JPS62246596A - 改質β↓２マイクログロブリン - Google Patents

改質β↓２マイクログロブリン

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JPS62246596A
JPS62246596A JP62007962A JP796287A JPS62246596A JP S62246596 A JPS62246596 A JP S62246596A JP 62007962 A JP62007962 A JP 62007962A JP 796287 A JP796287 A JP 796287A JP S62246596 A JPS62246596 A JP S62246596A
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microglobulin
mβ2m
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asp
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モゲンス　ホルスト　ニッセン
イエスパー　セウセン
フレミング　スティグ　ラルセン
ラルス　シム
モゲンス　クリステンセン
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Novo Industri AS
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は一般的には下記の式■を有する改質β２−マイ
クログロブリン（ｍβ２　ｍ　）、癌および免疫系を含
む病気のような各種異常の展間についての診断および／
または予後マーカーとして有用な上記ｍβ２　ｍ　Ｋ対
する４リクロ一ン抗体およびモノクローン抗体、該−リ
フローン抗体およびモノクローン抗体の製造法および診
断および予後補助としてのそれらの使用に関する。
本発明は更にｍβ２ｍまたは／および生物学的応答改質
剤として使用されるその前駆体であるβ２−マイクログ
ロブリン（β２　ｍ　）から成る製薬組成物および同様
に生物学的応答改質剤として使用される抗ｍβ２ｍ抗体
から成る製薬組成物に関する。
本発明の改質β２−マイクログロブリンは、一般式 ％式％ （式中、Ｒ１は２４個の７オノ酸残基の配列Ｉ　ｌｅ−
Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｅ　−Ｉ　１ｅ
−Ｇｌｎ−Ｖａｔ　−Ｔｙｒ−８＠ｒ−Ａｒｇ−Ｈｌ　
ｍ−Ｐｒｏ−Ａｌｔ−Ｇｌｕ−Ａｓ＋ａ−Ｇｌｙ−Ｌｙ
ｓ−Ｂ＠ｒ−Ａｌｔ１−Ｐｈｅ−Ｌ＠ａ−Ａｓｎ　であ
シ、Ｒ２は３０個のアミノ酸残基の配列 Ｔｙｒ−Ｖａ１−８＠ｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｌ　５−
Ｐｒｏ−８＠ｒ−Ａｓｐ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａ
ｓｐ−Ｌ＠ｕ−Ｌ＠ｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ　−Ｇ
ｌｕ−Ａｒｇ−ＩＩｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌ
ｕ−Ｈｌｓ−８＠ｒ−Ａｓｐ−Ｌ＠ｕ−Ｂ＠ｒであ）。
Ｒ３は２０個のアミノ酸残基の配列 Ｔｒｐ−８＠　ｒ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｌ＠ｕ−Ｉｒ＠ｎ
−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ　−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ
−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｉｎ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−
Ｔｙｒ−Ａｌｍ　　であシ、 Ｒ４は１９個のアミノ酸残基の配列 Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｈ１ａ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｌ
＊ｕ−８ｅｒ−Ｇｌｎ　−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ”Ｉ　ｌ　ｅ
−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｓｐ　
−Ｍ＠ｔ であシ、ＸはＰｈｅ　、　Ｐｈａ　−ｓ＠ｒ　ｔたはＰ
ｈａ　−Ｓ＠ｒ　−Ｌｙｓであシ、ＹはＡｓｐ　、　Ｌ
ｙｓ　−ＡｓｐまたはＳ＠ｒ−Ｌｙｅ−Ａｓｐである）
を有する、。
〔従来の技術〕
改質βｍ−マイクログロブリン（ｔｎ／２ｍ）は、β２
−マイクログ四ツリン（β２　ｍ　）の変種であシ、こ
の変種は各種の型の癌および免疫系の異常などに関連し
て検出されている。
その前駆体β２ｍは９９個のアミノ酸残基配列から成シ
２５位と８０位のシスティン残基の間にジスルフィド架
橋結合を有する単一鎖のポリイプチドから成る分子質量
が１１８００ダルトンであシ、既知のアミノ酸配列を有
する血清タン／ぐりである（１）。構造的には、β２ｍ
　ＦｉＺ　ｇＧ　Ｋおける一定の領域、特に重鎖ＨＬＡ
−Ｂ７のＣＮ３領域およびα３領域と顕著な類似性を示
す。β２ｍは細胞膜の主要な組織適合性複合体の一部分
であり、血清、髄液、唾液、精液および初乳のような体
液中に遊離の形で存在する（２．３）。健常人では、β
２ｍの血清中濃度は５０〜２００　ｎｍｏｔ／Ａである
（４）。
１１２ｍの血清中濃度は各種病変、例えば慢性関節リウ
マチ（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（８ＩＪ）　。
悪性リンΔ腫（ＭＬ）、小胞性肺癌（８ＬＣ）のような
ある種の肺癌では増加する（５〜７）。ＭＬでは、高水
準の血清中のβ２ｍは化学療法に応答して減少するが、
再発の場合には一般的には血清中のβ２ｍは上昇しない
。
小胞性肺癌（ＳＬＣ）は診断時にはほとんど何時も散在
性であシ、それゆえ主な治療は組み合わせ化学療法であ
る。化学療法では、総ての患者の８０９ｂ以上を軽快さ
せることが可能であるが、はとんどの場合に腫瘍は後で
制御することが出来なくなる。したがって、出来るだけ
早期の診断、好ましくは病気が未だ局部的である段階で
の診断が、ＳＬＣＫ罹っている患者の生存率を向上させ
るために極めて重要である。
〔発明が解決しようとする問題点〕
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、見掛上はＡＩＤ
Ｓ関連コンプレックスまたはリン／４節症候群のような
他の形態および保菌者状態を含む余シ発現していない状
態で存在する病気の最終的な状態である。仮定した原因
となるウィルス（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ）Ｋ対する
抗体を使用するととＫよって供血者のスクリーニングが
始まっている。かかるウィルスに対する試験はウィルス
に対して暴露されていることのみを検出するのであシ、
病気の存在またはその展開の予後を検出するものではな
い。また、ＨＴＬＶ−ＩＩＩＩＣ対する抗体試験は、ウ
ィルスの存在を検出し損ねることもめる（１）。
したがりて、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ暴露に対する免疫系の応
答をよシ定量的に評価することができる別の方法が必要
である。
β２ｍは上記のような病気の診断および観察に用いるこ
とができる一つのマーカーとして多くの注目を集めてい
る。
例えば、試験を受けたほとんどのＡＩＤＳ患者は正常値
よシ高いβ２ｍ水準を有することが報告されている。ま
た、ＡＩＤＳの臨床的診断を下される２年前でも多くの
場合に、β２ｍ水準の上昇が見られることが報告されて
いる。
ＲＡ、ＳＬＫ、生殖細胞腫瘍およびＭＬの患者からの血
清を試験管内で培養すると、「α−電気泳動性移動」を
有するβ２ｍ分画の交叉放射免疫電気泳動法（ＣＲＩＥ
）の外観に生じることが示されている。ＭＬの患者では
、このα分画の量と化学療法に対する応答との間に逆の
相関が見られている。
Ｒａｖｔ　　Ｂ、Ｂｈａｌｌａらは、Ｃｌ１ｎｉｃａｌ
　　Ｃｈ＠ｍ１ｓｔｒｙ。
３１（１９８５年）１４１１頁に、β２ｍまたは改質β
２ｍのα−電気泳動型が正常のβ２ｍ水準を有する患者
をも含む総てのＡＩＤＳ患者に存在し、またＨＴＬＶ−
ＩＩＩ−陰性である患者にも存在することを見い出した
ことを報告している。
以下余白 〔問題点を解決するための手段、作用および発明の効果
〕 それゆえ、α−電気泳動型または改質β２ｍ（ｍβ２　
ｍ　）は、各種の免疫学的以上のマーカーとして極めて
興味深いものと思われる。ｍβ２ｍは明らかに上記の病
気のいずれＫも特異的ではないが、その測定は多数の試
料のスクリーニングまたはそれらの病気の展開を観察す
るのに重要な手段となるであろう。
したがって本発明の目的は、癌および異常な水準のｍβ
２ｍによって発現する免疫学的疾患の診断および予後の
評価における一般的マーカーとしてｍβ２ｍを利用する
手段を開発することである。この目的は、本発明によれ
ば、体液中でｍβ２ｍを検出し且つ測定する効率的方法
を提供することによって達成される。この方法は、ｍβ
２ｍに対する抗血清中で得られる特異的ぼりクローン抗
体またはその上の特異的エピトープを用いて、かかる抗
体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させてノーイブリドーマ
を得て、特異的Ｋｍβ２ｍに結合するモノクローン抗体
を生産するハイプリドーマ細胞を選択するのである。本
発明は、ｍβ２ｍの化学的構造の決定にしたがって為さ
