得られた抗ＡＦＰ抗β−ガラクトシダーゼ抗体１
　ｔｔｆｉ　／　５０　ｔｔＡに各種濃度（７）　ＡＦ
Ｐ溶液５０　ｔｔＬ及び第１）項の別の細胞株から得ら
れた異なる抗原決定基を認識する抗ＡＦＰマウスＩｇＧ
１μ、９１５０　ｔｕｅを加え、３７℃で２０分間加温
した。これにβ−ガラクトシダーゼ５０μ！を加えてさ
らに３７℃で２０分間加温した。

基質液（３×１０　ＭＯ−二トロフェニルーβ−１−ガ
ラクトピラノシド、０．０１　Ｍ　トリス、０．１ＭＮ
ａＣ１、’　０．０５　Ｍ　２−メルカゾトエタノール
、Ｐｌ−＋７．０　）　１．０　ｍｌを加えて３７℃で
３０分間加温して酵素反応させ、０．５ｍｌの０．５Ｍ
炭酸溶液を加えて反応を停止させた。この反応液の４２
０　ｎｍにおける吸光度を測定した結果を第２図に示す
。図中、黒丸は他の異なる抗体を加えた場合を表わし、
白丸は加えなかった場合を表わしている。

（発明の効果） 本発明の方法は、リガンドを特異性高くかつ極めて高感
度で測定できる。また操作が簡単であり、安価かつ容易
にリガンドを定量することが可能である。本発明の方法
に用いる抗体は容易に大量生産できるという大きな利点
を有する。

【図面の簡単な説明】

図面はいずれも本発明の実施例で得られたものであり、
第１図はヒ）ＩｇＧ濃度と吸光度の関係を、そして第２
図はヒトα−フェトプロティン濃度と吸光度の関係を示
している。 特許出願人　富士レビオ株式会社 代理人弁理±　１η　　　中　　　政　　　浩第１図 ’）　　ＩｇＧ　　ｎｇ／ｍｌ

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）測定対象の抗原決定基具有物質と、酵素又は酵素
   と高分子化合物との結合物とを、溶液中で該抗原決定基
   具有物質及び該酵素の両者に結合性を有する抗体又はこ
   の抗体と高分子化合物との結合物に接触せしめ、その後
   前記酵素の活性を測定することを特徴とする抗原決定基
   具有物質の測定方法
2. （２）酵素の活性を測定するときより前に測定対象の抗
   原決定基具有物質と同じ抗原決定基具有物質と高分子化
   合物との結合物又は該抗原決定基具有物質の重合物を前
   記抗体又はこの抗体と高分子化合物との結合物に接触せ
   しめる特許請求の範囲第１項記載の抗原決定基具有物質
   の測定方法（３）酵素の活性を測定するときより前に測
   定対象の抗原決定基具有物質をこの抗原決定基具有物質
   に対して結合性を有しかつ前記酵素に対して結合性を有
   しない抗体もしくはこの抗体と高分子化合物との結合物
   に接触せしめるか、又は、前記酵素をこの酵素に対して
   結合性を有しかつ測定対象の抗原決定基具有物質に対し
   て結合性を有しない抗体もしくはこの抗体と高分子化合
   物との結合物に接触せしめる特許請求の範囲第１項記載
   の抗原決定基具有物質の測定方法