れた。
ｍβ２ｍの生物学的重要性は今日まで報告されていない
が、本発明の研究中に驚くべきことＫは、既に活性化さ
れてしまっている免疫学的応答を増大させる生物学的応
答改質剤として生物活性を有し、且つこの点において１
２ｍは活性種ｍβ２ｍの前駆体として作用することを見
い出した。また、抗ｍβ２ｍ抗体はｍβ２ｍの活性を遮
断することもでき、それによシ生物学的応答を抑制する
ことも出来ることも見い出した。
これらの知見の結果として、本発明の目的は生物学的応
答改質剤として用いられるｍβ２ｍまたは／およびβ２
ｍから成る製薬組成物並びに生物学的応答遮断剤として
用いられる抗／２ｍ抗体から成る製薬組成物を提供する
ことでもある。
第一の観点では、本発明は、上記一般式■を有する新規
改質β２−マイクログロブリンに関する。
第二の観点では、本発明は、蓄歯類のような動物を、宿
主の抗ｍβ２ｍ抗体の産生を誘発することができるｍβ
２ｍまたはその他の抗原で免疫することＫよってｍβ２
ｍに対して生じた抗血清またはＩリフローン抗体に関す
る。
更にもう一つの観点では、本発明は、ｍβ２ｍまたはも
ら一つの好適な抗原で免疫した動物からの抗体産生細胞
を骨髄腫細胞と融合させて、特異的モノクローン抗ｍ／
２ｍ抗体を生産するノーイブリドーマを得ることによっ
て提供されるモノクローン抗ｍβ２ｍ抗体に関する。
更にもう一つの観点では、本発明はこれらの特異的抗ｍ
β２ｍ抗体を個別Ｋまたは組み合わせて用いてヒト血清
またはその他の体液中のｍβ２ｍの検出および分析法お
よび抗ｍβ２ｍ抗体を含む診断用キットへの使用に関す
る。
更にもう一つの観点では、本発明は、ｍβ２ｍまたは／
およびβ２ｍと生理学的に受容可能な担体との組み合わ
せから成る製薬組成物およびこれら製薬組成物の免疫促
進または抑制剤のような生物学的応答改質剤としての使
用に関する。
更にもう一つの観点では、本発明は、特異的抗ｍβ２ｍ
抗体と生理学的に受容可能な担体との組み合わせから成
る製薬組成物およびかかる組成物の生物学的応答遮断剤
としての使用に関する。
本発明を、図面に関して以下に詳細に説明する。
改質β２−マイクログロブリンはＣＲＩＥで分析すると
き、元のタンノ母りに比較して相対移動度が２．０であ
るβ２ｍの分画として定義される。
本発明によれば、改質β２ｍマイクログロブリンは、組
織学的に証明された小胞性の未分化肺癌（ＷＨＯＩＩ）
　　の患者からの血清試料からβ２ｍと共に単離した後
、β２ｍから分離することによって得た。
血清からのｍβ２ｍおよびβ２ｍの単離は、２０℃で５
日間培養した後グル濾過することによって行りた。
ｍβ型およびβ２ｍを含む分画をｐＨ７〜４でり町マド
グラフィを行って、ｍβ２ｍおよびβ２ｍを分離し、ｍ
β２ｍを含む分画を次にグル濾過によって精製した。
本発明の生成物であるｍβ２ｍはＣＩＥ、ＣＲＩＥ。
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動法
（８ＤＳ−ＰＡＧＥ）および分析的等電集積（１ｓｏｅ
ｌｅｃｔｒｉｅ　ｆｏｃｕｓｉｎｇ　ａ、　ＩＥＦ　）
によって物理化学的および生化学的に特徴づけられ１文
献記載のようにβ２ｍおよびｍβ２ｍのα電気泳動型と
同一であることが示された。
本発明疼よるｍβ２ｍは、分子をそれらの大きさおよび
等電点にしたがって分画する当業界に知られている方法
の他のいかなる組み合わせによっても得ることができる
。
本発明の目的のβ２ｍおよびｍβ２ｍは遺伝子技術また
はペプチド合成によって製造することもできると思われ
る。また、ｍβ２ｍはβ２ｍから酵緊的に好都合に製造
することもできる。
本発明によるｍβ２ｍは、還元されていない型では見掛
けの分子量が１５，０００であシ、５ＤＳ−ＰＡＧＥに
・よって分析すると分子量が１２，０００以下の還元さ
れた型の２個の小さなペプチドに開裂する。未還元型で
は、ｍβ２ｍは分析的ＩＥＦではｐｉを有していた。
生成物のアミノ酸配列を調べたところ、下記の一般式■ Ｙ　−Ｒ３−Ｃｙ　ｓ　−Ｒ４ （式中、Ｒ１は２４個のアミノ酸残基の配列Ｉ　１＠−
Ｇｉｎ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｅ−ＩＩ＠−Ｇ
ｉｎ−Ｖａｌ　−Ｔｙｒ−８＠ｒ−Ａｒｇ−Ｈｌ　５−
Ｐｒｏ−Ａｌ　ａ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−
８＠ｒ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−レ＊ｕ−Ａｓｎであシ、Ｒ２
は３０個のアミノ酸残基の配列 Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｂａｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｌ　ｍ−
Ｐｒｏ−８ｅｒ−Ａｓｐ　−ＩＩｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−
Ａｓｐ−Ｌ＠ｕ−Ｌ＠ｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇ
ｌ　ｕ−Ａｒｇ−Ｉ　１　ｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ　−Ｖａ
　１−Ｇｌ　ｕ−Ｈｌ　Ｉ−８＠　ｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ
−８ｓｒであシ、 Ｒ３は２０個のアミノ酸残基の配列 Ｔｒｐ−８＠ｒ−Ｐｈ＊−Ｔｙｒ−Ｌ＠ｕ−Ｌ＠１ｌ−
Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｐ
ｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ　−Ｔ
ｙｒ−Ａｌｍ　　であシ、 Ｒ−ＨＩＱ掴の丁？ノシ碑其の１凝１１Ａｒｇ−Ｖａｌ
−Ａｓｓ−Ｈ１ａ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−レｍｕ−８＊ｒ−
Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−ＩＩｓ−Ｖａｌ−Ｌｙｅ−Ｔ
ｒｐ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｍ＠ｔ であｌ）　、　ＸＦｉＰｈｅ　、　Ｐｈｅ　−Ｓｅｒま
たはＰｈｅ−８＠ｒ−Ｌｙｓでｓｂ、ＹはＡｓｐ　、　
Ｌｙｅ−Ａｓｐまたは８＠ｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐである）
を有することが示された。
Ｒ，−Ｃｙｓ−Ｒ２−Ｘ鎖（Ａ鎖）のアミノ酸配列は、
アミノ酸残基４２が本発明による残基がＡＳｎであり、
報告された配列がＡｓｐであることを除いては元のβ２
ｍにおける残基１〜５６（５８）の報告された配列と同
じである。しかしながら、本発明による配列は％　８ｕ
ｇｇ−らのＰｒｏＣｅ　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ。
８ｅｉ　、ＵＳＡ、７８（１９８１）、６６１３〜６６
１７頁によってクローン化されたｃＤＮＡから推定され
た配列と同じであシ、彼等も４２位をＡａｎとしている
。
Ｒ１−Ｃｙ　ｓ　−Ｒ２−Ｘ鎖のＣ−末端の配列はＮ−
末端からのＥｄｍａｎ分解およびＣ−末端からのカルが
キシペグチダーゼ消化の二つの方法によって決定され、
生成物は主として（Ｘがｐｈ・であシ、ＹがＡ＠ｐであ
るペプチドから成ることが明らかＫなりた。Ｃ−末端の
決定は５２．５５および５７位にセリン残基が存在する
ことによって複雛であった。
Ｙ−Ｒ３−Ｃｙｓ−Ｒ４−Ｘ鎖（Ｂ（Ｉｍ）は、元のβ
２ｍの報告された配列における残基（５７）５９〜９９
と同じであった。
上記のように、ｍβ２ｍは免疫系を含む多数の疾患に罹
っている患者の体液中に見い出されている。
したかりて、ｍβ２ｍはこれらの疾患の有力なマーカー
であり、ｍβ２ｍの存在を検出し、且つ存在量を測定す
る迅速で、容易に行うことができ且つ信頼性の有る方法
が非常に望まれている。
本発明によれば、これは、窩歯類のような動物をこの動
物の抗ｍβ２ｍ抗体を上昇させることができる抗原で免
疫することによって得られる抗ｍβ２ｍ抗体の使用によ
りて得られる。
提供され九ｍβ２ｍの化学的構造の決定に基づいて、ｍ
β２ｍに対する特異的抗体は、抗原としてタンノクク分
解性開裂部位に隣接する配列に対応する合成ペプチドフ
ラグメント、すなわち、キーホール・りンペット・ヘモ
シアニン（ＫＬＨ）のような好適な担体タンノ臂りに結
合した式■の−Ｒ２−ＸまたはＹ−Ｒ，−として定義さ
れるセグメントの部分配列に対応するペプチドを用いる
ことによって得ることが出来る。本明細書に示される実
声例では、セグメント−１２−Ｘの配列、すなわちＬｙ
ｅ−Ｖａｌ　−Ｇｌ　ｕ−Ｍｌ　ｓ−８＠ｒ−Ａｓｐ−
Ｌ＠ｕ−８ｏ　ｒ　−Ｐｈｅは、Ｎ−末端（Ｌｙｓ　）
を介して担体としてのＫＬＨに結合した。
ｍβ２ｍを測定する理想的な実験室的方法は、特異的（
例えとβ２ｍの存在によって影響されず）８確且つ正確
であシ、容易Ｋｍ準化され、速やかで、安価であシ、容
易であるべきである。現在利用可能なＣＲＩＢのような
方法は、これらの要件を同時に総て満たすものではない
。特に、それらは極めて時間が掛かシ且つ得られた結果
は半定量的でしかない。
それゆえ、本発明の目的の一つは、上記の方法の欠点を
克服する、ヒトの体液中のｍβ２ｍを測定する方法を提
供することである。
本発明のこの観点は、適当な免疫化、スクリーニングお
よび選択法を用いるととＫよって、ｍ７　ｍＫのみ存在
して例えばβ２ｍＫは存在しないエピトープに特異的に
結合するモノクローン抗体を産生する細胞ライン（）・
イブリドーマ）を分離することが可能であるという驚く
べき観察に基づくものである。
免疫化に用いられる抗原はｍβ２ｍでもよいが、ｍβ２
ｍ上のニートープに特異的に結合する抗ｍβ２ｍ抗体を
増加させる能力について選択される他の抗原を用いるこ
ともできる。一般的にいえば、一般式■ Ｒ−ＺＩ［ 〔式中、Ｒはキャリヤータンパクであシ、２は式Ｒ，’
−ＸまたはＲ，’−Ｙ（但し、ＸおよびＹは式■におい
て定義した通シであシ、Ｒ２′は式Ｉにおいて定義され
たＲ２のＣ末端からのフラグメントに対応する１〜３０
個のアミノ酸残基を有するペプチドであシ、ＲｓＩは式
！に記載のＲｓのＮ末端から残基を有するペプチドであ
る）を有するペプチドである〕を有するが用いられる。
例えば、遊離のＣ−末端およびキーホール・リンペット
・ヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合し九Ｎ末端とを有する
アミノ酸残基−Ｌｙｓ　−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｈｌ　ｓ　
−８・１−ムｓｐ−レ＊ｘ−８＠ｒ−Ｐｈ＊から成る抗
原が良好に用いられ、抗血清およびｍβ２ｍのＡ＠の９
個のＣ−末端アミノ酸残基のエピトープに特異的に結合
しているモノクローン抗体を産生ずるのに用いられた。
免疫はネズミで皮下に数回抗原を注射後、抗原を静脈内
に注射することによりて行りた。適当な時間の後、ネズ
ぽを屠殺して膵臓を取シ出して、ミエローマ細胞を融合
させた。融合させた細胞は、以下に記載のように、Ｒ，
Ｔ＊ＴａｇｇａｒｔおよびＩ。
Ｍ、８ｍｍｌｏｆｆのＳｅｉ＊ｎｃｓ　、２１９　（１
９８３）、１２２８〜１２３０頁（ＡＰＲＴ−選択）Ｋ
よって訪導された。
特異的モノクローン抗体用に選択されたハイツＩＩ　ｙ
−−ｔｌｆ１２７）１１−二ｙＪ”ＨＩｆ！Ｔ、ＴＭＡ
　＆田−イ斜い、多数のクローンがβ２ｍと交叉反応な
しに特異的に反応することを見い出した。
本発明の抗体はｍβ２ｍの存在を検出し且つ存在量を定
量的に測定する方法に用いることもできる。
ｍβ２ｍの完全な抗原またはその特徴てきなエピドーグ
の存在の検出は、血清、血液、唾液、尿、精液、髄液、
初乳、組織、生検、気管支洗浄液などのような体液の源
または試料で行うことができる。
特異的抗体に基づいたｍβ２ｍの検出は、競合的または
免疫法（「サンドイッチ」）型のようなイムノアッセイ
によう【行うことができる。競合的アッセイでは、精製
されたｍβ２ｍ抗原ま九はその特徴てきなエピトープか
ら成る分子を検出可能な枦厭で評し記する。ｍβ２ｍ抗
体またはエピドーグを含むと思われる試料をｍβ２ｍお
よび標識したｍβ２ｍと共に培養して、免疫コンプレッ
クスが形成し１分離および検出した後、ｍβ２ｍ抗原の
水準は容易Ｋ　１ｍ１Ｊ定される。
もう一つの型の競合的アッセイは免疫したｍβ２ｍ抗原
またはエピトープおよび標識し九ｍβｍ抗体を含む。源
または試料中１ｃｍβ２ｍが存在すると、抗体の同定さ
れた抗原またはエピトープへの結合が妨げられるので、
抗原の存在の逆測定を提供する。
競合的型のアッセイでは、免疫コンプレックスの形成の
前または後に、抗体を固定相上に固定することもできる
。例えば、固定相上に固定された第二の抗マウスＩｇＧ
抗体を「二重抗体ｊ法として知られている方法で、混合
物に添加することもできる。
免疫測定（サンドイッチ）アッセイでは、一方のｍβ２
ｍ抗体を検出可能に標識する。もう一方の抗体を固定相
上で不溶化する。試料を、標識し且つ不溶化した抗体と
培養すると、サンドイッチを形成し、未結合抗体を分離
した後、樋識の量は抗原の量に比例する。免疫測定法は
、不溶化しおよび／ｌたはｌ！識した抗体の添加順序に
よりて、早期、逆転または同時の様式で行うこともでき
る。
サンドイッチ系での感度を増加させるため、記載の方法
を、アビジン−ペルオキシダーゼ共役体と反応するビオ
チン化し九ｍβ２ｍを用いて改質することもできる。
ｍβ２ｍ抗原の攪拌、振盪、濾過またはプレ・アッセイ
抽出などのような他の段階も、所望によシまたは特定の
状態に必要ならば、アッセイに加えることができること
は勿論である。
特定の濃度、培養の温度および時間あるいはその他のア
ッセイ条件も、試料中の抗原の錆度、試料の性状などの
ような要因にようて変えることができる。当業者は日常
の実験法を用いて、各測定に対する操作および最適アッ
セイ条件を決定することができるであろう。例えば、イ
ムノアッセイは４〜３７℃、好ましくは２６℃で行うこ
とができ、各培養工程は７２時間程度とすることもでき
る。
ｍβ２ｍ抗原または特徴的なエピトープの代わシに、ア
ッセイにおいて、アンチ・イディオタイプ抗体またはモ
ノクローン抗体ｍβ２ｍの結合部位に対して抗体を生成
させることＫよシ産生される免疫学的に活性な７ラグメ
ントを用いることが可能である。また、本明細書記載の
特定のｍβ２ｍの代わシに通常の方法でハイツリドーマ
を抗原でスクリーニングすることによって調製される等
量の抗体を用いることも可能である。ハイツリドーマは
、適当な生成された抗原に対して増感されたりンノヤ球
と適当な骨髄腫との融合にようて調製される。
（ｌｆｌｆ以上の）抗体を結合させることができ且つ本
発明に用いることができる多くの担体がある。
よく知られた担体には、ガラス、ポリスチレ“ン、ポリ
プロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、
アミロース、天然および改質セルロース、ポリアクリル
アミド、アガ°ロースおよびマグネタイトがある。担体
の性状は、本発明の目的のために有る程度可溶性にもま
たは不溶性にもすることができる。当業者は、（一種以
上の）抗体を結合させるのに好適な他の多くの担体を知
るであろうし、または通常の実験作業を用いて確かめる
こともできるであろう。
本発明のアッセイの特定の態様によっては、抗原または
１種以上の抗体を、酵素、放射性同位元素、螢光化合物
または金属、化学発光化合物または生物発光化合物のよ
うな検出可能な＆ｆ！識と結合させることもできる。更
に、これらの標識の所望な分子への結合は、商業者にと
って通常の標準的技術を用いて行うことができる。
所定のイムノアッセイにおける所望な分子を検出可能Ｋ
１１ｌすることができる一つの方法は、酵素に結合させ
ることＫよる方法である。この酵素はまた、後でその基
質に暴露されると、基質と反応して、例えは分光光度法
（ＢＬＩＳＡ系）または螢光硬度法によって検出するこ
とができる化学的残基゛を生成する。検出可能な標識と
して用いられる酵素の例には、ホースラディッシ・ペル
オキシダーゼ、マレート・デヒドロゲナーゼ、スタフィ
ロコッカス性ヌクレアーぜ、デルタ−５−ステロイド・
イソメラーゼ、酵母アルコール・デヒドロゲナーゼ、ア
ルファーグリセロホスフェート嗜デヒドロゲナーゼ、ト
リオース・ホスフェート・イソメラーゼ、アルカリ・ホ
スファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコース番オキシ
ダーゼ、ベーター−ガラクトシダーゼ、リゾヌクレアー
ゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−ホスフ
ェート−デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびア
セチルコリン・エステラーゼである。
抗原または抗体（および結果としてそれに対応するｍβ
２ｍ抗原）の存在は、所望な分子を放射性同位元素で標
識するととＫよりて検出することもできる。次いで、放
射性同位元素の存在を、ガンマ−カウンターまたはシン
チレーション・カウンターの使用などの手段によって決
定することができる。特に有用な同位元素は、３Ｈ１１
′Ｉ、′３１１．３２Ｐ、５５Ｂ、１４Ｃｓ　５１Ｃｒ
　ｓ　　Ｃ１，Ｃｏ、５８００．５９Ｆ０．７５ｓ０．
１１１１ｎ、　？？１１１Ｔ、、６７Ｇ１および？Ｏｙ
である。
抗原または抗体の存在を所望な分子を螢光化合物で標識
することによって検出することも可能である。螢光物質
を標識した分子を適当な波長の光に暴露すると、占領の
螢光によってその存在を検出することができる。最も重
要な螢光標識化合物には、フルオレセインｅインチオシ
アネート、口＋＋＋　／　ミン、フィコエリスリン、フ
ィコシアニン、アロフィコシアニン、０−７タルデヒド
およびフルオレスカミンがある。
Ｅｕ（エーロビウム）およびその他のランタニドのよう
な螢光を発する金属原子を用いることもできる。これら
は、ＤＴＰＡまたはＥＤＴムのような金属キレート剤に
よりて所望な分子に結合させることができる。
媚態または抗体を検出可能に標識することができるもう
一つの方法は、化学螢光化合物に結合させることによる
方法である。化学発光物質をｅｘａした免疫学的分子の
存在は、化学反応中に生じる発光の存在によって計測さ
れる。特に有用な化学発光枦隆化合物の例は、ル２ノー
ル、イソルミノール、芳香族アクリジニウム・エステル
、イミダゾール、アクリジニウム塩およびオキプレート
・エステルである。
同様に、生物発光化合物を標識として用いることもでき
る。生物発光は、生物系において見い出される特定の型
の化学発光であシ、触媒タン／やりが化学発光反応の高
率を増加させる。生物発光分子の存在は、発光の存在を
検出することによって計測される。標識の目的に重要な
生物発光化合物はルシフェリン、ルシフェラーゼおよび
ニーフォリンである。
ｍβ２ｍ抗原またはそれに相当する特徴を有するエピト
ープに対するもう一つの可能なアッセイ法は凝集による
方法であシ、ｍβ２ｍ抗体をラテックスビーズ上に結合
させて、ｍβ２ｍ抗原の存在をビーズ凝集体によりて測
定する。
また、ｍβ２ｍ抗体は、標識した抗体を使用す“ること
によりて免疫組織化学的組織の分析にも使用される。
上記のｍ７２ｍ抗原を検出する方法では、１釉の特定の
抗ｍβ２ｍ抗体を用いることが可能である。
しかしながら、２種以上の特定の抗ｍβ２ｍ抗体の組み
合わせ、例えば、Ａ鎖のＣ−末端におけるエビ）−７’
に特異的な１種の抗体とβ鎖のＮ−末端における工ｆト
ープに特異的な１種類の抗体との組み合わせを用いてこ
の方法の選択性を向上させることも可能である。
本発明のアッセイに用いられる材料は、理悲的にはキッ
トの調製に好適である。かかるキットは、区画に分けら
れた担体手段から成シ、狭い区画内に１種以上のバイア
ル、管などの容器手段を収容して、上記容器手段はそれ
ぞれ所望な方法で使用される別個の袈素の１つを有して
いる。
例えば、免疫測定法に有用な上記容器手段の一つは、担
体に結合したモノクローン抗ｍβ２ｍ抗体から成ること
ができる。第二の容器は、凍結乾燥した型または溶液で
の可溶性で検出可能に＃識されたモノクローン抗ｍβ２
ｍ抗体から成ることができる。
競合的アッセイに有用なキットは、検出可能に標識され
た抗原を有する第一の容器および遊離または担体に結合
した抗−ｍβ２ｍ抗体を有する第二の容器から成ってい
る。
更に、担体手段は複数の容器であって、それぞれがこと
なる所定量の抗原を有するものを含むことも出来る。こ
れらの後者の容器は、次いで標準曲線を調装するのに用
いて、未知量の抗原を含む試料から得られる結果を内挿
することが出来る。
本発明では驚くべきことには、生成されたｍβ２ｍは混
合したリンパ球培養物（ＭＬＣ）における細胞獣性作用
を増大させると共に、リンパ循環インターロイキン−２
（ＩＬ−２）の産生を促進することを示した。ｍβ２ｍ
と、β２ｍが正常な成分である主要な組織適合性コンプ
レ、クス（ＭＭＣ）との相互作用によって細胞を活性化
して、例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）のよ
うな一般的な刺激作用に対する細胞リセグター発現を増
加させ、ＩＬ−２に対するりセッターの発現を増加させ
且つこのリンホカインの内因性産生を増加させることが
出来る。本発明のｍβ２ｍの生物活性はｍβ２ｍの製薬
上の有用性を示唆し、薬理学的効果は免疫系の状態に関
係している。ｍβ２ｍの薬理作用は、いずれもＷＨＯと
の相互作用による膜レベルでの効果に関連させることが
でき、ＩＬ−２産生に対する特異的な刺激作用に関連さ
せることができる。
ＩＬ−２生産に対する刺激効果は、ｍβ２ｍの投与時の
免疫系の状態によって、促進、抑制などの免疫学的活性
の範囲を増加させることができる。
ｍβ２ｍによる■Ｌ−２の生産の促進の特に重要な点は
、腫瘍の後退を促進することが知られている天然のキラ
ー（ＮＫ）細胞によって媒介されるリンホカイン活性化
キリング（ＬＡＫ）の増加である。
本発明を下記の実施例において更に詳細に説明するが、
これらの実施例は単に例示のためのものであシ、特許請
求の範囲に記載の発明メ【囲を制限することを意図する
ものではない。
〔実施例〕
実施例１ 材料 ８＠ｐｈａｄ＠ｘ　（登録商標）Ｇ−７５およびＰｏ１
ｙ−ｂｕｆｆ＠ｒ　Ｅｘｃｈａｎｇ＠ｒ　９４は、両方
共Ｐｈａｒｍａｃ１ａＦ１ｎｅ　Ｃｈ・ｍ１ｃ１１．ウ
プサラ、スウェーデンから得た。アクリルアミド、メチ
レン・ビス拳アクリルアミドおよび過硫酸アンモニウム
は、５ｓｒｖａ。
ハイデルベルグ、西ドイツから入手した。アメジオール
およびドデシル硫酸ナトリウムは、Ｍ＠ｒｃｋ。
ダルムシ、タクト、西ドイツから購入した。
出発材料 小胞性未分化肺癌（ＷＨＯＩＩ）であることが組織学的
に証明された２名の患者からの血清試料を、血液試料を
採取した後６時間以内に単離して、使用まで一２０℃で
凍結した。
尿中β２ｍ 尿毒症患者から採取した尿試料を用いて、尿中ｍβ２ｍ
の単離を行った。タンノ譬りは９０％〜１００チ硫酸ア
ンモニウムによって５０００Ｇで１時間沈澱させた。次
いで、沈澱を等張食塩水に可溶化した。次の精製法は、
下記の血清に対する方法と同じでありた。
５ＷＩ９のタフ　ノ４りＡ　（Ｐｈａｒｍａｅｉａ　Ｆ
ｉｎｓＣｈｅｍｉｃａｌｇ　　）を等張食塩水に再溶解
して、最終濃度を１．２５１１／ｌとした。約１２．５
Ａｔを２ｍｃ１の　　Ｉ　（Ｉ　Ｍ　　５６’８１．Ａ
ｍ＊ｒｓｈａｍ、パッキンガムシーア、英国）を用いて
、Ｂｏｌｔｅｎ　−Ｈｕｎｔｅｒ法によって標識した。
ｗ識したタンノ母りＡを次いで、ＰＤ−１０カラムで脱
塩した後、コウシ・アルラミン（ＢＳＡ）（１１／ｌ）
およびＮａＮ３　（５ｍＭ　）　（Ｍ＠ｒｅｋ　）を含
むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐｉ−１７，４２す、
トルに希釈した。次いで、これを免疫電気泳動プレート
の培養Ｋ１月間用いた。
グルは、２ｍＭのＮａＮｇを含む７．３　ｍＭ　）リス
、２８ｍＭバルビタール緩衝液（−８，６）中１％（ｗ
／ｖ）Ｈ８Ａアガロース（Ｌｌｔ＠ｘ、’ペンハーグン
、デンマーク）であった。ｒル結合フィルム７１）ｍＸ
　７５　ｍＸ　Ｏ，２ｗ　（Ｍａｒｉｎ＠Ｃｏ１１ｏｉ
ｄｓＲｏｅｋｌａｎｄ　、マイン、米国）を支持体とし
て用いた。第一次元電気泳動には、２０μｔまたは４゜
μｔｔ加；ｃ−、ヘモグロビン・マーカーｉ１２．５　
ｃｍ　（約７５分間）移動するまでＩＯＶ／ｍで電気泳
動させた。ウサギ抗ヒトβ２ｍ後退（Ｄａｋｏｐａｔｔ
ｍ　、　　コベンハーグン、デンマーク）（１μｔ／＋
りｌｔ−る第２次元電気泳動を２　Ｖ　／　ｃｍで少な
くとも１６時間行った。次に、プレートをブレスして等
張食塩水で２回洗浄した後、乾燥し、Ｃｏｏｍａａｓｉ
・Ｂｒ１ｌｌｉａｎｔ　Ｂｌｕｅ　Ｒ−２５００（５１
ｇｍｍ、セントルイス、米国）で染色した。
交叉放射免疫電気泳動に対しては、上記と同じプレート
を１２５Ｉを標識したタンパクＡ溶液と共に一晩培養し
た。非特異的に結合した放射能をプレートを等張食塩水
で６時間洗浄し、蒸溜水中で一晩洗浄することによって
除去した。乾燥した後、放射活性を有する沈澱をＫｏｄ
ａｋ　Ｘ　Ｓ　−１フイルム上でオートラジオグラフィ
によって視覚化した。
露出時間は通常は２〜１６時間であった（１８）。
ｍβ２ｍの量はα−電気泳動領域におけるβ２ｍ沈澱の
下の面積に比例するものと考えられるので、ＣＲＩＥを
用いてβ２ｍ改質活性を計測した。２個のピークの面積
を、Ｗ・・に・（１９）が記載の方法で半自動プラニメ
ーターを用いて測定した。この比率θ〜１の任意単位（
Ａ、Ｕ、）の目盛シで表した。
（α領域中のβ２ｍ沈澱によって描かれる面積をβ２ｍ
ピークおよびｍβ２ｍピークの総面積（α＋β分画）で
割りたもの）。標準偏差は０．０３Ａ、Ｕ。
であった。
各種分画のβ２ｍ含量を、ＥＬＩＳＡ法（２０）の変法
によって測定した。
使用した抗血清：ウサギ抗ヒトβ２ｍ抗体（口。
）０９５）およびペルオキシダーゼ接合ウサギ抗ヒトβ
２ｍ抗体（Ｅ”ｙ）１００）は、共ＫＤＡＫＯ−Ｉｍｍ
ｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ　Ａ／Ｓ　ｓ　Ｈ碩ンハーグ
ン、デンマークから入手した。
試薬：試薬Ａ（コーティング緩衝液）：　ＰＤ８（０，
０１０Ｍ　　ＮａＨ２Ｐ　Ｏ４／ＮａＨＰ　Ｏ４：　０
，１４５Ｍ　ＮａＣＬ、ｐＨ７，２＋　０．２　）−試
薬Ｂ（洗浄および希釈緩衝液）：　ＰＤ８：０．１％Ｔ
Ｗ＠・−２０（マ／マ）（Ｍｅｒｅｋ　）　＊　０．５
　Ｍ　ＮａＣｔａ試薬Ｃ（試薬率）：８ダの１．２−フ
ェニレンジアミン・２塩酸塩（口、）０９５（ＤＡＫＯ
））、１２ｍ１の０．１　Ｍクエ７ｒＲ９ｙ酸緩衝液、
ｐＨ５，０＋０．２　、５　ｔａＬ　（７）３０チＨ２
Ｏ２・ 血清二標準血清は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製β２　ｍ　Ｒ
Ｉ　Ａキット会カタログ番号１０−６４０８−０１、口
、）８５７７の標準物を試薬Ｂで希釈して、１．３３μ
Ｉ／１〜５３．３３μＪｉｊ／１の操作範囲を得た。対
照用血清はＰｈａｒｍａｅｉａ　ｉＪＩ高水準および低
水準のβ２ｍであった。
β２　ｍ　Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ　：　ｄｅリスチレンマ
イクロタイタープレート（コード番号２３９４５４、Ｎ
ｕｎｓ、＝ｒペンハーグン）のウェルを、各ウェル中に
試薬Ａで１：１０００に希釈したβ２ｍ抗体１００　Ａ
ｔＣ２，９１／ｌ）を加えることＫよってβ２ｍ抗体で
コーティングした。室温で２４時間培養した後、プレー
トを空にして試薬Ｂで３回洗浄した。標準および試験試
料を試薬Ｂで希釈して、希釈液ｌＯＯμｔを増感したウ
ェルに移した。各測定は２回ずつ行った。１時間後に、
ウェルを空にして試薬Ｂで３回洗浄するととによって、
培養を停止した。
ペルオキシド標識した１２℃抗体（１，３，９／ｌ）を
試薬Ｂで１　：　１０００に希釈して、希釈液１００μ
ｔを各ウェルに移して、暗闇で室温で０．５時間培養し
た。次に、プレートを空にして、試薬Ｂで３回洗浄した
後、各ウェル中に色試薬Ｃ１００μｔを添加して、それ
から正確に１５分間培養した後、各ウェルにＩＭ＠酸１
５０μｔを加えて、酵素反応を停止した。マイクロタイ
ター・プレートのウェルでの吸収をＥＬＩ８Ａリーダー
５ＬＴ２１０（ザルンプルダ、オーストリア）上で４９
２　ａｍの波長で読むことＫよりて計測した。分析にお
叶る総ての工程は、室温で行りた。８チヤンネル・ビベ
ｙ　）　（Ｔ１ｔ＠ｒｔ＠ｋ　、　Ｔ＊ｋｎｕｎｅ　）
を用いて、試薬をウェルに迅速に添加した。
標準曲線を、半対数方眼紙上に濃度に対して各２回ずつ
計測した測定地の平均値をフロントするととＫよって作
成した。２回の計測での変動係数は９％でありた。
以下余白 ＳＤＳ　−ＰＡＧＥ ＳＤＳ−ＰＡＧＥは２．０鶴の厚さの１３Ｘ１６．５ｃ
Ｉｎスラブ・ダル中で行った。このダルおよびｆｇｉ液
系は、線形勾配ｆル（Ｔ＝５．２％−１５，３％、Ｃ＝
２．６％＜ビス））を用いてＷｙｃｏｆｆ　（２２）お
よびＢｕｒｙ　（２３）が記載したものと同じであった
。
分析した試料を９５℃で１４ＳＤＳ中で５分間加熱した
。未還元試料中の遊離のチオール基をアルキル化するた
めに、ヨードアセタミド（５１ｇｍｍ　）を最終濃度が
１１０　ｍＭ　ＩＩＣなるまで加えた。ジスルフィド結
合の還元の場合には、ジチオスレイ）　−ル（Ｓｉｇｍ
ｍ）を最終濃度が５５　ｍＭ　Ｋなるまで加えた。加熱
の直後に、未還元および還元状聾では最終濃度が２２０
　ｍＭおよび１１０　ｍＭになるまでヨードアセタミド
を添加した。
以下の分子量標準（Ｐｂａｒｍａｅｌａ　Ｆｉｎ＠Ｃｈ
ａｎｔ　−ｃａｌｇ　）を使用した。ホスホリラーゼｂ
　（９４，０００）、アルラミン（６７，０００）、オ
パルプミン（４３，０００）、カルがニック・アンヒド
ラーゼ（３０，０００）、トリプシン阻害剤（２０，１
００）およびα−ラクタルアルツミン（１４，４００）
。ブロモフェノールブルー（Ｒ１＊ｄ＠１　ｄ＠Ｒａｕ
＠ｎ、ゼールツェ、西ドイツ）をフロント・マーカート
シて使用した。？”ルを、Ｆａｉｒｂａｎｋｌ　ら（２
４）の方法によってＣｏｏｍａｓａｉｅ　ｂｒｌｌｌｉ
ａｎｔ　ｂｌｕ＠Ｒ−２５０で染色した。
分析的ＩＥＦ 分析的ＩＥＦを、Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ　（登録商標）　
ＰＡＧプレー）　（ＬＫＢ、プ四ンマ、スウェーデン）
上で２５Ｗ／時で行った。ＩＩＦの後、ダルを蒸溜水中
０、１４　Ｍスルホサリチル酸および０．７　Ｍ　）リ
クロロ酢酸で固定した。次いで、脱色溶液中で可溶化し
たＣｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｒ１ｌｌｌａｎｔ　Ｂｌｌ＠
　Ｒ−２５０で６０℃で１０分間染色した。過剰の染料
物質を除□くための脱色は、２５％（マ／マ）エタノー
ル５００−を８チ（マ／マ）酢酸と混合し九もので行っ
た。ｐＩを測定するために、以下のマーカーを用いた。
トリグシノーダン（ｐＩ９．３０）、レンチル・レクチ
ン−塩Ｍ柱帯（ｐＩ　８．６５　）　、レンチル・ンー
酸性（ｐＩ８．１５）、ミオグロビン−塩基性帯（ｐＩ
７．３５）、ミオグロビン−酸性帯（ｐＩ　６．８５）
　。
ヒト・カルが工、クーアンヒドラーゼＢ　（ｐＩ６．５
５）、コウシ・カルがニック・アンヒドラーゼＢ（ｐＩ
５．８５）、β−ラクトグプロリンＡ（ＰＩＦ）、２０
）、ダイス・トリプシン阻害剤（ｐＩ４．５５）、アミ
ログルコシダーゼ（ｐＩ３．５０）。
広範囲のキヤリプレーシ、ン・キ、）、ｐＩ３．５〜１
０　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｌｕ＠Ｃｈｅｍ１ｃａ１
ｇ　）。
配列分析 Ｅｄｍａｎ分解を、文献（２５）に記載のｆス相シーク
エンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｌｏｓｙｓｔｅｍｓ　４
７　ＯＡ型）を用いて行った。フェニルイ°ソチオシア
ネート・ア之ノ酸は、ＩＢＭシアノ・カラム上で逆相Ｈ
ｉ’ＬＣＫよって同定および定量した。
Ｓ−アミノエチル化したペプチドでシスティン残基をア
ミノ・エチル化中ＫＣで標識して、これらのペプチド中
のシスティン残基を各フェニルチオヒダントイン・ア之
ノ酸（ＰＴＨ−ａ、ａ、）残ｊｔ：Ｉりｒ−１Ｑｎｄ−
ｈｓＬｔＡｉｌ−ｈｒ斜−一ら条＝ｔ−ｂ’ｌＩｌ＆ｌ
〆２−”？−イ１１ト４．ａｌｌｌｌ嘗４アミノ酸分析 約５ｎｍｏｔのタンパクを６ＮのＨｃｔｘ　ｏ　ｏ　μ
を中で１１０℃で２４時間加水分解した。
アミノ酸分析は、Ｂｅｃｋｍａｎｎ　１２１型アミノ酸
分析装置で行った。Ｔｒｐ　、　Ｂａｒ　、　Ｔｈｒお
よびＣｙｓの分解には、補正をしなかった。
Ｃ−末端の決定 の　約２０ｎｍｏｔのＳ−アミノエチル化したＡ鎖を、
５０　ｍＭのピリジン−酢酸緩衝液（〆（６，１５）６
５０μｔに溶解した。２０μｔのノルロイコシン標準液
（６，５ｍｍｏｔ／水１μｔ）および３０μｔのカル？
ペプチダーゼＹ　（Ｂｏ・ｈｒｉｎｇ＠ｒ　、マンハイ
ム、西ドイツ）水溶液（１，７μｔ／μｔ）を添加した
。培養を３７℃で行い、消化混合物１００μｔを０．１
０．３０および１２０分後に採取した。酢ｆｆ１１５μ
ｔを添加して反応を停止した。
１２０分消化した後に、カルブキシ（ブチダーゼＢ　（
Ｂｏ＊ｈｒ１ｎｇ＠ｒ、−ｒンハイム、西ドイツ）水溶
液（０，０２μｔ／μｔ）、５μＬを添加して、試料１
００μｔを１２５分、１８０分、および２２時間後に採
取し、醇素反応を１５μｔの酢酸を添加することによっ
て停止した。試料を凍結乾燥して、アミノ酸分析に用い
た。試料容積（内部標準）および緩衝液中の遊離アミノ
酸の含量（０分後の試料）について補正を行りた。
１００　ｎｍｏｔのｍβ２ｍを６Ｍグアニジン塩酸塩（
Ｓｉｇｍａ　）および０．００５Ｍエチレンジアミン四
酢ｆＱ　（ＥＤＴＡ　）　（Ｍｓｒｃｋ　）を含む０．
５　Ｍ　）リス−ＨＣ２緩衝液中５ｍＭジチオスレイト
ール、ｐｉ−１８，１を用いて室温で一晩還元した。還
元後、５０μＣｔのヨード（２Ｃ）酢酸（Ａｍｅｒａｈ
ａｍ　、　ＣＦＡ２６９、比活性、５６ｍＣ１／ｍｍｏ
ｔ）を添加して、アルキル化を暗闇で３０分分間性させ
、その後、冷ヨード酢酸をｌ　Ｑ　ｎｍｏｔ間で撚加し
て、アルキル化を暗闇で進行させて、ＡおよびＢ鎖を同
じ日にＨＰＬＣ上で分離した。
反応混合物をＷａｔｅｒｓ　Ｎｏｖａ−ｐａｋ　　（登
録商標）５μ、Ｃ−１８カラム（４，６ｍＸ　１５０ｍ
）上で分離用ＨＰＬＣによって分画した。Ａ緩衝液は０
．１％Ｃマ／マ）トリフルオロ酢酸水溶液であル、Ｂ−
緩衝液は、０．０７％（マ／マ）トリフルオロ酢酸のア
セトニトリル溶液であった。カラムを９５％Ａ１５％Ｂ
で平衡にして、２００　Ａｔ　（７）ＩＩ料ｔ−注入し
た。試料の注入後、カラムを９５％Ａ１５％Ｂを用いて
１−７分の速度で２分間溶出させ、その後１％Ｂ−緩衝
液緩衝液腺形勾配で溶出を行った。２８０　ｎｍの吸収
を記録して、分画を集めた。
ペプチド物質は、真空遠心分離によって単離され（５ａ
ｖａｎｔ真空遠心分離機）、次の分析に供された。
ｂ）処理法 培養 約５０−の血清を小胞性肺癌の患者２名から単離し、３
．６２１１１９の精製した尿中β２ｍを添加した。
次に、血清を２０℃で６日間培養した。
精製処理中のｍβ２ｍを観察し且つ同定するために、Ｃ
ＩＥを処理中に異なる分画から採取した試料に加えた。
比較のため、第２図に、それぞれ培養前および２０℃で
３日間培養後の血清およびｍβ２ｍを加えた血清のＥＲ
ＩＥ（第２図１およびｂ）およびＣＩＥ（第２図Ｃおよ
びｄ）分析結果を示す。
第２図から、ｍβ２ｍは培養の結果出現することが明ら
かに示され、基のβ２ｍを添加することＫよってｍβ２
Ｆの収率は著しく増加することが明らかである。
Ｇ−７５セフアデツクス（登録商標）グルテ過培養した
後Ｋ、血清試料（５０＋＋ｄ）をセフアゾ、リス（登録
商標）Ｇ−７５を充填したカラム（１００Ｘ５ｃＩＩＩ
）に加えて、０．０２５Ｍイミダゾール／　ＨＣｔＩＩ
Ｈ衝液、声７．４を用いて平衡にした。
同じ緩衝液を用いて、４０−７時間の流速で溶出を行っ
た。ＩＯ−の分画を集めて、β２　ｍ　Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ
　Ａで分析した。その結果を第３Ａ図に示す。
Ｇ−７５カラムからのβ２ｍを含む分画を集めて、Ｐｏ
１ｙｂｕｆｆ＠ｒ　Ｅｘｅｈａｎｇ＠ｒ　９４　（Ｐｈ
ａｒｍａｃｌｍＦｉｎｅ　Ｃｈ＠ｍｉｃａ１ｍ　）を充
填したカラム（０，９Ｘ７０ｃｌＩ＆）に加えて、イミ
ダゾール／ＨＣ２緩衝液、…７．４で平衡にした。
β２ｍを蒸溜水で１＝８に希釈してＨＣｔでｐＨ４，０
ＫＦｕしたＰｏ１ｙｂｕｆｆ＠ｒ　７４で溶出した。ｚ
１勾配を溶出後の各分画の−１をｒＡｌｌ定することに
よって監視した。５−ずつの分画を纒めて、β２　ｍ　
Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａで分析して、その結果を第３Ｂ図に
示す。第３Ｂ図に示されたピークのそれぞれに対応する
分画を纏めて、ＣＩＥで分析し、その結果を第４図に示
す。
元のβ２ｍ＃′１ｐｒ５．７で溶出し、ｍβ２　ｍＦｉ
ｐ　Ｉ　５．３で溶出した。精製したｍβ２ｍを第３Ｂ
図の第二のピークに対応する分画を纏めることＫよって
得た。
混入物の除去および最終的精製 生成物から混入物および硫酸アンモニウムを除去するた
めに、ｍめたＩｎ／２ｍを含む分画を９０〜１００％硫
酸アンモニウムを用いて、５０００Ｇで１時間沈澱させ
、その後沈澱を等張食塩水中で可溶化して、Ｓ＠ｐｈａ
ｄ＠ｘ　（登録部ｔｌ）Ｇ−２５を充填したカラムに加
え、１Ｍ酢酸で平衡にした。
同じ緩衝液で溶出を行い、ｍβ２ｍを含む分画を纏めた
。
このようにして得られた生成物をＣＩＢで分析したとと
る、上記定義のｍβ２ｍであることが判りた。
アミノ酸配列 本発明のｍβ２ｍのアミノ酸配列は、上記の方法によっ
て決定した。
Ｎ−末端配列の分析の結果を、下記の表ＩＫ再生する。
以下≦ζ白 平均反復収率：９２．２チ。
！＋ｋ）　　　Ｐｒｏはサイクル１４で両方の鎖に存在
する。
＊＊）　　Ｇｌｕはサイクル１６で両方の鎖に存在する
。
＊＊＊）　Ｖａｌはサイクル２７で両方の鎖に存在する
。
これらの結果によって示されるようＫ、２個のＰＴＨ−
ａ　−ａ　ａ残基は、各分解サイクルにおいてほぼ等量
に放出され、分子が２本の鎖から成っていることを示し
ている。
アミノ酸組成 アミノ酸組成は上記のように決定され、この結果をｍβ
２ｍおよびβ２ｍの両方について下記の表に纒めている
。
以下全白 表２ 改質および元のβ−マイクロ グロブリンのアミノ酸組成 アミノ酸　　分子当シのアミノ酸残基 Ｔｈｒ　　　　　　５．６　　　　　　５Ｓｅｒ　　　
　　　８．５　　　　　　　ｇＧＩ！”　　　　１１．
８　　　　　１１Ｐｒｏ　　　　　　６．４　　　　　
　５ＧＩＦ　　　　　　５．４　　　　　　３Ａｉｍ　
　　　　　３．９　　　　　　２Ｃｙｓ捧　　　１．７
２ Ｖａｌ”　　　　　７．０　　　　　　７Ｍ・＊＊１．
１　　　　　　１ １１・　　　　　４．３５ Ｌｅｕ＊７．６　　　　　　７ Ｔｙｒ　　　　　　ｓ、ａ　　　　　　　６Ｐｈｅ　　
　　　　４゜６５ Ｌｙａ”　　　　７．０　　　　　８ Ｂ１膳　　　　　　　　３．７４ Ａｒｇ”　　　　　５．３　　　　　　５Ｔｒｐ　　　
　　ｎ　＊　ｄ　＊　　　　　　２Ｂ、ｄ、＝＝決定さ
れず ＊）規格化釦用いられるアミノ酸 ２５位におけるシスティン残基の位置は、各ＰＴＨ−ａ
ｌａｓ残基の一部分の放射能の計数に基づいた。
この鎖では、アミノ酸配列のＣ−末端の決定はＳ−アミ
ノエチル化した鎖のカルゲキシペグチダーゼによる消化
によって行った。この分析の結果を下記の表４１Ｃ示す
。
以下余白 この表から、生成物中の式ＩにおけるＸは主としてｐｈ
・であシ、ｐｈ・−Ｂａｒは少なくなシ、Ｘがｐｈ・’
−８＠ｒ−Ｌｙ−であるものは、極めて少量である。
Ｓ−アミノエチル化したＹ　−Ｒｓ　−Ｃｙ　ｓ　−Ｒ
４−鎖の配列分析のの結果を下記の表５に示す。
以下ｊζ白 表５ ｍβ２ｍのＳ−アミノエチル化 したＢ−鎖のアミノ酸配列 ２　　　　　　Ｔｒｐ　　　　　　３７７０３　　　　
　　Ｓ＠ｒ　　　　　　４０６４　　　　　　Ｐｈ・　
　　　　３９４１６　　　　　　Ｌ＠ｔＩ３５６２ ７　　　　　　Ｌ＠ｕ　　　　　　３９４６８　　　　
　　Ｔｙｒ　　　　　　３０３６９　　　　　　Ｔｙｒ
　　　　　　３３１５１０　　　　　　Ｔｈｒ　　　　
　　５１２１２　　　　　　Ｐｈ・　　　　　２５８１
１３　　　　　　Ｔｈｒ　　　　　　４４８１４　　　
　　　Ｐｒｏ　　　　　　１３５３１７　　　　　　Ｌ
７＝　　　　　　１３０２１８　　　　　　Ａｓｐ　　
　　　　６９０１９　　　　　　Ｇｉｎ　　　　　　６
６９２０　　　　　　Ｔｙｒ　　　　　　１１７０表　
５（続き） ２１　　　　　Ａｌａ　　　　　１００５２−一 ２３　　　　　Ａｒｇ　　　　　　３５０２４　　　　
　Ｖａｌ　　　　　１０２２２５　　　　　Ａｓｎ　　
　　　　５８６２６　　　　　　　　Ｈｌｓ　　　　　
　　　　　３０４２７　　　　　Ｖａｌ　　　　　　７
２４２８　　　　　Ｔｈｒ　　　　　　９４２９　　　
　　Ｌ＠ｕ　　　　　　４００３０　　　　　Ｓ＠ｒ　
　　　　　　３７３１　　　　　ＧＩｎ　　　　　　２
０７３２　　　　　Ｐｒｏ　　　　　　２６１３３　　
　　　Ｌｙｓ　　　　　　３０７３４　　　　　　　　
　ＩＩｓ　　　　　　　　　　２４４３５　　　　　Ｖ
ａｌ　　　　　　２８１３６　　　　　　　　　　Ｌ７
虐　　　　　　　　　　　２８０３７　　　　　Ｔｒｐ
　　　　　　１５３３８　　　　　Ａｓｐ　　　　　　
１１２３９　　　　　Ａｒｇ　　　　　　１４１４０　
　　　　Ａｓｐ　　　　　　１６７４１　　　　　　　
　Ｍ＠　ｔ　　　　　　　　　　　３５平均反復収率：
８７．４％。
２２位におけるシスティン残基の位置は、上記と同じく
、各ＰＴＨ−ａ、ａｓ残基の部分の放射能の計数に基づ
いている。上記の配列は、報告されているβ２ｍの配列
における５９〜９９位の残基の配列と同じである。
実施例２ ＲＢ　Ｆ　／　Ｄ　ｎ−株マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ。
Ｂａｒ　Ｈａｒｂｏｒ　、　？イン、米国から入手）を
２週間ずつの間隔を置いてＮ−末端を介してキー・リン
ペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合した合成ペプチ
ドＬｙｅ−Ｖａｌ−Ｇ１ｕＨ１ｍ−８＠ｒ−Ａｓｐ−Ｌ
＠ｕ−８＠ｒ　−ｐｈ・で３回免疫した。−ｅｆチド接
合体（２５μＩ／マウスのＰＢ８溶液、１００μＬ）を
第一の免疫に対するＦｒ＠ｕｎｄの完全アジ、パントお
よび続いての免疫に対するＦｒ＠ｕｎｄの不完全アジ、
パントで１：ＩＫ乳化し、送料２００μｔを皮下に（１
ｅｅｓ）投与した。免疫したマウスからの血液試料は後
部眼窩動脈叢または眼から得て、血清試料は、凝固稜の
試料の遠心分離によって得た。血清試料の特異性は元の
β２ｍまたはｍβ２ｍを１μ９／−でコーティングした
イムノプレート（ＮＵＮＣ。
Ｒｏｓｋｌｌｄｅ、デｙ’ｖ−り）を用いて、ＥＬＩＳ
Ａによって評価した。血清試料を１０倍希釈（１０。
１０”２．１０−３および１０−’　）　　で希釈して
、コーティングしたプレートで培養し、ホース・ラディ
、シュ・４ルオキシダーゼ（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ　、デ
ンマーク）と接合したウサギ抗−マウスイムノグロブリ
ンおよびＯ−７エニレンジアミン（ＯＰＤ）基質反応を
用いて、それぞれの抗ＭＫ対する抗体活性を比色法で測
定した。
第５図はｍβ２ｍ（綾目棒）および元のβ２ｍ（黒棒）
の結合について分析した代表的なマウス血清の滴定値を
示す。抗血清は選択的Ｋｍβ２ｍと反応し、これらの条
件下では、工０−４の希釈でｍβ２ｍに対して特異的で
ある。完全に特異的なｍβ２ｍに対するｙｊｅ　ＩＪク
ローン抗血清は、元のβ２ｍと共に更に吸収することに
よって得られた。
以下全白 実施例３ ペプチドＬｙｓ　−Ｖａ　１−Ｇｌ　ｕ−Ｈｌ　５−８
ｓ　ｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ｐｈｓ　　の１■を
、３■のＫＬＨ（キーホール・リンベット・へそシアニ
ン、　Ｃａ１ｂｉｏｃｈ＠ｍ）　色混合して、グルタル
アルデヒド（Ｍ＠ｒｃｋ　）を総ｆ！：１−で最終濃度
が０．２５　％　（マ／マ）となるまで加えた。−を８
．０に調整した。反応を室温で１時間行った後、４℃で
１８時間行った。その後、混合物をＰＢＳに対して透析
して、コンジーｆ−）を得て、これを次の免疫化で抗原
として使用した。
モノクローン抗体の生産 ＲＢ　Ｆ　／　Ｄ　ｎ−株マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ。
Ｂａｒ　Ｈａｒｂｏｒ　、　マイン、米国から入手）を
２週間ずつの間隔を置いてＮ−末端を介してキー・リン
ベット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合した合成ペプチ
ドＬｙｓ　−Ｖａ　１−Ｇｌｕ−Ｈｌ　ｍ−８＠ｒ−Ａ
ｓｐ−Ｌｏｌｌ−８＠　ｒ　−ｐｈ・で３回免疫した。
ペプチド接合体（２５μ９／マウスのＰＢ８溶液ＲＢ（
８，１２）５Ｂｎｒｒｏｂｓｒｔｓｏｎｔａｍ転座クロ
モシーム（ＪａｃｋｇｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　、　
Ｂａｒ　Ｈａｒｂｏｒ　、　？イン、米国）を有するＲ
ＢＦ／Ｄｎ一種のマウスを、１００μｔ）を第一の免疫
に対するＦｒ＠ｕｎｄの完全アジ、パントおよび続いて
の免疫に対するＦｒ＠ｕｎｄの不完全アジ、パントでｌ
：ｌに乳化し、送料２００μＬを皮下に（１ｍ＋！ｉ＋
）投与した。最後に皮下に免疫した時点から３０日後に
、マウスの静脈内に１０μｇの接合体を１００μｔ　ｐ
ｉｓに溶解したものを注射して、更に３日後にマウスを
屠殺して、それらのＷ！臓を取シ出して、骨髄腫細胞と
融合させた。
ＲＢＦ／Ｄｎ　マウス（１３，３Ｘ１０細Ｊｌ＆）から
の肺臓細胞を選択可能な酵素！−カ一部位のアデノシン
・ホスホリがシル・トランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ−’
）およびハイ−キサンチン・ホスホリがシル・トランス
フェラーゼ（ＨＰＲ？−）（ＨｙＣ１ｏｎ＠Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒ１＠ａ、口１ガン、ユタ、米国）を欠損してい
るＦＯＸＮＹ骨髄腫ラインの３．５Ｘ１０個と融合させ
た。細胞融合混合物をＡＰＲＴ−活性（ＡＰＲＴ十選択
）を要する媒質に暴露すると、未融合ＡＰＲＴ−骨髄旌
およびＡＰＲＴ−ハイツリドーマの両者が減少する（Ｒ
，↑。
ＴｌｕａｒｔおよびＩ　、Ｍ、８ｍｍｌｏｆｆ　：　５
ｃｉｅｎ＠ｅ　、　２１９（１９８３）、１２２８〜１
２３０頁）。融合した細胞をＢａ１ｂ／ｅ一種マウスマ
クロファージフィーダ一層上にＲＰＭＩ　−１６４０か
ら成る媒質中で総数が１０個の９６−ウェル・マイクロ
タイター・プレー）　（ＮＵＮＣ、ＲＯｓｋｉｌｌ・、
デンマーク）中でアデニン（７，５Ｘ１０″″５Ｍ）、
ア２ノグテリン（８Ｘ１０−７Ｍ）およびチζジン（１
，６Ｘ１０−５Ｍ）を補足した１５％（ｗ／マ）致死プ
ウシ血清（Ｇｉｂｃｏ　）と共に播種した（ＡＴＴ　）
。
培養物を５チＣ０２を含む空気中で３７℃で７日間培養
した後、培地を新しいものに取シ替えて、４日間培養し
た後、培養物をＥＬＩＳＡによって一次スクリーニング
した。
スクリーニング法（ＢＬＩ８Ａ） マイクロタイタープレート（ＮＵＮＣＩｍｍｕｎｏ−ｐ
ｌａｔｅａ　、　ＮＵＮＣ、Ｒｏｓｋｌ　１ｄ＊　、　
Ｄｅｎｍａｒｋ　）を抗原でコーティングした。用いた
ＥＬＩＳＡｔ−Ａ。
Ｗｅｌｌ＠ｒおよびＢａ　ｄ＠８ａｖｉｇｎｙ　（Ｒ，
Ａ＊Ｔｈａｍｐｓｏｎ：Ｔ＠ｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｌｎ　
Ｃｌ１ｎｉｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　、第２版、
（１９８１年）、１５７〜１６９頁、Ｂ１ａｅｋｖ＠１
１５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ　
、？ストン、マサチ、−セッツ）によって記Ｐされた方
法の改質法であった。コーティングはホスフェート・緩
衝食塩水（ＰＢＳ）中の抗原を用いて（５０μｔ／ウエ
ル）、−晩行った。プレートを空にして２％ｗ／マコウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳでブロックし
く２００μｔ／ウエル、２０℃、１時間）、その後、Ｐ
ＢＳ　−Ｔｖｔ＠ｎ−２０（０，０５チマ／マＴｗ・・
ｎ／ＰＢＳ）を用いて３回洗浄した。
ハイプリドーマ培養液（５０μｔ／ウエル）からの希釈
していない上澄液を２０℃で１時間加えた彼、上記のよ
うにグレートを洗浄した。コーティングに用いた抗原に
対する抗体活性を比色法によって測定し、０．５％ｗ／
ｖＢｓＡを含むＰＢＳ中ｌ：１０００に希釈したホース
・ラディ、シ、・ペルオキシダーゼ（Ｄａｋｏｐａｔｔ
畠、デンマーク）と接合したウサギ抗−マウス・イムノ
グロブリンのウェル当！！７１００μ９と共に２０℃で
１時間培養し、更に０．１　Ｍクエン酸−ホスフェート
緩衝液、−５，０（クエン酸ｌ水利物ニア、３ｇ、Ｎａ
２ＨＰＯ４・１２Ｈ２０：２３．８７Ｎを１リツトルと
する）：Ｃ３回の洗浄の後、０−フェニレンジアミン（
ＯＰＤ）基質（（１−フェニレンジアミン・２　ＨＣｌ
　：　８■、クエン酸緩衝液、１５ｄ、Ｈ２Ｏ２：（３
０ｑｂマ／マ）、５μｔ、と共に培養した。反応を３分
後に１５０μｔのＩＭのＨ２ＳＯ４を加えて停止させ、
４９２ｍｍの吸光度をメプルビームＫＯＮＴＲＯＮ　　
５ＬＴ−２１０比色計（ＳＬＴ、テ、−リッヒ、スイス
）を用いて、対照として６２０　ｎｍでの読みを採用し
て計測した。
一次スクリーニング 上記の方法で、免疫化に用いたノナペプチドをコーティ
ングしたが、ＫＬａ（ｘＡｙ／ｓｇ）とは結合しなかっ
た１０個のマイクロタイターグレートを用いて、９６０
個のハイツリドーマ培養上澄液を試験した。２７個の培
養物は著しく積極的に反応し、これらを更に試験に用い
た。
第６図は、−次スクリーニングにおけるＥＬＩＳＡの結
果を示す。１０個のマイクロタイタープレートからの結
果を示す。水平ラインは、−次スクリーニングに選択さ
れる任意の背景水準を示す。Ｘで示した培養物のみを更
に試験に用いた。
二次スクリーニング マイクロタイタープレートをノナペプチド、β２ｍ（元
のもの）またはｍβ２ｍ（変ｆａ）のいずれかでそれぞ
れ１μｔ／ｌｄ　、　１０μｔ／ｓａｔおよびｌＯμＬ
／−の濃度でコーティングした。２７個の培養上澄液を
加えて、試験を上記「スクリーニング法」にしたがって
行った。
第７図に、二次スクリーニングの結果を、上記特異化し
た抗原のいずれとも版の失いという意味で陰性であった
培養物Ｆｌ　、Ｆ３およびＦ７を除く一次スクリーニン
グからの選択された培養物について示した。
図から、３個のクローン（Ｆ２　、ＦＩＯ，Ｆ２５）は
ペプチドと顕著に反応し、１５個はペプチドおよびｍβ
２ｍと反応し、寝３（Ｆ５．Ｆ８．Ｆ２６）はペプチド
、ｍβ２ｍ、および（元の）β２ｍと反応した。残シの
３個のクローンは反応圧を喪失した。
ハイツリドーマの選択 ｍβ２ｍおよび／またはβ２ｍと反応するハイツリドー
マ抗体は総て、更に、マウス・イムノグロブリンのクラ
スのＩｇＭであることが示された。これは上記のＥＬＩ
ＳＡ法を用いる実験でペルオキシダーゼ標識したウサギ
抗マウス・イムノグロブリンのネズミ綱および亜絹に特
異的な標諧した抗体で置換することから成る改質を有す
ることが分かる。
実施例４ 生物応答改質剤としてのｍβ２ｍの活性を、一方の異種
の混合リンパ細胞培養液（ＭＬＣ）の増加によって評価
した。
３種の異なる！ロトコールを用いた。
１、　−ｒイクロカルチャー法ａ　（Ｃｌａｎｓｍｏｎ
　。
Ｍ、Ｈ，およびＭｌｌｌ＠ｒ　、Ｒ，Ｇ＊：Ｊ＊Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ　＠１３４、（１９８５）、６８４頁）。培養
物を９６ウエル・コニカル・マイクロタイター・トレー
　（Ｎｕｎｃ　、　Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク）中
で４〜６の複製物中に吸えた。応答細胞、２〜５Ｘ１０
５／培養物およびミドマイシン処理した促進材細胞（１
０’／培養物）を、送料２００μｔの容積で培養した。
２、培養物を１〜２−の容積に対して０．５〜１．０Ｘ
１０　マイトマイシン処理した促進剤細胞を用いて、１
２Ｘ７Ｓｉｍプラスチ、り管にセ、トシた。
３、培養物を５〜ｌＯ−の容積で、それぞれ１０６／−
の応答および促進剤細胞を有する５〇−組織培養フラス
コ（Ｎｕｎｅ　）中にいれた。元のβ２ｍおよび改質β
２ｍを個々のＭＬＣに培養の０白目にまたは培養のＯ〜
４日目白目個の実験で加えた。
細胞毒性アッセイ法 ＭＬＣ培養物の細胞毒性活性を４時間の５１　Ｃｒ放出
法で培養の５日後に決定した。標的細胞は、２〜５　Ｘ
　１０’（Ｄ５１　Ｃｒ１ｌ識したＲＢＬ５（Ｈ２ｂ）
、Ｐ８１５（Ｈ−２’）、およびＹＡＣ（ＮＫ標的）腫
瘍細胞ライ／であシ、ある実験ではＣｏｎｅａｎａｖａ
ｌｌｎＡ誘発ＭＬＣ促進剤種または関連のない第三〇ノ
４−ティ種からの膵臓細胞プラストである。標的細胞、
１〜５Ｘ１０’個１０．１一致死コウシ血清を１５０μ
ｃｔナトリウム（５１Ｃｒ　）クロメートで１〜２時間
３７℃で標識した。次に、細胞を細胞毒性ア。
セイの前に洗浄した。自発性５１　Ｃｒ放出をマイトマ
イシン処理しただけの促進剤細胞を含む培養液に加えた
標的細胞から決定した。総放出可能な５１　Ｃｒを酢酸
処理した標的細胞から決定した。特異的５１　Ｃｒ放出
率を（観察された放出−自発的放出）／（総放出−自発
的放出）Ｘ１００として計算した。
マイクロカルチャＭＬＣでは、０．１−上澄液を０、１
　ｍの５１　Ｃｒ−標識した標的細胞で置換した。
培養管および培養フラスｊＭＬｃ系では、０．１−の容
量を４個の９６ウエルのＶ底マイクロタイタートレー（
Ｎｕｎｅ　）複製に加えて、適当な５１　Ｃｒ標識した
容量が０．１−の標的細胞の添加を行った。
別の実験では、ＭＬＣ応答細胞はＬｙｍｐｈｏｐａｑｕ
ｅ（登録商標）　（Ｐｈａｒｍａｅｌｍ、スウェーデン
）上で遠心分離することＫよって精製し、一定数の標的
細胞に対して滴定した。４時間のアッセイの後、０、１
−の上澄液の培養容積を、ガンマ−カウンターから取プ
出した。
インターロイキン２８ＩＬ−２）測定 １〜４日間の培養を行りたＩＬ−２含量を２個の２−テ
、−ツのＭＬＲ培養物を、測定した。各Ｚｏｏμｔの培
養上澄液をＣＴＬライン、４１３（Ｃｕｒｔｉａ　、　
Ａ＠Ｓ　ｍＧｍおよびＲｏｏｎ＠ｙ　＊　Ｐ　ｅ　ｔＮ
ａｔｕｒ＠、Ｌｏｎｄｏｎ、２８１．　　（１９７９）
、２２２頁）３個の複製に加えた。４Ｂ３はＲ，Ｇ。
Ｍｉｌｌｅｒ博士、０ｎｔａｒｌｏ　Ｃａｎｃ＠ｒ　Ｉ
ｎ５ｔｉｔｕｔｅ　。
トロント、カナダによって好意で提供された。フラット
底９６ウエルマイク日タイタープレート（Ｎｕｎｅ　）
中で４８時間培養した後、３　Ｈ−ＴｄＲ（０，１−Ｃ
１／ウェル）を６時間添加する仁とによシ培饗した５Ｘ
１０３個／ウェルであった。細胞ａｓｃａｎｔｒｏｎ　
Ｃ＠ｌｌ　Ｈａｒｖｓｎｔ＠ｒ　（Ｏｓｌｏ、ノルウェ
ー）中で［ＩＬ、シンチレーション・カウンター中で計
数した。
第８図はｍβ２ｍが１０〜１１０００ｎの濃度でＭＬＣ
Ｋ加えられるとき、細胞毒性り／／４球の発生を有意Ｋ
（ｐ＜０．０１）増大する。Ｉｎ／２ｍＫ暴露されたＭ
ＬＣ中に発生したＣＴＬの官能性は第三の／４−テイハ
プロタイｆまたは天然のキラー感受性の標的細胞に対し
て発生しなかったので、特異的であった。更に、細胞毒
性法に直接加えられるｍβ２ｍは生成したＭＬＣに影響
を与えず、ＣＴＬによってキリングする。
元のまたはｍβ２ｍに暴露されたＭＬＣの上澄液は、培
養の１〜４日間で内因性ＩＬ−２生産について検討をし
た。
表７ β２ｍおよびｍβ２ｍ　　（２００ｎＭ／ｌｄ）および
ＰＢＳに暴露されたＭＬＣＫおける！Ｌ−２産生。ＭＬ
Ｃは２−の容量で、２ｘ１０６８Ｊ１ａ２ｘ１０６ＢＡ
ＬＢ／＠から成りた。！Ｌ−２産生け、ＩＬ−２異存製
ＣＴＬクローン、４Ｂ３について試験した。
以下ふ白 ＭＬＣ培養物昌シのＩＬ２の単位 添加　１ｂ）　　２　３　　４ ｍ／ｍｏ　　　°１４　　１３６　　　　８０β２ｍ　
　　　２　　　１２　　　４２　　　１０４ＰＢＳ　　
　　０　　　１６　　　２８　　　７０ａ）ＩＬ−２の
１単位は４８時間の培養での５×１’０３　４Ｂ３　　
ＣＴＬの増殖性応答を倍増するＩＬ−２の量として定義
される。
ｂ）　ＭＬＣの日数。
表７空ｍβ２ｍは元のβ２ｍおよびＰＢＳ暴露ＭＬＣに
比較して内因性ＩＬ−２の生産を早期（３日目）に促進
する。しかしながら、１日の４ＭＬＣ培養物では、ＩＬ
−２の濃度はｍβ２ｍに暴露したＭＬＣで培養のこの時
期では、増殖性ＣＴＬによりて消費される増加率によシ
減少した。ｍβ２ｍはそれ自体、ＩＬ−２活性の滴定に
用いられるクローン化したＣＴＬライフ　４　Ｂ　３　
（Ｃｕｒｔｉｓ　、　Ａ、Ｓ　、Ｇ、およびＲｏｏｎ＠
ｙ　、　Ｐ、Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ　）　２８
１　、　（１９７９゜ｐ、２８１）上で試験される場合
には、！Ｌ−２様効果は持たない。
参考文献 １、　　Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ、ＢｓＡ、、Ｗａｎｇ、
ＪｅＬ、。
Ｂ＠ｒｇｇａｒｄ　、　Ｉ　＠＆　Ｐ＠ｔ＠ｒｍｏｎ　
、　ＰａＡ１１（１９７３）　　Ｂ１ｏｅｈ＠ｍ１ｓｔ
ｒｙ　１２，４８１１−４８２２゜ ２、　　Ｓｕｇｇｓ、Ｓ、Ｖ＊、Ｗａｌｌａｃｅ、Ｒｏ
Ｂ、。
Ｈｌｒｏｓｅ　、　Ｔｅ　、Ｋａｖａｓｈｉｍｍ　、　
ＥｅＨｓ　　＆Ｉｔａｋｕｒａ　、　Ｋ、　　（１９８
１）　Ｐｒｏｓ　、Ｎａｔｌ　。
Ａｃａｄ、Ｓｅｉ、ＵＳＡ７８．６６１３−６６１７゜
３、　　Ｂ＠ｒｇｇ；ｒｄ　Ｉ　、Ｂｅａｒｎ　Ａ、Ｇ
、　（１９６８）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２４３．４
０９５−４１０３゜４、　　Ｐ１ｅｓｎ＠ｒＴ＆Ｂｊｅ
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ｕｎｏｌ、１１，３４１−３５１゜５、　　Ｓｏｌｈｅ
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−３８　。
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ｄ、Ｓｃ１゜ＵＳＡ　７１．３５−３９゜ ７、　　Ｃｏｔｎ＠ｒ　、　Ｊｅ　、Ｍａｓｈｌｍｏ　
、Ｈｅ　、Ｋｕｎｇ　、　ＰａＧ。
Ｇｏｌｄｓｔ＠ｉｎ　、　Ｇ＠　＆　８ｔｒｏｍｉｍｇ
＠ｒ　、　Ｊル・（１９８１）　　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、ＡｅａｄＪｃｌ、ＵＳＡ７８．３８５８−３８６２゜ ８、　　Ｔｅｒｈｏｒｍｔ、Ｃ，、Ａｇｔｈｏｖ＊ｎ、
Ｖ、Ａ＠。
Ｌ＠Ｃ１ａｉｒ　、Ｋｍ　、Ｓｎｏｗ、Ｐａ　、Ｒ＠ｌ
ｎｈ＠ｒｚ　＠Ｅ＋＋＆　　　Ｓｃｈｌｏｓｓｍａｎ、
５−（１９８１）Ｃ＠ｌｌ　　２３゜７７１−７８０゜ ９、　　Ｐａｔｅｒｓｏｎ、ＰｓＡ＊、Ｃｕｎｎｌｎｇ
ｈａｍ、ＢａＡ＊。
Ｂ＠ｒｇｇａｒｄ　、　Ｉ　、　　＆　Ｅｄ＊１ｍａｍ
　、Ｇ　５ＲＬ（１９７２）　　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、Ｓｅ１．ＵＳＡ６９．１６９７−１７０１゜ １Ｂ、　Ｐｌｅｓｎｅｒ　、　Ｔ　＊　、Ｗｔ　１ｋＩ
ｎ、Ｍａ　、　Ｂｊｅｒｒｕｍ　。
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ｉｔ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆｑｕａｎｔｌｔａｔｉｖｅ　
ｉｍｍｕｎｏ＠１ｅｅｔｒｏｐｈｏｒｅｓｌｓ。
Ｍ＠ｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　ａｐｐＨｅａｔｔｏｎｓ、１
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ｌ、Ｊ、　　＆　Ｗ＠ｅｋｓ。
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ｓｄ＠ｒｓ＠ｎ、ＢｓＡ　　Ｂｏｅｎｉｓｃｈ　Ｔ、（
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Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔｈｏｇｒａ−ｐｈ７　２１３，４９
１−５００゜ ２５、　Ｍｏｏｄｙ、Ａ、Ｊ、、Ｔｈ１ｍ、Ｌ、　　＆
　　Ｖａｌｖｅｒｄｅ。
１、　　（１９８４）ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ−１７２゜１
４２−１４８゜
【図面の簡単な説明】
第１図は、β２ｍのアミノ酸配列と比較した本発明の改
質ｍβ２ｍのアミノ酸配列を示し、第２図は、ヒト血清
およびｍβ２ｍを加えたヒト血清の交叉免疫電気泳動（
ＣＲＩＥ）および交叉免疫電気泳動（ＣＩＥ）を示し、 第３図は、β２ｍおよびｍβ２ｍのり四マトグラフィ溶
出空の分画のβ２ｍ酵素結合イムノソーペンドア、セイ
（ＥＬＩＳＡ）の結果を示し、第４図は、第３Ｂ図での
２個のピークからの分画のＣＩＥ分析を示し、 第５図は、本発明の抗血清のＥＬＩＳＡでの滴定からの
結果を示し、 第６図は、抗ｍβ２ｍ抗体産生培譬物の一次スクリーニ
ングの結果を示し、 第７図は、第６図の一次スクリーニングから選択される
培養物のＥＬＩＳＡでの二次スクリーニングからの結果
を示し、 第８図は、混合リン／譬球培養物（ＭＬＣ）および加え
られ九ｍβ２ｍの細胞毒性活性の関係を示す。 以下余白 ＳＬＣ患者からの血清 ２８０力ｍでの吸収 溶出容積（＋＋ｌ） く Ｆ　Ｉ　Ｇ、　０ １）　。 β２ｍの濃度（＋ｎＭ）

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ I （式中、Ｒ＿１は２４個のアミノ酸残基の配列Ｉｌｅ−
    Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇ
    ｌｎ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｐｒ
    ｏ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ
    −Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｎであり、 Ｒ＿２は３０個のアミノ酸残基の配列 Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｐ
    ｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓ
    ｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ
    −Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−
    Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒであり、 Ｒ＿３は２０個のアミノ酸残基の配列 Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔ
    ｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｐｒ
    ｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ
    −Ａｌａであり、 Ｒ＿４は１９個のアミノ酸残基の配列 Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｌ
    ｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｖａ
    ｌ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ
    であり、ＸはＰｈｅ、Ｐｈｅ−ＳｅｒまたはＰｈｅ−Ｓ
    ｅｒ−Ｌｙｓであり、ＹはＡｓｐ、ＬＹｓ−Ａｓｐまた
    はＳｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐである）を有する改質β＿２
    −マイクログロブリン。 ２、ＸがＰｈｅであり、ＹがＡｓｐである、特許請求の
    範囲第１項記載の改質β＿２−マイクログロブリン。 ３、検出可能な形状に標識した特許請求の範囲第１項ま
    たは第２項のいずれか１項記載の改質β＿２−マイクロ
    グロブリン。 ４、放射性同位元素で標識した形状の特許請求の範囲第
    ３項記載の改質β＿２−マイクログロブリン。 ５、不溶性固形相に結合した特許請求の範囲第１項また
    は第２項記載の改質β＿２−マイクログロブリン。 ６、特許請求の範囲第１項または第２項のいずれか１項
    記載の式 I を有する改質β＿２−マイクログロブリン
    に対する抗血清またはポリクローン抗体。 ７、特許請求の範囲第１項または第２項のいずれか１項
    記載の式 I を有する改質β＿２−マイクログロブリン
    に対するモノクローン抗体。 ８、ｍβ＿２ｍに対する特異性を有するが、β＿２ｍに
    対する特異性を持たない、特許請求の範囲第４項記載の
    モノクローン抗体。 ９、ｍβ＿２ｍおよび一般式II Ｒ−ＺII 〔式中、Ｒはキャリヤータンパクであり、Ｚは式Ｒ＿３
    ′−ＸまたはＲ＿３′−Ｙ（但し、ＸおよびＹは特許請
    求の範囲第１項において定義した通りであり、Ｒ＿２′
    は特許請求の範囲第１項に定義されたＲ＿２のＣ末端か
    らのフラグメントに対応する１〜３０個のアミノ酸残基
    を有するペプチドであり、Ｒ＿３′は特許請求の範囲第
    １項記載のＲ＿３のＮ末端からのフラグメントに対応す
    る１〜２個のアミノ酸残基を有するペプチドである）を
    有するペプチドである〕を有する化合物から成る群から
    選択される抗原で免疫することによって得ることができ
    る特許請求の範囲第７項または第８項のいずれか１項記
    載のモノクローン抗体。 １０、齧歯類またはヒトの特徴を有する特許請求の範囲
    第６〜９項のいずれか１項記載の抗体。 １１、検出可能な形状に標識された特許請求の範囲第７
    〜１０項のいずれか１項記載のモノクローン抗体。 １２、放射性同位元素で標識された形状の特許請求の範
    囲第１１項記載のモノクローン抗体。 １３、不溶性固形相に結合した特許請求の範囲第７〜１
    ０項のいずれか１項記載のモノクローン抗体。 １４、改質β＿２−マイクログロブリン（ｍβ＿２ｍ）
    を含むかまたは含むと思われるヒト体液を特許請求の範
    囲第６項〜第１３項のいずれか１項記載の（１種以上の
    ）モノクローン抗体と接触させ、該（１種以上の）抗体
    が上記ｍβ＿２ｍに結合しているか否かを検出すること
    から成るヒト体液中でのｍβ＿２ｍの検出法。 １５、ドット−プロット分析である、特許請求の範囲第
    １４項記載の方法。 １６、免疫学的サンドイッチ定量法である、特許請求の
    範囲第１４項記載の方法。 １７、競合的定量法である、特許請求の範囲第１４項記
    載の方法。 １８、特許請求の範囲第１項または第２項のいずれかに
    記載の改質β＿２マイクログロブリンと１種以上の生理
    学的に混和性のキャリヤーとから成る製薬組成物。 １９、β＿２マイクログロブリンと１種以上の生理学的
    に混和性のキャリヤーとから成る製薬組成物。 ２０、特許請求の範囲第１項または第２項のいずれかに
    記載の改質β＿２マイクログロブリンと１種以上の生理
    学的に混和性のキャリヤーとの配合物から成る製薬組成
    物。 ２１、特許請求の範囲第６項〜第１０項のいずれか１項
    記載の１種以上の特異的抗−ｍβ＿２ｍ抗体と１種以上
    の生理学的に混和性のキャリヤーとから成る製薬組成物
    。 ２２、生物学的応答改質剤としての特許請求の範囲第１
    ８項〜第２１項のいずれか１項記載の製薬組成物の使用
    。 ２３、哺乳動物に特許請求の範囲第１８項〜第２１項の
    いずれか１項記載の製薬組成物の治療上有効な量を投与
    することによって、該哺乳動物の生物学的応答を改質す
    る方法。
JP62007962A 1986-01-16 1987-01-16 改質β↓２マイクログロブリン Pending JPS62246596A (ja)

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